Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Влияние гепатопротекторов, содержащих полифенолы, на метаболизм печени при экспериментальной патологии

На правах рукописи

Шутов Дмитрий Вячеславович

□□345212 1 ВЛИЯНИЕ ГЕПАТОПРОТЕКТОРОВ, СОДЕРЖАЩИХ ПОЛИФЕНОЛЫ, НА МЕТАБОЛИЗМ ПЕЧЕНИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ПАТОЛОГИИ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология 14.00.16 — патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

„ " " 11":......

Томск - 2008

003452121

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и ГУ Научно-исследовательском институте фармакологии Томского научного центра Сибирского отделения РАМН.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор, Венгеровский

заслуженный работник высшей школы РФ Александр Исаакович

доктор медицинских наук, Хазанов

профессор Вениамин Абрамович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, Суслов

профессор Николай Иннокентьевич

доктор медицинских наук, Степовая

профессор Елена Алексеевна

Ведущее учреждение:

ГОУ ВПО «Кемеровская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Защита диссертации состоится «».АЕЧ^/У&Т^ 2008 года в часов на заседании диссертационного совета Д 001.031.01 при ГУ НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН по адресу: 634028, г. Томск, пр. Ленина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН.

Автореферат разослан «-2В » 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Амосова Е.Н.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АлАТ - аланинаминотрансфераза

АсАТ - аспартатаминотрансфераза

АТФ - аденозинтрифосфорная кислота

ГТП - у-глутамилтранспептидаза

КФ - кислая фосфатаза

ЛПВП - липопротеины высокой плотности

МДА - малоновый диальдегид

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СДГ - сукцинатдегидрогеназа

ЩФ - щелочная фосфатаза

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время остается высокой потребность в гепатопротективных средствах, повышающих резистентность печени к действию химических агентов и нормализующих ее метаболизм в условиях напряжения детоксицирующей функции. Расширение спектра гепатопротекторов, обусловленное использованием в медицине новых достижений биохимии и молекулярной биологии, расшифровкой биохимического состава растительного сырья и синтезом новых соединений, пришлось на XX в. Появление в конце прошлого столетия новых препаратов (интерферонов, аналогов нуклеозидов), воздействующих на этиологию заболеваний печени, не ослабило интереса клиницистов к гепатопротекторам. Безопасность, хорошая переносимость, возможность длительного приема нередко являются решающими факторами в пользу их выбора при заболеваниях гепатобилиарной системы (Сарашков A.C. и соавт., 2004; Доркина Е.Г., 2004; Шульпекова Ю.О., 2006).

Группа гепатопротекторов в России включает более 40 лекарственных средств. Кроме того, применяются препараты с гепатопротективными свойствами: витамины, предшественники нуклеиновых кислот, стимуляторы реакций детоксикации в печени, метаболиты митохондриального дыхания и др. (Новиков В.Е. и соавт., 2005).

Большое значение в проявлении гепатотоксического эффекта ксенобиотиков имеет усиление перекисного окисления липидов в мембранах гепатоци-тов, где, в основном, локализованы системы метаболической биотрансформации и конъюгации ксенобиотиков. При токсических поражениях печени, в первую очередь, применяют антиоксидантную терапию, направленную на ограничение перекисного окисления липидов и стабилизацию мембран. Внимание ученых, занимающихся разработкой гепатопротекторов, привлечено к соединениям с выраженной антиоксидантной активностью. Такими свойствами обладают растительные соединения под общим названием полифенолы. К полифенолам относят около 4000 разных веществ, в том числе флавоноиды, катехины, флавононы и флавоны. Полифенолы не токсичны для организма человека и животных при любом способе введения, обладают Р-витаминной активностью, усиливают действие аскорбиновой кислоты, снижают проницаемость капияля-

ров, стимулируют образование и выделение желчи (М1с!с11е1ог Е. й а1., 2000; Е^сЫ Б. е1 а1., 2002).

Представляет интерес изучить влияние гепатопротекторов, содержащих полифенолы и их комплексы, - экстрактов виноградной косточки, бадана толстолистного и силимарина на биоэнергетику печени при экспериментальной активации перекисного окисления и нарушении Р-окисления жирных кислот.

Цель работы. Изучение влияния гепатопротекторов полифенольной природы на функциональное состояние митохондрий печени крыс при экспериментальной активации перекисного окисления липидов, вызванной введением тетрахлорметана, и дефекте Р-окисления жирных кислот, развившемся при интоксикации 4-пентеноевой кислотой.

Задачи исследования.

1. Изучить функциональное состояние митохондрий печени крыс при экспериментальной интоксикации тетрахлорметаном и 4-пентеноевой кислотой и спустя 2 нед. после прекращения введения гепатотоксинов.

2. Оценить влияние гепатопротекторов, содержащих полифенолы (сили-марин, экстракт бадана толстолистного, экстракт виноградной косточки), на концентрацию в крови глюкозы, белка, холестерина, липопротеинов высокой плотности, билирубина, активность аминотрансфераз, кислой и щелочной фос-фатаз, у-глутамилтранспептидазы, перекисное окисление липидов, процессы биоэнергетики в митохондриях печени крыс при интоксикации тетрахлормета-ном и 4-пентеноевой кислотой.

3. Сравнить терапевтические эффекты препаратов полифенолов при разных моделях повреждения печени.

Научная новизна. Впервые изучено влияние оригинальных гепатопротекторов экстрактов бадана толстолистного, виноградной косточки и референтного гепатопротективного средства силимарина на функциональное состояние митохондрий печени крыс при экспериментальных моделях патологии - активации перекисного окисления липидов и нарушении Р-окисления жирных кислот. Силимарин при обеих моделях патологии печени оказывает умеренный терапевтический эффект: только частично восстанавливает скорости дыхания и сопряженность окислительного фосфорилирования в митохондриях печени. Экстракт бадана толстолистного при нарушении Р-окисления жирных кислот нормализует скорости дыхания в митохондриях печени, но снижает эффективность окислительного фосфорилирования; при интоксикации тетрахлорметаном

экстракт бадана толстолистного не улучшает биоэнергетику печени. Наилучший терапевтический эффект при моделях патологии печени достигается при защите экстрактом виноградной косточки: скорости дыхания и сопряженность окислительного фосфоршшрования в митохондриях полностью нормализуются.

Практическая значимость работы. Экспериментально обоснована целесообразность включения экстрактов виноградной косточки и бадана толстолистного в комплексную терапию токсических поражений печени, сопровождающихся усилением перекисного окисления липидов и нарушением Р-окисления жирных кислот. Материалы диссертации включены в отчет о специфической активности экстрактов бадана толстолистного и виноградной косточки, подготовленный для проведения клинических испытаний этих гепато-протекторов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Усиление перекисного окисления липидов, вызванное интоксикацией тет-рахлорметаном, сопровождается активацией преимущественно быстрого метаболического кластера митохондрий печени, разобщением окислительного фосфорилирования, снижением продукции макроэргических фосфатов, усилением перекисного окисления липидов; через 2 нед. после прекращения инъекций тетрахлорметана прогрессирует угнетение как сукцинат-, так и НАД-зависимого путей окисления субстратов, происходит дальнейшее снижение энергизованности митохондрий, интенсивнее протекают реакции липопероксидации.

2. Нарушение р-окисления жирных кислот, вызванное введением 4-пентеноевой кислоты, характеризуется замедлением сукцинат- и НАД-зависимого дыхания; спустя 2 нед. после отмены гепатотоксина биоэнергетика митохондрий печени частично восстанавливается, хотя сохраняются разобщение окислительного фосфорилирования и сниженная энергизован-ность митохондрий.

3. При интоксикации тетрахлорметаном силимарин частично нормализуют активность дегидрогеназ, увеличивают сопряженность окислительного фосфорилирования, ингибируют перекисное окисление липидов в печени; экстракт бадана толстолистного не улучшает биоэнергетику митохондрий печени; экстракт виноградной косточки способствует полному восстановлению дыхательной функции митохондрий печени.

6

4. На фоне нарушения (3-окисления жирных кислот силимарин не в полной мере восстанавливает активность сукцинатдегидрогеназы, частично увеличивает сопряженность окислительного фосфорилирования; экстракты виноградной косточки и бадана толстолистного ускоряют утилизацию кислорода митохондриями печени, нормализуют сопряженность окислительного фосфорилирования.

Апробация и публикации. Основные положения диссертационной работы представлены на заседаниях кафедры фармакологии Сибирского государственного медицинского университета (2007, 2008), Республиканской научной конференции «Создание новых лекарственных средств» (Томск, 2007), IX конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2008). Материалы диссертации опубликованы в 5 научных статьях и материалах конференций, в том числе 1 статья опубликована в журнале, рекомендованном ВАК РФ для публикации результатов кандидатских диссертаций.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 8 глав, отражающих результаты экспериментальных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 112 страницах, иллюстрирована 12 таблицами и 9 рисунками. Библиография включает 165 источников, из них 45 - зарубежных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводили в зимне-весенний период на 360 беспородных крысах-самцах массой 200-220 г, полученных из клиники лабораторных животных НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН. Животные находились в стандартных условиях вивария при естественном освещении, свободном доступе к воде и пище. Все манипуляции (взвешивание, введение препаратов, декапитацию) осуществляли с 9 до 12 ч с целью исключения суточных влияний на метаболизм. Исследования выполняли в соответствии с рекомендациями «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических средств» (2005).

В работе использовали экспериментальные модели токсического гепатита, вызванные у крыс внутрибрюшинным введением тетрахлорметана (Владимиров Ю.А. и соавт., 1998) и 4-пентеноевой кислоты (Glasgow A. et al., 1975).

С 2-го дня после интоксикации крысам на протяжении 14 сут. вводили ежедневно внутрижелудочно сухой экстракт бадана толстолистного (50 мг/кг), виноградной косточки (50 мг/кг) или силимарин (70 мг/кг) в виде суспензии на 1% крахмальной слизи. Дозы гепатопротекторов являются эффективными терапевтическими. Контрольные животные получали 1% крахмальную слизь в эк-виобъемных количествах.

Виноградные косточки - отходы производства вина и сока, содержат ли-пиды, белки, углеводы и 5-8% полифенолов в зависимости от сорта винограда. Полифенолы виноградной косточки представлены галловой кислотой, флаво-ноидами (катехин, эпикатехин, галлокатехин), димерами, тримерами и более высокополимеризованными процианидинами (Baderschneider В. et al, 1999). Примененный в исследовании экстракт виноградной косточки предоставлен компанией OENO Consulting S.R.L. (Республика Молдова). Общее содержание полифенолов в экстракте составляет более 50%.

Бадан толстолистный - многолетнее травянистое растение семейства камнеломковых. Его листья содержат седогептулозу, витамин С, каротин, гидрохинон, арбутин, рододендрин, эллаговую кислоту, бергенин, экдистерон, дубильные вещества, свободную галловую кислоту, катехины, флавоноиды, лей-коантоцианиды (Смирнова Н.Б. и соавт., 1999). Экстракт бадана толстолистного стандартизирован по количеству флавоноидов: их общее содержание составляет не менее 70%.

Снлилшрин - препарат семян расторопши пятнистой. Действующими веществами силимарина являются флаволигнаны - силибин (два изомера), сили-дианин и силикристин, соотношение которых в препарате - 3:1:1. Силибин является основным изомером не только по количественному содержанию, но и по лечебному эффекту (Венгеровский А.И. и соавт., 1997; Белхушет С., 2006).

Крыс декапитировали под легким эфирным наркозом через 12 ч после последнего введения препаратов. Для исследований использовали гомогенат печени и сыворотку крови.

Функциональное состояние митохондрий гомогената печени крыс исследовали полярографическим методом (полярограф РА-2, Чехия) с помощью закрытого электрода Кларка лабораторного изготовления по скорости потребления кислорода в различных метаболических состояниях по В. Chance (Chance

В. et al., 1961). Исследование проводили в термостатируемой (t=26°C) ячейке оригинальной конструкции объемом 1 мл.

В качестве субстратов окисления использовали МО"3 M и 5-10"3 M сукци-нат, а также глутамат и малат по З'Ю"3 М. В работе использовали ингибитор аминотрансфераз - аминооксиацетат (АОА) (2-10-3 М), активатор сукцинатде-гидрогеназы (СДГ) - изоцитрат (1,5-10"3 М), и ее ингибитор - малонат (2-Ю3 М).

Моделирование метаболических состояний митохондрий сводится к варьированию содержания в среде инкубации субстрата, акцептора фосфата и кислорода. Нас интересовали преимущественно два метаболических состояния — четвертое и третье. Их принято считать соответственно состояниями метаболического покоя и активности. Основываясь на разработанной М.Н. Кондрашо-вой концепции о градациях метаболических состояний (Кондрашова М.Н., 1972), мы рассматривали отдельно состояние 4 до внесения АДФ (50 мкМ) и после окончания ее фосфорилировання: соответственно 4 покоя (4П) и 4 отдыха (40). Во всех измерениях абсолютные значения скоростей потребления кислорода митохондриями представлены в нг атомарного кислорода в мин (нг ат. О/мин). Регистрировали скорость дыхания митохондрий до (V4n), после (V4o) и во время цикла фосфорилировання добавленной АДФ (Уз). АДФ вносили в ячейку в количестве 200 мкМоль. Для оценки энергетического статуса рассчитывали коэффициенты стимуляции дыхания (СД=Уз/У4п), дыхательного контроля (ДК=\уУ4о) и сопряженности окислительного фосфорилировання (АДФ/О) (Chance В. et al., 1955)

Содержание в сыворотке крови глюкозы определяли натощак глюкозоок-сидазным методом, общего белка - биуретовым методом, общего и конъюгиро-ванного билирубина - модифицированным методом Йендрашика-Грофа, общего холестерина - энзиматическим колориметрическим методом, липопро-теинов высокой плотности (ЛПВП) - путем разделения липопротеинов в присутствии Мп2+. Активность аланинаминотрансферазы (АлАТ) и аспартатами-нотрансферазы (АсАТ) измеряли динитрофенилгидразиновым методом, у-глу-тамилтранспептидазы (ГТП) - L-у-глутамил-нитроанилиновым методом, щелочной фосфатазы (ЩФ) - по расщеплению n-нитрофенилфосфата в глициновом буфере, кислой фосфатазы (КФ) - по расщеплению л-нитрофенилфосфата в цитратном буфере (Камышников B.C., 2000).

Активность перекисного окисления липидов (ПОЛ) исследовали по скорости образования спонтанного и аскорбатзависимого малонового диальдегида (МДА), содержанию диеновых конъюгатов и оснований Шиффа (Владимиров Ю.А. и соавт., 1972).

Результаты обрабатывали методом парных сравнений по критерию Ман-на-Уитни. В практике медико-биологических исследований общеприняты 1% и 5% уровни значимости, характеризующие достоверные отличия между группами, которым соответствуют вероятности ошибочного вывода р < 0,01 и р < 0,05 (Хафизьянова Р.Х. и соавт., 2006).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При курсовом введении тетрахлорметана высокоактивные свободные радикалы СС1з» и С1*, образующиеся в результате метаболизма в микросомальной системе печени, способны индуцировать процессы ПОЛ в мембранах гепатоци-тов. Это приводит к накоплению липидных гидроперекисей, выходу продуктов липопероксидации в кровь, снижению активности антиоксидантной системы (Владимиров Ю.А. и соавт., 1998).

4-Пентеноевая кислота нарушает р-окисление жирных кислот в печени (Glasgow A. et al., 1975). Это вещество, связывая карнитин в неактивный комплекс, тормозит транспорт среднецепочечных и длинноцепочечных жирных кислот в митохондрии. Развивается цепь патологических изменений по типу жирового гепатоза с нарушением биоэнергетики дыхания.

При интоксикации тетрахлорметаном биохимические показатели нарушались по сравнению с показателями интактных животных. В крови активность АсАТ, АлАТ, ГТП, КФ и ЩФ увеличивалась в 1,3—1,9 раза; концентрация глюкозы снижалась на 13%, общего белка - повышалась на 9% (р < 0,05). Содержание общего холестерина достоверно не изменялось, количество ЛПВП возрастало в 2,2 раза, общего и прямого билирубина - в 2,3 и 3,6 раза соответственно. Скорость аскорбатзависимого и спонтанного образования МДА в печени повышалась в 1,5 и 2,4 раза. Концентрация диеновых конъюгатов стала больше в 2,6 раза, оснований Шиффа - на 30% (табл. 1).

Спустя 2 нед. после завершения инъекций тетрахлорметана функциональное состояние печени частично восстанавливалось. Активность АлАТ снижалась на 13%, КФ - на 34%, активность ГТП увеличивалась на 29%

(р < 0,05) по сравнению с активностью ферментов, определенной сразу после окончания инъекций гепатотоксина. Активность АсАТ достоверно не изменялась. Содержание глюкозы становилось выше в 1,5 раза, концентрация общего белка нормализовалась. Содержание общего холестерина и ЛПВП снижалось на 29 и 42% соответственно. Количество общего и прямого билирубина в крови уменьшалось в 1,5-1,8 раза. Липопероксидация в печени активировалась по сравнению с интенсивностью в остром периоде интоксикации. Образование МДА при аскорбатзависимом ПОЛ ускорялось дополнительно в 1,7 раза, при спонтанном ПОЛ - в 1,5 раза. Количество диеновых конъюгатов и оснований Шиффа стало больше в 2,1 и 1,2 раза соответственно (табл. 1).

Гепатопротектор силимарин, введенный крысам на протяжении 14 сут. после последней инъекции тетрахлорметана, оказывал терапевтическое воздействие, хотя нормализовались не все метаболические процессы. Лечение сили-марином сопровождалось снижением активности ЩФ и ГТП на 22-24% по сравнению с активностью у нелеченных животных. Концентрация прямого билирубина повышалась на 17% (р < 0,05). Остальные биохимические показатели под влиянием терапии силимарином статистически значимо не изменялись. Скорость продукции МДА в печени снижалась в 1,4-1,5 раза. Количество диеновых конъюгатов и оснований Шиффа становилось в 1,3-1,5 раза меньше, чем в отдаленный период интоксикации тетрахлорметаном у крыс, не получавших силимарин (табл. 1).

Под влиянием терапии экстрактом бадана толстолистного интоксикации тетрахлорметаном активность ЩФ в крови повышалась на 19%, активность ГТП - на 21%, содержание прямого билирубина увеличивалось на 20% (р < 0,05) Другие показатели функций и метаболизма печени были такими же, как у крыс, оставленных без терапии. ПОЛ при терапии экстрактом бадана протекало с такой же активностью, как при терапии силимарином. Скорость образования МДА в печени снижалась в 1,5-1,6 раза. Содержание диеновых конъюгатов и оснований Шиффа становились соответственно в 1,6 и 1,3 раза ниже, чем у животных, не защищенных гепатопротектором (табл. 1).

При действии экстракта виноградной косточки на печень отравленных тетрахлорметаном крыс активность АлАТ, ЩФ и ГПТ в крови уменьшалась на 1В, 46 и 48% соответственно. Концентрация глюкозы и ЛПВП снижалась на 13 и 24%, общего холестерина - повышалась на 34%. Количество общего билирубина в сыворотке крови становилось меньше на 8% (р < 0,05), прямого — увели-

11

чивалось на 38% по сравнению с показателями, определенными у крыс, оставленных без лечения после интоксикации тетрахлорметаном. Все биохимические показатели крови при терапии экстрактом виноградной косточки нормализовались. Экстракт виноградной косточки как сильный антиоксидант эффективно подавлял ПОЛ в печени. МДА при аскорбатзависимом ПОЛ продуцировался медленнее в 1,8 раза, при спонтанном - в 1,7 раза. Количество диеновых коньюгатов уменьшалось в 1,8 раза, оснований Шиффа - на 36% (табл. 1).

При сравнении функционального состояния печени на следующий день после окончания 7 введений 4-пентеноевой кислоты и у интактных животных отмечалось увеличение в крови активности аминотрансфераз на 35-53%. Активность ЩФ повышалась вдвое, КФ - в 1,5 раза, ГТП - на 67%. Содержание в крови глюкозы, общего белка и общего холестерина оставалось таким же, как в норме. Содержание ЛПВП, общего и прямого билирубина увеличивалось в 2,33,7 раза. Продукция МДА в гомогенате печени крыс при спонтанном ПОЛ ускорялась вдвое, при аскорбатзависимом - в 2,3 раза. Количество диеновых коньюгатов возрастало в 2,1 раза, оснований Шиффа - в 1,3 раза (табл. 2).

Через 2 нед. после прекращения инъекций 4-пентеноевой кислоты функциональное состояние печени крыс изменялось по сравнению с состоянием в остром периоде интоксикации. В крови активность АлАТ уменьшалась на 16%, КФ - на 37%, при этом активность КФ становилась такой же, как у интактных животных. Активность ГТП дополнительно увеличивалась на 20%, содержание общего белка не изменялось, содержание глюкозы возрастало на 47%. Количество в крови общего холестерина, ЛПВП, общего и прямого билирубина снижалось на 27-78%. Скорости образования МДА в печени при аскорбатзависимом и спонтанном ПОЛ дополнительно увеличивались на 67 и 29% соответственно. Содержание диеновых коньюгатов и оснований Шиффа повышалось соответственно в 2,3 раза и на 20% (табл. 2).

У животных, получавших силимарин при интоксикации 4-пентеноевой кислотой, функциональное состояние печени существенно не улучшалось. В крови активность ЩФ и ГТП снижалась на 17 и 24% соответственно, содержание глюкозы уменьшалось на 7% (р < 0,05). Уровень прямого билирубина повышался на 13% (р < 0,05). ПОЛ в гомогенате печени под воздействием сили-

Таблица 1

Влияние силимарина, экстрактов бадана толстолистного и виноградной косточки на перекисное окисление липидов в гомогенате печени на фоне введения тетрахлорметана (М ± т)

'Экспериментальные группы МДА, нмоль/(мг белка-мин) Диеновые копъюгаты, ед. ош нч. ПЛ./МГ липидов Основания Шиффа, отп. ед./мг липидов

Аскорбат-завпспмое Спонтанное

Интактные животные 0,25±0,03 0,13±0,01 0,24±0,03 1,85±0,10

Тетрахлорметан в течение 4 сут. 0,67±0,03' 0,31±0,07' 0,62±0,041 2,40±0,09'

Тетрахлорметан, спустя 14 сут. после окончания инъекций 1,14±0,07и 0,47±0,031>г 1,32±0,091Д 2,96±0,121,2

Силимарин 0,53±0,051_3 0,27±0,05и о,62±о 2,14±0,14]~3

Экстракт бадана толстолистного 0,51 ±0,031-3 0,24±0,041'3 0,60±0,081'3 2,23±0,111_3

Экстракт виноградной косточки 0,28±0,032-5 0,14±0,022"5 0,31±0,042-5 1,88±0,09м

Таблица 2

Влияние силимарина, экстрактов бадана толстолистного и виноградной косточки на перекисное окисление липидов в гомогенате печени на фоне экспериментального нарушения р-окисления жирных кислот, вызванного 4-пентеноевой кислотой (М ± т)

Экспериментальные группы МДА, нмоль/(мг белка-мин) Дпсновые копъюгаты, ед. оптнч. Ш1./МГ липидов Основания Шиффа, отн. ед./мг липидов

Аскорбат-зависнмое Спонтанное

Интактные животные 0,25±0,03 0,13±0,01 0,24±0.03 1,85±0,10

4-пентеноевая кислота в течение 7 сут. 0,58±0,01' 0,28±0,02' 0,51±0,07' 2,38±0,12'

4-пентеноевая кислота, спустя 14 сут. после окончания инъекций 0,98±0,051,2 0,3б±0,041,2 1,15±0,091Д 2,85±0,10''2

Силимарин 0,44±0,02'~3 0,18±0,02'"3 0,50±0,0б'~3 2,05±0,07'"3

Экстракт бадана толстолистного 0,48±0,011^1 0,21 ±0,051-3 0,55±0,071_3 2,19±0,091_3

Экстракт виноградной косточки 0,31 ±0,021-5 0,15±0,012"5 0,37±0,051-5 1,94±0,082'3,5

Примечание к табл. 1-2: р < 0,05• 1 - по отношению к интактным животным, 2 - по отношению к гепатотоксину в остром периоде интоксикации, 3 - по отношению к гепатоток-сину спустя 14 сут. после окончания инъекций, 4 - по отношению к силимарину, 5 - по отношению к экстракту бадана толстолистного Приведены средние данные 10 определений.

марина протекало с меньшей интенсивностью, чем в отдаленном периоде интоксикации 4-пентеноевой кислотой. Скорость образования МДА снижалась на 50-55%, содержание диеновых конъюгатов становилось меньше на 57%, оснований Шиффа - на 28% (табл. 2).

Экстракт бадана толстолистного при нарушении (3-окисления жирных кислот, вызванном 4-пентеноевой кислотой, оказывал такой же, как силимарин, терапевтический эффект. Активность ЩФ и ГШ в крови уменьшалась на 2024%, активность КФ повышалась на 13%. Уровень глюкозы снижался на 10% (р < 0,05). Содержание прямого билирубина было таким же, как у интактных животных. Скорость образования МДА в печени при аскорбатзависимом ПОЛ у животных, леченных экстрактом бадана, была немного выше, чем при введении силимарина, но на 51% ниже, чем у животных, не получавших экстракт. При спонтанном ПОЛ скорость образования МДА уменьшалась на 42%. Количество диеновых конъюгатов снижалось на 52%, оснований Шиффа - на 23% (табл. 2).

Экстракт виноградной косточки при интоксикации 4-пентеноевой кислотой улучшал функции печени более выраженно, чем другие гепатопротекторы. Только у животных, защищенных экстрактом виноградной косточки, активность аминотрансфераз в крови снижалась на 17-19% и становилась такой же, как у интактных крыс. Активность ГТП и ЩФ уменьшалась на 45^47%, активность КФ увеличивалась на 15% (р < 0,05). Содержание глюкозы и ЛПВП становилось ниже на 19-23% и приближалось к норме. Концентрация общего холестерина возрастала на 24%. Уровень общего и прямого билирубина не отличался от нормы. Терапия экстрактом виноградной косточки замедляла на 3258% (до нормы) образование в печени МДА при спонтанном ПОЛ и снижала концентрацию оснований Шиффа. Скорость продукции МДА при аскорбатзависимом ПОЛ уменьшалась на 32% и была ниже, чем при введении других ге-патопротекторов. Содержание диеновых конъюгатов снижалось на 68% (табл. 2).

При активации ПОЛ под влиянием тетрахлорметана энергопродукция в митохондриях печени переключалась на преимущественное образование и использование сукцината. При окислении эндогенных субстратов скорости дыхания митохондрий в состояниях покоя (У4п), активного фосфорилирования (У3) и отдыха (У4о) были на 19-34% выше показателей интактной группы, при окислении экзогенного сукцината они увеличивались на 18-33%, при окислении

14

НАД-зависимых субстратов малата и глутамата - не изменялись. Время фосфо-рилирования АДФ возрастало в среднем на 20%, коэффициент АДФ/О оставался таким же, как в норме (рис. 1).

После прекращения инъекций 4-пентеноевой кислоты значительно нарушалась биоэнергетика печени крыс. Скорости дыхания У4п, Уз и У4о при окислении эндогенных субстратов снижались на 10-20%, при окислении экзогенного сукцината - на 32-38%, при окислении НАД-зависимых субстратов малата и глутамата - на 33-48%. Время фосфорилирования АДФ становилось на 10-41% меньше, чем в контроле. Коэффициент АДФ/О увеличивался в среднем на 24%. Малонат, добавленный в среду инкубации с НАД-зависимыми субстратами, лишь незначительно снижал скорости дыхания митохондрий (рис. 2). Такие отклонения свидетельствуют о нарушении процессов окислительного фосфорилирования и снижении активности СДГ - ключевого фермента реакций быстрого метаболического кластера митохондрий.

Через 2 нед. после прекращения введения тетрахлорметана скорости дыхания митохондрий У4п, Уз и У4о становились на 31-43% меньше, чем в остром периоде интоксикации. Время фосфорилирования удлинялось в среднем на 47%, коэффициент АДФ/О не изменялся (рис. 1). В отдаленном периоде поражения печени 4-пентеноевой кислотой скорости дыхания во всех метаболических состояниях при окислении эндогенных субстратов, экзогенного сукцината и НАД-зависимых субстратов возрастали на 14-36% по сравнению со скоростями в группе животных с острой интоксикацией. Фосфорилирование АДФ незначительно замедлялось, коэффициент АДФ/О уменьшался на 10-23% (рис. 2). Нарушения биоэнергетики при ингибировании р-окисления 4-пентеноевой кислотой и усилении ПОЛ тетрахлорметаном несмотря на разнонаправленный характер обусловлены низкой энергизованностью митохондрий и разобщением окислительного фосфорилирования. При обеих моделях патологии печени ослаблялась способность митохондрий окислять сукцинат и НАД-зависимые субстраты вследствие значительного ингибирования СДГ ок-салоацетатом - продуктом окисления сукцината.

При интоксикации тетрахлорметаном терапия силимарином приводила к увеличению на 12-18% (р < 0,05) скоростей дыхания У4п, У3 и У4ов экспериментах с окислением эндогенных субстратов, добавленных сукцината и смеси глутамат + малат. Время фосфорилирования АДФ и коэффициент АДФ/О оста-

а о а. о с; о 2

120

100

Н 80

из ^ 8.! 5 =

с л

и о а.

о ^

О

60 40 ■

20

Время, с

-Интактныеживотные

---Тетрахлорметан втечение4 сут

Тетрахлорметан. спустя 14 сут после окончания инъекций ----Силимарин

Рис. 1. Влияние силимарина на окислительное фосфорилирование в митохондриях печени на фоне введения тетрахлорметана.

а — эндогенные субстраты, б - сукцинат 1 мМ, в -малат 3 мМ и глутамат 3 мМ, г - малат ЗмМ и глутамат 3 мМ с добавлением малоната 2 мМ

120

■3 о а. о с;

0 а а;

1 Е

?з

в ^ & *

с л

о а. о

100

80 ■

60 ■

40 ■

20

О

б

-

УЯ4-

Время, с

-Интактные жи вотные

---4-пентеноевая кислота в течение 7 сут

-4-пентеноевая кислота, спустя 14 сут после окончания инъекций

----Силимарин

Рис. 2. Влияние силимарина на окислительное фосфорилирование в митохондриях печени на фоне введения 4-пентеноевой кислоты.

а - эндогенные субстраты, б - сукцинат 1 мМ, в -малат 3 мМ и глутамат 3 мМ, г - малат 3 мМ и глутамат 3 мМ с добавлением малоната 2 мМ

вались на низком уровне (рис. 1). Экстракт бадана не оказывал достаточного лечебного эффекта. Скорости дыхания, время фосфорилирования и отношение АДФ/О при введении экстракта бадана были такими же, как у животных, не защищенных гепатопротекторами (рис. 3).

При дефекте (3-окисления жирных кислот, вызванном 4-пентеноевой кислотой, силимарин и экстракт бадана толстолистного значительно повышали энергизованность митохондрий печени, особенно в ответ на увеличенную субстратную нагрузку. При терапии силимарином скорости дыхания в митохондриях во всех метаболических состояниях повышались на 11-26% (р < 0,05) по сравнению со скоростями, измеренными через 2 нед. после завершения инъекций гепатотоксина у незащищенных гепатопротектором животных. Время фосфорилирования увеличивалось на 21-36% (рис. 2). Экстракт бадана оказывал более выраженный лечебный эффект, чем силимарин. При его введении скорости дыхания возрастали на 31-59%. Ингибиторный анализ показал, что терапия экстрактом бадана толстолистного приводила к положительному приросту скорости дыхания за счет активации быстрого метаболического кластера. На это указывало и значение коэффициента АДФ/О, которое находилось в пределах от 1,51 до 2,34 (рис. 4).

Экстракт виноградной косточки оказался наиболее эффективным корректором нарушений биоэнергетики печени при ингибировании р-окисления жирных кислот и активации ПОЛ. При введении этого экстракта дыхательная функция митохондрий печени и окислительное фосфорилирование в максимальной степени изменялись в сторону нормы. Скорости дыхания возрастали на 18-38%. Время фосфорилирования добавленной АДФ сокращалось на 921% (рис. 5, 6). Экстракт виноградной косточки не усиливал реакцию СДГ на увеличение субстратной нагрузки, а также уменьшал вклад НАД-Н-дегидрогеназы в дыхание митохондрий в тесте с добавлением малоната, что свидетельствует о тенденции к истощению системы энергопродукции. Судя по этим результатам, экстракт виноградной косточки нормализовал только окислительное фосфорилирование, не устраняя дефицит субстратов, в том числе ацетилкоэнзима А.

®

а о а.

о

5

X

м

х 2

1 =

с л

и о

а.

§

О

140 120 ■ 100 ■ 80 60 40 20

ГГ-

Время, с

-Интактныеживотные

---Тетрахлорметан втечение4 сут

Тетрахлорметан. спустя 14 сут после окончания инъекции ----Экстракт бадана толстолистного

Рис. 3. Влияние экстракта бадана толстолистного на окислительное фосфори-лирование в митохондриях печени на фоне введения тетрахлорметана.

а — эндогенные субстраты, б - сукцинат I мМ, в -малат 3 мЫ и глутамат 3 мМ, г - малат 3 мМ и глутамат 3 мМ с добавлением малоната 2 мМ

120

я а о о.

0 с

и г а

к £

1 2

55 10 1-:

о о а. о

100

80 •

60

40

20 ■

,----1 —1.;--- ;■ | • 1

г—1-а _|_1 __¡. г------1

Л

Время, с

-Интактныеживотные

---4-пентеноевая кислота в течение 7 сут

-4-пентеноевая кислота спустя 14 сут после окончания инъекции

----Экстракт бадана толстолистного

Рис. 4. Влияние экстракта бадана толстолистного на окислительное фосфори-лирование в митохондриях печени на фоне введения 4-пентеноевой кислоты.

а - эндогенные субстраты, б - сукцинат 1 мМ, в -малат 3 мМ и глутамат 3 мМ, г - малат ЗмМ и глутамат 3 мМ с добавлением малоната 2 мМ

ш Ч о о. о с; о

к ® = =

I 2

¡5

(О ^ & *

о о а. о

О

140 120 ■ 100 80 ■ 60 ■ 40 20 ■

0

б

Время, с

-Интактные жи вотные

---Тетрахлорметан в течение 4 сут

-Тетрахлорметан. спустя 14 сут после окончания инъекции

----Экстракт виноградном косточки

Рис. 5. Влияние экстракта виноградной косточки на окислительное фосфорили-рование в митохондриях печени на фоне введения тетрахлорметана.

а - эндогенные субстраты; б - сукцинат 1 мМ, в -малат 3 мМ и глутамат 3 мМ; г - малат 3 мМ и глутамат 3 мМ с добавлением малоната 2 мМ 120

И

о а. о с; о г

100

I 2

о> Г

5°

о.

(О

5 I

с

и о о. о

60

60

40 ■

20

О

Л,7

_1»

Время, с

-Интактныеживотные

---4-пентеноевая кислота в течение 7 сут.

-4-пентеноевая кислота, спустя 14 сут после окончания инъекции

----Экстракт виноградном косточки

Рис. 6. Влияние экстракта виноградной косточки на окислительное фосфорили-рование в митохондриях печени на фоне введения 4-пентеноевой кислоты.

а - эндогенные субстраты, б - сукцинат I мМ, в -малат 3 мМ и глутамат 3 мМ, г-малат 3 мМ и глутамат 3 мМ с добавлением малоната 2 мМ

Таким образом, полифенолы силимарина, экстрактов бадана толстолистного и виноградной косточки отличаются по влиянию на биоэнергетику печени при моделях ее токсической патологии. Их терапевтическая эффективность проявляется в различной степени в зависимости от механизма метаболических нарушений в гепатоцитах. Полифенолы экстракта бадана эффективнее силимарина улучшают биоэнергетику печени при экспериментальном ингибировании Р-окисления жирных кислот, но действуют слабее силимарина в условиях окислительного стресса. Это обусловлено тем, что при усилении ПОЛ для сохранения нормальной работы митохондрий необходима, прежде всего, целостность мембраны. Липофильные флаволигнаны силимарина накапливаются в липид-ном бислое мембран, связывают ионы железа в хелатные комплексы и подавляют образование продуктов липопероксидации (Куркин В.А., 2003). В результате этого механизма они препятствуют нарушениям митохондриального окисления в печени. Экстракт бадана не обладает подобными свойствами, а его ан-тиоксидантный потенциал не достаточен при интоксикации тетрахлорметаном. Полифенолы экстракта виноградной косточки превосходят полифенолы силимарина и экстракта бадана по способности улучшать сопряженность окисления и фосфорилирования в митохондриях печени.

выводы

1. Тетрахлорметан в остром периоде активации перекисного окисления липи-дов увеличивает скорости дыхания митохондрий печени, разобщает окислительное фосфорилирование; в отдаленном периоде повреждения печени скорости дыхания митохондрий снижаются, разобщение окислительного фосфо-рилирования усиливается.

2. 4-Пентеноевая кислота в остром периоде угнетения р-окисления жирных кислот снижает скорости дыхания митохондрий печени, разобщает окислительное фосфорилирование; в отдаленном периоде интоксикации скорости дыхания митохондрий повышаются, разобщение окислительного фосфори-лирования становиться более выраженным.

3. Гепатопротективная терапия силимарином, экстрактами бадана толстолистного и виноградной косточки на протяжении 14 сут. после прекращения инъекций тетрахлорметана и 4-пентеноевой кислоты сопровождается торможением липопероксидации в печени, уменьшением в крови активности ами-нотрансфераз, кислой и щелочной фосфатаз, у-глутамилтранспептидазы, содержания общего и прямого билирубина, липопротеинов высокой плотности.

4. Силимарин при интоксикации тетрахлорметаном и 4-пентеноевой кислотой способствует восстановлению активности сукцинатдегидрогеназы и увеличению сопряженности окислительного фосфорилирования в митохондриях печени.

5. При терапии экстрактом бадана толстолистного, проведенной после прекращения инъекций 4-пентеноевой кислоты, скорости дыхания митохондрий печени нормализуются, сопряженность окислительного фосфорилирования возрастает; применение экстракта бадана толстолистного при интоксикации тетрахлорметаном не приводит к улучшению биоэнергетики митохондрий печени.

6. Экстракт виноградной косточки в максимальной степени улучшает биоэнергетику печени животных, получавших тетрахлорметан и 4-пентеноевую кислоту, увеличивает активность сукцинатдегидрогеназы, скорость утилизации кислорода митохондриями и сопряженность окислительного фосфорилирования.

ПЕРЕЧЕНЬ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шутов Д.В. Сравнительная оценка гепатопротекторной активности экстрактов расторопши пятнистой и бадана толстолистного // Вестник РГМУ. -2007,-№2.-С. 332.

2. Шутов Д.В. Гепатопротективное действие экстракта бадана и силимарина при экспериментальном ингибировании р-окисления жирных кислот, вызванном 4-пентеноевой кислотой // Бюллетень сибирской медицины. -2007.-Т. 6, №4.-С. 64-70.

3. Шутов Д.В. Гепатопротективное действие силимарина и экстрактов виноградной косточки и бадана при патологии печени, вызванной ингибирова-нием р-окисления жирных кислот // Фармация и общественное здоровье: материалы конференции. -Екатеринбург: УГМА. -2008. - С. 167-168.

4. Шутов Д.В. Гепатопротективное действие силимарина и экстрактов виноградной косточки и бадана при патологии печени, вызванной интоксикацией тетрахлорметаном // Науки о человеке: материалы IX конгресса молодых ученых и специалистов. - Томск: СибГМУ. - 2008. - С. 120-121.

5. Shutov D.V. Hepatoprotective activity: comparative estimate of silymarin, bergenia crassifolia and grape seed extracts // Traditional medicine: a current situation and perspectives of development: Materials of the III International Scientific Conference. - Ulan-Ude: The Publishing House of the Ministry of Health of Buryatia. - 2008. - P. 73-74.

Отпечатано в ООО «Скан» г.Томск, пр Ленина, 133, тел.: 51-65-71 Заказ № 21.10.08, тираж 100 экз.