Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Значение плазменных гликозаминогликанов и антитромбина-III в гемостазе



ленинградский ордена трудового красного знамени и ордена дружбы народов научно-исследоватжьсм!! институт гематологии и переливания кроит министерства здравоохранения рсфср

На правах рукописи

кададзе Юнона Леонидовна

УДК 0186 012 6978

значение плазменных глийозашогжканов и антитрошша-ш

в шлостазе 14 0029 - гематология и переливание крови

автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Ленинград 1989

Работа выполнена в Ленинградском научно-исследовательском институте гематологии и переливания крови Министерства здравоохранения РСФСР.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор К.Н.КЛИМОВА

член-корреспондент академии наук СССР доктор медицинских наук профессор В.А.АЛМАЗОВ

доктор медицинских наук, профессор З.С.БАРКАГАН

Ведущая организация Всесоюзный гематологический центр.

Защита диссертации состоится " " _1989 г.

в _ час. на заседании специализированного совета Д.084.19.01

Ленинградского ордена Трудового Красного Знамени и ордена Дружбы Народов научно-исследовательского института гематологии и переливания крови МЗ РСФСР (193024, Ленинград, ул.2-ая Советская,д.16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ленинградского НИИ гематологии и переливания крови МЗ РСФСР.

Автореферат разослан " " .. .. 1989 г.

Ученый секретарь специализированного совета

В.С.Быков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы определяется высокой частотой и значимостью тромбозов и геыоррагий, а также других осложнений, связанных с нарушениями агрегатного состояния крови и микроциркуляции в формировании подавляю него большинства патологических состояний. Недостаточно изучены физиологические механизмы ограничения энзиматического каскада гемокоагуляции в условиях практически непрерывной его активации через иммунную, эндокринную и калликреинкининовую системы (Зубаиров,1978,1988; Бышевский с соавт.,1987; seegers

,1986).

Поддержание жидкого состояния крови и ее текучесть обеспечиваются функционированием нейрогуморальной прогивосвертывающей системы (ПСС), триггерным механизмом которой является действие тромбина или его предшественников на рецепторы сосудистого эндотелия. Выделяющийся из сосудистой стенки основной гуморальный фактор ПСС гепарин, осуществляет нейтрализацию лрокоагулянтов комплексированием с ниш и-активацией "неферментативного" гепарин-зависимого фибринолиза (Кудря-шов В.А. с соавт.,1968,1973,1975,1981,1982; Литвинов В.И. с соавтв, 198I; Ляпина Л.А.,1980; Калишевская Т.М.,1982).

Установлено, что антипротеазный потенциал плазмы здорового человека значительно превосходит суммарное содержание сериновых про-теаз гемостаза, при этом около 90$ всей антитромбиновой активности относят за счет действия антитромбииа-Ш САТ-4И), плазменного кофактора гепарина. В последние годы интерес к исследованию содержания и

активности естественных антикоагулянтов АТ-Ш и П кофактора гепарина,

Л

протеинаiзначительно Еозрос, в связи с описанием врожденных и приобретенных состояний их дефицита или синтеза аномальных молекул, обуславливающих склонность к повторным тромбозам и диссеминации внутри-сосудистого свертывания (Раби К.,1974; Баркаган З.С. с соавт.,1982; Баркаган Л.3.,1983; Atilgaard ,1967,1968,1984; Biok et а1. ,1977;

В12аа в« ах. .1970; иг . 1978; МогЪепзеп еЪ аХ. ,1983; йоХ£ et а1., 1982,1985; Тапака et аХ. ,1986; То11е£ееп еЪ а1. ,1982; БХе et а1., 1985; Иоагов. вt а!,1986; ЗсЬиагг et аХ. ,1984.

Однако, диагностика этих нарушений в отечественной клинической практике резко ограничена из-за малодоступности стандартных реактиво и несовершенства методов исследования плазменных кофакторов гепарине других эндогенных антитромбинов и циркулирующих патологических ингибиторов. Так, в отечественном здравоохранении практически отсутствуя иммунологические методы количественной оценки содержания антитромбя-нов и других факторов гемокоагуляции, необходимые для улучшения диа1 ностики и контроля адекватности заместительной терапии при патологии

В последние годы появились отдельные публикации, свидетельству ще о целесообразности более широкого использования нативной и свеже замороженной плазмы и ее компонентов в лечении нарушений гемостаза, свжанных с тромбофилией при ЛЕС синдроме, тромбэмболической болезнт обусловленной дефицитом АТ-Ш и протеина С (З.Д.Федорова с соавт., 1971,1985, З.С.Баркаган,1988; 1кешшв et ах. ,1986). Выявилась потребность в четких клинико-лаборагорных ориентирах, отражающих уровень эндогенных антикоагулянтов и тромбин-нейтрализующей активности плазмы больного. Это имеет особую значимость, так как на фоне увлечения гемодилюцией и применением эритроцитарных трансфузий участились случаи возникновения ятрогенных юагулопатий, коррекция которьс должна осуществляться дозированно донорскими компонентами. Необходимость учета уровня прокоагулянтов и их ингибиторов все шире внедряется в практику реанимации и лечения различных видов шока (А.Н.Фила' М.А.КотовщиковаДЭбЗ; Балуда В.П. с соавт.,3980; Марков А.В.,1985; Иванов Е.П.,1983; Макацария А.Д.,1983; Шумеу Ю. с соавт.,1981; Бунатян А.А. с соавт.,1984).

Установлено, что для осуществления антипротеазной активности АТ-Ш необходимо присутствие в плазме гепарина или гепаран-сульфата

сосудистой стенки, а для активации и иигибиторного действия протеина С на факторы У и УШ требуется наличие протеина s и тромбомоду-лина-протеогликана эндотелия: Briginsüow et al. ,I974;Klein etal 1980; Biggs et al. 1970; Collen, et al., ,1979; Barrowcliff 1978,1980,1981,1983; Струкова C.M. с соавт.,1986.

Представляет интерес тот факт, что необходимый для активации протеина С тромбин контролируется комплексом АТ-Ш - гепарин, то есть между указанными эндогенными антикоагулянташ имеется еще недостаточно изученная связь, в которой эндогенные гепариноподобные вещества - гликозаминогликаны, протеогликаны и липопротеогликанн играют определенную роль ( Telen, et al. ,1976; Marcum et al. ,1986;

Björnsson et al. .1982).

Данные литературы, касающиеся роли гепарина и других ГАГ в гемостазе, посвящены, в основном, изучению действия гетерогенных препаратов, полученных из различных биологических источников, лишь отдельные публикации отражают исследования ГАГ, выделенных из тканей человека. Несмотря на полувековой опыт применения гепарина в

лечебной практике в качестве прямого антикоагулянта, в последние

( Zalcberg et al.,1983

годы появились высказывания о его "тромбогенности'Ч Borg et al.",1986) имеются резкие разногласия в трактовке действия гепарина на тромбоциты, а также целесообразности его лечебного применения при коррекции ДБС синдрома. До сих пор дискутируются показания, дозы, методы контроля безопасности терапии гепарином, профилактики тромботичес-ких и геморрагических осложнений, способы нейтрализации остаточного гепарина после операций с применением экстракорпорального кровообращения, г е i/o сорбции и данные о клиренсе в организме) нуждаются в совершенствовании количественные методы исследования его в крови, плазме и других биологических жидкостях.

Остается дискуссионным вопрос о возможности эндогенной гепари-немии, физиологические функции эндогенных гепариноподобных субстан-

ций требуют изучения, так как их свойства далеки от тех, которыми обладают коммерческие препараты гепарина ( Jaques L.в. ,1940,1967, 1978; Скипетров В.П.,1985).

Учитывая последние данные об уникальных свойствах сульфатиро-ванных ГАГ, природных биологических ионообменников и полианионов, играющих важную роль в распределении и регуляции межмолекулярных взаимодействий, их способности комплексироваться с белками и липо-протеинами, участвовать в полимеризации коллагена и адгезии фибро-нектина, мы предположили, что изменение уровня и состава плазменных ГАГ может влиять не только на ферментативные реакции каскада геыо-коагуляции, но и на физико-химические взаимодействия тромбоцитарных и плазменных компонентов, агрегацию и адгезию клеток, взаимодействт их с надмолекулярными структурами тканевого тромбопластина, формиро вание активного комплекса УШ фактора и генерацию тромбина.

Основной целью наших исследований явился поиск доказательств, выдвигаемой нами гипотезы, предполагающей, что в механизмах тромбо-цитарных и плазменных дефектов при геморрагических диатезах наследственного типа и при заболеваниях, связанных с аутоиммунизацией, участвуют плазменные гликозаданогликаны, уровень и состав которых можрт варьировать в зависимости от конституциональных особенностей организма и патологии.

В связи с этим в работе были поставлены следующие задачи:

1. Расширить и уточнить комплекс методов, характеризующих ин-гибиторную активность, и количественное содержание физиологических эндогенных антикоагулянтов а патологического циркулирующего ингибитора. Разработать прямой биохимический метод количественного опред« ления уровня эндогенного гепарина (плазменных гликозаминогликанов) и диагностический препарат для иммунологического определения анти-тромбина-Ш.

2. Провести экспериментальное исследование составляющих компо-

нентов антитромбинового и антигепаринового потенциала плазмы в условиях тромбоцитопении, тканевой тромбопластинемии и гепаринемии. Сопоставить антикоагулянтные свойства аллогенных плазменных ГАГ с коммерческим гепарином, исследовать влияние выделенной из плазмы гепа-риноподобной субстанции на индуцированную агрегацию тромбоцитов.

3. Провести количественную оценку уровня плазменных ГАГ в комплексе клинико-лабораторного обследования больных при дифференциальной диагностике геморрагических диатезов.

4. Исследовать особенности компенсаторных реакций в системе гемостаза сталированных доноров при интенсивном прерывистом цито-плазмаферезе.

5. Определить комплекс лабораторных методов исследования, характеризующих состояние тромбофилии как ранних стадий ДВС синдрома при гемобластозах, а также при токсикозах П половины беременности', необходимый для определения показаний и контроля адекватности гепа-ринотерапии и применяемых в комплексном лечении этих состояний гемо-компонентов и дезинтоксикационных сред. Уточнить особенности коррекции гемостаза при использовании сорбционных методов детоксикации на фоне тромбоцитопении у гематологических больных.

НОВИЗНА;

Работа открывает и научно обосновывает новое направление исследований в коагулологии - изучение роли эндогенных гепариноподобных субстанций (гликозаминогликанов) в ферментативных и физико-химических процессах, определяющих патологию гемостаза. На основе привлечения прямых биохимических методов выделения и количественной оценки содержания эндогенных ГАГ в плазме крови, ранее не применявшихся при обследовании больных с наследственными и приобретенными геморрагическими диатезами, впервые было показано, что от уровня и состава плазменных ГАГ зависит взаимодействие клеточных и плазменных компонентов системы регуляции агрегатного состояния крови.

Экспериментально изучены антикоагулянтные свойства ГАГ, вццеле! ных из донорской плазмы, а также влияние их на индуцированную АДФ, тромбином, ристоцетаном тромбоцитарную агрегацию. Впервые показано, что нарушения тромбоцитарного звена и плазменного гемостаза в 1-П ф< зе, сопровождающиеся повышением уровня ГАГ в циркулирующей крови, наблюдаются у больных, имеющих клинико-лабораторные признаки болезш Виллебранда, диспротеинемию, циркулирующий антикоагулянт.

Доказана значимость повышения концентрации и изменения состава плазменных ГАГ в циркулирующей крови для возникновения геморрагичес кого диатеза.

Предложен и апробирован в клинике комплекс информативных методов исследования эндогенных антикоагулянтов за счет разработки новы модификации и привлечения из зарубежных источников литературы, доступных для практики и позволяющих диагностировать нарушения тромби ногенеза, тромбофилию, циркулирующий ингибитор волчаночного типа, стадии ДВС синдрома, контролировать корригирующую терапию.

На основании разработанного комплекса методов исследования тромбиногенеза и эндогенных антикоагулянтов диагностирован циркулирующий антикоагулянт 1-П фазы волчаночного типа у 6 больных, дано описание их клинико-лабораторного статуса.

На основе собственных исследований и анализа данных литературъ предложена схема взаимодействия физиологических ингибиторов (ГАГ-ак титромбиновых комплексов и протеина С и Б ), объясняющая чередован! тромбозов и геморрагий у этих больных.

Разработан метод получения диагностического иммунологического препарата антисыворотки к антитромбину-Ш человека и сорбционный метод выделения из супернатанта, остающегося после выделения препара-"Криопреципитат" фракции плазменного АТ-Ш.

Впервые описано транзиторное появление циркулирующего ингибитора у 2-х доноров после интенсивного лейкоцитафереза. Компенсатор-

ные реакции, связанные с выбросом эндогенных антикоагулянгов в сосудистое русло в ответ на стимуляцию гемокоагуляции повторными эксфу-зиями крови, наблюдаемые при плазмацитаферезе у доноров, могут трансформироваться в патологическую реакцию ПСС в виде возникновения патологического ингибитора-циркулирующего англкоагулянта.

Определены особенности проведения гемосорбции и плазмосорбции у гематологических больных на фоне выраженной тромбоцитопении и нарушений гемостаза.

Выявлена патогенетическая связь снижения функции эндогенных антикоагулянтов и развития позднего токсикоза беременных, изучены возможности корригирующей заместительной терапии.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ МАТЕРИАЛОВ ДИССЕРТАЦИИ

Методы исследования активности ангитромбина-Ш в плазме крови, тест генерации тромбина, определение антигепариновой активности,модифицированные с целью повышения их информативности и доступности для клинических лабораторий, внедрены в работу Республиканского центра по лечению гемофилии, Ленинградского городского акушерского гематологического центра, реанимационной гематологической бригады скорой помощи г.Ленинграда.

Для лечебно-профилактических учреждений и научно-исследовательских институтов медицинского профиля составлены и опубликованы методические рекомендации "Исследование активности эндогенных антикоагулянтов у больных с нарушениями гемостаза", 1988г., включающие комплекс методов оценки состояния тромбиногенеза и его ингибиции.

Составлен и утвержден ученым советом института проект "Инструкции по изготовлению и контролю диагностического препарата антисыворотки к антитромбину-Ш человека". Проведена апробация опытных образцов препарата в диагностике нарушений гемостаза в гематологической клинике института, РЦЛГ и акушерском гематологическом центре.

Полученные в работе данные вопии в методические рекомендации, '

выпущенные клиникой ЛНИИГПК "Дезинтоксикационная терапия гемобласто-зов" и инструкцию по обследованию доноров плазмацитофереза.

Авторское свидетельство № 1450852 А1 на изобретение "Способ получения сорбента-гидроксилапагита" Ш 1989 2.

Апробация работы:

Основные научные результаты по теме диссертации доложены на Международном гематологическом конгрессе в Будапеште (авг.1982г.), на 2-х Всесоюзных конференциях "Сосудистая стенка и гемостаз", Полтава, 1981г. и Минск,1983г.; на Всесоюзном и I и П Всероссийском съездах гематологов и трансфузиологов, Львов,1985г.; Ленинград,1981г Челябинск,1986г., на Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы гемостаза в клинической практике", Москва,1987 г.; на I и П Всесоюзных конференциях с международным участием "Противотромботичес-кая терапия в клинической практике", Москва,1980,1982 гг.

Сделаны доклады и прочитаны лекции на научно-практических конференциях службы крови (Петрозаводск, Волгоград, Иваново, Кемерово, Омск, Калинин, Вологда), на ежегодных декадниках по проблемам свертывания крови для врачей-лаборантов и клиницистов различных специальностей, в том числе для гематологов-трансфузиологов и врачей реаниматологов г.Ленинграда, РСФСР, курса усовершенствования врачей Ленинградского ГИДУВа и Военно-Медицинской академии.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 60 работ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы объем и методы исследования, 9 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 404 источника, из которых 95 отечественных и 309 иностранных.

Общий объем работы включает 319 машинописных страниц, из них таблицы (56) и рисунки (23) занимают 68 страниц. Таким образом основное содержание диссертации изложено на 206 страницах.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объем и методы исследования.

Под наблюдением находилось 937 больных с различными формами врожденных и приобретенных коагулопатий в возрасте от 5 до 78 лет, которые проходили обследование и лечение в 1970-1988 годах в лаборатории свертывания крови, гематологической и хирургической клиниках Ленинградского НИИ гематологии и переливания крови, Республиканского Центра по лечению гемофилии и Ленинградского городского акушерского гематологического центра. Кроме того обследованы 42 человека-родите-ли и родственники больных, контрольная группа доноров и здоровых людей - 1210 человек, а также группа 60 сталированных доноров в процессе интенсивного плазма- и цитафереза.

Контроль за состоянием гемостаза обследованных больных и доноров плазмоцитафереза проводился в динамике наблюения от 2 до 12 раз.

Определение показателей гемокоагуляции проводилось по методикам, опубликованным в методических указаниях ЛНИИГПК 1971,1984,1986,1988г^ I) запись свертывания крови и плазмы на тромбоэластографе и коагуло-графе Н-334 ; 2) время свертывания венозной iqpom (Lee .white ); 3) время рекальцификации плазмы (Eergerhof, Hoka ); 4) активированное парциальное тромбопластнновое время, АПТВ; (с использованием парциального тромбопластина,приготовленного в лаб.свертывания крови ЛенНИИГПК или фирмы РЕАНАЛ); 5) протромбиновый индекс (Quick); 6) тромбиновое время; 7) "свободный" гепариа (Сирмаи); 8) толерантность плазмы к гепарину; 9) активность фактора -УШ:С, одноступенчатый метод; Ю) активность фактора Виллебранда с использованием ристомицина или реактива фирмы РЕАНАЛ); II) активность фактора У ( üwren 12) активность фактора УП (Owrea ); 13) активность факторов Х1-ХП; 14) активность фактора ХШ; 15) концентрация фибриногена; 16) продукты деградации фибриногена, ПДФ, полуколичественный иммуно-

Iü

логический метод с использованием антисыворотки, приготовленной в лаб.свертывания крови ЛНЖГПК; 17) количественный метод определения гепарина (Раби); 18) эганоловый тест ( Godai ). jg) длительность кровотечения (Шитикова); 20) адгезивность тромбоцитов при контакте с раневой поверхностью ( ia vivo ). 21) адгезивность тромбоцитов к стекловолокну; 22) фотометрический и микроскопический методы иссле дования агрегационной активности тромбоцитов с различными индуцерами агрегации - АДФ, тромбином, ристомицином, коллагеном; 23) ретракция кровяного сгустка (Котовщикова и Кузник); 24) фибринолитическая активность цельной крови (Котовщикова и Кузник); 25) время лизиса эу-глобулиновой фракции плазмы; 26) каолин-зависимое время лизиса эугло булинов плазмы ( Hieveroaaky ) ; 27) метод определения активност ингибитора в плазме ( Biggs -Kasper ).

По ходу выполнения работы были освоены и впервые внедрены в отечественную практику тест нейтрализации циркулирующего антикоагулянта тромбоцитами ( ïriplet ,1383), тканевой тромбопластин ингиби-торный тест ( sciiieider ,1976), позволяющие диагностировать циркулирующий антикоагулянт волчаночного типа, в связи с чем они подробно изложены в соответствующей главе.

В разделе собственных исследований представлены методы модифицированные и разработанные нами: тест генерации тромбина, метод определения активности антитроыбин-Ш-гепаринового комплекса плазмы (Кацадзе,Котовщикова,1982); прямой биохимический метод количественного определения эндогенного гепарина и других плазменных гликоза-шногликанов ГАГ ( Кацадзе,Харченко,1981); спектрофогометрический метод определения антигепариновой активности (по количеству гепарин--липопротеиновых комплексов в плазме); метод выделения антитромби-на-Ш из плазмы; метод получения антисыворотки к антитромбину-Ш человека; модификация метода определения толерантности плазмы к гепарину с регистрацией на тромбоэластографе ГКГМ 4-02; метод определения ин-

дукции коагуляционной активности на коагулографе Н-334.

Для вкполнения поставленных задач были использованы также: спектрофотометрический метод определения белка (Лоури), метод радиальной иммунодиффузии по Манчини, модифицированный метод двойной им-муноднффузии то 0ухтерлони в агаре на предметных стеклах, вертикальный электроферез в полиакриламидном геле; метод афинной хроматографии на гепарин-сефарозе; метод гельфильтрации (хроматографии) на СЕФАДЕКСе Г-ТОО и Г-200; метод направленной иммунизации кроликов для получения специфических антител.

Кроме того был использован анализ родословной больных с нарушениями гемостаза.

Полученные данные обработаны методом вариационной статистики по Стыоденту-Фишеру (Монцевичуте,1964);в ряде случаев применены непараметрические методы статистического анализа.

В работе принимали участие сотрудники лаборатории свертывания крови (проф.З.Д.Федорова), белков крови (д.б.н. М.Ф .Харчен ко), консервирования крови и трансфузиологии (проф.В.Н.Мельникова), донорского отдела (ст.н.сотр.Л.К.Николаева), гематологической (проф. К.М.Абдулкадыров) и хирургической (ст.н.с.В.Д.Каргин) клиник Ленинградского НИИ гематологии и переливания крови, Республиканского центра по лечению гемофилии (к.м.н. Т.М.Ханина), Ленинградского акушерского гематологического центра (проф.М.А.Репина, канд.мед.наук Г.А.Красовская), реанимационно-гематологической бригады скорой помощи Главного Управления Здравоохранения г.Ленинграда (оч£врач А.Г.Чуслов), в связи с чем автор приносит им свою благодарность.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ I. Исследование плазменных гликозаминогликанов (ГАГ) Необходимость привлечения прямых биохимических количественных методик, существующих в аналитической химии, к исследованию содержания гепарина и других ГАГ для клинических целей оценки состояния ге-

юстаза больных, обусловила наш выбор препаративных приемов, как наиболее простых и эффективных при использовании минимальных объемо: исследуемой плазмы и доступных реактивов.

Разработанный совместно с М.Ф.Харченко метод основан на количественном спектрофотометрическом определении плазменных ГАГ и в то) числе эндогенного гепарина, после их выделения из плазмы фенольной депротеинизацией и селективной преципитацией цетавлоном, по интенсивности специфической окраски при карбазольной реакции на уроновые кислота, фракций ГАГ, разделенных повышающейся концентрацией натрия хлорида при элюции с цетавлона. Расчет количества ГАГ проводится по стандартным кривым на глюкуроновую кислоту и коммерческий гепарин (СПОФА).

Данные, полученные при исследовании плазмы 30 здоровых лиц, представлены в таблице I.

Таблица I

Содержание ГАГ в плазме здоровых лиц (п=30)

Фракции В пересчете на глюкуроновую кислоту мкг/мл В пересчете на гепарин СПОФА мкг/мл

р! фракция хлорида^натрия 1,24^,17 2,57¿0,1

2М фракция хлорида натрия (гепарин) 0,7б1р,104 1,58^,12

Общее содержание ГАГ 2,0 ± 0,1 4,1 ± 0,1

Исследование фракций ГАГ, полученных из донорской плазмы, содержащих значительно большую их концентрацию и повторно очищенные переосаждением этанолом, выявило ярко выраженные антикоагулянтные ' свойства. Так, при определении гепарина по Раби в пробе с добавкой 2М фракции ГАГ, определяется десятикратное по сравнению с нормально

плазмой увеличение содержания гепарина. В этом случае 0,06 мкг ГАГ 2М фракции (в 0,05 мл взятых; в реакцию) проявляют антикоагулянтную активность, соответствующую 10 мг стандартного гепарина (100 ед/мг). В тестах время рекальцифинации плазмы и тромбиновое время ингибиция процесса образования сгустка более выражена в случае использования 21.1 фракции, хотя концентрация уроновых кислот в ней значительно ниже чем в Ш фракции (табл.2).

Таблица 2

Влияние полученных фракций гликозаминогликанов на

коагуляционные свойства донорской плазмы

Т п о !л 1 Контроль Добавление ГАГ

А С Ь 1 (на донорской плазме) • ЗМ- 0,05 мл 5,7 мкг/мл 2М - 0,05 мл 1,1 мкг/мл

I. Время рекальцификации плазмы (с) 144 с 64 мин. 64 мин.

2. Тромбиновое время (с) 25 с 108 с 36 мин.

3. Гепарин по раби

Разведения тромбина ( 50 ед/мл) 1/10 (с) 23 с ! 62 с 30 мин

1/5 (с) 16 с | 43 с 136 с

1/2 (с) 8 с | 18 с 47 с

Концентрация гепарина (мкг/мл) 1.1 4.0 10

Таблица 3

Сравнительная оценка антитромбинового действия коммерческого гепарина и выделенной из плазмы доноров 2М фракции ГАГ, в чистой системе тромбин-фибриноген (препараты ШИИГПК) и в цитратной плазме

Реагенты Количества, взятые в реакцию (мл)

Тромбин (акт 6-7") 0.1 ... 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

Фибриноген мг/мл 0,2 0,2 0,2 0,2

Физ.р-р рН-7,4 0,05 0,05|

Донорская безтромбоцит, плазма 0,2 0,2 0,2

Гепарин 20 ед/мл 0,05 0,05

Гепарин, 5000 ед/мл ГАГ х) 20 мкг/мл 0,05 0,05 0,05

Бремя образования сгустка (с) 6 контроль 8 : КОНТ ; РОЛЬ , 8-9 1 22-23 720 | 780 720

2М фракция ГАГ, ввделенная из 250 мл свежей донорской крови (из 82 мл богатой тромбоцитами плазмы) сконцентрирована в 20 ра т.е. содержит ГАГ около 20 мкг/мл по уроновым кислотам.

Данные, представленные в таблице 3, показывают, что выделенная наш из донорской плазмы гепариноподобная субстанция обладает мощным антитромбиновым действием только в присутствии плазменного кофактора, так же как и коммерческий гепарин. По своему антитромбино-вому действию 2М фракция ГАГ мало уступает концентрированному коммерческому гепарину (5000 КЕ/мл).

Гепарин (Рихтер) в концентрации 20 ед/мл, т.е. соответственно средней активности 100 ед/мг - 20 мкг/мл, практически не ингибирует действие тромбина в чистой системе фибриноген-тромбин (нет отличия

от контроля) и составляет 8 секунд. Гепариноподобное вещество, выделенное наш из плазмы, несколько удлиняет это время до 13-18 секунд в различных опытах, что свидетельствует о более выраженной антикоа-гулянтной активности и соответствует 170-200 МЕ/МГ вещества.

Добавление в кювету агрегометра одновременно с плазмой и АДФ, как индуцера агрегации, 2М фракции донорских плазменных ГАГ предотвращает агрегацию тромбоцитов. В случае введения 2М фракции ГАГ на фоне максимальной индуцированной АДФ агрегации тромбоцитов, происходит дезагрегация, регистрируемая прибором. Добавление коммерческого гепарина (Рихтер) в подобную систему, в качестве контроля, не вызывает дезагрегации, напротив агрегация усиливается (рис.1).

Как видно из представленных агрегатограмм ристоцетин-индуциро-ванная агрегация тромбоцитов ингибируется добавлением в кювету прибора выделенной наш из плазмы 2М фракции ГАГ в количестве 2 мкг/мл уроновых кислот (рис.2).

Таким образом наш выявлена способность ГАГ, выделенных из плазмы здоровых людей, ингибировать действие тромбина, АДФ и ристо-цетин индуцированной агрегации тромбоцитов. Показано отличие от коммерческого гепарина, который усиливает агрегацию. Полученные данные свидетельствуют о том, что противоречивость данных литературы, касающихся взаимодействия гепарина и тромбоцитов, в значительной степени обусловлена гетерогенностью коммерческих препаратов гепарина, которые использовались в этих работах.

Мы не ставили перед собой задачу идентификации фракций плазменных ГАГ, а придерживались имеющихся в литературе положений, утверждающих, что 2М раствор хлорида натрия способен элюировать высоко-сульфатированные ГАГ гепаран сульфат и гепарин ( Jaques ,1940; Shiller et al. ,1961; Galatr-oni ,1969). Инкубирование 2M фракции с тестикулярной гиалуронидазой не дало изменения экстинкции.что свидетельствует о характерном для гепарина отсутствии расщепления

Рис.1. Влияние плазменных гликозаминогликанов на АДФ индуцированную агрегацию тромбоцитов.

а) При одновременном добавлении АДФ и ГАГ к богатой тромбоцитами плазме агрегации не наблюдается: с

б) дезагрегация при добавлении ГАГ - АДФ 0,5.10 ;

в) добавление гепарина нть^ег -агрегация усиливается I контроль).

1

— 1 ! | 1 !

1

- - .

1 1

I 1 !

| о

Рис.2. Влияние 2М фракции ГАГ, выделенной из донорской плазмы

на ристоцетин-индупированную агрегацию тромбоцитов здорового человека. I. Контроль . 2. Добавление в кювету ГАГ 2 мкг/мл уроновых кислот предотвращает агрегацию.

гиалуронидазой. Электрофорез на ацетатной пленке полученных фракций плазменных ГАГ выявил хондроитинсульфат во всех фракциях и лишь минорный компонент в 2М фракции,соответствующий гепарзн-сульфату или гепарину. Соответственно нашим результатам и данным литературы эти 2 вида ГАГ обладают антикоагулянтныш свойствами ( Dietrich a.-fader ,1974; Telen et al. ,1976; Buonassiai a.Colburn ,1983;

Palmer a.Rick ,1984; Starpans ,1985). Лишь отдельные авторы отмечают наличие слабо выраженных антиноагулянтных свойств у высоко-сульфатированного хондроитинсульфата ( Qonura et al. ,1983)'.

Проведенные наш исследования показали, что количество ГАГ в криопреципитате (5,9 мкг/мл) составляет 2Ъ% от общего количества, имевшегося в плазме, тогда как объем его составил 22% от исходного объема плазмы. Из этого следует, что 75$ ГАГ остается в супернатанте (5,0 мкг/мл), поэтому, по нашему мнению, он может служить источником

для получения концентрированных препаратов плазменных ГАГ. То, что

фоне

концентрация эндогенных антикоагулянтов на сниженной концентрации-общего белка и прокоагулянтов близка к донорской плазме, супернатант может быть расценен как гемокомлонент с относительно высокой антикоа-гулянтной активностью.

Возможность использования плазмы и ее компонентов в качестве источника получения гепариноподобных субстанций в виде лечебного препарата рассматривается нами впервые;, нам не удалось найти в доступной литературе подобных исследований и предложений. Кроме того, по нашему мнению, для этой цели может быть использован секционный и абортивный аллогенный материал. Имеющиеся по этому вопросу сведения касаются легочной ткани, взятой при аутопсии; она содержит от I до 35 мг гепарина на I мг сухого вещества.

Исследование животного сырья показало, что до 53% всех ГАГ легочной ткани крупного рогатого скота составляет гепарин и гепа-ран сульфат. В среднем из 100 тонн сырья получают I кг препарата (ТО мг/г ткани) ( Нопщд. ,1948, Varna ,1982).

Выделение из эмбриональных легких человека (абортивный материал плодов 8-12 недель), проведенное наш тем же методом, который использовался для лабораторных исследований у больных, показало, что из I г ткани можно получить 80 мг с активностью в пересчете на гепарин Рихтер 175-200 МЕ/мг.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ГЕПАРИНА, ТКАНЕВОГО ТРОМБОПЛАСТИНА, ТРОМБОЦИТОВ И ПЛАЗМЕННЫХ КОМПОНЕНТОВ СИСТЕМЫ ГЕШСТАЗА

Моделируя ситуации повышения прокоагулянтной активности за счет введения тканевого тромбопластина на фоне высокой антигоагулянтной активности богатой тромбоцитами и бестромбоцитной плазмы, полученной добавлением к ней гепарина различной концентрации in. vitro , мы пытались составить представление о взаимодействии гепарина, тканевого тромбопластина и тромбоцитов, которое определяет понимание механизмов нарушений, возникающие при патологии. Таким образом в эксперименте в одном случае были созданы условия, близкие к тканевой тром-бопластинемии, - признанного индуцера ДВС синдрома, в другом - ситуация, возникающая на фоне гепаринотерапии 150-200 МЕ/кг массы тела и более.

Полученные данные свидетельствуют об участии тромбоцитов в нейтрализации введенного в тест систему гепарина. Так, даже при рутинном исследовании толерантности плазмы к гепарину, в богатой тромбоцитами плазме отмечается статистически значимое укорочение времени реакции почти вдвое. После удаления из плазмы тромбоцитов толерантность ее к гепарину снизилась: время образования сгустка удлинилось от 5,56 минут до 10,32 минут в первой серии опытов (при концентрации гепарина 5 ед/ш) и от 8,7 до 14 минут во второй серии опытов (гепарин 50 ел/т). Разведение богатой тромбоцитами плазмы путем добавления 0,05 мл физиологического раствора в контроле (1/4 первоначального объема плазмы), также привело к удлинению времени образования

сгустка.

Добавление малых доз гепарина 0,25 МЕ в 0,05 мл раствора, содержащего 5 МЕ/мл, вызвало снижение толерантности богатой тромбоцитами плазмы почти в 6 раз, а в бедной тромбоцитами плазме это количество гепарина привело к полной блокаде свертывания (более 60 минут).' Отмеченное различие объясняется тем, что находящиеся в богатой тромбоцитами плазме кровяные пластинки, за счет своей антигепариновой активности, нейтрализуют почти половину гепарина, имеющегося в реактивной гепарин-кальциевой смеси.

В условиях тромбоцитопении малые дозы гепарина плохо конкурируют с тканевым тромбопластиаом. Одновременное введение тромбопласти-на и гепарина дает в безтромбоцитной плазме время образования сгустка 0,68 мин, тогда как те же добавки в богатую тромбоцитами плазму приводят к образованию сгустка за 1,26 мин, время более близкое к нормальным цифрам. Парадоксально короткое (почти в 2 раза) время образования сгустка В бедной тромбоцитами плазме свидетельствует о большей тромбоопасности в условиях тромбоцитопении и об участии тромбоцитов в регуляции процессов тромбообразования, об их антитром-биновой активности, существование которой подтверждено нашими исследованиям активности АТ-Ш в богатой и бедной тромбоцитами плазме и литературными данными ( Соп1е^ ,1948, ^¡шаЪе ,1977).

Введение раствора гепарина в 10 раз большей концентрации (50 ед/мл) привело к резкой гипокоагуляции, препятствующей образованию сгустка в течение более 60 минут, и в богатой и бедной тромбоцитами плазме. В этом случае антигепариновая актишость тромбоцитов и плазменных факторов недостаточна для нейтрализации его антикоагу-лянтной активности.

Введение тканевого тромбопластина в систему плазма - гепарин -кальциевая смесь резко, в 8-10 раз укорачивает время образования сгустка, то есть повышает толерантность плазмы к гепарину.

Введенный тканевой тромбопластин (0,1 стандартной 1% суспензии) полностью нейтрализует действие гепарина (2,5 ед.), находящегося в гепарин-кальциевой смеси и даже несколько укорачивает среднее время рекальцификации плазмы без гепарина (103 с): оно составляет во всех группах опытов менее 60 с.

Как видно из приведенных данных, в услошях выраженной тромбо-пластинемии изменения содержания тромбоцитов в плазме не оказывают влияния на скорость образования активного тромбина. И в богатой и в бедной тромбоцитами плазме при добавлении тромбопластина наблюдалось практически одинаковое время образования сгустка, т.е. действие тканевого тромбопластина перекрывает влияние тромбоцитов.

Малые дозы гепарина (0,25 ед), введенные одновременно с тромбо-пластином, полностью нейтрализуются, а избыточный тромбопластин повышает толерантность плазмы к гепарину в богатой пластинками плазме до 1,26 мин., а в бедной тромбоцитами плазме до 0,88 мин.

Десятикратное увеличение дозы гепарина (2,5 ед) на фоне введения тромбопластина также сопровождалось полной нейтрализацией введенного антикоагулянта. Время образования сгустка в этих условиях было 7,62 и 10,61, что несколько короче показателей в контроле, что по-видимому, связано с избытком тромбопластина, оставшегося после взаимодействия с гепарином. Таким образом, 2,5 МЕ гепарина недостаточны для ингибиции действия 0,05 мл 1% суспензии стандартного тканевого тромбопластина.

Полученные данные свидетельствуют об антигепариновом действии тромбоцитов и тканевого тромбопластина, которые являются антагонистами его антикоагулянтной активности. Это дает основание для утверждения, что использование тромбоцитарной взвеси или богатой тромбоцитами плазмы, а также цельной крови, содержащей клеточные тромбо-пластины, для нейтрализации избыточного антикоагулянтного действия гепарина взамен общепринятого небезопасного введения протаминсуль-

фата, обладающего при передозировках антикоагулянтным действием. Кроме того, проведенный эксперимент показал, что низкая толерантность плазмы к гепарину, особенно в условиях тромбоцитопении, несомненно служит предостережением для проведения гепаринотерапии. Снижение функциональной активности тромбоцитов, нарушение выделительных реакций даже при достаточном их количестве, приводящее в конечном счете к замедлению процесса образования кровяного тромбопластина и генерации тромбина, может также отразиться на гепарин-нейтрализующей способности плазмы, обусловленной Ф4 тромбоцитов и тем самым явиться показанием к уменьшению терапевтической дозы гепарина.

С целью улучшения диагностики нарушения тромбиногенеза и выявления тромбофилии, наш проведено сравнительное изучение методов исследования АТ-Ш в плазме крови, которое показало правомочность модифицированной и внедряемой нами в практическую работу методикимагЪе'Ь awinterstein. . Кроме того, изучено в эксперименте влияние на активность АТ-Ш фибриногена, добавляемого в различных концентрациях (до 8 г/л), что позволило нам отказаться от предлагаемой ранее поправки на фибриноген и повысить точность метода определения АТ-Ш в плазме. Показаны диагностические возможности метода при выявлении состояния "тромбофилии", дефицита АТ-Ш в сравнении с двумя методами фирмы Behringwerke у детей с острой и хронической почечной патологией (данные совместной работы с Ленинградским педиатрическим институтом, зав.каф.профессор А.В.Папаян).

Отказ от использования добавки коммерческого гепарина, принятый в нашей модификации, при определении антитромбина-Ш у больных, позволяет определить истинную активность АТ-Ш, зависящую от наличия собственного эндогенного гепарина.

Дополнительными экспериментами нами показано, что антитромби-новая активность плазмы зависит от наличия в ней нативных тромбоци-' тов. Показано также, что тромбоцитопения усиливает тромбоопасность.

так как нарушается регуляция тромбинообразования и его инактивация'. Это удалось установить путем исследования предложенного нами теста генерации тромбина и толерантности плазмы к гепарину в условиях тканевой троыбопластинемии, гепаринемии и тромбоцитопении, а также с помощью определения активности АТ-Ш в плазме с различным содержанием тромбоцитов, что согласуется с отдельными публикациями, свидетельствующими о наличии АТ-Ш в тромбоцитах ( Gelas et al. ,1985).

РАЗРАБОТКА МЕТОДА 1ЮЛУЧШИЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО ДИАГНОСТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА АНТИСЫВОРОТШ К АТ-Ш ЧЕЛОВЕКА

Промежуточным этапом этой работы явилось освоение и модификация, применительно к нашим условиям, метода выделения антитромбина-Ш плазмы человека. Применение сорбционного метода (DorntÍLeim UiSchon , 1982), гельфильтрации и афинной хроматографии (wiaherhouser et al. 1979, Smith et al. ,1985, Маркова O.A. с соавт.,1987) позволило нам выделить антиген - АТ-Ш. Была проведена идентификация его в тест системах с антигеном, предоставленным v/iaUerhouser (США) и антисывороткой к АТ-Ш, полученной из лаборатории консервирования тканей ЦНИИ скорой помощи им.Склифосовского. Кроме того была определена его чистота вертикальным элекгроферезом в полиакриамидном геле.

Полученный опыт был положен в основу технологической разработки метода приготовления концентрата'АТ-Ш из малоиспользуемой в трансфу-зиологии фракции донорской дяазш (суперйатанта), остающейся при выделении препарата "криопреципитат". В процессе этой работы нами был предложен новый способ получения сухого сорбента (гидроксилапатита) для последовательного выделения из плазмы белков протромбинового комплекса и АТ-Ш, на который получено авторское свидетельство. Хотя в Кировском НИИ гематологии и переливания крови разработана документация, отсутствие мелкодисперсного сорбента (аналога зарубежного трикальцийфосфата) до настоящего времени сдерживает производство

в нашей стране ценного лечебного препарата - концентрата прогромби-нового комплекса плазмы.

Использование выделенного и очищенного АТ-Ш в качестве антигена дало нам возможность путем иммунизации кроликов получить новый диагностический препарат - антисыворотку к антитромбину-Ш человека. Апробированы специфическая активность и чувствительность этого препарата в методах радиальной иммунодиффузии по Манчини и двойной радиальной иммунодиффузии при исследовании плазмы больных с нарушениями гемостаза в гематологической и акушерской клиниках. Полученные наш данные согласуются с литературными сведениями о довольно частом отсутствий корреляции между содержанием антигена и проявлением антитром-биновой активности АТ-Ш ( Sas at al.,1974,1975,1979 ¿ас Kay ,1979, King et al. Д980; Jawed et al. ,1982).

Учитывая, что в нашей стране иммунологические методы исследования АТ-Ш в практическом здравоохранении не применяются, а немногочисленные научные публикации отражают работы, основанные на использовании импортных методик и реактивов, проведенная нами работа имеет важное значение.

Апробация антисыворотки к АТ-Ш диагностической в иммунохишчес-ких исследованиях плазмы больных с геморрагическими диатезами, а также при обследовании больных с гемобластозами дает дополнительную информацию для диагностики ДВС синдрома. Составленная совместно с ЦНИИ скорой помощи документация: "Инструкция по изготовлению и контролю "Антисыворотки к АТ-Ш человека диагностической" будет способствовать внедрению иммунологического метода определения уровня антигена АТ-Ш у больных. В клинической практике отсутствует не только диагностический, но и лечебный препарат АТ-Ш, так как современные препаративные методы, необходимые для фракционирования плазмы крови и получения АТ-Ш, не применяются в отечественной службе крови. Между тем опыт использования выпускаемых целым рядом фирм Западной Европы и

Америки концентратов АТ-Ш, при врожденном дефиците АТ-Ш во время беременности, при лечении повторных тромбозов, тромбэмболической болезни и ДВС синдрома широко обсуждается в литературе.

Проведенное нами исследование дало возможность сравнить сорб-ционный и хроматографический методы выделения АТ-Ш и предложить перспективный комбинированный способ получения из плазмы фракции, обогащенной АТ-Ш, содержащей альбумин. Этому способствовала разработка способа получения сухого сорбента гидроксилапагита.

Полученные данные служат основанием для создания лечебного препарата - концентрата АТ-Ш.

ИЗМЕНЕНИЯ В СИСТЕМЕ ГЕМОСТАЗА У СТАЛИРОВАННЫХ ДОНОРОВ ПРИ ИНТЕНСИВНОМ ЦИТОПЛАЗМАФЕРЕЗЕ

С нашим участием в ЛНИИПК были разработаны схемы, доступные для практической службы крови, тройных тромбоцитаферезов, позволяющих получать 2,0iP,I3.I0-'-^ клеток и лейкоплазмаферезов, извлекающих от донора 4-6x10® лейкоцитов и 500/750 мл плазмы, повторяющихся 2-3 раза в течение 2-х недель с интервалом от 48 часов до 2 дней. При этом для увеличения выхода клеток предусматривается использование для тромбоцитафереза более жестких режимов центрифугирования, чем применялись ранее (I - 780^/ в течение 10 мин и П - 1330|в течение 20 мин), в полимерных контейнерах (гемакон 500/300 и компопласт 300/300) на обычных рефрижераторных центрифугах. По этим схемам проводится 2-4 кратная эксфузия 400 мл крош, её стабилизация, глюкозо-цитратным раствором, центрифугирование и последующее переливание эритроцитной массы и плазмы. При этом изучение гемостаза представляло особую важность, так как, по имеющимся сведениям литературы, каждая из этих манипуляций влияет на гемодинамику и систему PACK донора. При анализе предварительного обследования стажированннх доноров (К =26) выявлены отклонения в сторону гипокоагуляции: повышение

фибринолитической активности крови, снижение толерантности плазмы к гепарину, удлинение времени рекальцификации плазмы. Указанные отклонения от нормы статистически достоверны. Кроме того отмечено достоверное увеличение ретракции (до П6±9,0), которое может быть вызвано повышенной плотностью образовавшегося кровяного сгустка.

Удлинение тромбикового времени (до 34,4+1,2 е., р<0,05) и увеличе-

jk

ние активности АТ-Щ (122±7,5) при нормальном содержании фибриногена (.3,3jD,Г7), вероятно, обусловлены реакцией противосвертывающей системы, ее тренированностью повторными кроводачаш, особенностями системы PACK кадровых доноров, имеющих длительный донорский стаж.

Время рекальцификации имело тенденцию к укорочению при каждом трехкратном ТПФ, и при П ТПФ эти изменения были статистически достоверны (от 131±Ю,8 с до 107^4,7 с). Резко изменялась активность У фактора в процессе П и особенно Ш ТПФ достигала I77jt35,5^ (исходная 98±7,9$, р<0,0б), значительно превышая физиологические колебания.

Активность антитромбина Ш значительно повысилась перед Ш ТПФ, т.е. на 8-ой день от начала цикла ТПФ на 2,1% (от I04±II,3$ до 152±26,]$, р^0,05). В дальнейшем активность АТ-Ш постепенно снижалась, достигая исходной к 10-му дню после окончания цикла.

Некоторое увеличение фибринолитической активности цельной крови имело место после П ТШ, но после Ш ТПФ^снизилась на 8% от исходного; в остальные сроки наблюдения ФА сохранялась наисходном уровне.

Таким образом в процессе интенсивного ТПФ по схеме 3x3x3 наблюдалась реакция системы гемостаза, выразившаяся в статистически значимых изменениях показателей. Одновременно с признаками активации, (протромбин, У фактор), выявленной во всех фазах, отмечалась гипокоагуляция, связанная с изъятием белков и тромбоцитов.

Тромбоэластография в динамике подтвердила данные биохимической

коагулограммы.

Использование теста генерации тромбина показало ускорение (на 26%) троыбиногенеза при снижении скорости его нейтрализации (на 9,5%) что является объективным признаком активации гемостаза, I стадии ДВС синдрома. Многочисленные эпизоды подобного состояния у доноров "тренируют" его ПСС и способствуют развитию у них отмеченного нами гипо-коагуляционного фона.

Состояние системы гемостаза сталированных доноров характеризуется признаками реактивно-комперсаторной активации АТ-Ш и фибрино-лиза, которая нередко сочетается с некоторой гипопротеинемией, обусловленной изъятием больших количеств плазмы. В этих условиях ускоренной репродукции белков и напряженной функциональной деятельности печени нередко, как показали исследования в ЛНШГПК, временно изменяются функциональные пробы печени (повышение уровня трансаминазы у некоторых доноров); с развитием аутоиммунных реакций, спровоцированных переливанием клеток крови, имеющих микроповреждения мембран, вызванных консервированием крови и ее центрифугированием, возможен процесс аутоиммунизации активированными факторами гемостаза и возникновение аутоантител к прокоагулянтам (Цибиков H.H.,1985). Именно такой механизм, по нашему мнению, имел место и обусловил появление циркулирующего ингибитора I-П фазы у 2-х молодых доноров - мужчин, имевших в анамнезе курс иммунизации стафилококковым антигеном сразу после интенсивного прерывистого плазмацитофереза. При отсутствии клинических проявлений и хорошем самочувствии перед проведением очередного цитафереза были выявлены значительные сдшги в сторону гипо-коагуляции: резко удлиненное время свертывания крови^до 40 мин^АПТВ, некоторое снижение протромбинового индекса, толерантности к гепарину^ снижение активности УШ фактора до 40%.

Аналогичных описаний в доступной литературе мы не нашли. Клинических проявлений нарушений гемостаза у этих доноров на фоне пато-

логической коагулограммы не отмечалось; при обследовании через I месяц коагулограыма в пределах норш.

Полученные наш данные по изучению особенностей гемостаза

стачшрованных допоров в процессе интенсивного прерывистого цито-

плазмафереза, в противоположность имеющимся данным литературы, сш-

_нами предложено

детельствуют об опасности осложнений, в связи с чемУвведение в схе-

7

му обследования доноров\отборе их для проведения интенсивного цита-фереза,контрольных исследований, характеризующих систему гемостаза (ТЭГ, время свертывания крови), для временного отстранения их в случаях выявленных нарушении.

ПЛАЗШННЫЕ ГЛИЮЗА 'ИНОГЛИКАНЦ И АНТИТРОШШ-Ш У БОЛЬНЫХ С ГИ.ОРРАШЧЕСКИШ ДИАТЕЗАШ

Полученные наш и литературные данные свидетельствуют, что циркуляция высокозаряженных анионов - ГАГ в кровотоке, дане в минимальных количествах может рассматриваться как фактор, поддерживающей оптимальное агрегатное состояние крош, несмотря на обидно ийдуце-ров активации гемокоагуляции, выработанных в филогенезе для останов-га! кровотечения.

С это!'] точки зрения представляло интерес изучение уровня ГАГ в плазме больных с геморрагическими диатезами, с паругаенпяш сосу-дисто-тромбоцитарного звена гемостаза, что и было предпринято наш в настоящем исследовании.

На основании дифференциальной диагностики, проводимой с учетом анамнеза, клинических признаков и лабораторных дапннх из 76 больных с геморрагическими проявлениями, обследованнкх в ЛШШГПК, в 2Ъ% случаев (19 больных) был установлен диагноз болезни Внлле-бранда, в 34% - тромбоцятопатии высвобождения (26 больных), в % -тромбастепия Гланцмана, остальные 35,(27 больных) составили группу больных, имеющих сочетанные нарушения, не характерные для известных нозологических форм. У всех больных отмечались проявления .

кровоточивости различной локализации и интенсивности, начавшиеся с раннего возраста. В большинстве случаев прослеживался семейный характер заболевания.

Обследование больных проводилось, как правило, в период умере) ных проявлений кровоточивости или в период ремиссии. Диагноз сташ. ся на основании клинических и лабораторных признаков, типичных для каждой патологии. Анализ полученных данных свидетельствует о прича< ности АТ-Ш и плазменных ГАГ к патогенетическим механизмам кровоточ] вости. При общей тенденции к гипокоагуляции и нарушениям в I-П фазе повышение активности АТ-Ш наблюдалось нами у всех обследованных больных в разной степени выраженности.

Исследование активности АТ-Ш у больных с болезнью Виллебранда свидетельствует о повышении активности АТ-Ш у 8 больных (от 130 до 250%). Ни в одном случае не наблюдалось снижения активности АТ-Ш ниже донорской нормы, то есть не отмечалось признаков тромбофилии. У 6 больных, повышение уровня АТ-Ш сочеталось со снижением адгезивнс функции тромбоцитов, во всех случаях оно коррелировало со снижение1 активности фактора УШ. В целом по группе отмечено достоверное повышение активности АТ-Л1 и повышение количества плазменных гликозаминс гликанов. У 10 из 19 больных (52$) содержание плазменных ГАГ значительно превышало донорскую норму.

Таким образом, нам удалось выявить коррелятивную связь повышения эндогенного гепарина (2М фракция) и других ГАГ в плазме крони больных с характерными признаками болезни Виллебранда в 52% случае1 и достоверное увеличение этих компонентов в целом по обследованной группе по сравнению со здоровыми людьми. Полученные данные позволял думать, что снижение активности прокоагулянтов, удлинение АПТВ и функциональной активности тромбоцитов связано с ингибиторным действием протеогликанов (комплекса ГАГ с АТ-Ш).

При лабораторном обследовании группы больных с кровоточивости

неясной этиологии выявлены значительные статистически значимые нарушения в гемостазе. Отмечается снижение функциональной активности тромбоцитов, сочетающейся со снижением активности фактора УШ, удлинением АПТВ и увеличением тромбиннейтрализующей активности плазмы. Все эти отклонения от нормы более выражены в I подгруппе, в которую включены больные со значительным увеличением содержания ГАГ в плазме крови (в 2 раза и более по сравнению со здоровыми людьми). В связи с тем, что активность фактора Вяллебранда в момент обследования этих больных была в пределах нормальных колебаний и не было выявлено характерных изменений длительности кровотечения, не был поставлен диагноз болезни Вяллебранда, хотя клиническая картина заболевания весьма сходная.

Таким образом, в отличие от диагностированной болезни Вилле-бранда, в группу больных с кровоточивостью неясной этиологии вошли больные с ненарушенной длительностью кровотечения и нормальной ко-факторной активностью плазмы в тесте ристоцитин-индуцированной агрегации донорских тромбоцитов. Кроме того, у этих больных нарушения в первой фазе гемокоагуляции менее выражены, хотя и проявляются в непостоянном умеренном снижении активности УШ фактора, метод определения которого не исключает ингибиторного действия на Ха и других се-риновых протеаз I фазы. Являясь ингибитором широкого спектра, ге-парин-АТ-Ш комплекс оказывает влияние и на все 3 фазы плазменного гемостаза. Интересно, что у больных с неустановленным диагнозом с повышенным содержанием плазменных ГАГ на фоне снижения адгезии, АДФ индуцированная агрегация тромбоцитов не нарушена. Возможно это связано с тем, что исследование проводится в ЭДТА стабилизированной плазме с увеличенным разведением (т.е. на фоне резкого снижения ионов кальция - не физиологичных для действия эндогенных ГАГ условиях (Исаева И.В., 1980).

В целом по группе больных с кровоточивостью неясной этиологии

АДФ-индуцированная агрегация даже несколько усилена. В связи с этим можно думать об отсутствии однородности этой группы и наличии в ней больных с компенсаторно-вторичным повышением антикоагулянтной активности по типу подобной реакции при лапетно-протекающем ДВС синдроме (П-Ш стадии).

Таким образом^установленное наш повышение уровня плазменных ГАГ, в том числе эндогенного гепарина (гепарансульфата) в кровотоке больных с сосудисто-тромбоцитарными и плазменными дефектами при геморрагических диатезах, а также экспериментальные данные о влиянии выделенных из плазмы здоровых людей ГАГ на коагуляцию и функцию тромбоцитов, позволяют признать их важную роль в патогенезе этих геморрагий, что существенно дополняет представление о плазменных компонентах, участвующих в гемостазе.

Полученные наш данные позволяют констатировать, что повышение количества эндогенных плазменных ГАГ коррелирует с нарушением АДФ-индуцированной агрегацией тромбоцитов и адгезией их к стекловолокну*. Их присутствие проявляется в ингибиции общих тестов и показателей, отражающих I фазу гемостаза, а также в виде повышенной автитроыйк-новой активности (АТ-Ш =172,1$, р<-0,02; в 1-ой подгруппе 209,4$, р<0,05). Так у больных наблюдалось достоверное удлинение времени рекальцификации плазмы, индекса АПТВ, увеличение'времени свертывания крови и тромбинового времени. Кроме этого отмечаются умеренные изменения в фазе превращения протромбина в тромбин (тенденция к снижению протромбинового комплекса), что может быть объяснено средством ГАГ к фосфолипидам (Бышевский с соавт.,1987) и связанным с этим нарушением ингибицией взаимодействия белков с фосфолипидной матрицей.

Анализируя клинико-лабораторные данные по этой группе больных, можно констатировать, что у 13 больных, составивших I подгруппу, имеется синдром повышенной антикоагулянтной активности. Поскольку было выявлено сходство клинической картины и лабораторных данных по всей

этой группе в целом и по группе больных болезнью Виллебранда, мы предположили возможность существования разновидностей болезни Виллебранда, имеющей в патогенезе нарушения метаболизма и клиренса ГАГ. При обследовании 15 больных с ранее установленным по клинико-генети-ческим и лабораторным данным диагнозом "классической" гемофилии А, в 9 случаях, то есть в 60$, выявлено повышение уровня плазменных ГАГ. Учитывая распространенность локальных поражений суставов у этих больных, полученные данные представляют особый интерес в свете современных представлений о наследственных энзимопатиях и различных формах мукополисахаридозов, обуславливающих нарушения метаболизма ГАГ и других компонентов соединительной ткани (Дельвиг А.А.,1986, Varna 1983).

Полученные данные дают нам основание считать, что у больных со склонностью к геморрагическим диатезам и осложнениям имеются особенности биохимии соединительной ткани, проявляющиеся в нарушении синтеза и клиренса ГАГ, хотя данных прямо подтверждаю-

щих это положение в доступной литературе, найти не удалось. Наш впервые установлен факт повышения уровня плазменных ГАГ при геморрагических диатезах наследственного типа. Повышение в кровотоке концентрации вещества (ГАГ), обладающих уникальной биологической активностью в ионном и молекулярном взаимодействии, приводит к сложным и многоплановым нарушениям в системе регуляции гемостаза и агрегатных свойств крови, её текучести и вязкости'.

Механизм ингибиторного дейстшя ГАГ, обуславливающего нарушения тромбоцитарного и плазменного звена гемостаза, выявленных наш in vitro и in vivo j можно объяснить следующим основными факторами: I) повышенным связыванием с ГАГ ионов кальция, участие которых во всех фазах плазменного и тромбоцитарного гемостаза доказано многочисленными публикациями; 2) препятствием образования активного X фактора, осуществляемое гепарином (ГАГ) в комплексе с белковыми

плазменными кофакторами (АТ-Ш и П кофактором гепарина), альфа-2 макроглобулином, а также путем блокирования взаимодействия факторов гемостаза с фосфолипидной матрицей тромбоцитов. Известна высокая афинность гепарина к тромбопластину тромбоцитов (ф 3) и к фибронек-тину, участвующему в адгезии клеток (Бышевский А.Ш. с соавт.,1987, Archer ,1973; Biggs et el. ti970); 3) влияние на гемостаз через участие в деградации липопротеидов и клеточных мембран и их фрагментов, связанных со способностью гепарина и гепаран сульфата активировать липолитическую липазу ( Наа ,1977; Triplet etalI983. persson. et al.,1987),

Причины появления аномальных молекул факторов свертывания крови не ясны и мало изучены, хотя в ряде случаев доказано, что степень гликолизации, сиализации, сульфатирования, зависящая от микроокружения и конкретных условий синтеза, приводит к изменению функциональных свойств молекулы ф УШ, АТ-Ш, фибриногена, ГАГ и т.д. Так, например, известно, что в условиях гипоксии синтез коллагена, в котором принимают участие ГАГ, извращается (Дельвиг А.А.,1986; Абдул-лин А.Р. с соавт.,1987).

ЦИРКУЛИРУЮЩЕЙ ИНГИБИТОР, ВОЛЧАНОЧНОПОДОБНЫЙ АНТИКОАГУЛЯНТ (ДИАГНОСТИКА, КЛИНИЧЕСКИЕ НАБЛОДЕНИЯ)

Сведения о патологических эндогенных антикоагулянтах, способных тормозить активацию проэнзимов каскада гемокоагуляции, создавая иллюзию их дефицита при исследованиях коагуляционными методами, появившиеся в последние годы в зарубежных научных публикациях, многообразны и достаточно противоречивы. Наряду с волчаночным ингибитором (антикоагулянтом), специфическим для системного заболевания соединительной ткани, многочисленные работы посвящены циркулирующему ингибитору, "приобретенной гемофилии" и "приобретенному синдрому Вилле-бранда" - патологическим состояниям, обусловленным ингибицией форвд-

рования активной молекулы УШ фактора (Прудникова Л.З., Сайковская

Т.В., 1988; í'eLastsinl a ñappaport, 1970; Duran-Suazer et alSS2; Granot a Stinar ,1982; Messmora et al. Д982; Messaore (jcg2. Gorreras a Vermyllen ,1982; Nakashima et а1.дс82; Palmer a Hick 1984; Prentice et al. ,1984; Graig et al. ,1988).

Наиболее распространенной точкой зрения на причины появления циркулирующих ингибиторов как у больных с генетически обусловленной классической гемофилией А, так и в случаях спонтанно появляющейся повышенной антикоагуляатной активностью плазмы, является аутояммунизация активированными факторами, изменения в иммунной системе и при патологии, связанной с аутоиммунизацией, диспротеине-шей и гипергаымаглобулинемией ( Robert et al. ,IS82;Triagarian et al. , I980;Nak:asIiima et al. ,1982).

Практически сходен спектр прокоагулянтов, которые ингибируются действием АТ-Ш в комплексе с гепаршом и циркулирующим ингибитором 1-П фазы (волчаночноподобным антикоагулянтом). Волчаночноподобный антикоагулянт определен в настоящее время как гетеронный иммуноглобулин, пролонгирующий in vitro фосфолипид зависимые тесты и тем самым препятствующий генерации тромбина по внешнему и по внутреннему пути ( Triagarian et al. , 1980; Messmore et al. ,1982; Sbcner ,1985).

Скрининговыми методами для выявления ВА при лабораторном обследовании больных являются АПТВ и протромбиновый индекс, вреда свертывания крови. При этом может наблюдаться снижение коагуляцион-ной активности ф УП и УШ (Глушков В .А. с соавт.,1982; shleider etigj . 1976; Kxner , 1985; Blockmans, N ermyllen , J986) .

Для дифференциальной диагностики впервые в отечественной прак-

тике н ами были применены дополнительные методы исследования с использованием нейтрализации ВА тромбоцитарными субстанциями и метод выявления ингибитора^лппмрщью разведения тканевого тромбопластина.

Скрининговое обследование больных с тяжелыми нарушениями гемостаза, проявляющимися в шде тромбозов и геморрагий с использованием указанных тестов, позволило выявить 6 больных, имеющих ингиби-цию фосфолипидзависимых тестов, циркулирующий антикоагулянт 1-П фазы Врожденные коагулопатии и тромбоцитопатии у этих больных были исключены с помощью алгоритма диагностики для болезни Виллебранда, предложенной Л.П.Папаян, а также в связи с отсутствием клинико-лабора-торных признаков гемофилии и тромбоцитопатий, применяемых для их выявления в лаборатории свертывания крови ЛНИИГПК.

Интерес представляет обнаруженный нами факт повышения уровня ГАГ у больных с циркулирующим антикоагулянтом, находившимися под нашим наблюдением. Гепариноподобная природа антикоагулянта подтверждается проведенной нами коррекцией тромбоэластографии плазмы больной Н-ко добавлением протаминсульфата, Подобная коррекция может быть использована в комплексе терапевтических мероприятий, однако нами она апробирована в клинике не была (Титр ингибитора у больной в период обследования составлял 5 Бетезда единиц/мл). Лечение, проводимое наш, соответствовало имеющимся в литературе рекомендациям и заключалось в проведении плазмафереза, иммунодепрессивной терапии преднизолоном и заместительной гешкомпонентной терапии. Комплекс этих мероприятий позволил достичь клинического улучшения. Однотипность изменений диагностических лабораторных показателей при циркулирующем ингибиторе и при фармакологической гепаринемии "искусствен, ной гемофилии", применяемой при операциях с экстракорпоральным кровообращением (удлинение АПТВ, тромбинового времени, снижение про-тромбинового индекса), затрудняет ведение больных и коррекцию гемостаза в послеоперационном периоде, о чем свидетельствуют отдельные

публикации ( wenger et alK8I; Nakashima et а1.ТЭ82; Palmer а. Kick ,1984; Sharon et al Д986)• Появление и спонтанное исчезновение ингибиторной активности описано у практически здоровых людей ( Green a.Lecher ,1982). Среди наших 6-ти больных с ВА только одной больной был поставлен диагноз диссеминированной красной волчанки, остальные имели признаки аутоиммунизации.

Парадоксальность возникновения тромбозов при ВА на фоне выраженной гипокоагуляции, определяемой коагуляционными методами, объясняется, большинством исследователей, повреждением эндотелия теми же антителами, которые ингибируют "прокоагулянтную активность" фосфо-липидов ( Freissinet et al..1386). С нашей точки зрения чередование тромбозов и геморрагий у этих больных объясняется, кроме того, взаимодействием протеина С и его кофакторов (протеина з и тромбо-модулина сосудистой стенки) с сульфатированными гликозашногликанами, белковыми и липоидныш компонентами плазмы и клеток крови. Предложенная нами схема (рис.3) отражает эти взаимодействия. Волнообраз-ность и обратимость реакций приводит к непостоянной коагуляционной активности У и УШ факторов, контролируемой протеином С, активация которого зависит от наличия в кровотоке активного тромбина, зависимого от действия АТ-Ш и ГАГ. Можно себе предсташть, что при избыточной активности АТ-Ш - гепаринового комплекса предотвращается полностью активация тромбина и соответственно протеина С, в связи с чем ограничения формирования активных молекул У и УШ факторов не происходит, что и приводит к тромбозу. Такая точка зрения исходит из собственных наблюдений непостоянной активности ф У и ф УШ на фоне гипокоагуляции у больных с ингибитором волчаночного типа и следующими данными литературы.

Предложенная наш схема позволяет трактовать появление реку-рентных тромбозов на фоне массивной гепаринотерапии, неадекватной состоянию тромбиногенеза у данного больного, путем предотвращения

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЭНДОГЕННЫХ ИНГИБИТОРОВ В СИСТЕМЕ ГЕМОСТАЗА

ЙЕРИНЮГЕН

/¿НИБРИНлМОНОМЕР ШЗМИНОГЕН ' /

ШЭНИН \ // «ИБРИН ПОЛИМЕР

_______^цда

тромбин-индуцированной активации протеина С. Хотя большинство авторов связывает эти тромбозы с потреблением АТ-Ш на фоне гепариноте-рапии, но описанное другими исследователями успешное лечение тромбозов гепарином на фоне врожденного дефицита АТ-Ш.

Существует мнение, что "прокоагуляктное" действие фосфолипидов и нарушение процессов активации плазменных белков, связанных с взаимодейстшем с фосфолипидной матрицей (поверхностью), происходит в связи с изменением электростатического потенциала этой поверхности (iàhleider ,1976; Barrowclif a Greig ,1981; L'xner ,I985;Bloch-man a Wermiiiee.1986). В связи с этим, по нашему мнению, не исключено участие высокосульфатированных ГАГ, оказывающихся в кровотоке при этой патологии и обладающих способностью менять электрический заряд компонента, с которым они комплексируются. Однако с этой точки зрения процессы ингибиции фосфолипидзависимых коагуляционных тестов до сих пор не исследовались. Повышение уровня ГАГ в плазме приведенных нами больных с циркулирующим ингибитором 1-П фазы и возможная нейтрализация антикоагулянта ПС косвенным образом подтверждают это предположение.

ДИАГНОСТИКА И КОРРЕКЦИЯ НАРУШЕНИЙ ГЕМОСТАЗА В КОМПЛЕКСНОЙ ТЕРАПИИ ЛЕЙКОЗОВ

На протяжении с 1979 по IS88 г. нами проводилось обследование системы гемостаза больных с различными формами лейкозов, диагностика и лечение которых осуществлялись на основании клинических, морфологических и цитохимических исследований в гематологической клинике ЛНЖГПК под руководством профессора д.м.н. К.М.Абдулкадырова. Наблюдения проводились не только при традиционной терапии, по и при разработке новых программ с применением интенсивной цитостатической, дезинтоксикационной трансфузионной терапии и гравитационной хирургии крови (плазма-, цитафереза, rem- и плазмосорбции). Учитывая поли-

о7

морфность изменений в системе гемостаза, фазность ДВС синдрома, описанную достаточно подробно и в зависимости от формы лейкоза, наличия или отсутствия геморрагических осложнений, наш задачи ограничивались поиском диагностических признаков недостаточности эндогенной анти-коагулянтной активности, при которой гепаринотерапия в сочетании с плазмой, назначалась бы по прямым показаниям для замещения имеющегося дефицита.

Анализируя данные, полученные при обследовании больных о.лейкозом, можно констатировать нарушения в коагулограмме до появления ге-моррагий и до назначения курса цитостатической терапии. У большинства больных при общей тенденции к гипокоагуляции и тромбоцитопении, нередко отмечались признаки активации гемостаза по общим тестам коагу-лограммы (укорочение времени рекальцификации плазмы до 90-75 с, увеличение толерантности плазмы к гепарину (1,5-2 мин)', сокращение времени свертывания до 5,5-5 мин, тромбинового времени до 26-28 с). Олег

новременно определялось увеличение концентрации фибриногена до 7,5 г/л, протромбинового индекса и ф У свыше 110%. Определение активности гепарин-АТ-Ш комплекса в плазме также выявило значительные колебания в динамике заболевания (от 40 до 300%). Иммунологическое исследование уровня антигена, проведенное с полученной наш диагностической сывороткой, также свидетельствует о значительных отклонениях от нормк

Как видно из представленных данных, в процессе течения заболевания состояние гемокоагуляции имеет выраженную динамику. Отмечаются сдвиги показателей коагулограммы как в сторону гипокоагуляции, так, в отдельные периоды, можно отметить признаки активации гемостаза. Наиболее подвержены колебаниям такие показатели как вреди рекальцификации плазмы, активность антитромбин-Ш, активность У фактора, отражающие, в определенной степени, участие тромбоцитов. Мозаичность и некоторая противоречивость данных коагулограммы характерны для развивающегося ДВС синдрома: при этом, соответственно, наш определя-

лись 3 стадии. Показано, что наиболее информативными, бистро и просто выполняемыми тестами для диагностики синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания являются: время свертывания щзови, время рекальцификации плазмы, концентрация фибриногена, активность фиб-ринстабилизирующего фактора, тромбиновое время, наличие продуктов деградации фибриногена и фибрина, паракоагуляционние тесты, активность антитромбина Ш, содержание тромбоцитов.

Для определения общей направленности процесса гемостаза нами исследовалась динамика генерации тромбина и его нейтрализации с помощью предложенного метода и расчета скорости активации и инактивации, что является важным критерием для оценки общей антикоагуля-нтнои активности плазмы и назначения гепаринотерапии.

С помощью этого теста мы пытались также разрешить некоторые патогенетические аспекты взаимодействия антитромбинов и тромбоцитов. Так, по нашим данным, в богатой тромбоцитами цитратной донорской плазме статистически достоверно (р = 0,02) увеличена активация и еще более резко ускорена инактивация тромбина по сравнению с бедной тромбоцитами плазмой. Это доказывает, что тромбоциты играют существенную роль не только в процессе генерации тромбина, но и в его инактивации.

Как показали наши данные, колебания активности АТ-Ш и содержания антигена в плазме больных весьма значительны. Уровень ГАГ, в составе которых высокосульфатированные ГАГ (2М фракция), обладающие ан-тикоагулянтными свойствами, также варьирует. Наряду с повышенным содержанием ГАГ в плазме больных различными фюрмами лейкоза отмечается в ряде случаев нормальный их уровень. Отмечено выраженное увеличение

0 летания ГАГ у больных на фоне бластного щшза.

Многократные исследования состояния гемокоагуляции с привлечением дополнительных разработанных нами методов оценки активации тромбина и антитромбиновых свойств плазмы в процессе лечения больных с

1 момента их поступления, свидетельствующие о значительной динамике

нарушений, показали важность индивидуализации терапии гепарином и тольк при наличии в данный момент признаков повышенной генерации тромбина и плохой его инактивации. Эти нарушения часто сочетались с тромбоцитопе-нией, инменениями в коагулограмме, характерными для I-II стадии ДВС синдрома с наличием положительных паракоагуляционных тестов, повышением уровня продуктов деградации фибриногена при иммунологическом их исследовании. Постоянный контроль за состоянием гемостаза вне зависимости от геморрагических проявлений, своевременное назначение патогенетической антикоагулянтной терапии на ранних стадиях ДВС синдрома в комплексе с цитостатической, иммунодепрессивной,и грансфузионной и гемокомпонентной терапии, позволило добиться клинико-гематологической ремиссии у 5 больных в группе из 12 больных острым промиелоцитарным лейкозом. Полученные данные убедительно показывают, что тромбоцитопения, сопровождаю^ тая гемобластозы влияет на процессы образования тромбина и его инактива цию. Показанная нами возможность повышения антикоагулянтной активности в связи с повышением уровня содержания эндогенных плазменных ГАГ диктует необходимость строгой индивидуализации показаний для гепаринотерапии у больных лейкозом, проведения контроля коагуляционных тестов в динамике заболевания.

Мы согласны с мнением ряда авторов, что многолетний опыт лечения лейкозов убеждает не столько в необходимости проведения гепаринотерапии для большинства больных / Wada et al- ,1933; Straub ,1975;

Goldberg et al. ,1987/, сколко в целесообразности массивных перели ваний плазмы и тромбоцитарных взвесей / Citarella et al,I979;

Kasatkin ,1982/, в несколько раз превышавших дозы используемые в отече ственной практике. Это убеждение связано с - известным фактом, что указанные гемокомпоненты обладают высоким антипротеазнш потенциалом широкого спектра / uessiaore ,1982/

ОСОБЕННОСТИ КОРРЕКЦИИ ГЕЮСТЛЗА ПРИ ГЕШ- И ШГАЗШСОРБЦИИ У ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ

Метод гемосорбции был использован в лечении 19 больных лейкозами, в том числе при ОЛ у 9, ХШ - 3, ХМ - 4, шеломной болезни у 3 больных. 13 больных в развернутой стадии заболевания. 6 - в терминальной. В 65$ случаев гемосорбция проводилась на фоне выраженной тромбоцитопении, обусловленной поражением гемопоэза опухолевым (лей-козным) процессом, так и потреблением их в процессе латентно протекающего синдрома диссешнированного шутрисосудистого свертывания. Даже при нормальном количественном содержании кровяных пластинок, нарушения тромбоцитарного звена гемостаза, проявляющиеся в снижении функциональной активности тромбоцитов и тромбоцитарных факторов свертывания у этих больных, как прашло, имеются.

При выборе дозировки гепарина в процессе гемосорбции необходимо учитывать состояние системы гемостаза больного, а таксе индивидуальную к нему чувствительность, которая определяется лабораторным исследованием времени свертывания крови или ТЭГ. Общая доза гепарина для проведения гемосорбции у гематологических больных на фоне тромбоцитопении не должна превышать 200 МЕ/кг веса тела; при нормальном содержании тромбоцитов она монет быть увеличена до 300 МЕ/кг.

Отказ от опасной возможными осложнениями нейтрализации гепарина проташнсульфатом позволил получить вполне удовлетворительные результаты и восстановление исходных показателей гемостаза через 20 часов после сорбции у тяжелых гематологических больных. В случае возникновения геморрагических осложнений рекомендуются трансфузии свекекон-сервированной донорской крови или нагавной плазмы 1-2 суток консер-вациП| тюомблцитарной Езвеси.

0перация плазмосорбции, более простая по технике выполнения, чем гемосорбция, разработанная сотрудниками ЛНШГПК Б.А.Ганапиевым и В.П.Шатровым, проводилась гематологическим болышм по тем же по-

казанияы в комплексе дезинтоксикационной терапии. Общая доза гепарина составила 5000 МЕ. В отличие от пациентов, которым проводилась гемосорбция, операция плазмосорбции у 26% больных выполнялась при наличии умеренных геморрагических проявлений в виде носовых кровотечений и подкожных кровоизлияний. В результате применения плазмосорбции у больных прекращались диспептические явления, головные боли, исчезало чувство тяжести в голове, что происходило, вероятно, за счез улучшения реологических свойств крови и нормализации мозгового кровообращения. Геморрагический и гемолитический синдромы купировались во всех случаях.

Проведенные исследования позволили заключить, что имеющиеся нарушения гемостаза не являются противопоказанием для проведения де-токсикации путем применения плазмосорбции даже на фоне умеренных геморрагических проявлений. Лабораторный контроль за состоянием гемостаза может осуществляться с помощью тромбоэластографии и является необходимым для ориентировки клинициста в применении коррекции гепарином и гемокошоненгадш.

ИЗУЧЕНИЕ СОСТОЯНИЯ ГЕЮСТАЗА В ПРОЦЕССЕ ЛЕЙЮ-1ШАЗМАФЕРЕЗОВ У БОЛЬНЫХ ЛЕЙКОЗАМИ

В гематологической клинике института с нашим участием произведено 270 плазма- и цитаферезов у 64 больных, из которых 25 страдали шеломной болезнью, 2 - макроглобулинемией Вальденстрема, 20 - хроническим лим|;олейкозом, 12 - хроническим миелолейкозом, 5 - острым лейкозом. Аферез осуществлялся в пластикатных контейнерах "Гемакон" 500 и 500/300.

Тромбоэластографические исследования, проводимые для контроля безопасности плазмаферезов у гематологических больных;с высокой степенью достоверности выявляют отклонения от нормы доафереза. Практически по всем показателям ТЭГ, что соответствует представлению о

том, что нарушения гемостаза при этом заболевании многоплановы.

Включение в программы лечения плазма- и цитафереза позволяет со!фатить сроки проведения терапии, увеличить разовые и снизить общие дозы применяемых цитостатических препаратов. Исследования системы гемостаза являлись критерием безопасности, в ряде случаев, при выраженной гиперкоагуляции при эксфузии крови у больных был использован гепарин в дозе 2-5000 МЕ, инфузия раствора альбумина во время центрифугирования крови больного, введение эритроцитарной взвеси в сочетании с физиологическим раствором хлорида натрия, что, по взей вероятности, и позволило добиться удовлетворительного клинического эффекта и профилактировать возможные осложнения, связанные с активацией гемостаза при цитаферезе.

ДЕФИЦИТ АНТИТРОМЕИНА-Ш КАК ЭТИОПАТОПНЕТИЧЕСКИЙ ФАКТОР, ПОЗДНИХ ТОКСИКОЗОВ БЕРЕМЕННОСТИ

В последние годы установлено, что "тромбофилия", склонность к тромбозам и ДВС синдрому обусловлена довольно распространенной унаследованной генетически или приобретенной недостаточностью эндогенных антикоагулянтов, в частности I кофактора гепарина антитромбина-Ш. Важно подчеркнуть, что дефицит АТ-Ш часто развивается на фоне острых и хронических заболеваний печени и почек, а также в результате длительного приема оральных контрацептивов. В связи с этим система диспансеризации и обследования беременных женщин, направленная на раннее выявление различной сопуствующей патологии, которая может осложнить течение беременности и родов, должна быть дополнена своевременное обследование системы гемостаза. Диагностика врожденных гемоста-зиопатий (коагулопатий, тромбоцитопатий, а также тромбофилии) необходима для их коррекции, с целью профилактики тяжелых тромбогемор-рагических осложнений в родах. Эти основные задачи и были поставлены перед организованным в 1982 г. и функционирующим по настоящее

время Ленинградским городским акушерским гематологическим центром. Наше участие складывалось в консультативно-методической работе по о; ганизацш центра, обучению персонала методам исследования системы гемостаза, приготовлению реактивов, апробации и внедрении новых методов диагностики и коррекции нарушений гемостаза. Объем работы центра быстро возрастал и в 1984 и 1985 гг. составлял более 2000 коагулограмм в год. В связи с тем, что кроме амбулаторного приема беременных с отягощенным акушерским анамнезом, обследовались беременные, находящиеся на лечении в дородовом, реанимационном и послеродовом отделениях, были внедрены методы, необходимые для диагностики ДВС синдрома (кроме общепринятых показателей коагулограммы', тромбоэластография, электрокоагулография, гепарин по Раби, антитром бин-Ш, этаноловый тест, каолин-зависимый лизис эуглобулиновой фракции плазмы, АПТВ, ВДФ, антитрипсин, антигепариновая активность, као линовое время, количество и функция тромбоцитов).

В отдельных случаях были использованы методы{явления циркулирующего антикоагулянта (Кацадзе с соавт.,1988) и беременные направлялись для уточнения нарушений и диспансерного наблюдения в лабораторию ЛНЙИПШ и РЦЛГ.

Данные обследования здоровых беременных (30 человек) отражают динамику изменений в системе гемостаза соответственно триместрам бе ременности. Начиная с первого триместра наблюдается заметная гиперкоагуляция, которая усиливается к моменту родоразрешения. Так статистически значимо изменяются: индекс коагуляции, толерантность пла мы к гепарину, протромбиновый индекс, активность У.УП.УШ факторов, концентрация фибриногена, гепарин по Сирмаи, фибринолитическая активность крови, лизис эуглобулиновой фракции плазмы. На этом гипер-коагуляционном фоне нами выявлена тенденция к повышению активности антитромбина-Ш, что свидетельствует, по нашему мнению, об адекватни компенсаторных реакциях организма в условиях повышенного тромбино-

генеза, связанного активацией прокоагулянтов, что согласуется с не- -которыми публикациями ( Weenink et а1.д982).

Из 978 обследованных наш беременных с отягощенным акушерским анамнезом дефицит АТ-Ш с активностью ниже 75$ (7,5 ед/мл плазмы) был выявлен в II,8$ случаев. Риск тромбэмболических осложнений и кровотечений в родах у этих женщин велик, в связи с имеющейся у них тромбофилией.

В проведенный нами анализ вошли данные обследования беременных с различными формами токсикоза 2-ой половины беременных (нефропа-тия - 356, преэклампсия - 118, эклампсия - 30), находившиеся на лечении в дородовом и реанимационном отделениях родильного дома № 6. Полученные данные свидетельствуют, что нефропатии сопровождаются глубокими нарушениями в системе гемостаза, степень выраженности которых соответствует тяжести токсикоза, нарушениям мозгового кровообращения, водно-солевого обмена, интоксикации, наличию кровотечений в период родоразрешения. При сравнении полученных данных с группой здоровых беременных в Ш триместре выявлена диссоциация признаков гипер- и гипокоагуляции, характерных для П-ой стадии ЛВС синдрома. Так, наряду с достоверным, хотя и незначительным, укорочением тром-бинового времени, увеличением концентрации фибриногена, снижением фибринолитической активности крови отмечается уменьшение содержания тромбоцитов, нередко наблюдается анемизация и микрогемолиз, несколько уменьшается протромбиновый индекс, выявляется наличие ВДФ и фибрин-мономера (положительный этаноловый тест), что является начальным признаками коагулопатии потребления. Активность АТ-Ш по усредненным данным не меняется, но примеры динамического наблюдения за этим показателем у отдельных больных весьма наглядны. Так в ряде случаев тяжелых токсикозов, когда применялось оперативное родораз-решение, сразу после операции активность АТ-Ш была очень низкой и доходила до 34-32$. Колебания активности АТ-Ш в процессе лечения и

родоразрешения при тяжелых токсикозах значительны от 30-45$ до 115-130$, она зависит как от индивидуальных особенностей больной, так и от схемы трансфузионной и гемокомпонентной терапии. Так у больной Т. (1984 г. И.б.К 254 ; д-з 38 недель беременности нефропа-тия-Ш, хр.пиелонефрит, преэклемпсия) динамика АТ-Ш; 46$ - 87$ -100$ - 116$ - 75$ при естественном родоразрешешш . После Кесарева сечения на фоне преэклампсии у больном В. (1984 г. И.б. $ 43) активность АТ-Ш - 45$, 32$, 44$, 99$, 64$; у больной М (1984 г. И.б.В 153) активность АТ-Ш 66$, 120$, 90$, 75$, 75$. Эти и другие примеры динамического изменения АТ-Ш в послеоперационном периоде согласуются с мнением, что этот показатель отражает динамику ДВС синдрома и может служить ориентиром для терапии ( Yio.st.zzep еЬ а1.,1984;Ага1 еЪ а1. 1983; Тгап et а1.,1985). Некоторыми авторами подчеркивается, что именно тромбин-нейтрализующая активность АТ-Ш, определенная коагу-ляционным методом, наиболее информативна и ваяна для клиницистов (сощрегЪ .12а<11 ДЭ83;Аапаг ей а1.1986;вог§ еЪ а1.»К86).

Как видно из приведенных примеров адекватная терапия токсикоза способствует коррекции активности АТ-Ш, однако нередко при обследовании перед выпиской, вновь отмечается умеренное снижение, что свидетельствует об индивидуальной фоновой низкой активности АТ-Ш, связанной с особенностями данной больной. Дефицит АТ-Ш ниже 80$ выявлен наш у Г77 из 670 женщин с поздним токсикозом беременных, что составило 28$ обследованных; это согласуется с литературными данными и объясняется наличием наследственно обусловленного или приобретенного дефицита (хроническая соматическая патология, прием оральных контрацептивов, какие-либо токсические воздействия, профессиональные вредности или вредные привычки (Белицер с соавт.,1387;Заэ еъ а1. 1975,1979; Удламег et а1. ,1984).

Противоречивость данных и трудности в оценке активности эндогенных ангикоагулянгов в сочетании с признаками быстро развивающего-

ся потребления прокоагулянтов обуславливают осторожность, с которой используют гепарин для коррекции гемостаза в поздние сроки беременности.

Лабораторными критериями для включения гепарина в комплексную схему лечения токсикоза в нашем исследовании были признаки ДБС синдрома 1-П степени; отсутствие выраженной активации флбргшолиза, снижение активности АТ-Ш, повышение толерантности плазмы к гепарину, как тест, определяющий переносимость гепарина и гепарин-нейтрализую-щий потенциал больного, положительный этаноловш тест. Гепарин вводился внутривенно капельно вместе с раствором глюкозы или альбумина в дозе 5000 № в сутки в течение 7-10 дней, в отдельных случаях гепарин вводился подкожно в 5-6 инъекциях в суточной дозе 5-10000 ТЛЕ. Представлены данные коагулологического обследования беременных с токсикозом до и после курса геларинотераши. Сравнение исходных данных проводилось с коагулограммой здоровых беременных в Ш триместре". В результате проведенной терапии на фоне клинического улучшения наблюдалась тенденция к нормализации коагулограмш.

Полученные данные позволяют считать, что развитие тяжелой Форш позднего токсикоза с локальны!.® нарушениями гемодинамики мозгового кровообращения (эклампсия) может быть патогенетически связано с недостаточностью эндогенных антикоагулянтов и угнетением фиб-ринолиза^

Опыт работы городского гематологического акушерского центра свидетельствует о целесообразности более широкого коагулологического обследования не только беременных с поздними токсикозами, но и беременных с разданной соматической патологией (нефрозонефрити, ге~ патоз, варикозная болезнь, анемии и т.д.) и имеющих в анамнезе указания на тромбозы и геморрагии. Исследование систем: гемостаза в этих случаях позволяет своевременно диагностировать тромбоцилию.что обеспечивает адекватную подготовку к родам в плане профилактики осложнений .

ВЫВОДЫ

1. Разработаны и модифицированы методы исследования эндогенных ингибиторов тромбиногенеза для диагностики и определения тактики корригирующей терапии нарушений гемостаза: прямой биохимический метод определения плазменных гликозаминогликанов, коагуляционный и иммунологический методы определения антитромбина-Ш, методы идентификации волчаночно^подобного антикоагулянта, тест генерации тромбина, метод определения общей антигепариновой активности плазмы.

2. Установлена патогенетическая связь повышенного содержания эндогенных ингибиторов тромбиногенеза (плазменных гликозаминогликанов и антитромбина-Ш) в крови больных с проявлениями Нарушений тром-боцитарного и плазменного звена гемостаза, по клинико-лабораторным . признакам сходных с болезнью Виллебранда. Показана в эксперименте зависимость антикоагулянтного и дезагрегирующего действия выделенных из донорской плазмы аллогенных : . ... " гликозаминогликанов от плазменных белковых кофакторов.

3. Впервые предложен для практики отечественного здравоохранения и апробирован комплекс методов диагностики циркулирующего ингибитора 1-П фазы волчаночного типа, обеспечивающий возможность выявления и контроля лечения этой патологии.

4. Получены экспериментальные доказательства регулирующего тромбиногенез действия тромбоцитов, свидетельствующие о зависимости антитромбиновой активности плазмы от содержания в ней нативных тромбоцитов. Тромбоцитопения способствует возникновению тромбоопасности для больного, в связи с чем трансфузии тромбоцитарной взвеси и на-тивной плазмы, содержащей тромбоциты, могут рассматриваться как заместительная терапия, способствующая регуляции процессов тромбино-образования.

5. Разработан комплекс методов диагностики недостаточности эндогенных антикоагулянтов при ДВС-синдроме у гематологических боль-

ных, позволяющий индивидуализировать заместительную терапию гепарином в сочетании с гемокомпонентами. Определены особенности проведения дезинтоксикационной терапии и гемосорбции у гематологических больных на фоне тромбоцитопении и выраженных нарушений гемостаза.

6. Выявлена вторичная активация эндогенных антикоагулянтов с транзиторным появлением в отдельных случаях циркулирующего ингибитора 1-П фазы волчаночного типа у доноров при интенсивном прерывистом цитаферезе, проводимом с использованием пластиковой тары и рефрижераторных центрифуг. Для обеспечения безопасности и предупреждения тромботических и геморрагических осложнений при интенсивном плазмацитаферезе предложен скрининговый отбор доноров по показателям времени свертывания крови, длительности кровотечения, тромбо-эластографии.

V. Доказана более высокая информативность данных тромбоэласго-графии в сравнении с визуальной оценкой коагуляционных тестов, что дает основание для более широкого использования ТЭГ для контроля адекватности и безопасности проводимой терапии.

8. Показана необходимость сщзинингового обследования беременных женщин для выявления состояний тромбофилии и повышенной кровоточивости, связанных с нарушением функции и синтеза эндогенных антикоагулянтов. Выявлена патогенетическая связь снижения функции эндогенных антикоагулянтов и развития позднего токсикоза беременных, изучены возможности корригирующей терапии.

9. Разработан метод получения антитромбина-Ш из плазмы с использованием сухого сорбента гидроксилапатнта, служащий основой для создания лечебного препарата концентрата антитромбина-Ш,

10. Разработана инструкция по получению и контролю нового коа-гулологического реагента - препарата диагностического антисыворотки к антитромбину-Ш человека для количественного определения антитромбина-Ш в плазме.

II. Установлено, что малоиспользуемая фракция плазмы доноров супернатант, получаемый при выделении препарата "Криопреципитат", а также эмбриональная ткань человека (абортивный материал), содержат гликозаминогликаны, обладающие гепариноподобной антикоагулянтной ак тивностыо, которые могут быть использованы для создания нового, не имеющего аналога в мировой практике, аллогенного лечебного препарат ГАГ для заместительной терапии нарушений гемостаза.

СПИСОК опубликованных работ по теме диссертации

1. Об изменениях активности факторов свертывания в консервированной крови при рециркуляции в аппарате ИСЛ-2. Материалы научн.сессии института, посвящ.50-летию Сов.гос. Ленинград,1967, с.59-62, в соавторстве с М.А.Котовщиковой, З.Д.Федоровой.

2. К разработке новых консервированных растворов для заготовки крови с повышенными гемостатическими свойствами. Материалы I Лен.гор. конф.молод.уч.по биол..медицине и биомедкибернотике. Л.,1970, с.104.

3. Определение активности плазминогена в плазме крови. Тез.докл. I респ.конф.врачей-лаборантов (тезисы докл.).Фрунзе,1970, с.69-71 в соавторстве с М.А.Котовщаковой.

4. Поиски новых способов консервирования крови с целью улучшения сохранности её гемостатических свойств. Проблемы гематол.и переливания крови, 1971, К 8, с.11-18, в соавторстве с З.Д.Федоровой, М.А.Котовщиковой.

5. О ¿{ибршшлитических процессах в конеервированной крови. Казанский мед.журн. 1972, !? 2, с.32-35. в соавторстве с И.К.Слобожан-киной.

6. О влиянии р!3 стабилизирующего раствора на коагуляггионныв свойства крони. Тез.докл.научн. конф.молод.уч.ЖПК по вопр.гемат.и трансфуз. ХП, 1972, Л., с.52-53.

7. Применение цалола для консервирования крови. Пробл.гемат.и перелив.крови, 1973, £ 2, с.52-53, в соавторстве с Л.С.Шулутко.

8. Определение генерации тромбина. П Всесоюзн.съезд врачей-лаб. кн."Ферменты в лаб.диагностике". М.,1973, с.37-38, в соавторстве

с М.А.Котовщиковой.

9. Применение гепарина при фпбринолитических кровотечениях в хирургии. Кн."Гепарин" Ш тех.Ш Всесоюзн.конф. Москва, 1973, с.314-315, в соавторстве с З.Д.Федоровой, А.З.Ханиным, А.Г.Чусловым.Ю.Н.ПоляцкоЙ.

10. К вопросу о некоторых проявлениях действия ацетилсалициловой кислоты. В сб."Гемофилия и кровотеч.,вызванные наруш.сверт.крови",

Л.,1973, в соавторстве с А.С.ЩитиковоЗ.'

11. Изучение переохлажденной крови и её клиническое использование. "Акт.вопр.гемат.и трансф." Тез.докл.всесоюзн.совещ.,Г.".,1974,

в соавторстве с Н.Г.Карташевсним, М.А.Рождественской,В.Н.Мельникс В.П.Гусевым, Б.В.Медвенским.

12. Оценка гемостатич.свойств холодоуст.крови. В сб."Методи1 и техника по перел.крови", Л.,1975, в соавторстве с З.Д.Федорово? В.Н.Мельниковой, В.П.Гусевым.

13. Изучение влияния ионов лития на функциональную активное! тромбоцитов. Тез.докл.Всесоюзн.конф."Вопр.диагн.и леч.лимГогрануз матоза. Функц.свойства тромбоцитов", Обнинск,1975, с.62-63, в сoí торстве с Т.А.Одесской.

14. Электронномикроскопическая тромбоцитограмма как показатЕ функционального состояния кровяных пластинок. Тез.докл.Всесоюзн. конф."Вопр.диагн.и леч.лимфогранулематоза. Функц.св~ва тромбоцит! Обнинск, 1975, C.38-4Q, в соавторстве с З.Д.Федоровой, И.Г.Белою новой, Е.А.Сенчило, Г.П.Шляпочниковой.

15. Электронномикроскопическое строение тромбоцитов больных хроническим миелолейкозом и хронич.лим^олейкозом. Тез.докл.Всеco¡ конф. "Вопрс.диагн.и леч.лимфогранулематоза. Функц.СЕ-ва тромбощ тов". Обнинск, 1975, с.13-14, в соавт.с З.Д.Федоровой, И.Г.Бело» новой, Л.М.Розановой, Г.П.Шляпочниковой.

16. Диагностические критерии болезни Виллебранда. Тез.докл. Всесоюзн.конф. "Вопрс.Диагн.и леч.лимфогранулематоза. Функц.св-в тромбоцитов". Обнинск, 1975, с.83-84, в соавторстве с З.Д.Федоро

A.С.Шитиковой, Т.А.Одесской, А.И.Елизаровой, Л.П.Палаян.

Г7. Ihe use of the inhibitors of fibrinous in blood preservation to maintain blood coagulative properties. II meeting of the European and Afrikan Division of the Intern. S of Haematol., Abstr. 2 .Prague.Chech,. ,1975.

18. Тест толерантности плазмы к гепарину в диагностике трок бофилии. Лаб.дело, IS8I, it 7, с.411-414.

1£. Разработка методов получения взвесей лейкоцитов и тромй цитов путем многократных цитаферезов у доноров. Сб.Всесоюзн.кон£ по фракционир.крови, Москва, IS8I, 20-21 окт., в соавторстве с

B.Н.Мельниковой, С.Д.Волковой, Л.К.Николаевой, Г.Г.Платоновой, Е.П.Михнонич, И.Н.Дегтяревой.

20. О роли естественных антикоагулянтов в гемостазе. Труды I Всероссийск.съезда гемат.и трансф;.Ленинград,1981, т.П, C.7I-7S в соавторстве с М.Ф.Харченко.

21. Применение полидеза у больных истинной полицитемией. Труды I Бсероссийск.съезда гемат.и трансф.,Ленинград,138I, т.П, с.201-23, в соавторстве с Е.Г.Щербаковой, Л.М.Розановой, Л.Г.Михайловой, М.А.Котовщяковой, В.А.Балашовой.

22. Изучение реологических свойств крови у больных истинной полицитемией. Труды I Всероссийского съезда гематол.и трансфуз., Ленинград,1380, с.152-155, в соавторстве с Л .Г .Михайловой, Л,М.Розановой, М.А.Котовщяковой, Е.Г.Щербаковой, К.Ю.Литманович, В.В.Зуевым, В.А.Балашовой.

23. Эффективный метод получения тромбовзвесей для клинического применения. Труды I Всероссийского съезда гемат.и трансф., Ленинград, 1981, т.1, с.85-87, в соавторстве с В.Н.Мельниковой, С.Д.Волковой, И.Н.Дегтяревой.

24. Характеристика антикоагулянтного звена гемостаза как критерий оценки защитной способности организма. В сб.Всесоюзн.конф. "Сосуд.стенка и гемостаз", 21-22.12.81г., в соавторство с З.Д.Федо-Роеой, Т.И.Поповой, И.В.Полынской, М.А.Котовщиково:!.

25. Определение активности антитромбин-Ш-гепаринового комплекса в плазме крови. Лаб.дело,1982, № 4, с.232-234, в соавторстве с М. А. Ко то вщи ко во й.

26. Антикоагулянты в лечении ДВС синдрома при миелопролифера-тивных заболеваниях. Материалы Междунар.конгресса гематол.и трансфуз., Будапешт,авг,1982г., с.380, в соавторстве с З.Д.Федоровой, К.М.Абдулкадыровым, Т.И.Поповой, М.А.Котовимковой, А.С.Шитиковой.

27. Определение общей антигепариновой активности плазмы. Тезисы докл.1 Респ.конфер.врачей-лаб.ЭССР,4-5 мая 1982г., с.47-48,

28. Лабораторная диагностика тромбофилгш - начальных проявлений. Тезисы 2 Всесоюзн.ДВС конф:."Противотромб.терапия в клинич. практике", М.,1982, с.101-102, в соавторстве с З.Д.Федоровой,

М.А.Котовщиковой, И.В.Полынской, Т.И.Поповой, Л.В.Кузнецовой.

29. Система регулирования агрегатного состояния крови в условиях гравитационной хирургии. Тезисы докл.Всесоюза.совещ.проб. комиссии "Патология гемостаза", Барнаул,Х-82г., в соавторстве с З.Д.Федоровой, В.Н.Мельниковой, К.М.Абдулкаднровым, М.Ф.Харчеико

и др.

30. Эффективный метод получения из консервированной крови клеточной взвеси, обогащенной тромбоцитами (в стеклянных флаконах)

для клинических целей. Ж."Гематол.и трансфузиолог". 1983, $ 3, с.52-53, в соавторстве с В.Н.Мельниковой, С.Д.Волковой, И.Н.Дегтяре вой.

31. Диагностика редко встречающихся форм и вариантов лейкозов. Тез.докл.Всесоюзн.конф."Распознавание и мерк борьбы с лейкозами", 22-24/Н-82, Белая Церковьч.М.,1382, с.69-70, в соавторстве с К.М.Абдулкадыровым, Е.А.Ушаковой, Л.М.Розановой, Е.Г.П]ербаковой, Т.И.Поповой и др.

32. Сравнительная оценка трех различных методов исследования антитромбина-Ш. В ж."Лаб.дело № 5, 1984г. , в соавторстве

с А.Накабанда, М.А.Котовщиковой.

33. Влияние гравитац.хир.на сверт.систему крош у больных мие-ломной болезнью. Тез.докл.П Всесоюзн.конф."Патология сосуд.стенки

и гемостаз". Минск,!.!.,1983. с.427-428, в соавторстве с В.А.Шатровым I.П.Пшеничной, Е.А.Ушаковой.

34. Критерии оценки функции противосвертывающей системы в клинике гломерулонефрита у детей. Тез.докл.П Всесоюзн.конф."Патология сосуд.стенки и гемостаз", Минск,М.,1983, с.483-484, в соавторстве с З.Д.Федоровой, А.В.Папаян, А.Накабанда, И.В.Полшской, Л.В.Кузнецовой.

35. Использование ллазмацитафереза в хирургической гематологии Вестник хирур.,т.131, 1983, Js 10, с.125-128, в соавторстве с К.М.Абдулкадыровым, В.А.Шатровым.

36. Организационно-методические основы донорства клеток крови для обеспечения компонентной терапии миелодепрессий. П съезд гемато, трансф.Узбекистана, Ташкент, 1У-33, с.21-22, в соавторстве с В.Н. Мельниковой, С.Д.Волковой, Л.К.Николаевой и др.

37. Иммунологические направления исследований в гемостазиологи. Гематол.и трансфузиол.,1984, К 2, с.22-26, в соавторстве с З.Д.Федоровой, А.С.Шитиковой, Л.П.Папаян и др.

38. Интенсивный прерывистый плазмацитаферез - перспективный метод обеспечения компонентной гемотерапии. Гематол.и трансфузиол., IS83, if. 10, с.13-16, в соавторстве с В.Н.Мельниковой, С.Д.Волковой, И.В.Монахенко, Л.К.Николаевой, В.Н.Шабалиным.

39. Роль эндогенных антикоагулянтов в развитии тромбозов и геморрагии. В сб."Клинические и экспериментальн.аспекты PACK", Сара тов,1984,т.28,с.64-69, в соавторстве с З.Д.Федоровой.М.А.Котовшико-вой, О.Е.Белязо.

40. Применение метода определения антитромбииа-Ш для лабораторной диагностики нарушений тромбогенеза. Тез.докл.Ш Всесоюзн. съезд врачей-лаб..Москва,1985, с.222-223.

41. Патогенез геморрагического синдрома у больных острым промиелоцитаркш.1 лейкозом и методы его лечения. В сб."Совр.пробл. клин.гемат.и транс.Тбилиси,1984, с.103-104, в соавторстве с К.М.Аб-дулкадыровш, З.Д.Федоровой, Т.И.Поповом, М.Ф.Харченко.

42. Интенсивный плазмаферез у доноров с использованием отечественной полимерной аппаратуры. В сб."Совр.пробл.клин.гемат.и транс.", Тбилиси,1984, с.68-69, в соавторстве с В.Н.Мельниковой, С.Д.Волковой, Л.К.Николаевой, Л.С.Кузьминой.

43. Диагностика и лечение троыбофилии в процессе беременности

и родов. Тез.докл.Ш Всесоюзн.конф."Противотроыботич.терапия",Москва, 1984, с.124-125, в соавторстве с З.Д.Федоровой, И.А.Репиной, Г.А.КрасоЕОКОЙ, Т.Т.Руденко, М.И.Кулеш.

44. Особенности коррекции агрегатного состояния крош при экстракорпоральной гемосорбции у гематологических больных. Терзар-хив,1985, !Ь I0IS85, с.80-85, в соавторстве с Б.Ганапиевым.

45. Коррекция гемостаза у больных о.лейкозом. Тез.докл.П Всесоюзн.съезд гемат.и транс.,М.,1985, в соавторстве с Т.И.Поповой.

45. Жировая эмульсия для внутривенного введения. Тез.докл. П Всесоюзн.съезда гемат.и транс.,М.,1985, с.7?, в соавторстве с А.И.Шанской, С.L1.Пучковой, Ю.Н.Беляковой.

47. Активность АТ-Ш как критерий эффективности антикоагулянт-ной терапии. Тез.докл.П Всесоюзн.съезда гемат.и транс.,М.,1885,

, в соавторстве с М.А.Котовщиковой, А.Накабанда, Е.А.Ушаковой, В.А.Шатровым, Ю.Л.Пшеничной.

48. Эффективность химиотерапии в условиях плазмафереза у больных парапротеинемическими гемобластозами. Тез.докл.П Всесоюзн. съезда гемат.и трансфуз.,М.,1385, с.

4S. Эндогенные антикоагулянты в генезе нарушений гемостаза. Принципы патогенетической терапии. В сб.Соврем.проблемы клин.коа-гулологии. Л.,1985, с.37-44, в соавторстве с Т.И.Поповой.

50. Опыт работы Ленинградского городского гематологического центра по профилактике и терапии акушерских кровотечений. Тез.докл.

пленума правления Всесогазн.об-ва акуш.-гинек..Ташкент, 1985, "Акушерские кровотечения"с.104-105, в соавторстве с М.А.Репиной, З.Д.Ф доровой, О.И.Ивановой, Г.А.Красовской, Г.Ф.Сумской, Т.Т.Руденко.

51. Значение исследования эндогенных антикоагулянтов в диффе-ренц.диагностике геморрагических диатезов. В сб.Всесоюзн.конф."Ак-туальн.пробл.гемостаза в клин.практике",Москва, 1987, 240-241, в соавторстве с О.Е.Белязо.

52. Диагностика и лечение тромбофплии в процессе беременности и родов. В сб.Всесоюзн.конф."Актуальн.пробл.гемостаза в клин.практике".Москва, 1987, с.194-195, в соавторстве с З.Д.Федоровой, М.А.Репиной, Ю.Л.Кацадзе, Г.А.Красовской и др.

53. Система гемостаза у больных гкпопластической анемией в процессе лечения антилим^оцитарным иммуноглобулином. Гематол.и трансфуз., 1987, 4, с.7-11, в соавторстве с З.Д.Федоровой, М.А.Ко-товшиковой, К.М.Абдулкадыровнм, С.С.Бессмельцевым, Т.И.Поповой.

54. Интенсивный тромбоцитаферез у доноров с использованием отечественных полимерных контейнеров. Тез.докл.ВМОЛА научн.конф., Л.,1987, с.57, в соавторстве с В.Н.Мельниковой, И.Н.Дегтяревой.

55. Профилактика нарушений гемостаза при гестозах. Казанский мед.журн.,1988, № I, т.69, с.53-56, в соавторстве с З.Д.Федоровой, М.А.Репиной, Г.А.Красовской и др.

56. Плазменные гликозаминогликаны в патогенезе врожденных геморрагических диатезов. Гематол.и трансфуз., 1988, т.33, Jf> II,с.3-0 в соавторстве с О.Е.Белязо, З.Д.Федоровой.

57. Влияние интенсивного плазмолейкафереза на показатели гемо динамики, реологии и гемокоагуляции у доноров. Гематол.и трансфу-зиол.,1988, Jf 7, с.12-16, в соавторстве с В.Н.Мельниковой, С.Д.Вол ковой, В.Т.Плешаковым, Л.М.Фрегатовой.

58. Гемокомпопентная и инфузионно-дезинтоксикационная терапия заболеваний системы крова (метод.рекомендации).Ленинград,1985,

с.1-22 в соавт.с К.М.Абдулкадыровш, Е.Г.Щербаковой, А.Л.Ганапиевп В.А.Шатровым, Е.А.УшакоБОй.

59. Исследование активности эндогенных антикоагулянтов у бол! них с нарушениями гемостаза (Метод.рекомендации), Ленинград, 1988, с.1-22 в соавт.с М.А.Котовщиковой, М.Ф.Харченко.

60. Способ получения сорбента - гидроксилапатита. Авторское свидетельство JE 1450852,7 янв.1987г.,Ш 1989 к 2 в соавт.с З.Д.Фчц РОЕОЙ ,0 ,Г .Головиной, 3 .П .Глаз ко вой.

М-36228. Подписано к печати 17.05.09 Объем 3 п.л. ЛенГКДУВ. 2ак.369. Тир. 100 1989 г. Бесплатно