Автореферат и диссертация по медицине (14.03.02) на тему:Патоморфогенез токсических поражений печени, индуцированных полихимиотерапией и тетрахлорметаном, и их коррекция тритерпеновыми производными

На правах рукописи

Жукова Наталья Анатольевна

ПАТОМОРФОГЕНЕЗ ТОКСИЧЕСКИХ ПОРАЖЕНИЙ ПЕЧЕНИ, ИНДУЦИРОВАННЫХ ПОЛИХИМИОТЕРАПИЕЙ И ТЕТРАХЛОРМЕТАНОМ, И ИХ КОРРЕКЦИЯ ТРИТЕРПЕНОВЫМИ ПРОИЗВОДНЫМИ

14.03.02 - патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Новосибирск - 2012

Работа выполнена в ФГБУ Научно-исследовательском институте региональной патологии и патоморфологии Сибирского отделения РАМН (Новосибирск) и ФГБУН Новосибирском институте органической химии имени Н.Н.Ворожцова Сибирского отделения РАН (Новосибирск)

Научные консультанты:

доктор биологических нгук,

профессор Толстикова Татьяна Генрнховна

доктор медицинских наук Семенов Дмитрий Евгеньевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, Лапий Галина Анатольевна профессор заведующая лабораторией общей патологии и

патоморфологии ФГБУ «НИИ региональной патологии и патоморфологии» СО РАМН

доктор медицинских наук Кливер Евгений Эдуардович

ведущий научный сотрудник лаборатории патоморфологии и электронной микроскопии ФГУ «Новосибирский НИИ патологии кровообращения имени академика Е.Н.Мешалкина» МЗ РФ

доктор медицинских наук, Грек Олег Рувимович

профессор заведующий кафедрой фармакологии ГБОУ

ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» МЗ РФ

Ведущая организация:

ФГБУ «Научный центр клинической и экспериментальной медицины» СО РАМН (Новосибирск)

Защита диссертации состоится «_»_2013 г. в 10.00

на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 001.037.01 в ФГБУ «НИИ региональной патологии и патоморфологии» СО РАМН по адресу: 630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ региональной патологии и патоморфологии» СО РАМН.

Автореферат диссертации разослан « _ » _ 2013 г.

Ученый секретарь Совета по защите докторских

и кандидатских диссертаций Молодых Ольга Павловна Д 001.037.01 доктор биологических наук, профессор

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА _

201 а ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Печень является ключевым органом, обеспечивающим все энергетические и пластические потребности, осуществляет детоксикацию эндогенных и экзогенных веществ путем их трансформации в конечные продукты обмена. В связи с этим проблема токсического поражения печени становится все более актуальной. Наиболее частой причиной гепатотоксичности становится неконтролируемый прием лекарственных препаратов, биологически активных добавок, по-липрагмазия в терапии, а также интенсивные схемы полихимиотерапии в онкологии. Гепатотоксичность может имитировать различные формы поражения печени, приводя к затруднениям в постановке диагноза и своевременной их коррекции. Повреждение печени от субклинических форм до фульминантной печеночной недостаточности описано приблизительно для 1000 лекарственных средств.

Лекарственно-индуцированные поражения печени (ЛИПП) реализуются непосредственным действием лекарства или его реактивным метаболитом, образованным вследствие биотрансформации под влиянием семейства цитохромов, а также активацией Т-клеточного иммунного ответа. Ключевым звеном патогенеза ЛИПП являются оксидативный стресс, нарушения кальциевого гомеостаза и митохондриальная дисфункция с последующей инициацией повреждения и гибели гепатоцитов и развития реактивного фиброза. Деструкция паренхиматозных клеток печени является пусковым механизмом активации других клеточных популяций, которые могут инициировать воспалительную реакцию и/ или адаптивный иммунный ответ и препятствовать регенерации печени (Ивашкин В.Т. и др., 2009).

Особое место занимают ЛИПП у онкологических больных. Наличие опухолевого процесса, метастатическое поражение органа, имеющиеся заболевания печени и пожилой возраст больных являются отягчающим фактором при проведении комплексного лечения, включающего полихимио- и лучевую терапию. Токсические реакции при проведении химиотерапии реализуются через химические и иммунологические механизмы, носят кумулятивный характер, препятствуют проведению курсового лечения в установленные сроки, сопровождаются снижением эффективности цито-статической терапии и требуют постоянной коррекции гепатотропными средствами в межкурсовой период (Гершанович М.Л. и др., 1999).

Клинические признаки токсического поражения печени разнообразны по интенсивности и типу проявлений, зависят от вида токсического фактора, а также от времени его воздействия. Первичные токсические поражения печени вызывают разной интенсивности воспалительные процессы или разрастание соединительной ткани с возможным развитием цирроза и печеночной недостаточности. При всех токсических воздействиях изменяется функциональная активность гепатоцитов - основного структур-

ного компартмента печени, синусоидов, что проявляется альтеративными изменениями в органе начиная, с обратимых внутриклеточных (жировая дистрофия гепатоцитов, мутное набухание) до тяжелых интерстициаль-ных изменений (фиброз, инфильтраты, цирроз, гепатоцеллюлярный рак) (Серов В.В., Лапиш К., 1989).

Проблема лечения больных с ЛИПП и циррозами печени является одной из важнейших в современной медицинской практике. В комплексной терапии болезней печени различного генеза выделяют фармакоте-рапевтическую группу средств с избирательным защитным влиянием на печень - гепатопротекторов, которые повышают функциональную способность клеток печени к синтезу, детоксикации и выведению различных продуктов обмена, поддерживают устойчивость гепатоцитов к различным патологическим воздействиям, не обладают стимулирующим влиянием на рост опухолей (Гершанович M.JI. и др., 1999; Шульпекова Ю.О., 2006). В зависимости от химической структуры гепатотропных средств выделяют естественные или полусинтетические флавоноиды расторонши и других растений; препараты животного проихождения; эссенциальные фосфолипиды; препараты разных групп, включающие тиокговую, урсодеоксихолиевую кислоты и адеметионин - «золотой» стандарт гепатологии (Оковитый C.B., 2003).

В настоящее время группа гепатотропных средств интенсивно расширяется за счет появления новых препаратов синтетического и природного происхождения различных классов: кумаринов, сапонинов, флавоноидов, терпеноидов. Особое место в этом ряду занимают пентациклические три-терпеноиды лупанового ряда - легкодоступные растительные метаболиты. В многочисленных экспериментах установлено, что бетулин, бетулиновая кислота, лупеол обладают широким спектром фармакологической активности: противовоспалительной, антитоксической, иммуномодулирующей, противоопухолевой (Семенченко В.Ф., 1993; Толстикова Т.Г. и др., 2006; Yasukawa К. et al., 1991). Уникальным свойством данных соединений является сочетание цитотоксического действия на опухолевые клетки и низкой токсичности в отношении ^трансформированных клеток (Eiznhamer D.A., Ze-Qi Ни, 2004; Chaturvedy Р.К. et al., 2008). Хорошо изучены гепатозащитное и антиоксидантное действие бетулина, бетули-новой кислоты, бисгемифталата бетулина при токсических воздействиях. В основе геиатопротективного действия лежит способность производных бетулина регулировать состояние никотинамидных коферментов, процессы белкового синтеза, сохранять энергетический баланс клетки (Кузнецов Б.Н. и др., 1998; Карачурина Л.Т. и др., 2003).

В результате химических модификаций из бетулина путем одностадийного окисления получена бетулоновая кислота и ее синтетические производные. В экспериментальных исследованиях установлено, что бетулоновая кислота и ее производные обладают антиоксидантными, гепато-, нефро-, кардиопротекторными и умеренно выраженными противоопухолевыми

свойствами (Грек O.P. и др., 2005; Толстикова Т.Г. и др., 2006; Жоголь P.A., 2006). В результате скрининга выявлены наиболее перспективные агенты с широким спектром биологической активности - бетулоновая кислота, как основа, и ее амид (Сорокина И.В., 2010). До настоящего времени хорошо изучены противоопухолевые, антиоксидантные, органопротекторные свойства бетулоновой кислоты и ее амида, но за рамками нашего внимания до сих пор оставалось влияние этих соединений на процессы фиброгенеза, популяционную динамику гепатоцитов и на процессы регенерации печени. Решение данной проблемы связано с неизученными ранее механизмами протекторного действия и позволит расширить фармакологические свойства бетулоновой кислоты и ее амида.

Цель исследования: изучить патоморфогенез субхронического токсического поражения печени в условиях полихимиотерапии, сочетанного воздействия тетрахлорметана и этанола и при коррекции тритерпеновыми соединениями с оценкой возможных механизмов их действия.

Задачи исследования:

1. Изучить особенности влияния бетулоновой кислоты и ее амида при субхроническом введении на структурные компоненты печени интактных крыс.

2. Изучить морфологические изменения печени крыс при введении бетулоновой кислоты и ее амида на фоне полихимиотерапии (CHOP).

3. Оценить влияние бетулоновой кислоты и ее амида на митотическую активность перевиваемых опухолей лимфомы RLS, резистентной к ци-клофосфану, и карциномы легких Lewis.

4. Выявить характерные особенности общего и местного влияния перевиваемых опухолей лимфомы RLS и карциномы легких Lewis на течение апьтеративных процессов в печени мышей.

5. Изучить особенности структурной реорганизации печени животных с перевитыми опухолями (лимфомой RLS и карциномой легких Lewis) в сочетании с полихимиотерапией и при изолированном введении бетулоновой кислоты и ее амида.

6. Выявить особенности структурных изменений печени при моделировании хронических токсических повреждений печени сочетанным введением тетрахлорметана и этанола и оценить влияние бетулоновой кислоты и ее амида на степень коррекции фиброза, токсического поражения и популяционной динамики гепатоцитов в сравнении с гептралом.

7. Оценить возможные механизмы коррекции тритерпеновыми производными токсических поражений печени при проведении противоопухолевой терапии и сочетанном воздействии тетрахлорметаном и этанолом.

Научная новизна. Впервые изучены основные механизмы развития токсических поражений печени у экспериментальных животных при инокуляции штаммов злокачественных новообразований на фоне и без полихимиотерапии, а также при длительном воздействии тетрахлорметана

и этанола в сочетании с энтеральным введением бетулоновой кислоты и ее амида. Показано, что бетулоновая кислота и ее амид в условиях цито-статического воздействия не оказывают стимулирующего влияния на рост и метастазирование опухолей.

Впервые у животных с перевитой карциномой Lewis выявлены особенности струюурных изменений печени, заключающиеся в снижении пластических резервов гепатоцитов и поражении микроциркуляторного русла в виде стромально-сосудистой дистрофии в стадии фибриноидного набухания. Установлено, что амид бетулоновой кислоты при изолированном введении обусловливает уменьшение количества клеточных метастазов в синусоидах и потенцирует развитие генерализованной стромально-сосудистой дистрофии, в то время как бетулоновая кислота вызывает только очаговые повреждения сосудов. При сочетанном введении с цитостатиками бетулоновая кислота и ее амид проявляют цитопротекторные свойства, что способствует уменьшению выраженности регенераторно-пластической недостаточности гепатоцитов, нормализации количественных характеристик синусоидального русла.

Впервые представлены морфометрические характеристики паренхи-матозно-стромапьных изменений и динамика количественных изменений клеточных популяций печени при токсическом поражении печени, вызванном длительным введением тетрахлорметана в сочетании с этанолом. Показано, что по сравнению с гептралом амид бетулоновой кислоты практически полностью купирует явления холестаза, предотвращает развитие жировой инфильтрации гепатоцитов и полностью предотвращает развитие фиброза.

Впервые установлены различия в патогенезе гепатопротекторного действия бетулоновой кислоты и ее амида. Бетулоновая кислота в ранние сроки после введения способствует компенсации пластической недостаточности гепатоцитов, только частично купирует явления некробиоза и холестаза, существенно не стимулирует регенераторный потенциал гепатоцитов, что сопровождается активацией десмопластических процессов с развитием фиброза и цирроза печени. Амид бетулоновой кислоты одинаково эффективно на всех этапах эксперимента повышает регенера-торно-пластический потенциал гепатоцитов, купирует явления холестаза и полностью предотвращает процессы фиброгенеза.

Теоретическая и практическая значимость. В работе получены новые знания о структурной реорганизации печени при токсических повреждениях различного генеза, которые MOiyr быть использованы при разработке новых схем лечения злокачественных новообразований и хронических токсических гепатитов. Получены новые данные о влиянии бетулоновой кислоты и ее амида на течение регенераторно-пластических и десмопластических процессов при моделировании токсических повреждений печени сочетанным длительным введением тетрахлорметана и этанола. Выявлены закономерности тканевой реорганизации печени в

условиях комбинированного и изолированного введения цитостаггических препаратов и тритерпеновых производных.

Результаты исследования включены в материалы по доклиническим испытаниям новых корректоров токсического поражения печени различного генеза в ряду производных бетулоновой кислоты. Материалы данной работы могут быть включены в лекционный курс кафедр патологической анатомии и фармакологии медицинских вузов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. При субхроническом введении интактным крысам амид бетулоновой кислоты на ранних сроках эксперимента угнетает пластические (регенераторные) процессы с полной нормализацией их к концу эксперимента. Введение бетулоновой кислоты на всех этапах эксперимента приводит к уменьшению объема синусоидального русла, умеренному угнетению регенераторно-пластических процессов, на поздних сроках - инициирует деструктивные изменения гепатоцитов.

2. Бетулоновая кислота и ее амид не обладают стимулирующим влиянием на рост и метастазирование опухолей, а также уменьшают общее и местное влияние неопластического процесса в печени на фоне и без полихимиотерапии.

3. Амид бетулоновой кислоты на фоне сочетанного токсического воздействия (CCL4 и этанолом) полностью предотвращает развитие фиброза на всех этапах эксперимента, стимулирует регенераторно-пластические процессы в гепатоцитах, практически полностью купирует явления хо-лестаза и предотвращает развитие жировой инфильтрации гепатоцитов.

4. Амид бетулоновой кислоты купирует токсические поражения печени различного генеза, проявляя свойства универсального гепато-протектора.

Апробация работы. Результаты исследования доложены на III Всероссийской научной конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2007), III International Conference «Basic Science for Medicine» (Novosibirsk, 2007), III Съезде фармакологов России (Санкт-Петербург, 2007), II Международной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений» (Казахстан, Алматы, 2007), EHRLICH II, 2nd World Conference on Magic Bullets (Nürnberg, Germany, 2008), 2nd Annual Russian-Korean Conference «Current issue of natural products chemistry and biotechnology» (Novosibirsk,

2010), Международной конференции «Current topics in organic chemistry» (Novosibirsk, 2011), VI Всеукраинской научно-практической конференции с международным участием «Современные аспекты медицины и фармации (Украина, Запорожье, 2011), Международной конференции «Current Topics in organic chemistry» (Новосибирск, 2011), II международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (Санкт-Петербург,

2011), 72-й Всеукраинской научно-практической конференции молодых

учёных и студентов с международным участием «Медицина и фармация XXI столетия - шаг в будущее» (Украина, Запорожье, 2012), 4th Annual Russian-Korean Conference «Current Issue of Natural Products for Chemistry and Biotechnology» (Novosibirsk, 2012), VI региональной научно-практической конференции студентов, аспирантов, молодых ученых и учителей «Химическая наука и образование Красноярья» (Красноярск, 2012), XX юбилейной международной конференции и дискуссионном научном клубе «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 2012), IV съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012), ученом совете в НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 39 работ, из них 18 - в рецензируемых журналах по списку ВАК и в системе цитирования (библиографической базе) Web of Science; получены 7 патентов РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 283 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, 6 глав с результатами и обсуждением собственных исследований, выводов; иллюстрирована 13 таблицами, 186 микрофотографиями, 15 диаграммами. Список использованной литературы включает 168 работ отечественных и 95 иностранных авторов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследуемыми соединениями были новые полусинтетические три-терпеновые соединения лупанового ряда - бетулоновая кислота (3-оксо-20(29)-лупен-28-овая кислота) и ее пептидное производное, содержащее у атома С-28 Р-аланин - 3-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-аминопропионовая кислота. Данные соединения синтезированы из бепулина в лаборатории медицинской химии Новосибирского института органической химии имени академика Н.Н.Ворожцова СО РАН (зав. лаб. - д.х.н., проф. Э.Э. Шульц).

Лабораторные животные. Исследования проведены на 480 крысах-самках, массой 180 - 200 г, и 320 мышах-самцах массой тела 22 - 25 г (табл. 1), предоставленных лабораторией разведения экспериментальных животных Института цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск). Животных содержали в пластмассовых клетках (по 10-12 особей) в стандартных условиях вивария при естественном освещении на гранулированном комбикорме «ПК 120-3» («Лабораторснаб») и воде ad libitum. Перед декапитацией животных лишали корма на 12 ч, забор материала проводили в утренние часы. Все манипуляции с лабораторными животными проводили, соблюдая «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» (1986). Животных декапитировали под эфирным наркозом.

Цели исследования Вид животных Кол. жив-х

Исследование морфологических особенностей печени при длительном введении БК и АБК (острая и субхроничсская токсичность) Белые б/п мыши-самцы массой 18-22 г 100

Белые б/п крысы-самки массой 180-200 г 120

Исследование иммунотоксичности Мыши-самцы С57В1/6 массой 18-22 г 60

Исследование особенностей морфологических изменений печени при изолированном применении БК и АБК, а также на фоне полихимиотерапии (ПХТ) (CHOP) Крысы-самки популяции Вистар массой 180-200 г 70

Структурная характеристика первичного узла опухоли и печени экспериментальных животных с лимфомой RLS и карциномой легких Lewis при коррекции БК и АБК на фоне ПХТ и при изолированном применении Мыши-самцы линии CBA/Lac 60

Мыши самцы линии С57В1/6 100

Исследование влияния тритерпеновых соединений на процессы фиброгенеза, регенератор-но-пластический потенциал и популяционную динамику гепатоцитов при длительном воздействии тетрахлорметана с этанолом Белые беспородные крысы-самки массой 180-200 г 290

Итого: 800

Примечание. БК - бетулоновая кислота, АБК - амид бетулоновой кислоты.

Доза и способ применения исследуемых соединений. Исследуемые соединения растворяли ex tempore в водно-твиновом растворе (твин 80) и вводили внутрижелудочно в дозе 50 мг/кг через 24 ч после введения комплекса цитостатиков или тетрахлорметана (Сорокина И.В. и др., 2003). Контрольные группы животных получали эквивалентное количество во-дно-твиновой смеси в дни введения соединений.

Субхроническую токсичность изучали на здоровых крысах в условиях ежедневного пероралъного введения исследуемых соединений в течение 7, 14 и 40 дней. Острую токсичность изучали на неинбредных мышах. Токсикологические исследования проводили согласно «Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2005).

Оценку иммунотоксического действия проводили по параметру числа антителообразующих клеток (АОК) селезенки, реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к чужеродному антигену, показателя фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов. Препараты вводили внутрижелудочно (50 и 500 мг/кг) в объеме 0,2 мл/10 г, однократно. Контрольным животным в те же сроки вводили физиоло-

гический раствор. По окончании введения препаратов через сутки мышей иммунизировали Т-зависимым антигеном - ЭБ. Мышам С57В1/6 вводили внутрибрюшинно суспензию трижды отмытых в стерильном физиологическом растворе ЭБ в дозе, равной 2x10® ЭБ/мышь. Определение количества АОК у иммунизированных животных проводили через 4 суток после иммунизации.

Моделирование цитотоксического поражения органов. В качестве экспериментальной модели использовали классическую химиотерапевти-ческую программу CHOP: циклофосфан, доксорубицин, винкристин, пред-низолон, адаптированную для лабораторных животных (Каледин В.И. и др., 2000; Мишенина C.B. и др., 2002). Однократно внутрибрюшинно вводили комплекс цитостатических препаратов, в дозах равных 1/5 LD50 (Беленький JI.M., 1963). Дозы препаратов для крыс и мышей соответственно: циклофосфан («Биохимик» Саранск) - 21 и 50 мг/кг, доксорубицин («ЛЭНС-Фарм» Москва) - 2,1 и 4 мг/кг, винкристин («Гедеон Рихтер», Венгрия) - 0,04 и 0,1 мг/кг, преднизолон («Гедеон Рихтер», Венгрия) - 2,1 и 5 мг/кг массы тела (Мишенина C.B., 2002). Через 24 часа после введения цитостатиков в течение 14 дней вводили бетулоновую кислоту и ее аланинамидное производное. Животных выводили из эксперимента на 7 и 14 сутки.

Методы перевивки и характеристика опухолевых штаммов. В экспериментах использованы перевиваемые опухоли, различные по гистогенезу, чувствительности к цитостатикам и степени злокачественности, полученные из банка опухолей лаборатории регуляции экспрессии генов Института цитологии и генетики СО РАН (зав. лаб. - д.б.н. Т.И. Меркулова). Данные опухоли поддерживаются в асцитной форме серийными пассажами на сингенных животных, при внутримышечной перевивке растут н виде солидного узла, спонтанной регрессии не подвергаются.

Опухоли RLS и CLL перевивали всем животным в мышцу бедра (2x106 клеток в 0,1 мл физиологического раствора). Через 5-10 дней после перевивки опухолей RLS и CLL (при достижении опухоли 1 см3) мышей делили на 6 групп (по 10 особей в каждой) и две подгруппы. Мышам I подгруппы вводили в сочетании комплекс цитостатиков и через 24 ч тестируемые агенты, животные II подгруппы получали БК и ее амид в виде монотерапии. Животных выводили из эксперимента на 8-е сутки эксперимента декапитацией. Данный раздел выполнен совместно с сотрудниками лаборатории экспрессии генов Института цитологии и генетики СО РАН - к.б.н. Калединым В.И и к.м.н. Николиным В.П. (зав. лаборатории экспрессии генов - д.б.н. Т.И. Меркулова).

Моделирование фиброза печени сочетанньш введением ССЬ4 и 5% раствора этилового спирта. Токсическое поражение печени у всех животных моделировали путем внутрижелудочного введения СС14 в дозе 0,1 мл/кг в растворе растительного масла (0,3 мл/100 г) трижды в неделю в сочетании с 5% раствором этанола в качестве питья в свободном доступе на протяжении 6 нед. Все животные были разделены на 5 групп

по 15 особей в каждой. Животные I группы получали только СС14 с 5% этанолом (негативный контроль), II группы - препарат сравнения гептрал в дозе 6 мг/кг (референсная группа), III группы - бетулоновую кислоту (БК), IV группы - амид бетулоновой кислоты (АБК) в дозе 50 мг/кг. Позитивным контролем служили интакгные животные. БК, АБК и препарат сравнения гептрал вводили ежедневно со 2 по 6 неделю эксперимента (включительно). Две последующие недели (7, 8) служили восстановительным периодом. Животных выводили из эксперимента декапитацией через 3, 6 и 8 нед.

Для оценки популяционной динамики гепатоцитов и доли соединительнотканного компонента была проведена щелочная диссоциация печени (Семенова Л.А., Непомнящих Л.М., Семенов Д.Е., 1985). Клеточную суспензию окрашивали 30 мин 1%-ным раствором орсеина на 70%-ной уксусной кислоте, разводили дистиллированной водой до концентрации 5 мг/мл. Подсчет ядер гепатоцитов из одного образца ткани проводили в 6-ти последовательно заполняемых суспензией камерах Горяева. Рассчитывали п - число ядер гепатоцитов в 1 мг ткани, абсолютное число ядер (Ы), М - абсолютное число гепатоцитов.

Морфологическое исследование. Объектом для светооптического исследования были печень и мышца бедра задней лапы с перевитой опухолью. Органы фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. Для дальнейшей гистологической обработки вырезали из большой доли печени и мышцы бедра образцы толщиной 5 - 7 мм путем поперечного рассечения, подвергали стандартной обработке на гистологическом комплексе М1С1ШМ («Карл Цейс», Германия): обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации с последующей заливкой в парафиновые блоки.

Срезы толщиной 4-5 мкм изготавливали на ротационном микротоме НМ 3 3 5Е, окрашивали гематоксилином Лилли - Майера и 1 % эозином на автомате НМ8 70 (время окраски - 1 ч 15 мин). Проводили гистохимическое окрашивание печени: по методу ШИК - гематоксилин - оранжевый в, толуидиновым синим для выявления мукополисахаридов. Дня выявления соединительной ткани окрашивали по ван Гизону, Масону, Маплори и по Лилли; для выявления Ре3+ и желчных пигментов - по Перлсу и Штейну, для выявления фибрина срезы окрашивали по Зербино (Лилли Р., 1969; Коржевский Д.Э., Гиляров А.В., 2009).

Для исследования в световом микроскопе полутонких срезов брали образцы печени объемом 1 мм3 в количестве 7 - 8 от одного животного, фиксировали в 1% водном растворе 0з04 на фосфатном буфере, рН 7,2 - 7,4 (МП1опт§ в., 1962), затем обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации и заключали в эпоновые смолы (Уикли Б., 1975). Из каждого блока на ультрамикротоме ЬКВ получали полутонкие срезы (1 мкм), которые окрашивали по методу ШИК с докрасюой по методу Романовского. Полутонкие препараты были изготовлены в НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН под руководством проф. Непомнящих

Г.И. Полученные срезы исследовали в световом микроскопе Axioscop 40. Микрофотографии сделаны при помощи фотокамеры AxioCam MRc с использованием программного обеспечения AxioVision.

Морфометрический анализ срезов проведен при увеличении микроскопа х400 с использованием окулярной сетки на 289 точек (Перов Ю.Л., 1984; Непомнящих Л.М. и др., 1984; Автандилов Г.Г., 1990; Автандилов Г.Г., 2002; Непомнящих Л.М. и др. 2003). Подсчет проводили в 10 - 15 полях зрения каждого препарата от 10 животных в группе. В тканевом микрорайоне печени подсчитывали объемную плотность (Vv) гепато-цитов с дистрофическими и некротическими изменениями, синусоидов, клеточных метастазов и лейкоцитов в просвете синусоидов. В печени животных с токсическими повреждениями подсчитывали объемную и поверхностную плотность гепатоцитов, очагов некрозов, синусоидов и соединительной ткани.

Объемную плотность каждого структурного компонента в изучаемых органах определяли по его доле по формуле: Vv=x/n, где х - количество точек, приходящихся на определенный структурный компонент; п - общее количество подсчитанных точек (Автандилов Г.Г., 1990). Изменение объемной плотности в опытных группах выражали в процентах относительно контроля и референс-группы (группа с полихимиотерапией и группа с гептралом). Поверхностную плотность рассчитывали по формуле: Sv = 4-j/p'z; где j - число пересечений тестовых линий с поверхностью элементов; р - число точек сетки; z - длина тестовой линии.

Абсолютную массу тканевых компонентов печени с токсическим гепатитом вычисляли по формуле: m - M Vvi; где M - абсолютная масса печени. Площадь поверхности структурных элементов (S) вычисляли путем умножения поверхностной плотности элементов на объем ткани печени: S = SvV (Целлариус Ю.Г., Ерисковская Н.К., 1979).

В первичном опухолевом узле подсчитывали количество митозов и апоптозов на 1000 опухолевых клеток с определением апоптотического и митотического индекса.

Статистическую обработку данных проводили методами параметрической статистики с использованием пакета программ Microsoft Excel с определением среднего значения (М), ошибки среднего (m). Различия между группами оценивали с помощью критерия Стьюдента t. Результаты считали достоверными при р < 0,05.

Работа выполнена при финансовой поддержке Междисциплинарных проектов СО РАН № 54 «Научные основы разработки новых лекарственных препаратов. Перспективы использования возобновляемого сырья»; № 20 «Инновационные технологии лечения рака»; № 93 «Развитие исследований в области медицинской химии и фармакологии как научной основы разработки отечественных лекарственных препаратов»; № 104 «Поиск и создание новых препаратов для противоопухолевой терапии на основе модифицированных природных соединений».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние бетулоиовой кислоты и ее амида на динамику структурных изменении печени крыс при субхроническом введении. Структурные изменения печени интактных крыс под влиянием БК и ее амида, вводимые интактным крысам внутрижелудочно в дозах 50 мг/кг ежедневно, оценивали на 7-е, 14-е и 40-е сутки. Контрольной группе вводили растворитель - водно-твиновую эмульсию (табл. 2).

На протяжении субхронического эксперимента у контрольных животных архитектоника печени была сохранена, желчные капилляры, вены и артерии имели типичное строение, а признаки патологической инфильтрации и фиброза отсутствовали. Мелковезикулярная дистрофия регистрировалась в отдельных гепатоцитах перипортальных зон, некрозы выявлялись преимущественно моноцеллюлярные, без четкой локализации, часто наблюдались двухъядерные гепатоциты, в синусоидах определялись купферовские клетки без признаков повышенной активности и монону-клеарные лейкоциты (см. табл. 2).

При субхроническом введении БК на всех этапах эксперимента стимулирует развитие деструктивно-некротических изменений в печени, снижая регенераторный потенциал гепатоцитов. Морфометрический анализ позволил выявить отрицательную тенденцию в динамике отдельных структурных компартментов печени по сравнению с контролем и группой животных, получавших АБК. На 7-е и 14-е сутки после введения БК увеличивалась доля некрозов гепатоцитов, и незначительно уменьшалась доля гепатоцитов с мелковезикулярной липидной инфильтрацией в сочетании с очаговой гидропической дистрофией. Максимальное уменьшение численной плотности двухьядерных гепатоцитов на 41% наблюдалось на 14-е сутки, с незначительным увеличением их к 40-м суткам (см. табл. 2).

На фоне введения АБК выраженность структурных изменений незначительна на всех этапах эксперимента по сравнению с БК. Через 7 сут после введения АБК в паренхиме преобладали гепатоциты с мутным набуханием цитоплазмы, с увеличением доли клеточных некрозов. К 14-м суткам отмечается практически полное восстановление структуры паренхимы, с уменьшением доли некрозов и степени дистрофий, с максимальным восстановлением ее к 40-м суткам. В течение эксперимента под влиянием АБК численная плотность двухьядерных гепатоцитов превышает аналогичные показатели в группе животных, получавших БК (см. табл. 2).

Выявленные альтеративные изменения подтверждаются результатами электронно-микроскопического исследования, в которых установлено, что БК и ее амид на ранних сроках введения вызывают нарушение тонкой структуры митохондрий, повышение эндоцитозно-пиноцитозной активности, гипертрофию комплекса Гольджи в гепатоцитах, эндотелиоцитах и клетках Купфера с возвращением к норме ультраструктуры клеток, но с сохранением эндоцитозной активности синусоидальной плазмолеммы.

Таблица 2. Морфометрическое исследование печени интактных крыс в динамике введения бетулоновой кислоты и ее амида (М±ш)

Группы Сроки введения (сутки) Синусоиды Некроз гепатоцитов Дистрофия гепатоцитов Дву ядерные гепатоциты

Vv„ % Vv„ % Vv,-, % Naj

Интактный контроль 25,63*0,83 1,19±0,31 2,78±0,42 7,74±0,51

БК 7 23,11±0,30 1,53±0,21 2,08±0,21 5,22±0,44

14 25,73±0,23 2,68±0,18 3,50±0,86 4,57±1,00

40 22,66±0,28 2,33±0,39 1,54±0,34 5,67±0,42

АБК 7 25,00±0,27 1,68±0,2 1,12±0,24 6,82±0,66

14 23,84±0,38 0,77±0,09 3,64±0,43 6,36±0,25

40 22,02±0,44 0,82±0,17 0,97±0,52 7,70±0,53

Примечание, Vv, - объемная плотность структуры (%); Na; - количество на 1 ООО клеток.

На фоне введения АБК в гепатоцитах было отмечено появление крупных митохондрий (Непомнящих JI.M. и др., 2010; Сорокина И.В., 2010). Выявленные морфологические изменения не сопровождались повышением активности ферментов цитолиза, обмена билирубина, ЛДГ и щелочной фосфатазы. При этом установлено, что БК и ее амид на ранних сроках понижали спонтанное перекисное окисление липидов (СПОЛ) в микросомах печени крыс с дальнейшей их нормализацией и свидетельствует о способности БК и АБК включаться в биологические мембраны (Жоголь P.A., 2006; Семенченко В.Ф., 1993).

На основании этого можно сделать вывод о том, что метаболизм БК и АБК осуществляется не только в гепатоцитах, но и в купферовских клетках и эндотелиоцитах. На ранних сроках под влиянием АБК наблюдается развитие деструктивных реакций, с полной нормализацией регенераторных и пластических процессов к 40 суткам, что можно расценивать как адаптивную реакцию. При той же схеме введения БК выраженные деструктивно - некробиотические процессы на всех этапах эксперимента приводят к снижению регенераторного потенциала печени, что свидетельствует об ее гипоксическом поражении (Оковитый C.B., 2003).

Оценка влияния БК и ее амида на иммунную систему животных. Как известно, производные бетулина и бетулоновой кислоты обладают широким спектром фармакологической активности, в том числе и им-муномодулирующей (Карачурина Л.Т., 2004). В этой связи, было целесообразным изучение влияния БК и АБК на клеточный и гуморальный иммунитет. Оценка влияния препаратов на реакцию ГЗТ показала, что тестируемые вещества в дозах 50 и 500 мг/кг проявляют дозозависимый эффект (табл. 3).

Введение АБК в дозе 50 мг/кг стимулировало реакцию ГЗТ, 10-крагное увеличение дозы - вызывало достоверное снижение показателей реакции.

Таблица 3. Влияние БК и АБК на фагоцитарную активность макрофагов мышей линии С57В1/6, иммунизированных ЭБ при однократном введении (М±т)

№ группы Индекс реакции ГЗТ, ИР Кол-во макрофагов 1 млх 106 Фагоцитарная активность макрофагов (оптическая плотность при 620 нм)

спонтанный Фагоцитоз стимулированный ОЭБ

Контроль 12,3±1,0 4,1 ±0,2 0,14±0,01 0,16±0,01

АБК 50 16,4±1,2* 4,3±0,5 0,15±0,03 0,15±0,01

АБК 500 8,3±0,5* 5,0±0,8 0,14±0,02 0,14±0,01

БК 50 7,1 ±0,6* 5,1 ±0,5 0,13±0,01 0,12±0,0Г

БК 500 12,6±0,7 5,1±0,8 0,16±0,02 0,17±0,0132

Примечание. ' — достоверно относительно контроля; 3 - достоверно относительно БК - 50 мг/кг; 2 - достоверно относительно АБК - 500 мг/кг.

Таблица 4. Влияние БК и АБК на гуморальный иммунный ответ мышей линии С57В1/6, иммунизированных ЭБ при однократном введении (М±т)

Группы доза мг/кг Кол-во ЯСК/селезенку (хЮ6) Относительное число АОК Абсолютное число АОК

Контроль 115,7±10,6 278±70,2 30081±6805,1

АБК 50 105,0±13,5 137,2±41,3 15777±5997,3

АБК 500 127,0±22,5 248,4±85,6 25526±7696,6

БК 50 116,0±4,4 295,4±64,1 34333±7446,8

БК 500 102,4±5,4 199,1±35,3 21193±4444,5

Подавление реакции ГЗТ наблюдалось также при введении БК в дозе 50 мг/кг, а в дозе 500 мг/кг не наблюдалось влияния на степень реакции ГЗТ.

Под влиянием АБК наблюдалось снижение показателя фагоцитарной активности при введении большей дозы (500 мг/кг), а введение БК в этой дозе не вызывало изменения фагоцитарной активности макрофагов. АБК и БК не оказывали достоверного влияния на число АОК, рассчитанных на 106 клеток селезенки или на весь орган. Однако при введении АБК в дозе 50 мг/кг наблюдалось уменьшение в 2 раза как относительного, так и абсолютного числа АОК (табл. 4).

Результаты проведенного комплексного исследования позволяют сделать вывод, что БК и АБК обладают иммуномодулирующей активностью, не оказывают иммунотоксического действия, поскольку введение их в субтоксической дозе (1/10 от ЬЭ50) не индуцирует иммунодепрес-сивные эффекты. Особый интерес имеет прямая дозовая корреляция иммунодепрессивных эффектов на развитие реакции ГЗТ и влияния на фагоцитарную активность макрофагов, которая может свидетельствовать о возможной противовоспалительной активности препаратов.

Структурные изменения печени крыс в динамике коррекции бетулоновой кислотой и ее амидом при моделировании токсического поражения комплексом цитостатиков

Метаболизм цитостатиков схемы CHOP (циклофосфана, доксорубици-на, винкристина и преднизолона) осуществляется в печени под влиянием системы цитохрома Р-450 в митохондриях (Богуш Т.А. и др., 2002; Flowers J.L., Ludeman S.M., 2000). Известно, что токсические метаболиты инициируют процессы свободнорадикального окисления с развитием тканевой гипоксии, гепагопатий, токсических гепатитов и цирроза печени (Ивашкин В.Т. и др., 2009; Mimnaugh Е. et al., 1986). Морфологически это проявляется комплексом стереотипных повреждений: некрозом гепатоцитов, фиброзом, стеатогепатитом, веноокклюзионной болезнью, холестазом (Зборовский А.Б., Тюренков И.Н., 2003). Для изучения особенностей морфологических изменений печени при применении бетулоновой кислоты и ее амида в сочетании с цитостатиками использована адаптированная для лабораторных животных классическая схема полихимиотерапии CHOP (Каледин В.И. и др., 2000; Мишенина C.B. и др., 2002). Забор материала проводили на 7-е и 14-е сутки после однократного введения ПХТ.

В течение всего эксперимента выявлено, что печень интакгных животных имеет типичное строение без признаков деструкции, патологической инфильтрации и фиброза (табл. 5).

На 7-е сутки после введения ПХТ в печени крыс выявлялись маркеры токсического поражения гепатоцитов, нарушение кровообращения с дис-комплексацией печеночных балок, снижение регенераторной активности. В гепатоцитах центролобулярных зон наблюдалась мелковезикулярная липидная инфильтрация и мелкоочаговые некрозы. По сравнению с ин-тактным контролем в 15 раз увеличилась объемная плотность некрозов, в 30 раз - доля гепатоцитов с дистрофиями, в 2 раза уменьшилась численная плотность двухъядерных гепатоцитов. На фоне выраженного венозного полнокровия наблюдалось расширение и дилятация центральных вен, стаз эритроцитов, сужение синусоидов, доля которых уменьшилась в 2 раза (см. табл. 5). На 14-е сутки после ПХТ в печени нарастают явления регенераторно-пластической недостаточности с очаговой окклюзией ми-кроциркуляторного русла клетками моноцитоидноготипа. В гепатоцитах центролобулярных зон сочетаются средневезикулярная липидная инфильтрация с гидропической дистрофией и выявляются клетки с «песочными» ядрами. Доля мелкоочаговых некрозов гепатоцитов уменьшилась в 1,5 раза по сравнению с 7-ми сутками, но в 9 раз превышала показания ин-тактного контроля. На фоне венозного полнокровия отмечалась редукция синусоидального русла, численная плотность двухъядерных гепатоцитов увеличилась в 1,4 раза по сравнению с 7-ми сутками, но на 38% меньше аналогичных показателей интактного контроля, что свидетельствовало о снижении процессов регенерации.

Таблица 5. Результаты морфометрического исследования печени крыс, получавших бетулоновую кислоту и ее амид на фоне полихимиотерапии (М±т)______

Группы Сроки введения (дни) Синусоиды, % Некроз гепатоцитов, УУ, % Дистрофия гепатоцитов, УУІ5 % Двухъядер-ные гепатоциты, N31

Интактный контроль 25,6±0,83 1,2±0,31 2, 8±0,42 7,7±0,51

ПХТ (референс) 7 12,8±0,66' 17,9±0,75' 62^2,31' 3,5±0,56'

14 13,7±1,40' П.ЗіО.бО1 64,8±1,15' 4,8±0,46'

ПХТ + БК 7 19,8±0,62'-2 17,1±1,19' 30,3±4,991-2 5,4±0,71

14 21,5±1,082 17,2±0,632 15,6±0,60!'2 6,5±0,52

ПХТ + АБК 7 14,8±0,77' 9,1±0,881-2-3 зздьг.во1-2 3,4±0,51'

14 23,2±0,992 7,4±1,181-2'3 6,9±0,562

Примечание. 1,2>3 - изменения достоверны по отношению к группам с соответствующим номером при р < 0,05; Уу, - объемная плотность; Ыа, — количество на 1000 клеток.

Максимальные положительные сдвиги были наиболее выраженными у животных, получавших АБК. Через 7 сут введения АБК на фоне ПХТ преобладали гепатоциты с «мутным» набуханием цитоплазмы, в цен-тролобулярных зонах регистрировалась мелковезикулярная липидная инфильтрация. По сравнению с референс-группой (ПХТ) уменьшилась доля гепатоцитов с дистрофиями и некрозами на 45 и 50%, соответственно, что привело к увеличению объемной плотности синусоидов (см. табл. 5). На 14-е сутки после введения АБК на фоне ПХТ наблюдалась дальнейшая прогрессивная динамика репаративных процессов по сравнению с референс-группой и 7-ми сутками эксперимента в данной группе. При морфометрическом анализе выявлено уменьшение объемной плотности гепатоцитов с дегенеративно-некротическими изменениями на фоне увеличения на 69% объемной плотности синусоидов. На всех сроках эксперимента АБК оказывал стимулирующее влияние на фагоцитарную активность: появление в просвете синусоидов лимфоцитов и купферовских клеток. Особенно выражено стимулирующее влияние АБК на процессы клеточной регенерации: численная плотность двухъядерных гепатоцитов увеличилась в 2 раза по сравнению с референс-группой и 7-ми сутками эксперимента (см. табл. 5).

При введении БК на фоне ПХТ наблюдалось частичное купирование альтеративных процессов с усилением цитотоксического действия в виде увеличения некротических поражений гепатоцитов и незначительным уменьшением степени дистрофий. На 7-е сутки в гепатоцитах центро-лобулярных зон обнаружено сочетание мелко- и средневезикулярной липидной инфильтрации. Моноцеллюлярные некрозы выявлялись на границе перипортальных и центролобулярных зон, умеренно был выражен клеточный и ядерный полиморфизм гепатоцитов с достаточно сохранной

популяцией двухъядерных клеток. На 14-е сутки после введения БК на фоне ПХТ в гепатоцитах наблюдалось сочетание липидной и гидропи-ческой дистрофии и незначительное увеличение численной плотности двухъядерных гепатоцитов. Некрозы и единичные постнекротические гранулемы, инфильтрированные мононуклеарными клетками, локализовались на границе перипортальных и центролобулярных зон. Синусоиды были незначительно расширены, полнокровны, увеличивалась в 2 раза их объемная плотность. В просвете синусоидов наблюдались лимфоциты и купферовские клетки с признаками повышенной активности (см. табл. 5).

Следует особо подчеркнуть, что на всех этапах исследования введение БК на фоне ПХТ сопровождалось увеличением объемной плотности некрозов гепатоцитов (см. табл. 5). Электронно-микроскопическое исследование позволило установить, что данная особенность на ранних сроках введения БК на фоне циклофосфана связана с изменениями тонкой структуры митохондрий с редукцией крист, расширением гранулярной эндоплазматической сети с нормализацией при дальнейшем введении ультраструктуры одних гепатоцитов и усилением повреждения в других (Сорокина И.В., 2010). Введение АБК на фоне ПХТ приводит в нормализации ультраструктуры клеток, отличительной особенностью которых было появление крупных митохондрий с повышением эндоцитозной активности (Непомнящих J1.M. и др., 2010). В основе цитотоксического действия БК лежат универсальные механизмы повреждения клеток печени: влияние на митохондрии, провокация окислительного стресса, подавление ß-окисления жирных кислот, подавление синтеза белка в клетке и транспорта желчных кислот, иммуноаллергические реакции. Каскад метаболических реакций сопровождается снижением продукции аденозин-трифосфата (АТФ) недостаток которого, запускает процессы элиминации клеток по некротическому пути (Душников Е.Ф., Абросимов А.Ю., 2001).

Таким образом, однократное введение животным комплекса цитостати-ков привело к развитию гепатоза. Тритерпеновые соединения на фоне ПХТ оказали разнонаправленное влияние на течение репаративных процессов. АБК наиболее эффективно нормализует количественные параметры микроциркуляторного русла, улучшая тем самым транссинусоидальный обмен, стимулирует фагоцитарную активность купферовских клеток, регенераторные и синтетические процессы в гепатоцитах. Тогда как, БК нормализует количественные показатели микроциркуляторного русла, проявляет цитотоксическое действие, индуцируя некрозы гепатоцитов.

Влияние тритерпеновых соединений на морфологию перевиваемых опухолей мышей - лимфому RLS и карциному легких Lewis на фоне н без полихимиотерапии

Морфологическое и морфометрическое исследование проведено на опухолях с различной чувствительностью к цитостатической терапии с це-

Таблица 6. Влияние бетулоновой кислоты и ее амида на митотическую активность в первичном узле лимфомы RLS на фоне и без полихимиотерапии (ПХТ) (М±ш)_

Группа Апоптозы, Na; Некрозы, Vv Митозы, Na,

1. Контроль(опухоль) 1,18±0,1 1,16±0,19 2,39±0,15

2. Опухоль + ПХТ (CHOP) 3,11±0,67* 3,82±0,76* 1,69±0,18*

3. Опухоль + ПХТ+БК 2,96±0,31 * 0,84±0,10*" 1,76±0,15*

4. Опухоль + ПХТ+АБК 6,86±0,58"* 0,92±0,09*" 0,63±0,1Г"

5. Опухоль + БК 1,92±0,26 1,51±0,15 1,78±0,07*

6. Опухоль + АБК 4,54±0,24* 0,56±0,22*" 1,02±0,15*#

Примечание. 'т - р < 0,05 относительно I и II группы соответственно; Ыа, - количество на 1000 клеток; Уу - объемная плотность.

лью определения влияния на митотическую и апоптотическую активность тритерпеновых соединений на фоне полихимиотерапии и в ее отсутствие.

Структурные изменения в опухолевой ткани мышей с лимфомой RLS под влиянием бетулоновой кислоты и ее амида на фоне и без полихимиотерапии. Лимфома RLS является субштаммом мышиной лимфомы LS, первично индуцированной у мышей линии СВА нитрозометилмочеви-ной. Устойчивость к циклофосфану достигнута в результате воздействия цитостатика на рецидивы лимфомы LS при постепенном повышении дозы циклофосфана с 10 до 200 мг/кг. В результате этого лимфома RLS приобрела перекрестную устойчивость и к другим алкилирующим препаратам, а также и к адриамицину (Гришанова А.Ю. и др., 2005).

Опухоль RLS не имеет четко выраженной структуры, состоит из властных клеток различных типов, с ярко выраженным клеточным и ядерным полиморфизмом (овальные, круглые, угловатые, расщепленные), которые находятся в активном митотическом делении. Численная плотность митозов (2,39) в опухоли контрольных животных превалирует над апоп-тотической активностью (1,18) (табл. 6). Преобладающими клеточными элементами являются большие центроциты, центробласты, гигантские многоядерные клетки, типа Рид - Штернберга. Размеры клеток лимфомы RLS с обильной цитоплазмой больше, чем у клеток крупноклеточных лимфом. В центральной части опухоли наблюдается массивный распад тканей с кровоизлияниями. В зонах инфильтративного роста выражено образование периваскулярных муфт, с микроэмболами из опухолевых клеток в капиллярах. Среди клеток встречаются макрофаги, создавая впечатление картины «звездного неба». Данная опухоль относится к классу диффузных крупноклеточных B-клеточных лимфом центроцитоидного подтипа. Этот подтип опухоли характеризуется агрессивным течением и относительной резистентностью к противоопухолевой терапии. Мета-стазирует опухоль гематогенно в печень и почки с образованием крупных опухолевых инфильтратов.

Однократное введение ПХТ (референс-группа) животным с лимфомой RLS оказало слабо выраженное влияние на митотическую активность, но стимулировало апоптотическую активность в клетках опухоли (на 30% уменьшился МИ, а численная плотность апоптотических телец превышала аналогичные показатели в контрольной группе на 163%). Данные процессы сопровождались увеличением объемной плотности некрозов в опухоли на 229% (см. табл. 6). Эти данные подтверждаются исследованием, в котором установлено, что лимфома RLS резистентна к индукции апоптоза, и противоопухолевый эффект может реализоваться только через цитостатическое и некрогенное действие (Каледин В .И. и др., 2003; Усова Т.А. и др., 2003).

Амид бетулоновой кислоты, введенный в схему терапии, оказал индуцирующее влияние на активность цитостатиков. Так, численная плотность митозов уменьшилась на 74% по сравнению с контролем и на 63% по сравнению с референс-группой (ПХТ). Численная плотность апоптотических телец в основном опухолевом узле увеличилась на 481% по сравнению с контролем и на 110% по сравнению с референс-группой (см. табл. 6). При изолированном введении АБК зарегистрировано наиболее выраженное индуцирующее влияние на процессы апоптотической гибели опухолевых клеток по сравнению с контролем и референс-группой (ПХТ).

БК на фоне ПХТ и при изолированном применении не оказала ярко выраженного индуцирующего влияния на процессы гибели опухолевых клеток. В этой группе, мы наблюдаем, незначительное уменьшение ми-тотической активности с превалированием доли некротической и апоптотической активности в опухоли только по сравнению с контролем (см. табл. 6).

Структурные изменения в опухолевой ткани мышей с карциномой легких Lewis под влиянием бетулоновой кислоты и ее амида на фоне и без полихимиотерапии. Карцинома легких Lewis характеризуется хорошей чувствительностью к циклофосфану, после перевивки в мышцы бедра растет в виде солидного узла, спонтанной регрессии не подвергается. Зоны роста находятся по периферии опухоли в виде тонких межмышечных тяжей с активным делением клеток. Строма опухоли пронизана многочисленными капиллярами синусоидного типа, образована преимущественно эпителиоидными клетками. Опухолевые клетки находились в активном митотическом делении, популяция их характеризовалась выраженным ядерным и клеточным полиморфизмом. В центральной части опухоли наблюдались массивные очаги некроза и распада с кровоизлияниями. В просвете капилляров и сосудов выявлялись эмболы из опухолевых клеток, которые метастазировали гематогенно преимущественно в легкие, в виде узлов различной величины; в печени - выявлялись в портальных трактах и синусоидах в виде мелкоочаговых клеточных метастазов.

После ПХТ и введения тестируемых соединений опухоль подвергалась распаду практически полностью. Через 48 ч после ПХТ количество

Таблица 7. Влияние бетулоновой кислоты и ее амида на митотическую активность в первичном узле карциномы легких Lewis на фоне и без полихимиотерапии (ПХТ) (М±т)

Группа Апоптозы, Na, Некрозы, Vv,% Митозы, Naj

I - Контроль (опухоль) 1,68±0,22 22,04±4,79 2,37±0,64

II - Опухоль + ПХТ 5,66±0,99* 16,92±2,77 1,10±0,45

III - Опухоль + АБК 8,01±0,78*" 13,16±2,77 0,54±0,19*

IV- Опухоль + БК 3,15±0,45* 9,06±1,13 2,03±0,45

Примечание, р < 0,05** - относительно I и II группы. Ыа, - количество на 1000 клеток; Уу - объемная плотность.

апоптотических клеток в опухоли увеличивалось на 226%, а митотическая активность уменьшалась на 54% по сравнению с контролем (табл. 7).

АБК в сочетании с ПХТ и при изолированном применении оказал ярко выраженное индуцирующее влияние на процессы апоптотической гибели клеток и ингибирующее влияние на митотическую активность, что проявилось снижением митотического индекса и увеличением апоптотической активности на 376% по сравнению с контролем и референс-группой (см. табл. 7).

Бетулоновая кислота в сочетании и без ПХТ не оказала значимого влияния на митотическую активность. На фоне введения БК отмечен незначительный рост апоптозов на 87% по сравнению с контролем и на 46% по сравнению с группой животных, получавших цитостатическую терапию.

Апоптогенное действие препаратов сопровождалось снижением концентрации основного провоспалительного цитокина - IL-ip, после введения БК и АБК. Тогда как, на фоне введения циклофосфамида, реализующего свой противоопухолевый эффект на данных моделях через апоптоз и некроз, сохранялись высокие концентрации данного цитокина. Это, вероятно, связано с важной ролью в инициации воспаления IL-1 р, который активирует эндотелий и лейкоциты, усиливая экспрессию адгезивных белков, оказывает стимулирующее влияние на нейтрофилы, увеличивая уровень продукции фагоцитами активных форм кислорода. Проапоптотическое действие АБК связано со снижением концентрации как, макрофагальных цитокинов - IL-1 р и ФНО-а, так и IL-4, ответственного за гуморальный иммунитет (Позднякова C.B., 2007).

Таким образом, установлено, что тритерпеновые соединения в сочетании и без ПХТ не оказывают стимулирующего плияния на рост перевиваемых опухолей лимфомы RLS и карциномы Lewis. АБК потенцирует действие ПХТ в опухолях с различной чувствительностью к циклофос-фану. При изолированном введении АБК оказывает более выраженное индуцирующее влияние на процессы программируемой гибели клеток опухолей лимфомы RLS и карциномы легких Lewis. Этот вывод под-

тверждается многочисленными исследованиями, в которых установлено, что производные бетулина проявляют синергическое действие с различными химиопрепаратами (доксорубицином, этопозидом, цисплатином, таксолом, актиномицином D), направленное на повышение апоптоза и подавление клоногенного окружения клеток опухоли (Fulda S. et al., 2005). Противоопухолевое действие тритерпеновых соединений реализуется через индукцию ими внутреннего митохондриального пути апоптоза, не зависящего от внешнего, связанного с экспрессией р53 и CD95/FasL, что характерно для большинства противоопухолевых препаратов (Zarec J. et al., 2003; Eiznhamer D.A., Ze-Qi Hu, 2004).

Патоморфологическое исследование печени при моделировании опухолевого поражения органа в динамике коррекции бетулоновой кислотой и ее амидом на фоне и без полихимиотерапии

Наличие злокачественной опухоли в организме человека и животных является пусковым механизмом активации процессов перекисного окисления липидов, приводя, в конечном итоге, к развитию тканевой гипоксии (Кавецкий P.E., 1977; Колганов A.C., 2001; Capel J. et al., 1982). Опухолевая гипоксия вызывает ингибирование системы монооксигеназ печени, играющих важную роль в процессах метаболизма, выведения токсических продуктов распада (Богуш Т.А. и др., 2002; Зборовский А.Б, Тюренков И.Н., 2003; Лопаткина Т., Бурневич Э., 2003). Это проявляется ослаблением клеточного дыхания, усилением гликолиза, снижением процессов энергетического обмена, развитием пластической недостаточности гепатоцитов (Лукьянова Л.Д., 1985). Морфологически это проявляется дистрофическими изменениями паренхиматозных клеток, тромбозами мелких сосудов, геморрагиями, отеком эндотелия и сосудистой стенки с выходом форменных элементов за пределы сосудистого русла, что является отягчающим фактором при проведении полихимиотерапии (Кипиани В.А., Гамбашидзе К.Г. и др., 2006).

Структурная характеристика печени экспериментальных животных с лимфомой RLS при коррекции производными бетулоновой кислоты на фоне и без ПХТ. Характер и выраженность морфологических изменений печени животных с лимфомой RLS определяются типом опухоли (резистентность к ПХТ) и объемом метастазирования.

У животных всех групп с перевитой лимфомой RLS (контроль) (табл. 8) степень морфологических изменений печени определяют обширные опухолевые инфильтраты. Лимфомные клетки выходят за пределы пограничной пластинки, диффузно инфильтрируют синусоидальные пространства, находятся в активном митотическом делении. Обширная опухолевая инфильтрация портальных трактов приводит к сдавлению долек с развитием выраженных явлений внутри и внепеченочного холестаза: диффузное пропитывание гепатоцитов желчными пигментами, в резуль-

Таблица 8. Морфометрическое исследование печени животных с перевитой лимфомой RLS при коррекции БК н АБК на фоне и без полихимиотерапии (ПХТ) (М±т) _

Группа Объемная плотность структурных компонентов печени (%)

Дистрофии Некрозы Синусоиды Метастазы

Контроль(опухоль) 58,8±0,11 20,1±0,3 11,6*0,09 7,7*0,09

ПХТ 42,7±0,2** 36,3±0,11** 9,9*0,1 8,6*0,14

ПХТ + АБК 54,4*0,13** 13,4*0,09*** 13,5*0,13 19,9*0,14

ПХТ + БК 48,4±0,23* 12,2*0,1"*** 10,8*0,12 28,7*0,3

Опухоль + АБК 58±0,12 21,7±0,22 13,5*0,08 9,06*0,06

Опухоль + БК 44,6*0,015'" 30,5*0,13' 12,7*0,07 12,3*0,14

Примечание. * - р < 0,05;** - р < 0,01; ***р < 0,001 - относительно контрольной группы; **-p<0,01;***-p< 0,001 - относительно референс-группы (ПХТ).

тате которого они приобретают коричневую окраску и так называемую «ворсистую дегенерацию». При «ворсистой дегенерации» цитоплазма гепатоцитов просветлена, имеет выраженный сетчатый рисунок. Пери-фокально вокруг опухолевых инфильтратов и в паренхиме выявляются некрозы гепатоцитов с умеренной лимфогистиоцитарной инфильтрацией. В гепатоцитах умеренно выражены явления пластической недостаточности: содержание гликогена резко снижено или полностью отсутствует. В центральных венах и синусоидах наблюдаются отложения фибрина в виде ШИК-положительной субстанции.

Лимфопролиферативные заболевания приводят к развитию гепатопа-тий с холестазом, который обусловлен как внутри, так и внепеченочными факторами вследствие перипортальной и портальной инфильтрации лимфомными клетками (Подымова С.Д., 1998; Серов В.В., Лапиш К., 1989). Компоненты желчи (гидрофобные желчные кислоты, билирубин, холестерин) оказывают токсическое действие на гепаггоцит, в частности, на его митохондрии, прямо или опосредованно блокируя дыхательный цикл и окисление жирных кислот (Данченко Е.0,2001; Никифоров Н.Д. и др., 2003). Желчные кислоты и продукты обмена билирубина стимулируют включение в их избыточный метаболизм купферовских клеток, приводя к развитию ворсистой дегенерации цитоплазмы гепатоцитов, что является прогностически неблагопрятным признаком (Мухина Ю.Г. и др., 2005; Hofmann A.F., 2000). По данным литературы, «ворсистая дегенерация цитоплазмы» является следствием жировой дегенерации печени и характеризуется наличием в цитоплазме несливающихся капель жира (пенистые гепатоциты) (Яюовенко Э.П. и др., 2003).

Однократное введение комплекса цитостатиков (рефсренс-группа) усугубляет течение гепатопатии с превалированием некротических изменений, доля которых увеличилась на 72 % (см. табл. 8). Крупно- и мелкоочаговые некрозы локализовались во всех отделах паренхимы, а

моноцеллюлярные, коагуляционные - по периферии крупных метастазов. В гепатоцитах тотальная крупно- и мелковезикулярная липидная инфильтрация сочетается с гидропической дистрофией и полным отсутствием гликогена. Часто выявляются гепатоциты с оптически пустыми (перстневидными) ядрами. У большей части животных сохраняются выраженные явления холестаза: ворсистая дегенерация гепатоцитов и пропитывание их желчью. Объемная плотность гепатоцитов с дистрофиями уменьшилась на 28% по сравнению с контролем. На фоне очагового венозного полнокровия объем синусоидального русла уменьшился на 15%. Синусоидальные пространства сужены, в их просвете выявлялись клетки опухоли, которые находились в активном митотическом делении, немногочисленные купферовские клетки с ШИК-позитивной цитоплазмой и отложения фибрина.

После введения животным тритерпеновых соединений на фоне ПХТ наблюдается мозаичный характер патологических изменений, обусловленный, прежде всего, различными свойствами БК и АБК, а также плотностью метастатического поражения. В гепатоцитах отмечается сочетание очаговой гидропической дистрофии с мелковезикулярной липидной инфильтрацией. Увеличение объемной плотности гепатоцитов с дистрофиями более выражено у АБК (28% - АБК и 13% - БК). В гепатоцитах отмечается появление гликогена в виде мелкой зернистости в перипортальных зонах, что является признаком частичного восстановления пластических резервов гепатоцитов. В паренхиме преобладают коагуляционные моноцеллюлярные и очаговые колликвационные некрозы гепатоцитов без четкой локализации. По периферии крупноочаговых метастазов выявляются гепатоциты в состоянии ацидофильной дегенерации. После введения АБК зарегистрировано наибольшее уменьшение объемной плотности некрозов на 50% (БК на 23%) по сравнению с референс-группой. Объемная плотность синусоидов увеличилась под влиянием АБК на 40% и на 20% - БК. На фоне ПХТ в сочетании с АБК и БК выявлено увеличение объемной плотности клеточных метастазов в просвете синусоидов на 47 и 31% соответственно (см. табл. 8). Эта особенность объясняется замещением злокачественными лимфоидными клонами лимфоцитарной синусоидальной инфильтрации, трудно отличимой от круглоклеточного воспалительного инфильтрата при лимфопролиферативных заболеваниях (Серов В.В., Лапиш К., 1989; Подымова С.Д., 1998).

При изолированном введении БК и АБК потенцируют повреждающее влияние опухоли в печени, снижая при этом степень деструкции гепатоцитов. В данном случае БК также проявляет цитотоксические свойства, приводя к увеличению объемной плотности некрозов гепатоцитов на 50%, с уменьшением на 24% доли гепатоцитов с дистрофиями. Гепатоциты находились в состоянии мелковезикулярной жировой и очаговой гидропической дистрофии, гликоген определялся в отдельных клетках в виде мелкой пылевидной зернистости. Нарушения гемодинамики проявлялись

очаговым полнокровием центральных вен и синусоидов. В просвете незначительно расширенных синусоидов наблюдались купферовские клетки с признаками повышенной активности, очаговые отложения фибрина, приводящие к частичной окклюзии просветов мелких сосудов и синусоидов. Отмечается в виде тенденции способность индуцировать увеличение объемной плотности клеточных метастазов у АБК на 16% и на 58% - у БК (см. табл. 8).

Таким образом, у животных с лимфомой RLS мы наблюдаем развитие неопластической гепатопатии, осложненной холестазом. Однократное введение ГОСТ осложняет течение гепатопатии, приводя к увеличению степени и объемной плотности деструктивно - некротических процессов. Бетулоновая кислота и ее амид частично купировали явления гепатопатии, незначительно улучшая гемодинамику и снижая степень выраженности дистрофий, оказывая при этом индуцирующее влияние на рост клеточных метастазов в синусоидах. БК угнетает пластический и регенераторный потенциал печени, увеличивая объем некротического поражения. Эти результаты находятся в тесной корреляции с полученными результатами на модели цитотоксического поражения печени интакгных крыс, где АБК также оказал стойкое позитивное влияние на течение репараггивных процессов.

Структурная характеристика печени экспериментальных животных с карциномой легких Lewis и при коррекции производными бетулоновой кислоты на фоне и без ПХТ. Карцинома легких Lewis прежде всего характеризуется хорошей чувствительностью к циклофосфану. В результате преимущественного метастазирования в легкие с образованием крупных субплевральных инфильтратов и периваскулярных муфт, в данном эксперименте определяет поражение печени опухолевая гипоксия. Отличительной особенностью данной опухоли является поражение сосудов и синусоидов, воспалительная инфильтрация синусоидального русла, дистрофия и некроз гепатоцитов (Старцева Ю.В., Сулимова H.A. и др., 2006).

В печени животных всех групп с перевитой карциномой Lewis преобладают гепатоциты с мутным набуханием цитоплазмы, а также с очаговой мелковезикулярной жировой и, у отдельных животных, гидропической дистрофией с резко сниженным содержанием гликогена. Перипортально и в синусоидах выявляли признаки гранулематозного воспаления в виде мелких лимфоцитарных инфильтратов. Вокруг метастазов наблюдали гепатоциты с признаками ацидофильной дегенерации (резко эозинофиль-ная цитоплазма, гиперхромное пикнотичиое ядро) и моноцеллюлярные клеточные некрозы. У животных всех групп выявлялись перипортальные мелкоочаговые метастазы, опухолевые клетки находились в активном митотическом делении, у двух животных прорастали за пределы пограничной пластинки. На фоне умеренного венозного полнокровия в просвете синусоидов наблюдали увеличенные в размере купферовские клетки с

Таблица 9. Влияние БК и АБК на морфомстрическне показатели печени у животных с карциномой легких Lewis на фоне полихимиотерапии (ПХТ) и в ее отсутствие (М±га)

Группы Гепато-циты (Vv) ИВ (Vv) Некрозы гепатоцитов (Vv) Просвет синусоидов (Vv)

свободный лейкоциты метастазы

Контроль (опухоль) 0,65±0,22 0,29±0,01 0,08±0,13 0,19±0,22 0,017±0,06 0,06ь0,09

ПХТ 0,62±0,002 0,25±0,0Г 0,15±0,007* 0,15*±0,01 0,028±0,01 0,046±0,01

ПХТ + АБК 0,62±0,26 0,45±0,03* 0,07±0,01* 0,2±0,02" 0,029±0,01 0,043±0,01

ПХТ + БК 0,59±0,04 0,ЭЭ±0,0Э" 0,087±0,02" 0,21±0,02* 0,06±0,02 0,03±0,01*

Опухоль + АБК 0,63±0,08 0,43±0,0Г 0,041 ±0,05* 0,27±0,05* 0,024±0,02 0,022±0,04*

Опухоль + БК 0,64±0,038 0,29±0,01 0,11±0,05* 0,18±0,03 0,023±0,05 0,03±0,03*

Примечание. * - р < 0,05 - относительно контрольной группы; * - р < 0,05 - относительно II группы с ПХТ (референс); ИВ - индекс васкуляризации (отношение объема синусоидов к объему паренхимы).

ШИК-позитивной цитоплазмой, крупные клетки моноцитоидного типа, клетки опухоли единичные и в виде скоплений, из 4 - 8 клеток. Стенки синусоидов и мелких вен отечные, с признаками плазматического пропитывания, эндотелиальная оболочка утолщена, просветы синусоидов частично обтурированы незрелым фибрином (по Зербино - желтого цвета) без перифокальной воспалительной инфильтрации (табл. 9).

ПХТ и в данном эксперименте также усугубляет неопластическое поражение печени ярко выраженным синдромом регенераторно-пластической недостаточности: полиморфные дистрофии (липидная и гидропическая), некрозы гепатоцитов, очаговая стромально-сосудистая дистрофия, по-лиморфноклеточная инфильтрация синусоидов. Объемная плотность некрозов гепатоцитов увеличилась на 88% по сравнению с контролем (см. табл. 9). Выражены и нарушения микроциркуляции: мелкоочаговое полнокровие синусоидов и центральных вен с плазматическим пропитыванием их стенок. По сравнению с контролем, на 23% уменьшилась объемная плотность синусоидов с метастазами и свободным просветом, на 14% - индекс васкуляризации, при этом на 80% увеличился объем синусоидального русла с крупными полиморфноядерными клетками. На полутонких срезах в цитоплазме синусоидальных клеток отчетливо выявлялись мелковезикулярные вакуоли, а в просвете синусоидов немногочисленные купферовские клетки с ШИК-позитивной цитоплазмой.

На данной модели опухоли (CLL) тритерпеновые соединения на фоне ПХТ оказали более эффективное влияние на течение репаративных процессов. Особенно выражена эта особенность у АБК. В печени животных отмечается уменьшение степени выраженности дистрофических и объемной плотности некротических изменений гепатоцитов, частичное вос-

становление гемодинамики. Объемная плотность некрозов гепатоцитов уменьшилась на 54 %, а доля гепатоцитов с дистрофиями существенно не изменилась по сравнению с референс-группой (см. табл. 9). На фоне умеренного венозного полнокровия в синусоидах определялись купферовские клетки, с признаками повышенной активности, крупные полиморфноя-дерные клетки и лейкоциты. Очаговая стромально-сосудистая дистрофия в стадии фибриноидного набухания наблюдалась в синусоидах. Объемная плотность синусоидов со свободным просветом увеличилась на 33%, а индекс васкуляризации на 80%, по сравнению с референс-группой (см. табл. 9).

Под влиянием БК на фоне ПХТ в печени с одной стороны отмечается частичное купирование признаков токсического воздействия, а с другой отягчающим фактором является сочетание паренхиматозной, липидной и очаговой стромально-сосудистой дистрофии с инфильтрацией синусоидов крупными полиморфноядерными клетками, имеющими сходство с клетками красной пульпы селезенки и лейкоцитами. По сравнению с референс - группой (ПХТ), доля клеток с дистрофиями гепатоцитов уменьшилась на 10%. Однако, следует отметить, что доля некрозов после введения БК на 24% больше, чем в группе животных, получавших АБК (см. табл. 9). Так же как и в группе с АБК, на 40 % увеличилась доля синусоидов со свободным просветом, на 32% увеличился индекс васкуляризации. По сравнению с референс-группой на 35% уменьшилась доля метастазов в просвете синусоидов. Введение БК на фоне ПХТ сопровождалось увеличением на 114% объемной плотности полиморфноядерных клеток и лейкоцитов в просвете синусоидов с очаговой дезорганизацией соединительной ткани в стадии фибриноидного набухания. На фоне ПХТ в сочетании с БК и АБК стромально-сосудистая дистрофия носит мелкоочаговый характер, с преимущественным поражением синусоидов. Данный факт можно объяснить сочетанием действия преднизолона и циклофосфана, подавляющих имму-нологически опосредованные процессы путем уменьшения поступления лейкоцитов в зону воспаления, изменения функциональной активности лейкоцитов, фибробластов, и, тем самым, снижающих скорость развития фиброзных изменений (Решетняк Т.М. и др., 1998; Насонов Е.Л., 1999).

Существенные отличия при изолированном введении БК и АБК связаны с их разнонаправленным влиянием на теыение альтеративных и репаративных процессов в печени: степень деструкции гепатоцитов и дезорганизации соединительной ткани, объем клеточных метастазов, полиморфных клеток и лейкоцитов в просвете синусоидов. Так, БК уменьшает степень деструкции гепатоцитов, увеличивает объем некрозов в паренхиме, вызывает развитие очаговой стромально-сосудистой дистрофии. АБК, напротив, уменьшая объем некрозов, стимулирует развитие генерализованной стромально-сосудистой дистрофии без перифокальной воспалительной реакции с угнетением пластических процессов (отсутствие гликогена), оба соединения обладают антиметастатическим действием

(уменьшают объемную плотность метастазов) (см. табл. 9). Так, на фоне изолированного введения БК, объемная плотность моноцеллюлярных некрозов гепатоцитов увеличилась на 37%. У всех животных данной группы отмечается развитие очаговой стромально-сосудистой дистрофии в стадии фибриноидного набухания. Объемная плотность клеточных метастазов уменьшилась на 50% и на 35% увеличилась доля полиморфноядерных клеток в синусоидах (см. табл. 9).

АБК с одной стороны уменьшает на 49% объемную плотность некрозов, на 63% - клеточных метастазов в просвете синусоидов, но с другой стороны, генерализованная стромально-сосудистая дистрофия с окклюзией мелких сосудов и синусоидов, приводит к нарушению транссинусоидального обмена, поддерживая дистрофические изменения гепатоцитов. Следует подчеркнуть, что на этом фоне на 42% увеличилась объемная плотность синусоидов со свободным просветом и на 48 % - индекс ва-скуляризации с увеличением на 40% в синусоидах объемной плотности полинуклеарных клеток. На полутонких срезах в синусоидах отчетливо выявляются звездчатые клетки с мелкими липидными каплями в цитоплазме. Выявленные изменения на уровне центральных вен и синусоидов лимитируют нормальную гемодинамику печени, что приводит к сокращению метаболически эффективной паренхимы с развитием в дальнейшем портальной гипертензии. Коллагенизация пространств Диссе нарушает нормальный метаболический трафик между кровью и гепатоцитами, препятствуя клиренсу циркулирующих веществ, изменяет межклеточные взаимодействия, и поддерживает тканевую гипоксию. Свидетельством глубокого угнетения синтетических и дезинтоксикационных процессов является диффузная мелковезикулярная липидная инфильтрация цитоплазмы гепатоцитов и отсутствие гликогена (Лукьянова Л.Д., 1985).

Нельзя исключить из внимания и тот факт, что производные бетулина, обладая цитотоксическим действием, усиливают процессы элиминации метастазов не только в синусоидах, но и в первичном опухолевом узле, стимулируя выброс токсических продуктов распада, иммунных комплексов, которые также могут стимулировать развитие сосудистых повреждений (Шинтяпина А.Б. и др., 2005; Ворожейкина Е.Г. и др., 2006). Степень выраженности стромально-сосудистой дистрофии связана и с особенностями метаболизма тритерпеноидов, который осуществляется не только в гепатоцитах, но и в эндотелиоцитах (Сорокина И.В., 2010). Выявленные васкулярные расстройства связаны и с активацией медиаторами воспаления звездчатых клеток, которые становятся главным источником избыточной коллагенизации стромы. Этот факт косвенно подтверждается увеличением полиморфноклеточной инфильтрации в синусоидах и появлением липидсодержащих клеток, стимулирующих фиброгенную трансформацию продуцирующих звездчатых клеток в прострастве Диссе, что приводит к «капилляризации», нарушению архитектоники и препятствует транссинусоидальному обмену (Непомнящих Д.Л. и др., 2006).

Патоморфологическое исследование печени при моделировании

фиброза и цирроза смешанного генеза в динамике коррекции бетулоновоб кислотой и ее амидом

Известно, что тетрахлорметан является истинным гепатотоксином, оказывает прямое повреждающее действие на печень, вызывая гепато-целлюлярные, холестатические и смешанные формы поражения, исходом которых является фиброз и цирроз. Отягчающим фактором в данной модели является этанол, морфологический субстрат которого - жировая дистрофия и фиброз с перисинусоидальным расположением коллаге-новых волокон и микронодулярный цирроз, лобулярная инфильтрация полиморфноядерными лейкоцитами с участками фокального некроза. Значительная часть токсических эффектов этанола обусловлена ацеталь-дегидом, наиболее тяжелый повреждающий эффект которого связан с нарушением функции важнейшего структурного компонента клеточных мембран - фосфолипидов, что сопровождается повышением проницаемости мембран, нарушением трансмембранного обмена, функционирования клеточных рецепторов и мембраносвязанных ферментов (Лопаткина. Т., Бурневич Э., 2003; 8екг Н.К. еЬ а1., 2005).

На модели острого гепатита, индуцированного тетрахлорметаном, было установлено, что БК и ее амид купируют явления цитолиза, холестаза и обладают антиоксидантным действием (Сорокина И.В. и др., 2003). Фиброз и цирроз печени, вызванный тетрахлорметаном, широко применяемая экспериментальная модель, дающая хорошо воспроизводимые результаты и отражает в полной мере процессы фиброгенеза у человека (Ташауо Я Р., 1983). Целью данной серии экспериментов было исследование влияния БК и АБК на процессы фиброгенеза, регенераторно-пластический потенциал и популяционную динамику гепатоцитов при длительном сочетанном воздействии тетрахлорметана с этанолом в сравнении с гептралом, который является «золотым» стандартом при проведении антифиброзной терапии (Шульпекова Ю.О., 2007). Контрольный забор материала для комплексного исследования проводили на 3-, 6-, 8-й неделях эксперимента.

Патоморфология печени животных при моделировании фиброза и цирроза токсического генеза в динамике эксперимента. На основании полученных результатов на 3-й неделе в группе негативного контроля (СС14 в сочетании с этанолом) смертность составила 40%. При светооптическом исследовании выявлены резкие отличия степени и стадии патологического процесса в группе. У 5 из 6 животных популяция гепатоцитов была достаточно однородной, с низким содержанием гликогена. Преобладающим видом дистрофии являлась мелко и средневезикулярная липидная инфильтрация, с локализацей в центролобулярных зонах. В перипортальных зонах наблюдались мелкоочаговые некрозы гепатоцитов со слабо выраженной лимфоцитарной инфильтрацией портальных трактов, с умеренным фиброзом без распространения на перипортальные и перисинусоидальные

зоны. Просветы синусоидов сужены, умеренно полнокровны. В их просветах отмечаются клетки Купфера с признаками повышенной активности и мононуклеарные лейкоциты.

Описанные выше изменения соответствуют минимальной степени активности альтеративного процесса. У одного животного, напротив, были ярко выражены признаки токсического поражения. В гепатоцитах выявлялась тотальная полиморфная (крупно, средне и мелковезикулярная) липидная инфильтрация, с полным отсутствием гликогена. Крупные капли липидов оттесняют на периферию ядра клеток, которые принимают перстневидную форму. Отмечается слияние жировых капель части гепа-тоцитов с образованием внеклеточных жировых кист. Мелкоочаговые некрозы гепатоцитов локализуются в перипортальных и центролобуляр-ных зонах с тельцами Каунсилмена в синусоидах. Ярко выражен фиброз смешанного типа с перестройкой печеночных балок и формированием ложных долек. Портальные тракты резко расширены фиброзной тканью и пролиферирующим эпителием желчных протоков. Клеточная инфильтрация диффузная, лимфоцитарная и мелкоочаговая, эозинофильная. lia фоне выраженного венозного полнокровия отмечается гемосидероз, тотальное сужение синусоидального русла с признаками повышенной активности купферовских клеток.

При морфо- и стереометрическом исследовании по сравнению с интактным контролем объемная плотность некрозов увеличилаь в 1,5 раза (табл. 10). Объем синусоидального русла уменьшился в 1,5 раза, поверхностная плотность - на 40% и на 60% - площадь поверхности синусоидов. Выявлено увеличение всех показателей соединительной ткани в сравнении с интактным контролем: объемная плотность в 7 раз, поверхностная плотность в 6 раз, абсолютная масса в 11 раз (табл. 11 ). Объемная и поверхностная плотность гепатоцитов существенно не изменилась, но при этом на 24 % увеличилась абсолютная масса гепатоцитов и на 25% - площадь их поверхности. Методом щелочной диссоциации выявлено уменьшение количества одно и двухъядерных гепатоцитов на 68 и 98% соответственно (табл. 12), этот дисбаланс между показателями, можно объяснить увеличением объема цитоплазмы гепатоцитов вследствие липидной инфильтрации.

К 6-й неделе эксперимента у всех животных увеличивалась степень деструктивно-некротических поражений гепатоцитов с прогрессивным ростом соединительной ткани и пролиферацией желчных капилляров, нарушением гемодинамики и пигментного обмена, сопровождавшиеся структурной перестройкой паренхимы, с высоким индексом гистологической активности и фиброзирования (см. табл. 11).

У всех животных был выражен фиброз смешанного типа. Прослойки соединительной ткани широкие в перипортальных зонах и более узкие в перисинусоидальных пространствах. Выражена пролиферация эпителия желчных протоков с аденоматозной трансформацией, гемосидероз,

Таблица 10. Общая характеристика гецатоцитов по данным морфометри-ческого анализа (М±т)

Группы Срок (нед.) Гепато-циты, Vv, % Некрозы, Vv, % Абсолютная масса гепатоцитов (г) Поверхностная плотность гепатоцитов Площадь поверхности гепатоцитов (см2)

СС14 (Н.К.) 3 69,75±6,0 1,6±1,5 8,06±0,52* 0,4353±0,02 5,07±0,33*

6 60,83±2,9 0,4±0,1 4,09± 0,9* 0,3554 ±0,02** 2,39±0,54*

8 72,38±1,47" 0 8,6±1,2 0,4243±0,01 5,04±0,72

3 73,35±1,7 0,65±0,2 6,62±0,5 0,4376±0,006 4,059±0,24*

Гептрал 6 67,41 ±3,64 0,79±0,74 7,14±1,14 0,4043±0,02 4,29±0,69

8 Смертность 100% к 6-й неделе

3 76,31±2,67 0,17±0,05 7,31±0,4 0,4362±0,01 4,17±0,19й

БК 6 71,8±1,9*# 1,52±0,5 8,13±0,7™ 0,4303^,01« 4,89±0,39м

8 70,82±1,59 0 5,09±0,3* 0,4213±0,01 3,51±0,16

3 74,91±1,3 0,21±0,2 7,39±0,4 0,4491±0,01 4,44±0,23

АБК 6 69,01 ±1,93* 0,1±0,13 7,83±0,4М 0,4358±0,01ж 4,96±0,25м

8 72,78±1,38 0 6,45±0,33 0,4413±0,004 3,90±0,2

И.К. 8 66,51±0,98 0 6,49±0,33 0,4187±0,001 4,07±0,16

Примечание. *; ** - р< 0,05; р< 0,01 - относительно интактной V группы (И.К.);

т - р< 0,05; р< 0,01 - относительно группы негативного контроля (СС14); М -абсолютное число гепатоцитов; И.К. - интактный контроль; Н.К. - негативный контроль.

в перипортальных зонах выявляются желчные пигменты. Клеточная инфильтрафия диффузная лимфоцитарная, слабо выражена. В просвете синусоидов часто наблюдаются постнекротические тельца Каунсильмена.

В сравнении с 3-й неделей эксперимента зарегистрировано незначительное уменьшение объемной плотности гепатоцитов, на 50% уменьшилась абсолютная масса, поверхностная плотность и площадь поверхности гепатоцитов. Отмечен небольшой рост общего числа гепатоцитов и увеличение в 5 раз (485%) популяции двухъядерных гепатоцитов. По сравнению с 3-й неделей эксперимента на 247% увеличился объем соединительной ткани, на 362% увеличилась поверхностная плотность, и на 110% увеличилась площадь поверхности соединительной ткани. На этом фоне в 1,5-2 раза (36%) отмечается редукция синусоидального русла (табл. 13). Эти данные находятся в тесной корреляционной связи с результатами биохимического анализа, в которых установлено многократное превышение уровня ферментов цитолиза ACT и AJ1T, билирубина, 1ЦФ и ЛДГ (Семенов Д.Е. и др., 2012).

Таким образом, к 3-й неделе эксперимента на фоне введения четы-реххлористого углерода в сочетании с этанолом у животных развилась гепатопаггия токсического генеза с переходом к 6 неделе в неспецифиче-

Таблица 11. Общая характеристика соединительной ткани поданным мор-фометрического анализа (М±т)

Группы Срок (нед.) Соединительная ткань, УУ, % Абсолютная масса соединительной ткани (г) Поверхностная плотность соединительной ткани Площадь поверхности соединительной ткани (см2) ИГА СГ

СС14 (Н.К.) 3 7,33±6,7 1,083±1,02 0,0296±0,025 0,4349±0,39 6,3 1,0

6 25,5±4,6" 1,7± 0,5 0,1368 ±0,03** 0,9171±0,29* 11,0 6,0

8 12,19±2,33** 1,33±0,06 0,07±0,01" 0,7337±0,02" 4,5 5,8

Геп-трал 3 8,08±3,22 0,73±0,3 0,0514±0,02 0,4625±0,19 6,5 1,0

6 15,09±5,3 1,49±0,6 0,0794±0,03 0,7826±0,31 9,8 5,2

8 Смертность 100% к 6-й неделе

3 13,45±3,6 1,3±0,4 0,0715±0,02 0,6944±0,19 4,0 1,4

БК 6 6,98±2,8Ж 0,75±0,3 0,0383±0,01*# 0,4163±0,13 2,8 0,8

8 11,62±2,32 0,97±0,2 0,0593±0,012 0,493 5±0,09 4,4 1,6

3 2,07±0,95 0,21±0,01 0,0109±0,01 0,1086±0,05 2,0 0

АБК 6 2,09±0,68#* 0,23±0,01" 0,0131±0,003* 0,1445±0,04* 2,4 0

8 2,04±0,63#* 0,^0,06«* 0,0111±0,003" 0,1768±0,09м 2,6 0

И.К. 8 0,99±0,28 0,098±0,03 0,0296±0,025 0,0532±0,02 0 0

Примечание. *; " - р< 0,05; р< 0,01 - относительно интактной V группы (И.К.);

"" - р< 0,05; р< 0,01 - относительно группы негативного контроля (СС14); И.К. — интактный контроль; Н.К. - негативный контроль; ИГА - индекс гистологической активности; СГ - стадия гепатита.

ский гепатит с фиброзом смешанного типа выраженной пролиферацией эпителия желчных протоков и редукцией микроциркуляторного русла.

Структурные изменения печени животных при фиброзе и циррозе токсического генеза в динамике коррекции бетулоновой кислотой и ее амидом. На всех этапах эксперимента (3 и 6 нед) АБК оказал ярко выраженное позитивное влияние на течение репаративных процессов. Гибели животных в данной группе не зарегистрировано. На 3 неделе эксперимента ведущий признак поражения гепатоцитов - мелкоочаговая клеточно-инволютивная дистрофия (опустошение цитоплазмы с сохранением перинуклеарной зоны). Популяция гепатоцитов без явных признаков гетерогенности, со сниженным содержанием гликогена и перипортальны-ми некрозами гепатоцитов. При окрашивании по Масону, ван Гизону и Маплори фиброзная ткань выявляется только перипортально. Признаки пролиферации эпителия желчных протоков отсутствуют или выражены весьма незначительно у отдельных особей. Просветы синусоидов умеренно полнокровны, в них выявляются лимфоциты и купферовскис клетки с повышенной активностью. При морфометрическом анализе на 3 неделе экспериме11та по сравнению с группой негативного контроля основные положительные изменения выявлены во всех параметрах соединительной

Таблица 12. Влияние тритерпеновых производных на популяционную динамику гепатоцитов на фоне воздействия тетрахлометаном (метод щелочной диссоциации) (М±т)

Группы Срок (нед.) п*103 N♦106 М*106 1-ядерные гепатоциты (* 106) 2-ядерные гепатоциты (•106)

со, (Н.К.) 3 35,14+0,7" 398,37+32,1" 394,89+33,5" 391,46+34,8 3,44+1,5

6 64,7Э±3,6** 486,18±94,3" 466,05+89,8*" 445,92+85,6 20,13+6,9

8 44,82+7,6" 595,07±116,9** 584,04+115,9** 573+115,0 11,03+3,7

Гептрал 3 36,45±1,3 326,04+27,2* 320,19+25,4« 314,33+23,7 5,86+2,4

6 56,29+4,Зж 566,49±73,9 562,68+73,0 558,87+72,2 3,81+2,0

8 Смертность 100% к 6-й неделе

БК 3 60,56+10,3## 543,46+80,7« 535,11+77,5«* 526,76+74,3 8,35+3,6

6 67,44±7,5 744,96+84,4** 739,79+84,5** 734,62+84,7 5,17+2,7

8 54,91±14,7 431,41±106,7 397,79+102,9 364,17+99,9 33,62+9,8

АБК 3 43,04+3,4м 404,67±38,1 400,35+38,9 396,03+39,7 4,32+1,8

6 66,56±4,9 742,15+81,7«* 719,09+77,4т 696,02+73,8 23,07+8,1

8 81,39+6,4Ж 745,24+54,5" 695,46+49,2 645,68+44,7 49,78+8,0

И.К. 8 115,73+4,7 1252,75+49,3 1093,90+45,7 935,04+42,7 158,85+6,0

Примечание. *; ** - р< 0,05; р< 0,01 - относительно контрольной (интактной) группы; т - р< 0,05; р< 0,01 - относительно контрольной (СС^) группы; п -число ядер гепатоцитов; в 1 мг ткани; N - абсолютное число ядер; М - абсолютное число гепатоцитов; И.К. - интактный контроль; Н.К. - негативный контроль.

ткани. Так, объемная плотность соединительной ткани уменьшилась на 72% с пропорциональным уменьшением ее поверхностной плотности, площади поверхности и абсолютной массы на 64,75 и 81 % соответственно. При щелочной диссоциации существенных отличий в количественных параметрах, характеризующих гепатоциты и синусоиды, не выявлено (см. табл. 12).

Через 6 нед введения АБК наблюдаются дальнейшие положительные изменения в динамике репаративных процессов. В гепатоцитах преимущественно выявлялось мутное набухание цитоплазмы, в очаговых скоплениях из 2 - 4 клеток - мелковезикулярная липидная инфильтрация со сниженным содержанием гликогена. Популяция гепатоцитов отличалась умеренным ядерным полиморфизмом, появлялись двухъядерные клетки. Клеточные некрозы гепатоцитов и фокальные лимфоцитарные инфильтраты локализовались в перипортальных зонах.

Грубая фиброзная ткань при различных вариантах окрашивания выявлена только перипортально с распространением отдельных тонких тяжей в виде коротких лучей в перисинусоидальные пространства. При морфометрическом анализе выявлено увеличение объемной плотности (на 13%), поверхностной плотности (на 20%) и площади поверхности

Таблица 13. Общая характеристика синусоидального русла по данным морфометрического анализа (М*т)

Группы Срок (нед.) Синусоиды, УУ, % Абсолютная масса синусоидов (г) Поверхностная плотность синусоидов Площадь поверхности синусоидов (см2)

СС14 (Н.К.) 3 21,4*2,4" 2,45*0,12 0,0796*0,01 0,9118*0,05

6 13,6,±1,9" 0,95*0,27 0,0568*0,01" 0,3956*0,11"

8 15,35±0,81" 1,86*0,3 0,0602*0,002" 0,7173*0,11"

Гептрал 3 17,92*3,98 1,65*0,4 0,0572*0,02 0,5424*0,19

6 16,68*2,2 1,51*0,2 0,0627*0,01 0,6718*0,13

8 Смертность 100% к 6-й неделе

БК 3 10,01*1,9** 0,92*0,17 0,0997*0,05 0,9829*0,55

6 19,57*1,2" 2,24*0,23 0,0725*0,004 0,8322*0,09**

8 17,56*0,79 1,45*0,08 0,0701*0,003* 0,5862*0,04

АБК 3 22,87*1,9 2,54*0,15 0,0913*0,01 0,8933*0,06

6 28,57*2,03** 3,27*0,3 0,1059*0,01** 1,2196*0,15**

8 25,25*1,23** 2,23*0,2 0,0986*0,003** 0,8757*0,06

И.К. 8 32,33*0,85 3,15*0,2 0,1272*0,006 1,2490*0,11

Примечание. *; ** - р< 0,05; р< 0,01 - относительно интактной V группы (И.К.); *;** - р< 0,05; р< 0,01 - относительно группы негативного контроля (СС14); И.К. - интактный контроль; Н.К. - негативный контроль

гепатоцитов (на 107%). Абсолютная масса гепатоцитов увеличилась на 91 %. При щелочной диссоциации установлено увеличение на 54% численной популяции одноядерных гепатоцитов и на 14% - двухъядерных гепатоцитов. Объемная плотность и абсолютная масса соединительной ткани существенно не изменились по сравнению с предыдущим сроком эксперимента в данной группе, однако поверхностная плотность и площадь поверхности соединительной ткани уменьшились на 90 и 85% соответственно (см. табл. 10 - 13).

Таким образом, введение АБК полностью предотвращает токсическое поражение клеток печени, улучшает гемодинамику, препятствует развитию фиброза и цирроза, стимулирует регенераторный потенциал.

Бетулоновая кислота в сравнении с АБК оказала положительное влияние лишь ма отдельные альтеративные изменения, вызывая через 3 нед так же, как и в группе негативного контроля, развитие гепатопатии и фиброза со слабо выраженной пролиферацией эпителия желчных протоков. По сравнению с негативным контролем методом щелочной диссоциации выявлено увеличение на 35% абсолютного числа гепатоцитов на фоне незначительных изменений объемной и поверхностной плотности, абсолютной массы гепатоцитов. При морфометрии установлено, что поверхностная плотность синусоидов увеличилась на 25% с уменьшением на 53% объемной плотности и абсолютной массы синусоидов. Объемная и

поверхностная плотности и площадь поверхности соединительной ткани увеличились на 83, 147 и 53 % соответственно (см. табл. 10 - 13).

Через 6 нед эксперимента после введения БК в динамике коррекции существенные сдвиги отмечаются лишь в степени деструкции гепатоцитов и в состоянии микроциркуляторного русла. В гепатоцитах наблюдается сочетание дистрофий (липидной и гидропической). Гепатоциты характеризуются незначительным полиморфизмом, встречаются часто фигуры митоза и двухъядерные клетки. Наиболее часто в центролобулярных зонах выявляются мелкоочаговые некрозы гепатоцитов, инфильтрированные лимфоцитами. Выражен распространенный фиброз смешанного типа с пролиферацией эпителия желчных протоков и сидерофагами в тяжах соединительной ткани. Синусоиды умеренно полнокровны, в просвете их визуализируются купферовские клетки с признаками повышенной активности.

При морфометрическом исследовании так же, как и в других экспериментах, на 280% увеличилась объемная плотность некрозов гепатоцитов. При этом выявлено увеличение на 43% объемной плотности синусоидов, на 135% абсолютной массы, на 27% поверхностной плотности и на 110% площади поверхности синусоидов (см. табл. 10 - 13). По сравнению с негативным контролем незначительное увеличение на 17% объемной плотности гепатоцитов сопровождается и увеличением на 93% их абсолютной массы, поверхностной плотности и площади поверхности на 21 и 103% соответственно. По данным щелочной диссоциации абсолютное число гепатоцитов увеличилось на 53% за счет популяции одноядерных клеток. Объемная плотность соединительной ткани уменьшилась на 73% с пропорциональным уменьшением на 72%, 45% и на 56% поверхностной плотности, площади поверхности и абсолютной массы соединительной ткани соответственно. Таким образом, бетулоновая кислота частично купирует признаки токсического воздействия, уменьшая процессы фи-брозирования лишь на 6-й неделе эксперимента, незначительно повышая регенераторную активность гепатоцитов.

В качестве референс-контроля использовали широко применяемый для коррекции токсических поражений различного генеза фармакопейный препарат гептрал. После 3-х недельного введения гептрала, на фоне продолжающегося токсического воздействия, летальность животных в группе составила - 33%. Так же как, и в контрольной группе, выраженное токсическое поражение гепатоцитов сочетается с фиброзом смешанного типа, нарушениями пигментного обмена и гемодинамики в виде венозного полнокровия. Индекс гистологической активности составил 6,5 балла, индекс фиброзирования -1 балл (см. табл. 11). По данным морфометриче-ского анализа и щелочной диссоциации статистически значимых отличий по сравнению с животными негативного контроля на 3 неделе не выявлено.

После 6-недельного введения гептрала смертность в группе составила 48%. У выживших животных наблюдался полиморфный характер

патологических изменений. У 2 животных деструктивно-некротические изменения гепатоцитов, синусоидов, фиброз и гиперпластические процессы были слабо выражены. У 4 животных наблюдались ярко выраженные признаки токсического поражения с перестройкой архитектоники: распространенный фиброз смешанного типа, с формированием узлов регенерации, пролиферацией эпителия желчных протоков с признаками аденоматозной трансформации и выраженным гемосидерозом. В гепа-тоцитах выявлялось сочетание жировой и белковой дистрофий (средне, крупновезикулярная липидная инфильтрация, гидропическая дистрофия) с выраженным клеточным и ядерным полиморфизмом. Содержание гликогена в гепатоцитах резко снижено в перипортальных зонах и полностью отсутствует в центролобулярных. Индекс гистологической активности и индекс фиброзирования увеличились по сравнению с 3 неделей эксперимента (см. табл. 11). При комплексном исследовании также не выявлено статистически значимых различий по сравнению с животными негативного контроля на данном сроке эксперимента.

Таким образом, внутрижелудочное введение гептрала не оказало существенного положительного влияния на процессы фиброгенеза, степень деструктивно-некротических поражений гепатоцитов (см. табл. 10 - 13).

Структурные изменения печени животных при фиброзе и циррозе токсического генеза в восстановительный период. 7-я и 8-я недели эксперимента служили восстановительным периодом, в течение которого животные получали в свободном доступе только гранулированный корм и воду.

В восстановительный период (7 и 8 нед) у животных в группе негативного контроля отмечалось прогрессивное развитие гиперпластических и некротических процессов. В гепатоцитах выявлялась гидропическая и очаговая баллонная дистрофия, с резко сниженным содержанием гликогена в клетках, и выраженным клеточным и ядерным полиморфизмом (двуъхядерные, клетки с резко выраженной ацидофилией цитоплазмы и пикнотичными ядрами, крупные гиперхромные, песочные ядра, мелкие нормохромные). Часто наблюдаются постнекротические гранулемы и тельца Каунсильмена в синусоидах. Наблюдался фиброз и цирроз смешанного типа мелко и крупнонодулярный, с узлами регенерации, перипортальным гемосидерозом и полиморфноядерной клеточной инфильтрацией. В желчных протоках выражена пролиферация эпителия с признаками аденоматозной трансформации. Синусоиды умеренно полнокровны, в просвете их встречаются лимфоциты и в небольшом количестве купферовские клетки без явных признаков активности.

По данным морфометрии, увеличились на 18% объемная и поверхностная плотности гепатоцитов, на 110% увеличились площадь их поверхности и абсолютная масса по сравнению с 6-й неделей эксперимента. Методом щелочной диссоциации установлено увеличение на 25% абсолютного

количества гепатоцитов с преобладанием одноядерных форм и уменьшением на 46% числа двухьядерных гепатоцитов по сравнению с 6 неделей, и остается резко сниженным на 39% и в 14 раз число одно и двухьядерных гепатоцитов по сравнению с показателями интактного контроля. По данным морфометрического анализа, отмечается уменьшение на 50% объемной и поверхностной плотности, а также на 20% площади поверхности соединительной ткани по сравнению с 6-й неделей эксперимента, и значительно превышают аналогичные показатели в интакгном контроле. Незначительно увеличились показатели, характеризующие состояние синусоидов (см. табл. 10- 13).

Токсические повреждения печени различного генеза (метаболические, воспалительные) реализуются посредством стереотипных патологических реакций, завершающихся фиброзом и циррозом. В основе фиброгенеза лежит избыточное накопление протеинов внеклеточного матрикса и тканевых коллагеназ, основным источником которых являются звездчатые клетки печени (липоциты, клетки Ито). Их стимуляция сопровождается избыточной продукцией компонентов соединительной ткани с развитием перисинусоидального фиброза, а при длительном персистировании процесса цирроза печени, что мы наблюдали в контрольной группе на всех этапах эксперимента. Активация звездчатых клеток медиаторами клеточного воспаления, к которым относятся активные формы кислорода, секретируемые поврежденными гепатоцитами; тромбоцитарный фактор роста; фактор роста фибробластов; трансформирующий фактор роста ßl; фактор некроза опухоли а; фактор роста гепатоцитов; интерлейкин-1 является основным патогенетическим звеном фиброгенеза. Звездчатые клетки, перемещаясь в зону центральной вены, превращаются в активированный фенотип (клетки становятся похожими на миофибробласты), активно пролиферируют и теряют запасы ретиноидов. Известно, что клетки Ито контролируют свою фиброгенную активность по приципу аутокринной регуляции, вырабатывая различные факторы, усиливающие или подавляющие образование колллагена. На регуляцию фиброгенного потенциала клеток Ито оказывают также влияние клетки Купфера и эндо-телиальные синусоидальные клетки, синтезирующие простагландин (Pg) Е2 и простациклин (PgI2), ингибирующие их фиброгенную активность и повышающие активность коллагеназ и внеклеточного матрикса. При циррозе печени антифиброзная функция клеток Купфера нарушается, они теряют способность тормозить образование фиброзной ткани, стимулируя деление клеток Ито, усиливают тем самым фиброгенез. Гепатоциты в цирротической печени вырабатывают факторы, стимулирующие пролиферацию клеток Ито, что приводит к усилению синтеза соединительной ткани (Яковенко Э.П. и др., 2003; Непомнящих Д.Л. и др., 2006; Mäher J.J., McGuire R.F., 1990; Iredale J.P. et al., 1998).

В основе восстановления патологически измененной печени лежат процессы неполной репаративной регенерации (субституции), с замеще-

ниєм дефектов повреждения паренхимы печени соединительной тканью, развитием компенсаторной гиперплазии и гипертрофии гепатоцитов, что мы наблюдали на всех этапах эксперимента. Восстановление исходной массы органа наблюдалось к 8-й неделе, на фоне значительного уменьшения общей численности гепатоцитов (см. табл. 12). Важной особенностью нашего эксперимента является выраженная пролиферация эпителия желчных протоков, что связано с существованием бипсггентной стволовой клетки печени, способной дифференцироваться как в гепатоциты, так и в холангиоциты. Локализованы эти клетки вблизи каналов Геринга и характеризуются признаками холангиоцитов и гепатоцитов одновременно (Гарбузенко Д.В., Попов Г.К., 2001). Неустраненные факторы альтерации (травмы, инфекции, токсические вещества и т. д.) могут стимулировать не только пролиферацию гепатоцитов, но и фиброз, сосудистые аномалии и цирроз, являющиеся признаком уже патологической регенерации, что наблюдалось и в группе негативного контроля в восстановительном периоде эксперимента.

Таким образом, сочетанное токсическое воздействие привело к развитию гепатопатии на 3-й неделе с трансформацией в неспецифический гепатит с фиброзом к 6-й неделе и к 8-й неделе завершилось формированием цирроза печени с выраженной гиперплазией эпителия желчных протоков.

В группе животных, получавших АБК, в течение восстановительного периода наблюдается стойкое уменьшение степени выраженности гиперпластических и деструктивно-некротических процессов, повышение регенераторного потенциала печени с ингибированием фиброгенеза. При светооптическом исследовании в паренхиме преобладают гепатоциты с мутной цитоплазмой, а в отдельных клетках - мелковезикулярная липидная инфильтрация, содержание гликогена в гепатоцитах остается сниженным. Популяция гепатоцитов характеризуется умеренным полиморфизмом. Фиброзная ткань локализована преимущественно перипортально, с распространением тонких тяжей в перисинусоидальные пространства в виде коротких лучей. Клеточная инфильтрация незначительная, лимфо-цитарная, отмечается умеренное венозное полнокровие, пролиферация эпителия желчных протоков слабо выражена. Стенки синусоидов тонкие, в просвете их определяются активированные купферовские клетки и единичные лимфоциты.

При морфометрическом анализе выявлено уменьшение абсолютной массы гепатоцитов на 25% при стабильно высокой абсолютной численности популяции одноядерных и двухъядерных гепатоцитов. Абсолютное число одноядерных гепатоцитов увеличилось на 19% и на 351% число двухядерных гепатоцитов по сравнению с негативным контролем. Мор-фометрический анализ позволил подтвердить существенное уменьшение фиброзной ткани, но сравнению с опытными группами на всех этапах эксперимента. Так, объемная и поверхностная плотность соединительной ткани уменьшилась в среднем на 84%, абсолютная масса на 86% и на 76%

- площадь поверхности соединительной ткани. Выявлено, что АБК на всех этапах эксперимента оказывает корригирующее влияние и на состояние синусоидального русла. Так, объемная и поверхностная плотность синусоидой увеличилась на 64%, в среднем на 19 - 20% увеличилась абсолютная масса и площадь поверхности синусоидов. Данные морфометрического исследования находятся в прямой корреляционной связи с результатами биохимического анализа крови крыс, в ходе которого установлено, что АБК значительно уменьшал на ранних сроках (3 нед), а на поздних (6, 8 нед) - полностью купировал явления холестаза, цитолиза, гликолиза, проявляя выраженные антиоксидантные свойства (Семенов Д.Е. и др., 2012).

Бетулоновая кислота в течение восстановительного периода оказала разнонаправленное влияние на степень фиброза, деструктивно-некротические, гиперпластические процессы, регенераторную функцию. В паренхиме наблюдаются обратимые виды дистрофий гепатоцитов, с уменьшенным содержанием гликогена, а так же выраженным клеточным и ядерным полиморфизмом. В центролобулярных зонах встречаются множественные мелкоочаговые постнекротические гранулемы, инфильтрированные мононуклеарными клетками. Грубая фиброзная ткань толстыми тяжами окружает портальные тракты, тонкие тяжи ее образуют отдельные портоцентральные септы, с локальным распространением в перисинусо-идальные пространства с умеренной лимфоцитарной инфильтрацией и выраженным гемосидерозом. В желчных протоках умеренно выражена пролиферация эпителия с явлениями аденоматозной трансформации. На фоне венозного полнокровия просветы синусоидов расширены, с цепочками в них лимфоцитов и купферовских клеток.

При морфометрии установлено, что площадь поверхности гепатоцитов уменьшилась на 31%, а их абсолютная масса - на 41%. Эти изменения обусловлены уменьшением абсолютного числа гепатоцитов на 32% по сравнению с аналогичными показателями в группе негативного контроля и в данной же группе на 6 неделе эксперимента. При этом популяция двухъядерных гепатоцитов увеличилась на 204% по сравнению с показателями негативного контроля и группе с введением БК на 6-й неделе эксперимента. По сравнению с 6-й неделей эксперимента в данной группе объем соединительной ткани увеличился на 66% с пропорциональным увеличением поверхностной плотности и площади поверхности на 54% и 18% соответственно. По сравнению с показателями негативного контроля выявлено незначительное увеличение на 14% и 16% объемной и поверхностной плотнос тей синусоидов соответственно. Но по сравнению с показателями в данной группе на 6-й неделе эксперимента отмечается уменьшение объемной плотности (на 11%), абсолютной массы (на 36%) и площади поверхности (на 30%) синусоидов (см. табл. 10-13).

После введения БК на 3-й неделе репаративная регенерация является неполной и реализуется по механизму компенсаторной гиперплазии и гипертрофии, свидетельством чего является резкое уменьшение общего

числа гепатоцитов при сохранении объемной плотности и абсолютной массы паренхиматозных клеток. На 6-й неделе после введения БК регенерация печени осуществляется уже сочетанием клеточных и внутриклеточных механизмов: увеличение общего числа гепатоцитов, за счет одноядерных форм, с пропорциональным увеличением абсолютной массы, площади поверхности, объемной и поверхностной плотности. Следует подчеркнуть, что на 6-й неделе только в группе с БК сохраняется на высоком уровне объемная плотность некрозов. Как известно, некрозы паренхимы оказывают ингибирующее влияние на дальнейшие процессы пролиферации, стимулируют фиброгенез путем активации клеток Купфера и синусоидальных эндотелиоцитов (Пышкин С.А., Димов П.Г., 2004). На 8-й неделе эксперимента после введения БК преобладающим механизмом регенерации является компенсаторная гипертрофия, так как общее уменьшение числа гепатоцитов сочетается с пропорциональным уменьшением их абсолютной массы, но с сохранением площади их поверхности. Таким образом, бетулоновая кислота частично купирует фиброгенез, уменьшает степень деструкции гепатоцитов, незначительно стимулируя регенераторный потенциал.

На 8-й неделе эксперимента в группе животных, получавших гептрап, невозможно оценить степень патологических изменений в связи со 100% гибелью. Отсутствие корректорного эффекта в данной группе животных, получавших гептрал per os, связано со способом введения препарата, так как известно, что максимальный гепатопротекторный эффект адеметиони-на проявляется лишь при парентеральном введении. Преимущественное влияние гептрал оказывает на проявления токсемии, и в меньшей степени влияет на показатели цитолиза и холестаза, уступая урсодеоксихолевой кислоте (Оковитый C.B. и др., 2010). В данном исследовании при внутри-желудочном введении гептрал не оказал влияния и на степень токсемии (смертность животных была выше, чем в контроле), на выраженность степени деструкции и цитолиза, холестаза и фиброза.

Наиболее актуальной задачей при коррекции альтеративных процессов различного генеза является стимуляция регенераторной активности гепа-тотропными средствами. Известно, что наиболее мощным стимулятором регенерации печени является гепатоцитарный фактор роста (HGF). Про-дуццруемый в печени клетками Ито и Купфера, он оказывает аутокринное, паракринное и эндокринное действие (Гарбузенко Д.В., 2008; Джояшвили H.A. и др., 2010). Результаты исследований показали, что HGF способен стимулировать синтез ДНК в первичной культуре гепатоцитов, а также модулировать регенерацию печени после её резекции, при токсикоиндуци-рованном некрозе печени, фульминантной печёночной недостаточности.

Цитокины и простагландины, образующиеся в клетках Купфера, способны воздействовать на клетки печени в острую фазу ответа на повреждение и играют существенную роль в их пролиферации и диф-ференцировке, увеличение продукции которых необходимо лишь на

короткий период, чтобы инициировать рост клеток (Пышкин С.А. и др., 2004). Бесконтрольность процесса приводит к стадии продолжительного острофазового ответа со стимуляцией выработки амилоидных пептидов, угнетению синтеза белка гепатоцитами, ингибированию глюконеогенеза, нарушению митохондриального дыхания и индукции гепатоцеллюлярного апоптоза. Увеличение продукции простагландина Е2 в первые часы регенерации печени связано со стимулирующим влиянием HGF на клетки Купфера. Помимо подавления активности цитокинов, это является мощным митогенным стимулом для пролиферации гепатоцитов (Гарбузенко Д.В., Попов Г.К., 2001).

Анализ данного исследования показал, что АБК, обладая антиокси-дантыми, иммуномодулирующими, цитопротекторными свойствами в сочетании с умеренно выраженной противоопухолевой активностью, является мощным стимулятором биологических реакций в гепатоцитах, клетках Купфера и синусоидальных эндотелиоцитах. Под влиянием АБК репаративная регенерация на ранних сроках токсического поражения осуществляется за счет гипертрофии гепатоцитов: на фоне резкого уменьшения общей численности гепатоцитов сохраняется неизменной поверхностная плотность, площадь поверхности и абсолютная масса гепатоцитов. На 6-й и 8-й неделях эксперимента ведущими регенераторными процессами являются сочетание клеточной и внутриклеточной репаративной регенерации с низким уровнем ферментов цитолиза, стойким повышением численности гепатоцитов, в том числе и двухъядерных клеток, уменьшением массы гепатоцитов, вследствие уменьшения отека цитозоля (Толстикова Т.Г. и др., 2012). Внутриклеточная регенерация характеризуется восстановлением тонкой структуры клеточных органелл с сохранением эндоцитозной активности клеточной мембраны (Молодых О.П. и др., 2007; Сорокина И. В., 2010).

ВЫВОДЫ

1. При субхроническом введении интакгным крысам амид бетулоновой кислоты на ранних сроках эксперимента угнетает пластические (регенераторные) процессы с полной нормализацией их к концу эксперимента. Напротив, введение бетулоновой кислоты на всех этапах эксперимента приводит к уменьшению объема синусоидального русла, умеренному угнетению регенераторно-пластических процессов, но при дальнейшем введении инициирует стойкие деструктивные изменения гепатоцитов.

2. Бетулоновая кислота и ее амид при введении на фоне полихимиотерапии частично купируют гепатопатию, обусловленную сочетанным Цитотоксическим влиянием на печень компонентов схемы CHOP. Амид бетулоновой кислоты наиболее эффективно купирует признаки токсического поражения, уменьшая степень дистрофических поражений и объем очагов некроза гепатоцитов, увеличивая объем синусоидального русла и

числа двуъхядерных гепатоцитов. Введение бетулоновой кислоты способствует нормализации объемной плотности синусоидов, уменьшению выраженности дистрофических поражений гепатоцитов, но инициирует их некротическую гибель.

3. Бетулоновая кислота и ее амид на фоне и без полихимиотерапии не оказывают стимулирующего влияния на рост перевиваемых опухолей лимфомы RLS и карциномы легких Lewis. Амид бетулоновой кислоты потенцирует действие ПХТ в опухолях с различной чувствительностью к циклофосфану. Противоопухолевое действие амида бетулоновой кислоты реализуется путем стимуляции апоптоза с одновременным ингибирова-нием митотической активности и уменьшением объема очагов некроза опухолевых клеток. Бетулоновая кислота, напротив, в большей степени стимулирует некротические процессы в опухолевых клетках, существенно не влияет на уровень апоптоза и снижение митотической активности клеток. При изолированном введении амид бетулоновой кислоты оказывает более выраженное индуцирующее влияние на процессы программируемой гибели клеток лимфомы RLS и карциномы легких Lewis, чем бетулоновая кислота.

4. Инокуляция животным лимфомы RLS и карциномы легких Lewis приводит к развитию неопластической гепатопатии, степень выраженности которой определяется сочетанием общего неопластического влияния опухоли с объемом метастатического поражения. У животных с лимфомой RLS на фоне опухолевой гипоксии и обширного местного диссеминиро-вания, гепатопатия осложняется внутрипеченочным холестазом, глубоким угнетением пластических (регенераторных) процессов с перестройкой архитектоники печени. Поражение печени у животных с карциномой легких Lewis определяется преимущественно общим неопластическим влиянием опухоли, отличительной особенностью которого является развитие мелкоочаговой стромально-сосудистой дистрофии.

5. Введение бетулоновой кислоты и ее амида животным с лимфомой RLS на фоне ПХТ лишь частично купирует проявления гепатопатии, вызывая незначительное увеличение объемной плотности синусоидов, снижая выраженность дистрофических изменений гепатоцитов, оказывая при этом индуцирующее влияние на диссеминацию опухоли в синусоидах. Амид бетулоновой кислоты оказывает стойкое позитивное влияние на течение некробиотических процессов, тогда как бетулоновая кислота вызывает увеличение объема очагов некроза гепатоцитов, угнетает пластический (регенераторный) потенциал клеточных популяций печени. При изолированном введении оба соединения незначительно купируют явления гепатопатии, уменьшают выраженность дистрофических изменений гепатоцитов, оказывая индуцирующее влияние на рост клеточных метастазов в синусоидах, при этом введение бетулоновой кислоты способствует значительному увеличению объема очагов некрозов гепатоцитов.

6. Введение бегулоновой кислоты и ее амида животным с перевитой карциномой Lewis на фоне ITXT обусловливает уменьшение выраженности регенераторно-пластической недостаточности гепатоцитов и снижение степени метастазирования синусоидов. Бетулоновая кислота при изолированном введении животным с карциномой легких Lewis в большей степени, чем ее амид, способствует некротической гибели гепатоцитов и развитию очаговой стромально-сосудистой дистрофии. Амид бегулоновой кислоты при изолированном введении способствует более выраженному генерализованному развитию стромально-сосудистой дистрофии и снижению объемной плотности очагов некротических поражений гепатоцитов.

7. Введение амида бетулоновой кислоты в условиях токсического воздействия, индуцированного тетрахлорметаном и этанолом, способствует восстановлению объема синусоидального русла, предотвращает деструктивно-некротические изменения гепатоцитов, приводит к снижению фиброгенеза (уменьшению объемной плотности соединительной ткани), что предотвращает перестройку архитектоники печени, более эффективно по сравнению с гептралом и бетулоновой кислотой стимулирует регенераторную активность гепатоцитов, что проявляется в увеличении числа одно- и двухъядерных гепатоцитов на всех этапах эксперимента. Бетулоновая кислота частично купирует признаки токсического воздействия, незначительно уменьшая процессы фиброгенеза и степень деструкции гепатоцитов, повышает общее число одноядерных гепатоцитов только к концу эксперимента.

8. Амид бетулоновой кислоты в условиях токсического поражения печени различного генеза, обладая антиоксидантными, иммуномоду-лирующими, цитопротекторными и умеренными цитотоксическими свойствами, является мощным стимулятором биологических реакций в гепатоцитах, клетках Купфера и синусоидальных эндотелиоцитах, способствует повышению устойчивости органа к воздействию патогенных факторов, нормализации функциональной активности и стимуляции регенераторных процессов в печени. Цитопротекгорные свойства реализуются через антиоксидантную и противовоспалительную активность, снижения выраженности деструктивных изменений гепатоцитов, а цитотоксические - через усиление в большей степени апоптотической гибели клеток, чем некротической.

9. Наличие эффекта «первого прохождения» через печень, возможность уменьшать чрезмерно выраженное воспаление, способность подавлять фиброгенез и стимулировать регенерацию печени, отсутствие стимулирующего влияния на рост и метастазирование опухолей и собственной токсичности позволяют позиционировать амид бетулоновой кислоты в качестве универсального гепатопротектора при токсических и метаболических повреждениях печени различного генеза. Бетулоновая кислота может быть использована в качестве перспективной платформы для синтеза новых соединений.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Летягин А.Ю., Сорокина К.Н., Толстикова Т.Г., Жукова Н.А., Попова Н.А., Фурсова Е.Ю., Савелов А.А., Овчаренко В.И. Оценка магнитно-резонансных визуализационных свойств новых нитроксильных радикалов на модели лимфомы RLS // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2007. - Т. 143, № 2. - С. 202 - 205.

2. LetyaginA.Yu., Sorokina K.N., TolstikovaT.G., ZhukovaN.A., Popova N.A., Firsova E.Yu., Savelov A.A., Ovcharenko V.I. Evaluation of magnetic resonance imaging characteristics of new nitroxyl radicals on the model of RLS lymphoma // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2007. - Vol.

143,№2.-P. 240-243.

3. Лушникова Е.Л., Толстикова Т.Г., Непомнящих Л.М., Кпинникова М.Г., Молодых О.П., Свиридов Е.А., Сорокина И.В., Жукова Н.А. Численность кардиомиоцитов в миокарде крыс при воздействии на организм агентов с противоопухолевой активностью - циклофосфана и тритерпеноидов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2007. - Т.

144, № 9. - С. 331 - 337.

4. LushnikovaE.L., TolstikovaT.G., Nepomnyashchikh L.M., Klinnikova M.G., Molodykh О.P., Sviridov E.A., Sorokina I.V., Zhukova N.A. Cardiomyocyte Count in Rat Myocardium under the Effect of Antitumor Agents Cyclophosphamide and Triterpenoids // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2007. - Vol. 144, № 3. - P. 355 - 361.

5. Баев Д.С., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Жукова Н.А., Вееров Д.С., Флехтер О.Б. Новые производные бетулоновой кислоты с антиоксидантной и противоопухолевой активностью //Материалы III Всероссийской научной конференции «Новые достижения в Химии и химической технологии растительного сырья». - Барнаул, 2007. - К. 2. - С. 78 - 82.

6. Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Баев Д.С., Жукова Н.А., Шульц Э.Э., Харитонов Ю.В. Новые антиоксиданты лабданового ряда с гепатопротек-торной и гемостимулирующей активностью. A new antioxidant of labdan type with hepatoprotective and hemostimulative activity // III International conference «Basic science for Medicine». - Novosibirsk, 2007. - C. 175.

7. Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Жукова Н.А., Баев Д.С., Петренко Н.И., Шульц Э.Э. Аланинамидные производные бетулоновой кислоты - перспективные корректоры цитостатической полихимиотерапии опухолей // Материалы II международной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений». - Алматы, Казахстан, 2007.-С. 92.

8. Харитонов Ю.В., Шульц Э.Э., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Баев Д.С., Жукова Н.А., Толстиков Г.А. Антиоксидант, обладающий гепатопро-текторной и гемостимулирующей активностью. - Патент RU № 2364599 С2 от 23.08.2007.

9. Харитонов Ю.В., Сорокина И.В., Шульц Э.Э., Толстикова Т.Г., Баев Д.С., Жукова H.A., Толстиков Г.А. 16-{2-Бензоиламино-2-[3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил) алкилкарбамоил]винил} лабдатриены с антиок-сидантными, гепатопротекторными и гемостимулирующими свойствами. - Патент RU № 2346940 Cl от 23.08.2007.

10. Харитонов Ю.В., Шульц Э.Э., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Баев Д.С., Жукова H.A., Толстиков Г.А. (2)-Метил-16-(5-оксо-2-фенилоксазол-4-илиденметил)-15,16-эпокси-8(17),13 (16),14-лабдатриен-18-оат, обладающий антиоксидантной, гепатопротекторной и гемостимулирующей активностью. - Патент RU № 2353620 Cl от 23.08.2007.

11. Позднякова C.B., Фунтиков A.C., Данильнева Т.В., Жукова H.A., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г. Нефропротективный эффект производных бетулоновой кислоты при экспериментальном цитостатическом повреждении почек у крыс // Бюллетень Сибирского отделения РАМН. - 2007. -Т. 127, №5. -С. 117-121.

12. Гетманова Т.Н., Жукова H.A., Мазуркова H.A., Сенькина Т.Ю., Толстикова Т.Г., Вилесов А.Д., Нечаева Е.А. Патоморфологическое изучение воздействия пасты хвойной хлорофилло-каротиновой на организм белых мышей при однократном пероральном введении // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2007. - № 4.-С. 46-48.

13. Баев Д.С., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Жукова H.A., Казакова О.Б. Антиоксидантная и гепатопротекторная активность новых производных бетулоновой кислоты // Мат. 3-й Всероссийской конф. с межд. участием «Новые информационные технологии в медицине». - Бюллетень Волгоград, научного центра РАМН. - 2008. - № 3. - С. 66 - 67.

14. Sorokina I.V., TolstikovaT.G., ZhukovaN.A., Baev D.C., Schults E.E. Betulonic acid and its alanine amide derivatives - a new multy-target agents for tumor chemotherapy // EHRLICH II - 2nd World Conference on Magic Bullets. - Nürnberg, Germany, 2008. - P. 305.

15. Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Жукова H.A., Баев Д.С., Толстиков Г.А., Казакова О.Б. Корректор паранеопластических повреждений и токсических эффектов цитостатической полихимиотерапии. - Патент RU № 2385324 Cl от 07.07.2008.

16. Жукова Н.А, Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Семенов Д.Е. Морфологические изменения печени животных с перевитой карциномой легких Lewis при коррекции бетулоновой кислотой и её производными // Бюллетень Сибирского отделения РАМН. - 2008. -№ 6. - С. 113 -118.

17. Каледин В.И., Жукова Н.А, Николин В.П., Попова H.A., Беляев М.Д., Багинская Н.В., Литвинова Е.А., Толстикова Т.Г., Лушникова Е.Л., Семёнов Д.Е. Гепатокарцинома-29 - метастазирующая перевиваемая опухоль мышей, вызывающая кахексию // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2009. - Т. 148, № 12. - С. 664 - 669.

18. Kaledin V.l., Zhukova N.A., Nikolin V.P., Popova N.A., Belyaev M.D.,

Baginskaya N.V., Litvinova E.A., Tolstikova T.G., Lushnikova E.L., Semenov D.E. Hepatocarcinoma-29, a metastasizing transplantable mouse tumor inducing cachexia // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2009. - Vol. 148,N 12.-P. 903 - 907.

19. Сорокина И.В., Баев Д.С., Толстикова Т.Г., Жукова Н.А., Казакова О.Б., Гиниятуллина Г.В. N-метилпиперазиниламид бетулоновой кислоты - корректор противоопухолевой химиотерапии 2 - Международный конгресс-партнеринг и Выставка по биотехнологии и биоэнергетике. -Москва, 2010. - С. 172- 173.

20. Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Баев Д.С., Жукова Н.А., Харитонов Ю.В. Производные метилламбертианата - перспективные корректоры цитостаггиков с гепатопротекторной и гемостимулирующей активностью // Химия в интересах устойчивого развития. - 2010. - Т. 18, № 4. - С. 499 - 504.

21. Жукова Н.А., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Долгих М.П., Семенов Д.Е. Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на морфологию почек животных с перевитой карциномой легких Льюис на фюне полихимиотерапии и без ее воздействия // Химия в интересах устойчивого развития. - 2010. - Т. 18, № 4. - С. 483 - 488.

22. Жукова Н.А., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Лушникова Е.Л., Непомнящих Л.М., Семенов Д.Е. Структура печени мышей с перевитой карциномой легких Льюис при полихиомиотерапии и коррекции бетулоновой кислотой и её производными // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010. - Т. 150, № 7. - С. 108 - 112.

23. Zhukova N.A., Sorokina I.V., Tolstikova T.G., Lushnikova E.L., Nepomniashchikh L.M., Semenov D.E. Structure of the liver with transplanted Lewis carcinoma during polychemotherapy and correction with betulonic acid and its derivates // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2010. -Vol. 150, №1.-P. 96-99.

24. Sorokina I.V., Tolstikova T.G., Baev D.S., Zhukova N.A., Tolstikov G.A. Development of cancer chemopreventive agents on betulonic acid platform // BIT's 8th Annual Congresss Of international Drug Discovery Science and technology, Пекин. 2010. - 22-27 October - C. 33.

25. Жукова H.A., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Лушникова Е.Л., Непомнящих Л.М., Семёнов Д.Е. Морфология печени мышей с перевитой карциномой лёгких Льюис при полихимиотерапии и коррекции бетулоновой кислотой и её производными // Сибирский научный вестник. -2010.-Т. XIV.-С. 25-28.

26. Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Жукова Н.А., Баев Д.С., Толсти-ков Г.А., Антимонова А.Н., Петренко Н.И., Шульц Э.Э., Николин В.П., Попова Н.А. Средство для коррекции цитостатической полихимиотерапии с противовоспалительной активностью. // Патент РФ №2325680 от 10.08.2011.-Бюл.№ 22.

27. Бессергенева Е.П., Жукова Н.А., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г.

Исследование влияния Зр,28-ди-0-никотинат бетулина и метилового эфира 3,20-диоксимино-29-норлуп-28-овой кислоты на степень поражения печени на фоне и без полихимиотерапии // Мат. V1 Всеукраин. научно-пракгич. конф. с межд. участием «Современные аспекты медицины и фармации». - Запорожье. Актуальные вопросы фармации и медицины, науки и практики. — 2011. — Вып. XXIV. - №2. - С. 181-182.

28. Sorokina I.V., Tolstikova T.G., Zhukova N.A., Baev D.S., Tolstikov G. A. New cancer chemopreventive agents as modified plant metabolites // Межд. конф. «Current Topics in organic chemistry». - Novosibirsk, 2011. - C. 57.

29. Bessergeneva E.P., Zhukova N.A., Sorokina I.V., Tolstikova T.G., Shul'ts E.E. The influence of 3p,28-di-0-nikotinate of betulin and methyl ether 3,20-dioximino-29-norIup-28-oic acid on the extent of toxic liver injury against a polychemotherapy background and without it in animals with transplanted lymphoma RLS // Межд. конф. «Current Topics in organic chemistry». -Novosibirsk, 2011.-C.85.

30. Толстикова Т.Г., Сорокина И.В., Баев Д.С., Жукова Н.А., Понедель-кина И.Ю., Лукина Е.С., Хайбрахманова Э.А., Одинокое В.Н., Джемилев У.М. Противовоспалительное средство с антикоагулянтной, противоопухолевой и антиметастатической активностью // Патент РФ № 2412712 от 27.02.2011.

31. Толстикова Т.Г., Сорокина И.В., Баев Д.С., Жукова Н. А., Понедель-кина И.Ю., Лукина Е.С., Хайбрахманова Э.А., Одинокое В.Н., Джемилев УМ. Антикоагулянтное средство с противовоспалительной и противоопухолевой активностью // Патент РФ № 2408379 от 10.01.2011.

32. Бессергенева Е.П., Жукова Н.А., Сорокина И.В., Баев Д.С., Толстикова Т.Г. Влияние тритерпеновых производных на биохимические показатели крови животных с токсическим гепатитом // Сборник статей П международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине». - Санкт-Петербург, 2011. - Т. 2. - С. 119 - 123.

33. Бессергенева Е.П., Жукова Н.А., Толстикова Т.Г., Сорокина И.В. Коррекция лекарственно-индуцированной гепатотоксичности новыми тритерпеновыми производными (экспериментальные исследования) // Сибирский онкологический журнал. - 2011. - № 6 (48). - С. 41 - 46.

34. Семенов Д.Е., Жукова Н.А., Бессергенева Е.П., Сорокина И.В., Баев Д.С., Глухов Б.М., Непомнящих Г.И., Толстикова Т.Г. Влияние тритерпеновых производных на общую численность гепатоцитов в печени крыс с токсическим гепатитом // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. - Т. 153, № 6. - С. 837 - 840.

35. Semenov D.E., ZhukovaN.A., BessergenevaЕ.Р., Sorokina I.V., Baev D.S., Glukhov B.M., Nepomnyaschikh G.I., TolstikovaT.G. Effect oftriterpene derivatives on the total hepatocyte count in the liver of rats with toxic hepatitis H Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2012. - Vol. 153, No. 6.-P. 859-862.

36. Жукова H.A., Семенов Д.Е., Бессергенева Е.П., Сорокина И.В., Тол-стикова Т.Г. Коррекция лекарственно-индуцированной гепатотоксичности новыми тритерпеновыми производными при перевиваемой лимфоме RLS // Бюллетень экспериментальной биологии и медиципы. — 2012. - Т. 154,№9.-С. 356 - 360.

37. Толстикова Т.Г., Жукова H.A., Семенов Д.Е., Бессергенева Е.П., Сорокина И.В., Баев Д.С., Глухов Б.М. Биохимические показатели крови и количество гепатоцитов в печени крыс с токсическим гепатитом при действии аланинамида бетулоновой кислоты // Фундаментальные исследования. - 2012. - № 5 (1). - С. 120 - 123.

38. Бессергенева Е.П., Жукова H.A., Сорокина И.В., Баев Д.С., Толстикова Т.Г., Семенов Д.Е. Коррекция токсического поражения клеток печени животных тритерпеновыми производными // IV съезд фармакологов России «Инновации в современной фармакологии». - Казань, 2012. - С.

39. Бессергенева Е.П., Жукова Н.А., Сорокина И.В., Баев Д.С., Толстикова Т.Г., Семенов Д.Е. Исследование гепатопротекгорнош эффекта тритерпеновых производных на животных с токсическим гепатитом // Материалы VI Региональной научно-практической конференции студентов, аспирантов, молодых ученых и учителей «Химическая наука и образование Красноярья». - Красноярск, 2012. - С. 52 - 56.

21-22.

Соискатель

НА.Жукова

Подписано в печать 09.12.2012. Формат 60x84/16. Гарнитура Тайме. Бумага Zoom plus. Усл. печ. л. 2,0. Тираж 100 экз. Заказ № 09. Отпечатано в типографии ОАО "НИИ систем" Новосибирск-58, ул. Русская, 39. т. 306-67-39

3 344

201225194а

2012251943