Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Фармакокоррекция экспериментального токсического поражения печени тритерпеновыми производными

На правах рукописи

ИВАНОВА

ЕКАТЕРИНА ПАВЛОВНА

ФАРМАКОКОРРЕКЦИЯ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ТОКСИЧЕСКОГО ПОРАЖЕНИЯ ПЕЧЕНИ ТРИТЕРПЕНОВЫМИ ПРОИЗВОДНЫМИ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 8 НОЯ 2013

005539989

Томск - 2013

005539989

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Новосибирском институте органической химии им. H.H. Ворожцова Сибирского отделения Российской академии наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Толстикова Татьяна Генриховна

Официальные оппоненты:

Плотников Марк Борисович, доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, лаборатория фармакологии кровообращения, руководитель лаборатории

Чучалин Владимир Сергеевич, доктор фармацевтических наук, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра фармацевтической технологии, заведующий кафедрой

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «_» _ 2013г. в_на заседании

диссертационного совета Д 001.031.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук по адресу: 634028, г. Томск, пр. Ленина 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Автореферат диссертации разослан «_»_ 2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор биологических наук —~ Амосова Евдокия Наумовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Токсические поражения печени являются актуальной проблемой в мире и связаны с ключевой ролью печени в процессах детоксикации, депонирования эндогенных и экзогенных субстанций (Yang et al., 2008). Особое место в гепатологии занимают лекарственно-индуцированные поражения печени, которые являются следствием неконтролируемого приема лекарственных препаратов, биологически активных добавок, полипрагмазии, интенсивных схем полихимиотерапии в онкологии. Центральным звеном патогенеза токсического поражения печени является окислительный стресс, митохондриальная дисфункция, нарушение обмена кальция. Повреждение и деструкция гепатоцитов является пусковым моментом активации других клеточных популяций, которые инициируют воспалительную реакцию, адаптивный иммунный ответ с развитием реактивного фиброза (цирроза) печени и гепатоцеллюлярного рака (Блюм Х.Е., 2007; Корой П.В., Ягода A.B., 2007; Ивашкин В.Т. и др., 2009).

В связи с этим чрезвычайно важной является проблема медикаментозной коррекции поражений печени. В настоящее время группа гепатотропных средств интенсивно расширяется за счет новых препаратов как синтетического, так и природного происхождения различных классов: флавоноидов, сапонинов, кумаринов, терпеноидов. В этом ряду особое место занимают пентациклические тритерпеноиды лупанового типа -легкодоступные растительные метаболиты. Лупеол, бетулин, бетулиновая кислота, обладают широким спектром фармакологической активности: противовоспалительной, антитоксической, иммуномодулирующей, противоопухолевой (Семенченко В.Ф., 1993; Yasukawa К. et al., 1991; Толсгикова ТГ., Сорокина HB., Толсгиков ГА и др., 2006). В многочисленных экспериментах установлено, что в основе гепатозащитного и антиоксидантного действия бетулина, бисгемифталата бетулина, бетулиновой кислоты при токсическом воздействии лежит их способность регулировать состояние никотинамидных коферментов, процессы белкового синтеза, сохранять энергетический баланс клетки (Кузнецов Б.Н. и др., 1998; Карачурина JI.T. и др., 2003).

В результате химических модификаций из бетулина путем одностадийного окисления получена бетулоновая кислота и ее синтетические производные. В экспериментальных исследованиях установлено, что бетулоновая кислота и ее производные обладают антиоксидантными, гепато-, нефро-, кардиопротекторными и умеренно выраженными противоопухолевыми свойствами (Позднякова C.B. и др., 2005; Толстикова Т.Г. и др., 2006; Жоголь P.A., 2006). В ходе скрининга выявлены наиболее перспективные агенты с широким спектром биологической активности -бетулоновая кислота, как основа для создания новых полифункциональных агентов, и ее ß-аланинамидное производное (бетамид) (Сорокина И.В., 2010).

До настоящего времени хорошо изучены противоопухолевые, антиоксидантные, органопротекторные свойства бетулоновой кислоты и бетамида, но за рамками внимания до сих пор оставалось влияние этих соединений на процессы репаративной регенерации печени, популяционную динамику гепатоцитов и фиброгенез. Настоящая работа посвящена изучению влияния бетулоновой кислоты и бетамида на данные процессы.

Цель исследования. Изучить влияние бетулоновой кислоты и бетамида на процессы фиброгенеза и регенерации печени крыс при сочетанном токсическом воздействии тетрахлорметаном и этанолом.

Для достижения данной цели были сформулированы следующие задачи исследования:

1. Изучить влияние длительного введения бетулоновой кислоты и бетамида на функцию печени интактных крыс по динамике биохимических показателей крови и морфологических характеристик ткани органа.

2. Исследовать корректирующее влияние бетулоновой кислоты и бетамида на течение хронического токсического гепатита, индуцированного тетрахлорметаном и этанолом, в сравнении с гептралом путем оценки динамики биохимических показателей крови крыс.

3. Изучить влияние бетулоновой кислоты и бетамида на течение хронического токсического гепатита, индуцированного тетрахлорметаном и этанолом, в сравнении с гептралом путем оценки степени морфологических изменений и регенераторного потенциала печени крыс в динамике.

4. Определить возможный механизм действия бетамида и бетулоновой кислоты на процессы репаративной регенерации печени.

Научная новизна работы. Впервые изучено комплексное влияние тритерпеновых соединений (бетулоновой кислоты и бетамида) в сравнении с гептралом на течение хронического токсического гепатита, вызванного длительным введением тетрахлорметана и этанола, по изменению биохимических и морфометрических показателей, а также по изменению количественной динамики клеточных популяций печени крыс. Показано, что бетамид купирует явления холестаза, предотвращает развитие фиброза и жировой инфильтрации гепатоцитов.

Впервые установлены различия в патогенезе гепатопротекторного действия бетулоновой кислоты и бетамида. Бетулоновая кислота в ранние сроки после введения способствует компенсации пластической недостаточности гепатоцитов, купирует явления некробиоза и цитолиза, не оказывая достоверного влияния на регенераторный потенциал гепатоцитов. Бетамид, в отличие от бетулоновой кислоты, одинаково эффективно на всех этапах эксперимента стимулирует регенераторно-пластический потенциал гепатоцитов, купирует явления холестаза и полностью предотвращает процессы фиброгенеза.

Теоретическая и практическая значимость. Изучено влияние бетулоновой кислоты и бетамида на динамику регенераторно-пластических и десмопластических процессов в печени в условиях воздействия гепатотоксинами. Полученные в работе новые знания могут быть использованы при разработке новых схем лечения хронических токсических гепатитов. Результаты исследования включены в материалы по доклиническим испытаниям новых корректоров токсических поражений печени в ряду производных бетулоновой кислоты. Материалы данной работы могут быть использованы при подготовке лекционных спецкурсов по патологической анатомии, фармакологии и медицинской химии.

Положения, выносимые на защиту.

1. Бетамид на ранних сроках введения (7 суток) интактным крысам снижает пластические и регенераторные процессы в гепатоцитах, но полностью нормализует их при продолжении введения к концу исследования (40 суток). Бетулоновая кислота на протяжении всего исследования угнетает регенераторно-пластические процессы в печени интактных крыс, стимулируя при этом на поздних сроках некротические изменения гепатоцитов.

2. Бетамид на фоне экспериментального токсического поражения печени полностью предотвращает развитие токсемии и фиброза на всех этапах исследования, стимулирует регенераторно-пластические процессы, купирует явления холестаза, цитолиза, уменьшает гипоксическое повреждение гепатоцитов. Бетулоновая кислота купирует признаки цитолиза, снижает активность процессов фиброгенеза и степень деструкции гепатоцитов, способствует увеличению количества одноядерных гепатоцитов.

3. Бетамид повышает устойчивость ткани печени к токсическому воздействию, нормализует функциональную активность органа и предлагается в качестве доступного источника для создания высокоэффективных гепатопротекторов.

Апробация результатов. Основные результаты работы представлены на международной конференции «Current topics in organic chemistry» (Новосибирск, 2011); Всеукраинской научно-практической конференции с международным участием «Современные аспекты медицины и фармацевтики» (Запорожье, 2011); Н-ой международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (Санкт-Петербург,

2011); ХХ-ой юбилейной международной конференции и дискуссионном научном клубе «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Ялта-Гурзуф, 2012); конференции «Медицина та фармащя XXI столптя-крок у майбутнс» (Запорожье, 2012); IV-м съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань,

2012); а также VI-ой региональной научно-практической конференции

студентов, аспирантов, молодых ученых и учителей «Химическая наука и образование Красноярья» (Красноярск, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 5 статей - в журналах, входящих в перечень печатных изданий, рекомендуемых ВАК для публикаций.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 152 страницах компьютерного текста и включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты собственных исследований и обсуждение, заключение, выводы; иллюстрирована 7 таблицами, 68 микрофотографиями. Список использованной литературы включает 104 работы отечественных и 108 работ иностранных авторов.

Работа выполнена в лаборатории фармакологических исследований Отдела медицинской химии ФГБУН Новосибирский институт органической химии им H.H. Ворожцова СО РАН (зав. лаб. - д.б.н., проф. Т.Г. Толстикова).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика экспериментального материала. Работа выполнена на 420 крысах-самках линии Вистар массой 180 - 200 г, полученных из лаборатории экспериментальных животных Института цитологии и генетики СО РАН и содержащихся в стандартных условиях вивария на обычном пищевом и водном рационе. Манипуляции с животными проводили в строгом соответствии с законодательством Российской Федерации, положениями «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1986).

В работе исследованы новые полусинтетические соединения, синтезированные в лаборатории медицинской химии Новосибирского института органической химии СО РАН им. H.H. Ворожцова (зав. лаб. -д.х.н., проф. Э.Э. Шульц) из бетулина (3-оксо-20(29)-лупен-28-ол): бетулоновая кислота - (3-оксо-20(29)-лупен-28-овая кислота) и ее пептидное производное, содержащее у атома С-28 ß-аланин - 3-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-аминопропионовая кислота (бетамид). Данные соединения относятся к тритерпеноидам лупанового ряда. Бетулоновую кислоту и бетамид вводили животным внутрижелудочно в дозе 50 мг/кг в водно-твиновом растворе. Средняя эффективная доза (50 мг/кг) для данных соединений выбрана в результате экспериментальных исследований.

В качестве референсного соединения использовали фармакопейный препарат гептрал (адеметионин) (Фамар Л'Эйль, Франция), который вводили животным внутрибрюшинно в дозе 6 мг/кг. Доза была пересчитана со средней суточной терапевтической дозы человека (Хабриев Р.У., 2005). Способ введения препарата гептрал был выбран на основании многочисленных литературных данных, в которых показана его наибольшая эффективность для купирования токсических поражений.

Влияние длительного ежедневного перорального введения бетулоновой кислоты и бетамида изучали на интактных крысах. Через 7, 14 и

40 суток после начала применения исследуемых соединений проводили биохимическое исследование крови, а также морфологическое и морфометрическое исследование ткани печени.

Модель токсического гепатита, фиброза, цирроза печени. Токсическое повреждение печени, фиброз и цирроз моделировали путем внутрижелудочного введения тетрахлорметана (СС14) в дозе 0,1 мл/кг в растворе растительного масла (0,3 мл/100 г) трижды в неделю в течение 6 недель. Для ускорения формирования хронического патологического процесса в печени использовали потенцирование гепатотоксического эффекта СС14 с помощью 5%-ного раствора этилового спирта с глюкозой, который предоставлялся в качестве питья вместо воды в свободном доступе на протяжении 6 недель (Хабриев Р.У., 2005).

Все животные были разделены на 5 групп по 15 особей в каждой. Животные I группы получали тетрахлорметан и раствор этанола (негативный контроль), II группы - гептрал (адеметионин) (позитивный контроль), III группы - БК, IV - бетамид, V группы - водно-твиновый раствор (интактный контроль). Препарат сравнения гептрал и исследуемые агенты вводили ежедневно со 2-й по б-ю неделю эксперимента включительно. Две последующие недели (7, 8) служили восстановительным периодом. Животных выводили из эксперимента декапитацией через 3, 6 и 8 недель. Для биохимического анализа проводили забор крови из шейных сосудов. Для гистологического исследования была взята печень.

Методы биохимического исследования. Биохимические показатели крови: аланинаминотрансферазу (АЛТ), аспартатаминотрансферазу (ACT), щелочную фосфатазу (ЩФ), общий белок, прямой билирубин, глюкозу и лактатдегидрогеназу (ЛДГ) определяли с использованием стандартных диагностических наборов фирмы «Ольвекс-диагностикум» на фотометре -5010 «Boehringer Mannheim» (Германия).

Методы гистологического исследования. Полученный для морфологического исследования материал фиксировали в 10%-ом нейтральном формалине с последующей автоматической проводкой на комплексе «MICROM» (аппарат НМР 110) («Carl Zeiss» Германия) по стандартной методике (Лилли Р., 1969). Препараты заливали в парафиновые блоки на станции АР 280; на ротационном микротоме HM 335Е получали срезы толщиной 3-5 мкм. Обзорную окраску срезов проводили гематоксилином Лилли-Майера и 10%-ым эозином (Лилли Р., 1969) в автомате HMS 70 с заключением в бальзам Shandonmount.

Методы гистохимического исследования. Для более детального изучения процессов фиброгенеза использовали дополнительные гистохимические окраски: по Ван-Гизону, Маллори, Массону, по методу ШИК-гематоксилин-оранжевый G и аллохромное окрашивание соединительной ткани по Лилли. Окрашенные препараты исследовали методом световой микроскопии в проходящем свете на микроскопе Axioskop

40. Микрофотографии сделаны с использованием фотокамеры АхюСат МЯс и программного обеспечения АхюУшоп 4.5.

Морфометрический анализ срезов проведен при увеличении микроскопа х400 с использованием окулярной сетки на 289 точек (Непомнящих Л.М. и др., 2003). Подсчет проводили в 10-15 полях зрения каждого препарата от 10 животных в группе. В тканевом микрорайоне печени подсчитывали объемную и поверхностную плотность гепатоцитов, некрозов, синусоидов и соединительной ткани. Объемную плотность каждого структурного компонента определяли по его доле с применением формулы: Уу=х/п; где х — количество точек, приходящихся на определенный структурный компонент; п - общее количество подсчитанных точек (Автандилов Г.Г., 1990). Изменение объемной плотности в опытных группах выражали в процентах относительно контроля. Поверхностную плотность рассчитывали по формуле: 8у=4^/рхг; где ] - число пересечений тестовой линии с поверхностью элементов; р - число точек сетки; г - длина тестовой линии в масштабе увеличения микроскопа. Абсолютный объем какого-либо компонента печени (VI) рассчитывали из уравнения: У1=У*Уу1; где V -объем печени, \М - относительный объем компонента. Так как удельная масса печени близка к единице, то объем печени считают равным его массе. Абсолютную массу тканевых компонентов печени с токсическим гепатитом вычисляли по формуле: т=МхУу1; где М - абсолютная масса печени; Уу1 -относительный объем компонента. Площадь поверхности структурных элементов (Б) вычисляли путем умножения поверхностной плотности элементов на объем ткани печени: 8=8уху (Семенова Л.А. и др., 1985).

Метод щелочной диссоциации фиксированной ткани. Для оценки популяционной динамики гепатоцитов была проведена щелочная диссоциация печени (Семенова Л. А., 1985). Клеточную суспензию окрашивали 30 мин 1%-ным раствором орсеина на 70%-ной уксусной кислоте, разводили дистиллированной водой до концентрации 5 мг/мл. Подсчет ядер гепатоцитов из одного образца ткани проводили в 6-ти последовательно заполняемых суспензией камерах Горяева. Рассчитывали: п - число ядер гепатоцитов в 1 мг ткани по формуле: п=х/УхС; где х - среднее число ядер гепатоцитов в одной камере; V - объем камеры Горяева (0,9x10'3 мл); С - концентрация суспензии (5 мг/мл); абсолютное число ядер гепатоцитов в печени (Ы): Ы=пх\У; где п - число ядер гепатоцитов в 1 мг ткани, \У - масса печени. Абсолютное число (М) гепатоцитов в печени определяли по формуле:М=НхЮ00/ш; где ш - число ядер в 1000 гепатоцитов.

Статистическая обработка результатов проведена с помощью программного пакета «в^Б^са 7.0». Результаты представлены как среднее (М) ± стандартная ошибка среднего (т). Достоверность определяли по Ь критерию Стьюдента. Результаты считали достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние бетулоновой кислоты и бетамида на динамику структурных изменений печени интактных крыс при длительном введении

Биохимическое исследование крови животных на фоне введения бетулоновой кислоты и бетамида. Данные биохимического исследования крови интактных животных на фоне длительного введения бетулоновой кислоты и бетамида представлены в таблице 1.

Таблица 1. Биохимические показатели крови животных при длительном

03 К С £ Общий белок, г/л Бил. пр., мкм оль/л Глюкоза, ммоль/л АЛТ, Ед/л АСТ, Ед/л ЩФ, Ед/л лдг, Ед/л

7 сутки введения

ИК 57,6 ±0,4 2,6 ±0,8 5,34 ±0,1 21,2 ±2,5 22,7 ±5,5 62,3 ±7,9 176,9 ±18,5

БК 59,0 ±0,4 1,7 ±0,4 5,51 ±0,1 17,8 ±2,9 23,7 ±2,3 69,9 ±10,3 113,2 ±24,2*

Бетамид 58,6 ±0,4 6,8 ±2,8 5,53 ±0,03 13,2 ±2,3* 11,4 ±1,7 52,5 ±7,2 94,5 ±16,1*

14 сутки введения

ИК 60,4 ±0,6 1,6 ±0,2 5,6 ±0,1 23,2 ±2,2 25,6 ±5,6 75,9 ±7,8 101,0 ±14,9

БК 58,9 ±0,4* 1,3 ±0,2 5,6 ±0,1 33,3 ±6,5 33,7 ±7,8 56,9 ±7,8 75,4 ±7,8

Бетамид 58,9 ±0,6 1,5 ±0,2 5,6 ±0,1 31,2 ±3,2 40,2 ±6,9 62,3 ±11,9 67,2 ±8,5

40 сутки введения

ИК 60,0 ±0,4 1,0 ±0,2 5,7 ±0,7 21,7 ±2,0 36,9±3 ,9 89,5 ±5,7 182,9 ±21,4

БК 61,5 ±0,6 1,4 ±0,3 6,7 ±0,1 20,4 ±1,6 33,7±2 ,3 83,4 ±9,1 100,0 ±24,4*

Бетамид 58,4 ±1,1 1,5 ±0,2 9,8 ±0,8* 19,4 ±2,1 33,6±1 4,7 84,0 ±7,2 74,5 ±14,2*

билирубин.

Установлено, что при длительном введении бетулоновой кислоты и бетамида биохимические показатели существенно не изменялись. Исключением являлись ЛДГ, активность, которой снижалась под влиянием тестируемых соединений, и глюкоза, ее уровень увеличивался на 40-е сутки введения бетамида.

Морфологическое исследование печени интактных крыс при длительном введении бетулоновой кислоты и бетамида. Структурные

изменения печени интактных крыс на фоне внутрижелудочного ежедневного введения БК и бетамида в дозах 50 мг/кг оценивали на 7-е, 14-е и 40-е сутки. На протяжении всего эксперимента у контрольных животных архитектоника печени была сохранена, желчные капилляры, вены и артерии имели типичное строение, а признаки патологической инфильтрации и фиброза отсутствовали. Мелковезикулярная жировая дистрофия регистрировалась в отдельных гепатоцитах перипортальных зон, некрозы выявлялись преимущественно моноцеллюлярные, часто наблюдались двухъядерные гепатоциты, а в синусоидах - купферовские клетки без признаков повышенной активности и мононуклеарные лейкоциты (табл. 2).

Таблица 2. Морфометрическое исследование печени интактных крыс на фоне введения БК и бетамида

Группы/сроки введения (сутки) Синусоиды Некроз гепатоцитов Дистрофия гепатоцитов 2х-ядерные гепатоциты

V*, % У* % V*, %

ик 25,63±0,83 1,19±0,31 2,78±0,42 7,74±0,51

БК 7 23,11±0,30 1,53±0,21 2,08±0,21 5,22±0,44

14 25,73±0,23 2,68±0,18* 3,50±0,86* 4,57±1,00*

40 22,66±0,28 2,33±0,39* 1,54±0,34 5,67±0,42*

Бетамид 7 25,00±0,27 1,68±0,20 1,12±0,24 б,82±0,бб

14 23,84±0,38 0,77±0,09 3,64±0,43 6,36±0,25

40 22,02±0,44 0,82±0,17 0,97±0,52* 7,70±0,53

Примечание. УУ1 - объемная плотность структуры; N3, - количество на 1000 клеток.

При длительном введении бетулоновая кислота на всех этапах эксперимента стимулировала развитие деструктивно-некротических изменений в печени. Морфометрический анализ позволил выявить отрицательную тенденцию динамики структурных компонентов печени по сравнению с контролем и группой животных, получавших бетамид. В гепатоцитах отмечалась жировая и очаговая гидропическая дистрофия. На 14-е и 40-е сутки после введения БК на 125% увеличилась доля некрозов гепатоцитов. Максимальное, на 41%, уменьшение численной плотности двухъядерных гепатоцитов наблюдалось на 14-е сутки с незначительной положительной динамикой к 40-м суткам, в сравнении с бетамидом (табл. 2).

На фоне введения бетамида выраженных альтеративных изменений ткани печени по сравнению с БК не отмечалось. На 7-е сутки после введения бетамида наблюдалось недостоверное увеличение объемной плотности клеточных некрозов, с полным восстановлением паренхимы к 40 суткам. Под влиянием бетамида численная плотность двухъядерных гепатоцитов на протяжении всего эксперимента превышала аналогичные показатели в группе животных, получавших БК (табл. 2).

Таким образом, при введении бетамида на ранних сроках (7 суток) наблюдается развитие деструктивных изменений с полной нормализацией

10

регенераторных и пластических процессов к 40-м суткам, что можно расценивать как адаптивную реакцию. В случае аналогичного введения БК, выраженные деструктивно-некротические процессы на всех этапах эксперимента приводят к снижению регенераторного потенциала печени, что может являться свидетельством развития тканевой гипоксии (Оковитый C.B., 2003).

Исследование влияния бетулоновой кислоты и бетамнда на динамику токсического поражения печени крыс, индуцированного тетрахлорметаном и этанолом, в сравнении с гептралом

Биохимическое исследование крови животных. Как известно, при воздействии большинства гепатотоксичных веществ нарушаются обменные и ферментативные процессы в печени. Данные измения обусловлены перекисным окислением липидов в мембранах гепатоцитов, что в дальнейшем приводит к нарушению проницаемости клеточных мембран и выходу внутриклеточных ферментов в кровеносное русло (Burk R.F. et al., 1984; Lieber C.S., 2000). Для выявления степени повреждения печени был проведен биохимический анализ крови животных с определением уровня прямого билирубина, АЛТ и ACT, ЩФ, ЛДГ, общего белка и глюкозы.

В группе негативного контроля (тетрахлорметан в сочетании с этанолом) через 3 недели было установлено статистически достоверное повышение активности внутриклеточных ферментов АЛТ, ACT, ЩФ, ЛДГ на 115%, 189%, 229% и 262% соответственно, по сравнению с интактным контролем (табл. 3). Известно, что при токсическом гепатите, фиброзе, циррозе уровень глюкозы в крови падает, что обусловлено быстрым истощением запасов гликогена в печени в связи с нарастающей тканевой гипоксией (Камышников B.C., 2011). Так, уровень глюкозы в группе негативного контроля к концу 3-ей недели снизился на 27% относительно группы интактных животных. Однако, в связи с тем, что в нашем эксперименте все крысы на протяжении 6-ти недель получали 5%-ный раствор этанола с глюкозой, то не представляется возможным дать объективную оценку углеводному обмену. Летальность в группе негативного контроля на 3-й неделе эксперимента составила 20%. В группе животных с токсическим поражением печени через 6 недель в сыворотке крови сохранялись повышенные уровни ферментов ЩФ, АЛТ, ACT и ЛДГ на 129%, 46%, 167% и 105% соответственно, относительно показателей интактного контроля. Концентрация общего белка сыворотки крови в группе негативного контроля достоверно увеличилась на 57% (табл. 3). Гиперпротеинемия может быть связана, как с дегидратацией животных, употреблявших в качестве питья 5%-ный раствор этилового спирта, так и с повышенным синтезом иммуноглобулинов под влиянием алкогольного гиалина. Динамика уровней ферментов свидетельствует о выраженном холестатическом синдроме, массивном цитолизе гепатоцитов и нарастающей тканевой гипоксии (Кольман Я., Рем К.-Г., 2000; Камышников B.C., 2011). Смертность возросла

до 40% (табл. 3). На основании этих данных можно сделать вывод о развитии у всех животных в группе негативного контроля тяжелого прогрессирующего токсического поражения печени.

Таблица 3. Биохимические показатели крови крыс при введении бетулоновой

кислоты, бетамида и гептрала на фоне токсического воздействия

Группы Срок (нед.) Общий белок, г/л Бил. пр., мкмоль/л Глюкоза, ммоль/л АЛТ, Ед/л ACT, Ед/л ЩФ, Ед/л ЛДГ, Ед/л Летальность, %

3 78,9 ±8,0 22,1± 7,1 4,5 ±0,5* 239,2 ±25,9* 480,2 ±99,3* 1293,6 ±275,7* 2257,7 ±451,3* 20

X 6 102,0 ±3,8* 8,1 ±1,1 4,8 ±1,0 162,4 ±11,6* 443,5 ±67,7* 901,4 ±120,8* 1281,2 ±104,4* 40

8 98,3 ±8,1* 2,8 ±1,2 6,9 ±0,2 222,0 ±22,6* 296,9 ±29,9* 940,2 ±105,3* 1845,3 ±259,7* 0

3 91,2 ±5,8 16,1 ±2,6 6,7 ±0,3* 180,1 ±13,3* 458,3 ±32,4 1323,0 ±201,8 2297,9 ±147,2 0

& R и 6 89,0 ±5,5 3,7 ±0,6* 6,8 ±0,7 84,5 ±10,0* 184,0 ±9,9* 479,7 ±53,4* 1304,2 ±125,6 0

(-Н 8 96,5 ±8,2 2,7 ±0,6 7,0 ±0,3 161,5 ±11,9* 249,3 ±11,0 551,2 ±57,8* 1504,3 ±149,1 0

3 98,2 ±12,5 18,6 ±4,2 6,1 ±0,4* 120,4 ±15,5* 258,4 ±47,4 1227,5 ±129,9 1491,0 ±135,3 19

« W 6 84,0 ±6,6* 21,9 ±1,4* 7,0 ±0,3* 164,5 ±45,7 363,1 ±84,5 906,6 ±301,7 1191,6 ±145,3 19

8 77,9 ±5,6 5,6 ±1,5 3,8 ±0,3* 127,8 ±16,0* 244,2 ±25,1 519,8 ±49,5* 727,7 ±167,2* 0

§ 3 82,0 ±8,4 11,6 ±2,4 6,0 ±0,2* 128,3 ±11,7* 233,8 ±27,4* 435,0 ±49,3* 1266,1 ±57,4* 0

S В о 6 85,5 ±7,4 20,7 ±1,5* 8,5 ±0,5* 78,9 ±5,5* 164,9 ±8,4* 317,6 ±26,7* 1414,0 ±68,4 5

М 8 103,6 ±7,9 5,8 ±1,8 5,2 ±0,4* 107,7 ±15,4* 217,7 ±20,7* 285,5 ±32,2* 583,3 ±113,3* 0

ик 8 64,8 ±2,2 8,9 ±3,0 6,2 ±0,4 111,4 ±11,7 165,9 ±27,2 393,2 ±83,0 623,5 ±231,0 0

Примечание. Здесь и далее р< 0,05 - относительно НК.

Биохимическое исследование крови животных с токсическим поражением печени в условиях коррекции бетулоновой кислотой и бетамидом в сравнении с гептралом. Введение животным бетулоновой кислоты сопровождалось неоднозначными изменениями биохимических показателей. Через 3 недели активность АЛТ была статистически достоверно меньше на 50%, чем в группе негативного контроля. Также наблюдалась тенденция снижения уровня ACT (табл. 3). Однако активности ЩФ и ЛДГ достоверно не изменялись относительно аналогичных показателей у крыс

12

контрольной группы, которые подвергались только токсическому воздействию, что является свидетельством сохранения тканевой гипоксии и синдрома холестаза у животных, получавших бетулоновую кислоту. Через 6 недель эксперимента уровень прямого билирубина в данной группе был выше на 170%, чем в группе животных негативного контроля на том же сроке наблюдения. С одной стороны, этот факт подтверждает сохранение функциональной активности гепатоцитов, а с другой - наличие выраженного внутрипеченочного холестаза. Активности ферментов AJ1T и ACT, ЩФ и ЛДГ в группе животных, получавших бетулоновую кислоту, через 6 недель опыта достоверно не отличались от аналогичных показателей группы негативного контроля (табл.3).

Наиболее выраженная положительная динамика уровней ферментов на всех этапах исследования выявлена у животных, получавших бетамид. Введение бетамида крысам через 3 недели привело к достоверному снижению активности ферментов ACT и АЛТ на 51% и 46% соответственно, а ЩФ и ЛДГ - на 66% и 44%, относительно группы негативного контроля (табл. 3). На 6-й неделе эксперимента уровни ферментов ACT, АЛТ, ЩФ существенно не отличались от таковых показателей интактного контроля. Следует подчеркнуть, что на фоне введения бетамида как через 3, так и через 6 недель уровни ACT и ЩФ были существенно ниже, чем в группе животных, получавших гептрал (табл. 3).

Под влиянием гептрала уменьшилась активность АЛТ относительно группы негативного контроля на 3-й неделе эксперимента на 25%, на 6-ой неделе - на 48% (табл. 3). Уровень ферментов ACT, ЩФ и прямого билирубина на 6-ой неделе эксперимента был достоверно меньше аналогичных показателей негативного контроля на 59%, 47% и 54% соответственно (табл. 3). Следует отметить положительное влияние гептрала на проявления токсемии: гибели животных в данной группе на всех этапах эксперимента не наблюдалось.

Таким образом, бетамид на 3-й и 6-ой неделе эксперимента наиболее эффективно купировал признаки холестаза, цитолиза и тканевой гипоксии. Бетулоновая кислота нивелировала симптомы цитолиза, а гептрал способствовал снижению степени токсемии, холестаза и цитолиза.

Биохимическое исследование крови животных в восстановительный период. В восстановительном периоде у животных в группе негативного контроля уровни исследуемых ферментов оставались значительно повышенными по сравнению с показателями интактного контроля. Так, активность ACT, ЛДГ, ЩФ была выше аналогичных показателей группы интактного контроля на 79%, 196% и 139% соответственно (табл. 3).

В группе животных, получавших бетамид, наблюдалось восстановление уровней ЩФ, ЛДГ и АЛТ до показателей интактного

контроля, тогда как у животных после применения БК показатели АЛТ, ЩФ и ЛДГ значительно превышали таковые в интактном контроле (табл. 3).

В результате использования гептрала уровни ферментов АЛТ и ЩФ уменьшились на 27% и 49% соответственно относительно группы негативного контроля (табл. 3). После введения гептрала исследуемые биохимические показатели существенно не отличались от таковых у животных, получавших бетулоновую кислоту, и превышали аналогичные показатели у животных после применения бетамида (табл. 3).

Таким образом, в восстановительном периоде выраженная положительная динамика уровней ферментов, достигающая значений интактного контроля, была зарегистрирована только в группе животных, получавших бетамид. У животных после введения бетулоновой кислоты и гептрала отмечалась нормализация показателей АЛТ и ЩФ. В группе негативного контроля наблюдалось существенное увеличение уровней АЛТ, ЩФ и ЛДГ, что является свидетельством сохраняющегося холестаза, цитолиза гепатоцитов и нарастающей тканевой гипоксии.

Влияние бетулоновой кислоты и бетамида на морфологические и морфометрические показатели печени крыс на фоне длительного токсического воздействия тетрахлорметаном и этанолом

Морфология печени животных на фоне длительного введения тетрахлорметана в сочетании с этанолом на 3-й и 6-ой неделе эксперимента. На 3-й неделе в группе негативного контроля (СС14 в сочетании с этанолом) смертность составила 20%. При светооптическом исследовании выявлены резкие отличия степени и стадии патологического процесса в группе. У 5 из 6 оставшихся животных популяция гепатоцитов была достаточно однородной с низким содержанием гликогена. Преобладающим видом дистрофии являлась мелко- и средневезикулярная жировая дистрофия с локализацией в центролобулярных зонах. В перипортальных зонах наблюдались мелкоочаговые некрозы гепатоцитов со слабо выраженной лимфоцитарной инфильтрацией портальных трактов. Соединительная ткань локализована в портальных трактах без распространения в перисинусоидальные зоны. На фоне венозного полнокровия в просвете синусоидов отмечались клетки Купфера с признаками повышенной активности и лимфоциты. Описанные выше изменения соответствуют минимальной степени активности альтеративного процесса. У одного животного, напротив, были ярко выражены признаки токсического поражения: полиморфная жировая дистрофия с образованием внеклеточных жировых кист, мелкоочаговые некрозы гепатоцитов, тельца Каунсилмена в синусоидах, выраженный фиброз смешанного типа с перестройкой печеночных балок, формированием ложных долек и пролиферацией эпителия желчных протоков. Клеточная инфильтрация -диффузная лимфоцитарная, эозинофильная мелкоочаговая. На фоне выраженного венозного полнокровия отмечались гемосидероз, редукция

синусоидального русла с признаками повышенной активности купферовских клеток.

При морфометрическом исследовании наблюдалась тенденция роста объемной плотности некрозов в 1,5 раза по сравнению с интактным контролем (табл. 4). Объемная и поверхностная плотность гепатоцитов существенно не изменилась, но при этом на 24% увеличилась абсолютная масса и площадь их поверхности (табл. 4). При подсчете клеток (метод щелочной диссоциации) выявлено уменьшение по сравнению с интактным контролем количества одно- и двухъядерных гепатоцитов на 68% и 98% соответственно (табл. 5). Объем синусоидального русла уменьшился в 1,5 раза, поверхностная плотность - на 40%, и на 60% - площадь поверхности синусоидов (табл. 7). Увеличились все показатели соединительной ткани: объемная и поверхностная плотность в 7 и 6 раз соответственно, абсолютная масса - в 11 раз (табл. 6).

К 6-й неделе эксперимента у всех животных в группе негативного контроля увеличивалась степень деструктивно-некротических поражений гепатоцитов. Наблюдался прогрессивный рост соединительной ткани с пролиферацией желчных капилляров, нарушением гемодинамики, пигментного обмена и структурной перестройкой паренхимы (фиброз смешанного типа). Прослойки фиброзной ткани широкие в перипортальных зонах и более узкие в перисинусоидальных пространствах. Следует отметить выраженный полиморфизм гепатоцитов с признаками очаговой дисплазии. Выражена пролиферация эпителия желчных протоков с аденоматозной трансформацией, в перипортальных зонах выявлялись желчные пигменты. Клеточная инфильтрация - диффузная лимфоцитарная, слабо выражена. В просвете синусоидов часто наблюдались постнекротические тельца Каунсилмена.

При морфометрическом исследовании в сравнении с 3-й неделей эксперимента в группе негативного контроля зарегистрировано уменьшение на 50% абсолютной массы, поверхностной плотности и площади поверхности гепатоцитов (табл. 4). Методом щелочной диссоциации выявлен рост общего числа гепатоцитов на 18% (табл. 5). По сравнению с 3-й неделей эксперимента на 247% увеличился объем соединительной ткани, на 362% увеличилась поверхностная плотность и на 110% увеличилась площадь поверхности соединительной ткани (табл. 6). На этом фоне отмечалось уменьшение всех параметров синусоидального русла в 1,5-2 раза (табл. 7). Данные морфологического исследования подтверждаются и результатами биохимических анализов, в которых установлено многократное превышение уровня ферментов цитолиза ACT и AJIT, билирубина, ЩФ и ЛДГ (Семенов Д.Е., Жукова H.A. и др., 2012).

Морфология печени животных при введении бетамида на фоне сочетанного токсического воздействия. Бетамид на всех этапах эксперимента (3-я и 6-я неделя) оказывал выраженное подавляющее влияние

на развитие патологического процесса. Ведущим признаком поражения гепатоцитов в эти сроки наблюдения являлась лишь очаговая мелковезикулярная жировая и клеточно-инволютивная дистрофия, характеризующаяся опустошением цитоплазмы с сохраненной перинуклеарной зоной, некрозы единичных гепатоцитов выявлялись перипортально. Популяция гепатоцитов без явных признаков гетерогенности с уменьшенным содержанием гликогена. При окрашивании по Массону, ван Гизону и Маллори соединительная ткань локализовалась в портальных зонах с наличием небольшого количества сидерофагов. Пролиферация эпителия желчных протоков выражена незначительно лишь у отдельных особей. На фоне умеренного полнокровия синусоидов в их просвете выявлялись лимфоциты и купферовские клетки с признаками повышенной активности.

Таблица 4. Общая характеристика гепатоцитов при введении бетулоновой кислоты, бетамида и гептрала на фоне токсического воздействия _

из С С а. [_ Срок ■ (нед.) ! Объемная плотность % Объемная плотность некрозов, % Абсолютная масса, г Поверхностная плотность, %0 Площадь поверхности, см2

ж 3 69,75±6,0 1,60±1,5 8,06±0,5* 435,30±0,02 5,07±0,3*

6 60,83±2,9 0,40±0,1 4,09±0,9* 355,40±0,02 * 2,39±0,5*

8 72,38±1,5* 0 8,60±1,2 424,30±0,01 5,04±0,7

Гепт-рал 3 65,35±3,5 0,27±0,2 5,84±0,2 428,60±0,02 3,84±0,2

6 61,79±4,1 0,24±0,2 5,43±0,3 390,30±0,02 3,42±0,2

8 75,05±1,1 0 8,99±0,4 441,80±0,01 5,29±0,2

ЦЗ 3 76,31±2,7 0,17±0,1 7,31±0,4 436,20±0,01 4,17±0,2#

6 71,80±1,9# 1,52±0,5 8,13±0,7* 430,30±0,01 # 4,89±0,4*

8 70,82±1,6 0 5,09±0,3# 421,30±0,01 3,51±0,2

Бета-мид 3 74,91±1,3 0,21±0,2 7,39±0,4 449,10±0,01 4,44±0,2

6 69,01±1,9# 0,10±0,1 7,83±0,4* 435,80±0,01 # 4,96±0,3*

8 72,78±1,4 0 6,45±0,3 441,30±0,01 3,90±0,2

ИК 8 66,51±1,0 0 6,49±0,3 418,70±0,01 4,07±0,2

При морфометрическом анализе на 3-й неделе эксперимента отмечалась тенденция к уменьшению объемной плотности соединительной ткани на 72% с пропорциональным уменьшением ее поверхностной плотности, площади поверхности и абсолютной массы на 64%, 75% и 81% соответственно, по сравнению с группой негативного контроля (табл. 6).

Таблица 5. Показатели популяций гепатоцитов при введении бетулоновой кислоты, бетамида и гептрала на фоне токсического воздействия_

Группы Срок (нед.) п*103 Ы*10б М*106 1-ядерные (*10б) 2-ядерные (*10б)

3 35,1±0,7* 398,4±32,Г 394,9±33,5* 391,5±34,8* 3,4±1,5*

« ас 6 64,7±3,6* 486,2±94,3* 466,1±89,8* 445,9±85,6* 20,1±6,9"

8 44,8±7,6* 595,1±116,9* 584,0±115,9* 573,(Ы 15,0* 11,0±3,7*

§ е- 3 90,9±4,8 829,1±62,2 810,8±64,3 791,9±66,8 18,б±5,8

6 73,9±9,6 691,3±105,4 663,8±101,7 636,2±98,0 27,5±5,5

о и 8 71,0±3,0 841,0±51,7 811,5±50,8 782,0±50,6 29,5±5,9

3 60,6±10,3* 543,5±80,7# 535,1±77,5# 526,8±74,3# 8,3±3,б*

« из 6 67,4±7,5 745,0±84,4# 739,8±84,5# 734,6±84,7" 5,2±2,7#

8 54,9±14,7 431,4±106,7 397,8±102,9 364,2±99,9 33,6±9,8

§ 3 43,0±3,4* 404,7±38,1 400,4±38,9 396,0±39,7 4,3±1,8

6 66,6±4,9 742,2±81,7# 719,1±77,4* 696,0±73,8# 23,1±8,1*

О из 8 81,4±6,4* 745,2±54,5* 695,5±49,2 645,7±44,7 49,8±8,0

ИК 8 115,7±4,7 1252,8±49,3 1093,9±45,7 935,0±42,7 158,9±6,0

Примечание, п - число ядер гепатоцитов в 1 мг ткани; N - абсолютное число ядер; М - абсолютное число гепатоцитов. (метод щелочной диссоциации)

При морфометрическом анализе на б-й неделе выявлено увеличение объемной плотности на 13%, поверхностной плотности на 20%, площади поверхности гепатоцитов на 107% и абсолютной массы гепатоцитов на 91% (табл. 4). При щелочной диссоциации установлено увеличение на 54% и 14% численной популяции одноядерных и двухъядерных гепатоцитов соответственно (табл. 5). Объемная плотность и абсолютная масса соединительной ткани в данной группе существенно не изменились по сравнению с предыдущим сроком эксперимента. Однако, поверхностная плотность и площадь поверхности соединительной ткани уменьшились на 90% и 85% соответственно (табл. 6).

Морфология печени животных при введении бетулоновой кислоты на фоне сочетанного токсического воздействия. Бетулоновая кислота, в сравнении с бетамидом, не оказывала существенного влияния на деструктивно-некротические изменения гепатоцитов и процессы фиброгенеза. Через 3 недели эксперимента так же, как и в группе негативного контроля, наблюдалось развитие гепатопатии и фиброза с выраженным ядерным полиморфизмом гепатоцитов. Мелкоочаговые некрозы гепатоцитов и лимфоцитарные инфильтраты локализовались преимущественно в

перипортальных зонах. Портальные тракты расширены, с признаками гемосидероза и умеренно выраженной пролиферацией эпителия желчных протоков. Синусоиды полнокровны, в их просвете выявляются увеличенные в размерах купферовские клетки.

На 3-й неделе эксперимента на 35% увеличилось абсолютное число гепатоцитов по сравнению с аналогичным показателем негативного контроля (табл. 5). При морфометрии установлено, что поверхностная плотность синусоидов возросла на 25% с уменьшением на 53% объемной плотности и абсолютной массы синусоидов (табл. 7). Объемная и поверхностная плотность, площадь поверхности соединительной ткани увеличились на 83%, 147% и 53% соответственно по сравнению с аналогичными показателями негативного контроля (табл. 6).

Через 6 недель введения БК ведущим признаком поражения гепатоцитов являлась клеточно-инволютивная и очаговая крупновезикулярная жировая дистрофия. Отмечался выраженный крупноочаговый клеточный и ядерный полиморфизм гепатоцитов (частые митозы, двухъядерные и гигантские клетки), наблюдалось увеличение площади мелкоочаговых некрозов гепатоцитов, инфильтрированных лимфоцитами. У двух животных был зафиксирован распространенный фиброз смешанного типа с ярко выраженной пролиферацией эпителия желчных протоков и гемосидерозом. Синусоиды умеренно полнокровны, в их просвете определялись купферовские клетки с признаками повышенной активности и постнекротические тельца Каунсилмена.

При морфометрическом исследовании выявлено увеличение объемной плотности, абсолютной массы гепатоцитов, поверхностной плотности и площади поверхности на 17%, 93%, 21% и 103% соответственно по сравнению с негативным контролем на 6-й неделе. Доля некрозов на 280% превышала аналогичные показатели на всех этапах эксперимента во всех опытных группах (табл. 4). По данным щелочной диссоциации на 53% увеличилось абсолютное число гепатоцитов за счет популяции одноядерных клеток. К 6-й неделе эксперимента уменьшились объемная и поверхностная плотность, площадь поверхности и абсолютная масса соединительной ткани на 73%, 72%, 45% и 56% соответственно, по сравнению с аналогичными показателями негативного контроля (табл. 6). На этом фоне отмечается увеличение объемной плотности синусоидов на 43%, абсолютной массы - на 135%, поверхностной плотности - на 27% и на 110% - площади поверхности синусоидов (табл. 7).

Морфология печени животных при коррекции гептралом на фоне сочетанного токсического воздействия. При введении гептрала в условиях токсического воздействия летальности животных на 3-й неделе опыта не наблюдалось. Характер деструктивно-некротических изменений гепатоцитов существенно не отличался от таковых в группе с БК. На фоне венозного полнокровия наблюдались мелкоочаговые некрозы гепатоцитов,

инфильтрированные полиморфноядерными лейкоцитами, портопортальный фиброз без распространения на другие отделы печеночной дольки с признаками умеренной пролиферации дуктального эпителия. При морфометрическом исследовании установлено, что объемная плотность гепатоцитов не превышает показатели интактного контроля.

Таблица 6. Общая характеристика соединительной ткани при введении бетулоновой кислоты, бетамида и гептрала на фоне токсического воздействия

Группы Срок (нед.) Объемная плотность, % Абсолютная масса, г Поверхностная плотность %о Площадь поверхности, ем2

3 7,33±6,70 1,08±1,02 29,60±0,03 0,43±0,39

X 6 25,50±4,60* 1,70±0,50 136,80±0,03* 0,92±0,29*

8 12,19±2,33* 1,33±0,06 70,00±0,01* 0,73±0,02*

§ 3 4,75±1,48 0,47±0,17 27,90±0,01 0,27±0,10

& с 6 13,94±6,36 1,32±0,66 75,60±0,03 0,71±0,34

и 8 5,82±1,98 0,73±0,25 33,80±0,02 0,42±0,14

3 13,45±3,60 1,30±0,40 71,50±0,02 0,69±0,19

6 6,98±2,80* 0,75±0,30 38,30±0,01# 0,42±0,13

8 11,62±2,32 0,97±0,20 59,30±0,01 0,49±0,09

« 3 2,07±0,95 0,21±0,01 10,90±0,01 0,11±0,05

I 6 2,09±0,68# 0,23±0,01# 13,10±0,00* 0,14±0,04*

1) ш 8 2,04±0,63* 0,19±0,06# 11,10±0,00" 0,18±0,09*

ИК 8 0,99±0,28 0,10±0,03 29,60±0,03 0,05±0,02

Абсолютная масса гепатоцитов и площадь поверхности гепатоцитов меньше аналогичных показателей негативного контроля на 28% и 25% соответственно (табл. 4). После 6-недельного введения гептрала на фоне токсического воздействия деструктивно-некротические процессы в гепатоцитах были слабо выражены. Наблюдался умеренный фиброз портальных трактов с незначительной пролиферацией эпителия желчных протоков. Методом щелочной диссоциации выявлено незначительное уменьшение общего числа гепатоцитов по сравнению с 3-й неделей эксперимента (табл. 5). Объемная плотность соединительной ткани на 3-й, 6-й неделе в 2 раза меньше аналогичных показателей в группе негативного контроля и значительно больше аналогичных показателей в группах животных, получавших бетамид и бетулоновую кислоту (табл. 6).

Структурные изменения печени животных в восстановительный период. В течение восстановительного периода у животных в группе

негативного контроля отмечалось дальнейшее прогрессирование гиперпластических и дистрофических процессов в печени. Отличительной особенностью являлась выраженная ядерная и клеточная гетерогенность гепатоцитов. При окрашивании по Маллори, Массону и Лилли наблюдались фиброз и цирроз смешанного типа, выраженная пролиферация эпителия желчных протоков с признаками аденоматозной трансформации и воспалительной инфильтрацией. Перигепатоцеллюлярные пространства выполнены тонкими тяжами соединительной ткани бледно-голубого и розового цвета. Синусоиды умеренно полнокровны, в их просвете было отмечено небольшое количество купферовских клеток без явных признаков повышенной активности

Таблица 7. Общая характеристика синусоидального русла при введении бетулоновой кислоты, бетамида и гептрала на фоне токсического воздействия

Группы Срок (нед.) Объемная плотность, % Абсолютная масса г Поверхност ная плотность %0 Площадь поверх ности см2

3 21,40±2,40* 2,45±0,12 79,60±0,01 0,91±0,05

ОС 6 13,60±1,90* 0,95±0,27 56,80±0,01* 0,40±0,11*

8 15,35±0,81* 1,86±0,30 60,20±0,00* 0,72±0,11*

3 29,60±2,19 2,79±0,39 119,20±0,01 1,12±0,14

Э с 6 24,03±2,53 2,10±0,20 104,20±0,01 0,90±0,06

и 8 19,03±1,31 2,26±0,09 74,70±0,00* 0,89±0,03

3 10,01±1,90* 0,92±0,17 99,70±0,05 0,98±0,55

ЬЙ из 6 19,57±1,20* 2,24±0,23 72,50±0,00 0,83±0,09*

8 17,56±0,79 1,45±0,08 70,10±0,00# 0,59±0,04

ч 3 22,87±1,90 2,54±0,15 91,30±0,01 0,89±0,06

га 6 28,57±2,03* 3,27±0,30 105,90±0,01* 1,22±0,15*

о и> 8 25,25±1,23* 2,23±0,20 98,60±0,00# 0,88±0,06

ИК 8 32,33±0,85 ЗД5±0,20 127,20±0,01 1,25±0,11

По сравнению с 6-й неделей эксперимента, по данным морфометрии, на фоне незначительного увеличения объемной и поверхностной плотности на 110% увеличилась площадь поверхности и абсолютная масса гепатоцитов (табл. 4). Следует отметить уменьшение числа одно- и двухъядерных гепатоцитов на 39% и 93% соответственно, по сравнению с показателями интактного контроля (табл. 5). Показатели объемной и поверхностной плотности соединительной ткани по сравнению с 6-й неделей эксперимента уменьшились на 50%, на 20% сократилась площадь поверхности

соединительной ткани. В тоже время эти показатели значительно превышали аналогичные данные интактного контроля (табл. 6). Абсолютная масса синусоидов и площадь поверхности синусоидального русла в группе негативного контроля на 8-й неделе опыта увеличивались соответственно на 95% и 81% относительно таковых данных на предыдущем сроке эксперимента (табл. 7).

Известно, что в основе восстановления патологически измененной печени лежат процессы неполной репаративной регенерации с замещением дефектов паренхимы соединительной тканью, развитием компенсаторной гиперплазии и гипертрофии гепатоцитов. Эти данные нашли подтверждение и в настоящем исследовании. Восстановление исходной массы органа наблюдалось к 8-й неделе, при уменьшении на 39% общей численности гепатоцитов (табл. 4). Важной особенностью данной модели токсического поражения печени является выраженная пролиферация эпителия желчных протоков, что, возможно, связано с существованием бипотентной стволовой клетки печени, способной дифференцироваться как в гепатоциты, так и в холангиоциты. Локализованы эти клетки вблизи каналов Геринга и характеризуются признаками холангиоцитов и гепатоцитов одновременно (Непомнящих Д.Л. и др., 2006; Гарбузенко Д.В., Попов Г.К., 2001). После устранения патологических факторов, как правило, происходит восстановление нормальной архитектоники органа. Однако, в данном случае неустраненные факторы альтерации (некрозы, дистрофии) оказывают стимулирующее влияние не только на пролиферацию гепатоцитов, но и на формирование фиброза, сосудистых поражений (редукция синусоидального русла) и цирроза, являющихся признаками патологической регенерации.

Таким образом, сочетанное токсическое воздействие привело к развитию гепатоза на 3-й неделе с трансформацией в неспецифический гепатит с фиброзом к 6-й неделе и к 8-й неделе завершилось формированием цирроза печени. Эти процессы сопровождались выраженной гиперплазией эпителия желчных протоков, что является отличительной особенностью данной модели (Ташауо Я.Р., 1983).

Бетулоновая кислота в течение восстановительного периода оказывала разнонаправленное влияние на степень фиброза, деструктивно-некротические, гиперпластические и регенераторные процессы. В гепатоцитах наблюдались обратимые виды дистрофий, популяция их характеризовалась выраженной гетерогенностью. В паренхиме отмечались множественные мелкоочаговые постнекротические гранулемы, инфильтрированные лимфоцитами. Портальные тракты сформированы толстыми тяжами грубой фиброзной ткани. Отдельные портоцентральные септы образованы тонкими тяжами соединительной ткани с ее локальным распространением в перисинусоидальные пространства. В желчных протоках умеренно выражена пролиферация эпителия с явлениями аденоматозной трансформации. При морфометрии установлено, что площадь поверхности

гепатоцитов уменьшилась на 31%, а их абсолютная масса - на 41% по сравнению с негативным контролем (табл. 4). Эти изменения были обусловлены уменьшением на 32% абсолютного числа гепатоцитов относительно аналогичных данных в группе негативного контроля (табл. 5). По сравнению с 6-й неделей эксперимента объем соединительной ткани в данной группе увеличился на 66% с пропорциональным увеличением поверхностной плотности (на 54%) и площади поверхности (на 18%) (табл. 6). При этом отмечалось уменьшение объемной плотности (11%), абсолютной массы (36%) и площади поверхности (30%) синусоидов (табл. 7).

После введения БК на 3-й неделе репаративная регенерация была неполной и реализовалась по механизму компенсаторной гиперплазии и гипертрофии, свидетельством чего явилось резкое уменьшение общего числа гепатоцитов при сохранении объемной плотности и абсолютной массы паренхиматозных клеток. На 6-й неделе после введения БК регенерация печени осуществляется путем сочетания клеточных и внутриклеточных механизмов, что подтверждает увеличение общего числа гепатоцитов за счет одноядерных форм с пропорциональным увеличением их абсолютной массы, площади поверхности, объемной и поверхностной плотности. Следует подчеркнуть, что на 6-й неделе только в группе с БК объемная плотность некрозов сохраняется на высоком уровне. Как известно, некрозы гепатоцитов оказывают ингибирующее влияние на дальнейшие процессы регенерации, стимулируют фиброгенез путем активации клеток Купфера и синусоидальных эндотелиоцитов (Пышкин С.А., Димов П.Г., 2004). В течение восстановительного периода после введения БК преобладающим механизмом регенерации является преимущественно компенсаторная гипертрофия и гиперплазия, так как уменьшение числа гепатоцитов сочетается с увеличением их суммарной массы, но с сохранением площади их поверхности.

На 8-й неделе эксперимента в изученных показателях животных, получавших гептрал, прослеживалась положительная динамика нивелирования альтеративных процессов по сравнению с группой негативного контроля. В гепатоцитах преобладали обратимые виды дистрофий. Гетерогенность гепатоцитов была слабо выражена, носила очаговый характер. Мелкоочаговые некрозы гепатоцитов, инфильтрированные лимфоцитами, наблюдались в центролобулярных отделах долек. Соединительная ткань локализовалась перипортально, распространяясь тонкими тяжами в перисинусоидальные пространства. Отмечалась незначительная пролиферация эпителия желчных протоков и умеренно выраженная лимфоцитарная инфильтрация. При морфометрическом исследовании выявлено уменьшение показателей соединительной ткани в 2 раза и увеличение на 23% объемной плотности синусоидов по сравнению с группой негативного контроля (табл. 6, 7). На фоне увеличения общего числа гепатоцитов зафиксировано значительное

возрастание их абсолютной массы и площади поверхности, что является косвенным признаком умеренной гипертрофии гепатоцитов. В группе животных, получавших бетамид, объем соединительной ткани уменьшился на 65%, на 32% увеличился объем синусоидов, абсолютная масса гепатоцитов и площадь их поверхности уменьшились на 30% относительно аналогичных показателей в группе животных с введением гептрала.

У животных, получавших бетамид, в течение восстановительного периода наблюдалось стойкое уменьшение степени выраженности гиперпластических и деструктивно-некротических процессов, повышение регенераторного потенциала печени с ингибированием фиброгенеза. Морфометрический анализ выявил уменьшение абсолютной массы гепатоцитов на 25% при стабильно высокой численности популяции одноядерных и двухъядерных гепатоцитов. Абсолютное число одноядерных гепатоцитов увеличилось на 13%, количество двухъядерных гепатоцитов - в 4,5 раза по сравнению с негативным контролем. Объемная и поверхностная плотность гепатоцитов существенно не отличались от показателей негативного контроля, но при этом на 23% уменьшилась площадь поверхности гепатоцитов. На основании морфометрического анализа было выявлено существенное уменьшение площади фиброзной ткани по сравнению с опытными группами на всех этапах эксперимента. Так, объемная и поверхностная плотность соединительной ткани уменьшилась на 84%, абсолютная масса - на 86%, и на 76% — площадь поверхности соединительной ткани. Установлено, что бетамид на всех этапах эксперимента оказывает положительное влияние и на параметры синусоидального русла: объемная и поверхностная плотность синусоидов увеличилась на 64%, в среднем на 20% возросли абсолютная масса и площадь поверхности синусоидов.

Таким образом, бетамид в условиях сочетанного токсического воздействия уменьшает интрацеллюлярный отек гепатоцитов, восстанавливает объем синусоидального русла, препятствует развитию фиброза и цирроза, а также оказывает более выраженное положительное влияние на течение регенераторных процессов по сравнению с гептралом и бетулоновой кислотой. Эти данные находятся в соответствии и с результатами биохимического исследования, в ходе которого было показано, что бетамид на всех этапах эксперимента эффективно купировал явления холестаза, цитолиза, гликолиза, проявляя выраженные антиоксидантные свойства (Семенов Д.Е. и др., 2012). Полученные в нашем исследовании данные согласуются также и с результатами электронно-микроскопического исследования печени животных на фоне полихимиотерапии при 10-дневном введении бетамида. Было установлено, что внутриклеточная регенерация характеризуется восстановлением тонкой структуры клеточных органелл с сохранением эндоцитозной активности

клеточной мембраны и появлением крупных митохондрий (Молодых О.П., Лушникова Е.Л., 2007; Сорокина И. В., 2010).

Анализ настоящего исследования показал, что бетамид, обладая ярко выраженными антиоксидантыми, цитопротекторными и

противовоспалительными свойствами, является мощным стимулятором биологических реакций в гепатоцитах, клетках Купфера и синусоидальных эндотелиоцитах. Под влиянием бетамида репаративная регенерация на 3-й неделе опыта осуществляется за счет гипертрофии гепатоцитов. На фоне резкого уменьшения общей численности гепатоцитов сохраняется неизменной поверхностная плотность, площадь поверхности и их абсолютная масса. На 6-й и 8-й неделе наблюдения ведущим регенераторным процессом является сочетание клеточной и внутриклеточной репаративной регенерации с низким уровнем ферментов цитолиза, стойким повышением численности гепатоцитов, в том числе и двухъядерных клеток (Толстикова Т.Г. и др., 2012).

ВЫВОДЫ

1. Внутрижелудочное введение бетамида интактным крысам способствует угнетению регенераторно-пластических процессов на 7-е сутки с полной их нормализацией к 40-м суткам исследования. Аналогичное введение бетулоновой кислоты на всех этапах исследования приводит к редукции синусоидального русла, угнетению регенераторно-пластических процессов, инициируя при дальнейшем введении стойкие деструктивные изменения гепатоцитов.

2. Показано, что бетамид на фоне токсического воздействия, индуцированного тетрахлорметаном и этанолом, на 3-й и 6-й неделе эксперимента полностью купирует признаки холестаза, цитолиза и тканевой гипоксии, снижая уровень трансаминаз, прямого билирубина, щелочной фосфатазы, лактатдегидрогеназы. Бетулоновая кислота купирует только признаки цитолиза.

3. Установлено, что бетамид в условиях токсического воздействия, индуцированного тетрахлорметаном и этанолом, способствует восстановлению к концу исследования объема синусоидального русла, предотвращает деструктивно-некротические изменения гепатоцитов, приводит к снижению выраженности процессов фиброгенеза, предотвращая структурную перестройку паренхимы печени. Выявлена преимущественная эффективность бетамида на всех этапах исследования в отношении стимуляции регенераторной активности за счет увеличения количества одно- и двухъядерных гепатоцитов. Бетулоновая кислота незначительно (на 8%) уменьшает объем соединительной ткани и степень деструкции гепатоцитов.

4. Бетамид, обладая высокой антицитолитической активностью, способностью подавлять фиброгенез, стимулировать нормальную репаративную регенерацию, может быть предложен для дальнейших доклинических исследований в качестве высокоэффективного

гепатопротектора при токсических повреждениях печени. Бетулоновая кислота может быть использована в качестве основы для синтеза новых перспективных гепатопротекторов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Bessergeneva (Ivanova) Е.Р., Zhukova N.A., Sorokina I.V., Tolstikova T.G., Shul'ts E.E. The influence of 3ß,28-di-0-nikotinate of betulin and methyl ether 3,20-dioximino-29-norlup-28-oic acid on the extent of toxic liver injury against a polychemotherapy background and without it in animals with transplanted lymphoma RLS // Abstract book of international Conference «Current topics in organic chemistry». - Novosibirsk, 2011. - P.85.

2. Бессергенева (Иванова) Е.П., Жукова H.A., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г. Исследование влияния 3ß, 28-ди-О-никотинат бетулина и метилового эфира 3, 20-диоксимино-29-норлуп-28-овой кислоты на степень токсического поражения печени на фоне и без полихимиотерапии у животных с перевитой лимфомой RLS // Материалы 71 Всеукраинской научно-практической конференции с международным участием «Современные аспекты медицины и фармации». - Запорожье, 2011. - С. 181-182.

3. Бессергенева (Иванова) Е.П., Жукова H.A., Сорокина И.В., Баев Д.С., Толстикова Т.Г. Влияние тритерпеновых производных на биохимические показатели крови животных с токсическим гепатитом // Сборник статей «II международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине». -СПб, 2011.-С.119- 123.

4. Бессергенева (Иванова) Е.П., Жукова H.A., Толстикова Т.Г., Сорокина И.В. Коррекция лекарственно-индуцированной гепатотоксичности новыми тритерпеновыми производными (экспериментальные исследования) // Сибирский онкологический журнал. - 2011. - № 6 (48). - С. 41 — 46.

5. Семенов Д.Е., Жукова Н.А, Бессергенева (Иванова) Е.П., Сорокина И.В., Баев Д.С., Глухов Б.М., Непомнящих Г.И., Толстикова Т.Г. Влияние тритерпеновых производных на общую численность гепатоцитов в печени крыс с токсическим гепатитом // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. - Т. 153,-№6.-С. 837-840.

6. Бессергенева (Иванова) Е.П., Жукова H.A., Сорокина И.В., Баев Д.С., Толстикова Т.Г., Семенов Д.Е. Коррекция тритерпеновыми производными поражения клеток печени животных на фоне токсического гепатита // Материалы XX юбилейной международной конференции и дискуссионного научного клуба «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». - Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 2012. - С. 183.

7. Бессергенева (Иванова) Е.П., Жукова H.A., Сорокина И.В., Баев Д.С., Толстикова Т.Г., Семенов Д.Е. Влияние тритерпеновых производных на биохимические показатели крови и количество гепатоцитов в печени животных на фоне токсического гепатита // Материалы конференции «Медицина та фармацш XXI столптя-крок у майбутнс». - Запорожье, 2012. -С. 7-8.

8. Бессергенева (Иванова) Е.П., Жукова H.A., Сорокина И.В., Баев Д.С., Толстикова Т.Г., Семенов Д.Е. Коррекция токсического поражения клеток печени животных тритерпеновыми производными // Материалы IV съезда

фармакологов России «Инновации в современной фармакологии». — Казань, 2012.-С. 21 -22.

9. Бессергенева (Иванова) Е.П., Жукова H.A., Сорокина И.В., Баев Д.С., Толстикова Т.Г., Семенов Д.Е. Исследование гепатопротекторного эффекта тритерпеновых производных на животных с токсическим гепатитом // Материалы VI Региональной научно-практической конференции студентов, аспирантов, молодых ученых и учителей «Химическая наука и образование Красноярья». — Красноярск, 2012. — С. 52 — 56.

10. Толстикова Т.Г., Жукова H.A., Семенов Д.Е., Бессергенева (Иванова) Е.П., Сорокина И.В., Баев Д.С., Глухов Б.М. Биохимические показатели крови и количество гепатоцитов в печени крыс с токсическим гепатитом при действии аланинамида бетулоновой кислоты // Фундаментальные исследования. — 2012. - № 5. - С. 120- 123.

11. Жукова H.A., Семенов Д.Е., Бессергенева (Иванова) Е.П., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г. Коррекция лекарственно-индуцированной гепатотоксичности новыми тритерпеновыми производными при перевиваемой лимфоме RLS // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. - Т. 154. - № 9. -

C. 356-360.

12. Semenov D.E., Zhukova N.A., Bessergeneva (Ivanova) E.P., Sorokina I.V., Baev

D.S., Glukhov B.M., Nepomnyaschikh G.I., Tolstikova T.G. Effect of triterpenc derivatives on the total hepatocyte count in the liver of rats with toxic hepatitis // Bulletin of experimental biology and medicine. - 2012. - V.153. - № 6. - P. 859 -862.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AJ1T- аланинаминотрансфераза ACT - аспартатаминотрансфераза БК — бетулоновая кислота ИК - интактный контроль ЛДГ — лактатдегидрогеназа НК - негативный контроль ЩФ - щелочная фосфатаза СС14 - тетрахлорметан

Подписано к печати 14 ноября 2013 г. Тираж 100 экз. Заказ № 052. Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 335-66-00