Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Влияние гепарина на структурно-функциональные свойства иммуноглобулина G

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ ИМЕНИ ПОЧЕТНОГО АКАДЕМИКА Н.Ф.ГАМАЛЕИ

на правах рукописи

РОДНИКОВА Анна Аркадьевна

ВЛИЯНИЕ ГЕПАРИНА НА СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ИММУНОГЛОБУЛИНА в

14.00.36 - аллергология и иммунология 03.00.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: член-корр. РАМН, профессор А.Я.Кульберг

Москва, 1998 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ........................................4

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................ .6

Глава 1. Взаимодействие иммуноглобулинов с различными биомолекулами . . .6

1. Иммуноглобулины в активации системы комплемента.............6

2. Влияние гликозилирования первичной последовательности иммуноглобулинов на эффекторные функции молекул...........................8

3. Взаимодействие с лектинами........................11

4. Влияние агрегации иммуноглобулинов на их эффекторные функции ... .12

5. Комплексы иммуноглобулинов с заряженными биополимерами:

значение в регуляции гуморального иммунитета.................13

Глава 2. Строение и свойства гепарина.......................20

1. Синтез, секреция и распределение гепарина в тканях и циркуляции в норме и при различных патологических состояниях..................... .20

2. Биологические функции гепарина........................24

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..................27

III. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.......................34

Глава 1. Взаимодействие с гепарином......................34

1. Выполнение эксперимента по взаимодействию с гепарином.......35

2. Антикоагулянтные свойства гепарина, образующего комплекс с ... .36

3. Спектрофотометрический анализ комплекса гепарина с .........37

4. Влияние до и после обработки гепарином на реакцию агглютинации эритроцитов........................................38

Глава 2. Взаимодействие низкомолекулярной фракции гепарина (НМФГ) с .42

1. Выполнение эксперимента............................42

2. Спектрофотометрический анализ полученных препаратов..........43

3. Изучение антикоагулянтной активности соединения с НМФГ......44

4. Изучение влияния на реакцию агглютинации эритроцитов соединения с НМФГ...........................................45

5. Взаимодействие НМФГ с пептидами района талии молекулы ......54

6. Взаимодействие с восстановленными связями с НМФГ.......56

Глава 3. (Приложение)

Структурно-функциональные свойства коммерческого препарата гепарина . . .62

1. Связь структуры молекулы гепарина с его антикоагулянтной и антиоксидантной активностью.......................................62

2. Взаимосвязь антиоксидантных свойств гепарина и его антикоагулянтной

активности при введении in vivo............................72

IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ..........................75

ВЫВОДЫ........................................81

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...............................82

ВВЕДЕНИЕ

Иммуноглобулины и основной класс этих белков - IgG играют ключевую роль в защите организма от генетически чужеродных молекул и микроорганизмов. Защитная роль IgG сочетается, ввиду многообразия эффекторных функций этого белка, с участием в многочисленных патофизиологических реакциях, способных оказать существенное влияние на жизнедеятельность отдельных систем организма и всего организма в целом. Эффекторные функции IgG реализуются при изменении конформации молекулы этого белка и сопутствующего процесса его агрегации (24, 33, 34). Следовательно, изменение агрегатного состояния IgG служит основной причиной возникновения патофизиологических реакций с участием IgG.

Изменения агрегатного состояния IgG могут происходить в результате взаимодействия IgG антител с антигенами или без участия последних, в частности, в результате изменения электрического заряда молекулы IgG вследствие комплексообразования с полиэлектролитами (22, 24, 33, 57). Источником последних in vivo служат разнообразные сульфатированные и сиалированные гликопротеины и продукты их расщепления (протео- и пептидогликаны).

Важнейшим представителем семейства пептидогликанов служит гепарин. Концентрация таких полиэлектролитов, как гепарин, способна существенно изменяться в короткое время (минуты, часы) при различных патофизиологических реакциях, за счет его высвобождения из гранул тучных и эндотелиальных клеток (5, 15).

Содержание IgG в циркуляции также претерпевает изменения, например, при инфекционных и других заболеваниях, однако за более продолжительные сроки, чем увеличение уровня гепарина и других пептидогликанов (24, 34). Ввиду возможности взаимодействия IgG с гепарином, непосредственно в циркуляции следует ожидать существенных изменений кинетики их взаимодействия, обусловленных быстрыми изменениями концентрации гепарина при острых нарушениях гомеостаза, например, при травмах, ожогах и др.. Последствиями таких сдвигов в концентрации гепарина в системе IgG - гепарин могут быть быстро возникающие изменения агрегатного состояния IgG и, как результат этого, возникновение разнообразных патофизиологических реакций.

Взаимодействие IgG с гепарином не было исследовано до настоящего времени. Между тем представляется очевидной теоретическая значимость этой проблемы для

понимания роли IgG в регуляции гомеостаза. Что касается прикладной значимости проблемы, то она определяется широким использованием гепарина в клинической практике.

Целью работы явилась оценка изменений свойств реагирующих биомолекул и выяснение роли дисульфидных связей молекулы IgG при взаимодействии этого белка с гепарином.

В задачи исследования входило:

1. Анализ антикоагулянтных свойств гепарина в присутствии IgG.

2. Оценка физико-химических свойств IgG, комплексообразующего с гепарином.

3. Выяснение роли дисульфидных связей молекулы IgG для взаимодействия с гепарином и проявления антикоагулянтных свойств формирующегося комплекса.

4. Изучение взаимодействия синтетических пептидных аналогов участка шарнирной области IgG с гепарином.

5. Исследование закономерностей изменения антикоагулянтной активности гепарина in vitro и in vivo и сопоставление полученных результатов с динамикой антикоагулянтной активности гепарина в присутствии IgG.

Научная новизна и практическая значимость работы:

впервые показано образование комплекса IgG с гепарином и проанализированы свойства указанных биомолекул после формирования между ними комплекса;

- впервые показано, что IgG способен влиять на антикоагулянтные свойства гепарина;

- установлено, что IgG с восстановленными дисульфидными связями между гамма-цепями в шарнирной области молекулы не взаимодействует с гепарином и не влияет на его антикоагулянтную активность;

- показано, что изменения антикоагулянтной активности гепарина под влиянием IgG in vitro зависят от исходного агрегатного состояния гепарина, это следует учитывать в клинической практике гепаринотерапии как таковой, или при комплексной терапии с использованием гепарина;

проанализированы условия, оказывающие влияние на изменение антикоагулянтной активности гепарина;

- показана обратная зависимость между антикоагулянтной и антиоксидантной активностью гепарина, что можно использовать для контроля качества различных фармакологических препаратов гепарина в условиях его производства.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. Взаимодействие иммуноглобулинов

с различными биомолекулами 1. Иммуноглобулины в активации системы комплемента

Иммуноглобулины и комплексы антиген-антитело относятся к активаторам системы комплемента. Молекула ^О может связывать три компонента комплемента: СЦ, С4Ь и СЗЬ (70, 135). Теми же свойствами обладают иммуноглобулины класса М. Что касается иммуноглобулинов других классов, то они связывают только С4Ь и СЗЬ., Центр связывания СЦ находится в Су2-домене молекулы Он расположен, судя по данным рентгеноструктурного анализа комплексов с СЦ, на внешней стороне каждого из Су2-доменов (24, 32, 69, 107). Белки комплемента участвуют в воспалительных процессах, опсонизируют чужеродные молекулы для их последующего фагоцитоза и опосредуют уничтожение различных клеток и микроорганизмов (24, 32, 46). При исследовании ингибирования СЦ-

опосредованного гемолиза установлено, что за этот вид активности отвечает фрагмент аминокислотной последовательности 281-292 СН2-домена (28). В этой работе авторы высказали предположение о роли положительно заряженных аминокислотных остатков (Шз-285, Ьуз-288, Ьуз-290, А^-292) для связывания с СЦ-компонентом комплемента.

Уже сравнительно давно было показано (22, 146), что после восстановления дисульфидной связи, образованной остатками Суз 226 тяжелых цепей, молекулы кролика утрачивают способность фиксировать комплемент (СЗ). Позднее было установлено, что в результате моновалентного связывания молекулой антитела специфического лиганда индуцируется конформационное изменение электронной плотности в Бс-фрагменте. Однако, это не обнаруживается, если предварительно было проведено восстановление и алкилирование дисульфидной связи между Н-цепями. При исследовании изолированных СН2-фрагментов из молекулы человека показано, что дисульфидная связь не входит в состав центра фиксации компонента комплемента СЗ (109).

Поверхность полианионов, таких как сиаловые кислоты и гепарин, как полагают, повышает связывание фактора Н комплемента с СЗЬ, откладываясь на

поверхностях частиц и клеток, и восстанавливая активность комплемента. Показано, что фактор Н связывается предпочтительно с гепарином, который содержит много сиаловых кислотных остатков, чем с самими сиаловыми кислотами. В работе (68) установлены гепарин-связывающие сайты на факторе Н. Связывание фактора Н является единственным механизмом, при котором гепарин может восстанавливать С-активность.

Гепариновый слой был применен, как путь удачного восстановления активации комплемента при гемодиализе. Однако, роль фактора Н в восстановлении активности комплемента на гепариновом слое материалов до сих пор не изучена.

2. Влияние гликозилирования первичной последовательности иммуноглобулинов на эффекторные функции молекул

Анализ взаимосвязи между гликозилированием иммуноглобулинов и их иммунологическими функциями впервые провели для IgG антител к эритроцитам барана N.Koide и соавт. (123). С помощью специфического ферментативного дегликозилирования у этих IgG было удалено большинство углеводных остатков. Такая обработка не отразилась на гемагглютинирующих свойствах IgG. В то же время IgG с удаленными сахарами имели существенно меньшую активность в реакции антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности, ЕА-розеткообразо-вании и комплементзависимом гемолизе по сравнению с интактивными IgG. Эти данные указывали на роль углеводных цепей в процессе распознавания IgG белками системы комплемента и отсутствие участия в процессе взаимодействия с антигеном. Поэтапное удаление моносахаров, наличия с терминального конца углеводной цепи, позволило предположить, что в реализации антигенозависимых функций IgG ключевую роль может играть наличие N-ацетилгликозамина или маннозы в терминальных положениях. В работе (174) на модели моноклональных антител показано, что отсутствие углеводных цепей в СН2-доменах не изменяло специфичности антител и их способности реагировать с белком-А, снижало уровень антитело-зависимой цитотоксичности, связывания с Fc-рецептором макрофагов, активации системы комплемента, а также быстрое выведение комплекса антиген-антитело из циркуляции (113, 116. 170).

Авторы объяснили это тем, что, во-первых, СН2-домены IgG 2в существенны для эффективного связывания с Fc-рецепторами макрофагов (77); во-вторых, связывающий участок для Clq компонента системы комплемента также локализован в СН2-домене IgG 2в. По предположению авторов, возможно как прямое, так и опосредованное (через структурные перестройки белковой части) участие углеводов IgG во взаимодействии с Fc-фрагментом и комплементом. Опосредованное участие сводится к следующему. Известно, что модификации в CHI-домене или в шарнирной области могут полностью нарушить способность взаимодействовать с Fc-рецептором (71, 122) и серьезно влиять на способность активировать комплемент (109, 122). Поскольку углеводные цепи в человеческом IgG 1 занимают не только гидрофобные

районы в СН2-доменах, но и на участке между CHI- и СН2-доменами (18), то возможно, что алостерические изменения молекул IgG после связывания с антигенами приводят к углеводозависимым изменениям в СН2-домене и таким путем регулируют взаимодействие IgG с Fc-рецептором и системой комплемента.

Непосредственное участие углеводов IgG во взаимодействии с Fc-фрагментом и комплементом предполагается на том основании, что углеводные цепи в составе агрегатов или иммунных комплексов (ИК) более подвижны (176) и доступны (75), чем в нативных молекулах. Возможно, что связывание IgG с антигеном увеличивает доступность углеводов, цепи которых прямо участвуют в реакции с Fc-рецептором и Clg-компонентом комплемента (112, 166). Отсутствие влияния дегликозилирования иммуноглобулинов на взаимодействие с белком-А связано, очевидно, с тем, что "узнаваемый" белком-А участок находится между СН2 и СНЗ-доменами и скорее всего не изменяется в дегликозилированных антителах (1, 3).

Характер гликозилирования IgG определяет, также, интенсивность фагоцитоза иммунокомпетентных клеток нормальными человеческими моноцитами эритроцитов барана (ЭБ). Так, в работах (137, 138) авторы изучали фагоцитоз нормальными человеческими моноцитами ЭБ, покрытых кроличьими антителами к ЭБ, разделенными по способности связываться с лектином арахиса (Arachis hupogala lectin - ЛА) и конканавалином А (Кон А). Было показано, что IgG, выделенный по способности связываться с Кон А, т. е. имеющим более доступные маннозные остатки, способен блокировать Fc-завиеимый фагоцитоз более выражено, чем нормальный IgG. Непосредственное связывание с Fc-рецепторами в зависимости от способности IgG взаимодействовать с ЛА и Кон А, достоверно не различалось. Однако индекс фагоцитоза был значительно ниже при использовании ЭБ, покрытых антителами, связывающимися с Кон А.

Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о том, что углеводные цепи в составе IgG в значительной мере определяют такие его свойства, как способность к связыванию комплемента, взаимодействие с Fc-рецепторами, активность в реакции антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксич-ности, скорость выведения из кровотока, т. е. характер гликозилирования Fc-фрагментов (удаленных от антигенраспознающего центра) IgG изменяет антигеннезависимые его свойства, практически не изменяя распознавание антигена

(18,111).

В работе (137) показано, что существует требование к длине олигосахаридной структуры для оптимального узнавания и активации эффекторных механизмов через БсуЯ и С1 компонент С. Минимальная олигосахаридная структура является гексасахаридом (01сКАс2Мап301сКАс)3 со связанными вариабельными остатками. Авторы предположили, что взаимодействие между минимальным гексасахаридным компонентом и протеиновой структурой являются важными для генерации четвертичной структуры, которая является оптимальной для экспрессии биологической активности (4, 20, 42).

3. Взаимодействие IgG с лектинами

В работе (52) для доказательства участия галактозосодержащих углеводных эпитопов на поверхности модельных IgG комплексов (МИК) во взаимодействии с высокомолекулярными лигандами получены МИК и исследовано их взаимодействие с лектином клещевины обыкновенной. Полученные результаты свидетельствуют о доступности антенн олигосахаридов IgG в составе МИК для связывания с высокомолекулярными лигандами и об увеличении плотности содержащих галактозу эпитопов на поверхности МИК с ростом их молекулярной массы.

Недавно N.Summar и соавт. (169) предложили использовать реакцию IgG с двумя лектинами из Bandeinraed simplicitolia 2 (ЛБ2) и Ricinus communis (CPA), реагировавшими с N-ацетилглюкозамином и галактозой соответственно, - как величину, пропорциональную содержанию галактозы в IgG.

К другим относительно простым и быстрым методам изучения гликози-лирования углеводных цепей следует отнести использование моноклональных антител к N-ацетилглюкозамину (159, 169).

- 124. Влияние агрегации иммуноглобулинов на их эффекторные функции

Неблагоприятные реакции у пациентов могут вызвать агрегированные иммуноглобулины (47, 57), поэтому в иммуноглобулин-содержащих фармацевтических препаратах вводятся ограничения на содержание агрегатов IgG (26, 66, 147). В работе (114) препараты человеческого IgG, содержащие агрегаты, были введены крысам для индуцирования гипотонии. Гипотония была индуцирована изолированной фракцией агрегатов IgG, не содержащей мономеров. Препараты, содержащие агрегаты и мономерный IgG оказались более эффективными в индукции гипотонии, чем одни агрегаты. Агрегированный гамма-глобулин участвует в регуляции эффективности ЕК-опосредованного цитолиза клеток-мишеней предположительно на стадии двухнаправленного переноса структур рецептор-антирецептор мембра