Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Фармакологическое исследование поликатионов на основе N-винилазолов по влиянию на свертываемость крови и взаимодействие с гепарином

ч й з 4-1

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ПО БЕЗОПАСНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

на правах рукописи

АФАНАСЬЕВА. ГАЛИНА ЕАСИЛЬКБНА

САПШОЛОП1ЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЙ ПОЛШЛТИОНОВ НА ОСНОВЕ Н-ВЙНИЛАЗОЛОВ ПО ВЛШШЮ НА СВЕРТ1ШЛЕ1ЮСТЬ.КРОВИ и , ВЗ№40ДЕЙСТВИЕ С' ГЕПАРИНОМ

14.00.25 - фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических нзук

Купавна - 1992

Работа выполнена во 2 Московском ордена Ленина Государственном медицинском институте имени Н.Н.Пирогова и Иркутском государственном университете.

Научные руководители - доктор медицинских наук,профессор в.с.Ефимов

доктор химических наук,профессор А.И.Сиирнов

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук.профессор Крылов Ю.й. доктор медицинских наук Рагииов A.A.

Ведущая организация - Университет Дружбы народов имени П.Лумумбы

Защита состоится K/Z"ct*yv&uc. 1992 г. в час. на заседании специализированного Ученого Совета Д 098.01.02. при Всесоюзном научном центре по безопасности биологически активных ведеств по адресу: п.Старая Купавна,ул.Кирова,23,ВНЦ БАВ.

С диссертацией можно ознакомиться в оиолиотеке Всесоюзного научного центра по безопасности биологически активных веществ.

Автореферат разослан " /4 "1992, г.

Учений секретарь специализированного Совета кандидат биологических наук

Т.Н.Робакидзе

" | _ РЩАЯ^М^ЕИ1СТШ А _ РАБОТЫ^

,д'" ДУАЛЬНОСТЬ ТЕШ:

стаций I

--Антагониста гепарина широко используются для восстановления

свертываемости крови по окончании проведения различных видов экстракорпорального кровообращения,с целью регуляции чрезмерного гшто-коагуляшюнного эффекта гепарина,в случаях повышенной чувствительности к нему пациентов,а также в лабораторной практике для определения концентрации этого антикоагулянта в образцах крови.

В настоящее время для &*их целой применяют нрироднне поликатионы белковой природа - протамшш, источником получения (соторых являются гонада ценных пород рыб.Многолетнее использование в практической медицине солей протаминоз показало,что эти простые белки обладают нежелательными побочными эффектами(угнетение активности факторов свертывания,тромбоцитопенмя,пазодилатация),возникающими вследствие недостаточной селективности реакцга связывания гепарина в крови даже при совпадении дозировки антигепарияата с количеством циркулирующего гепарина.

В случаях передозировок протаминов их собственное воздействие на свертываемость крови мало отличается от действия гепарина.Поэтому вопрос правильности расчета дозы антигепарината имеет важное практическое значение для эффективной нейтрализации антикоагулянта.Он целиком зависит от скорости определения концентрации гепарина и точности применяемого метода. Разрешающая способность известных методов титрования сильно ограничено возможностями заложенных в них принципов.

В результате активных поисков синтетических аналогов протамина тоявились сообщения,которые описывают структуру и биологические свойства новых перспективных антигеноркнятов в. эксперименте(Ефимов В.В.,

и соавт.,1»76;Усманова Д.М. и соавт.,1979;Чернова О.В.,1983).Многие из них обладают болоа сильной,чем проташшы,нейтрализующей активностью,однако,и они не лишены побочных эффектов(тромОотдатопения,частичная инактивация факторов свертывания)(которые можно объяснить не только вариациями основных характеристик заряженной макромолекулы (линейная плотность заряда,размеры макромолекулы,степень кватерниза-цки и др.),но и структурными особенностям носителей кватернизован-ных атомов ааота.Используя современные возможности полимерной химии, в лаборатории полимеризационных процессов Иркутского государственного университета синтезироъан ряд гюликатионов на основе Н-винилазолов.

Известные производные азолов проявляют выраженную антиагрегаци-онную активность(Уеггсли и еоавт,1Э88;МПап1 И соавт,1Э88;Ш.аауата и соавтДавЗ и др.),что повлияло на выбор втой структурной основы для создания новых поликатионов.Зто свойство носителя заряда наиболее существенно,поскольку известно,что яри адекватной нейтрализации гепарина юш передозировках изученных антигепаринатов возникает выраженная тромОоцитопения.как результат склеивания этих клеток и задер-

е

шш агрегатов в капиллярном русле.

Кроме того,производные азолов могут вступать в реакции ссголи-меризации,открывая новые структурные вариации макромолекул.Оптимальное соотношение сомономерных,групп в поликатионе может благоприятно повлиять на нейтрализующую активность и токсичность антигепарината за счет уменьшения продолжительности ехчэ пребывания в организме.Установленные реакционные возможности сильных и слабых полиэлектроли-'тов.могут быть положены в основу прогрессивных методов определения гепарина в крови,что имеет первостепенное.значение для исключения передозировок антигепаринатов и проявления их токсических свойств.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

Цель» данной работы было выявление антигепариновнх свойств в ряду гомо- и сополимеров на основе «-винилазодов,исследование острой токсичности этих соединений и зависимости их специфической фармакологической активности от важнейших характеристик.

В связи с этим били поставлены следующие задачи:

1. Установить наличие антигепариновнх свойств и определить токсичность в ряду гомо- и сополимеров на основе Н-винилааолоо.

2. Выявить зависимость-антигепариновнх сбойств ст следующих'характеристик: структуры мономэрного звена,молекулярной массы полимере», линейной плотности положительного заряда,использованных противо-ионов.

3. Исследовать собственное действие наиболее эффективных антигепариновнх соединений .данного ряда на свертываемость крови интакт-шх животных.

Использовать реакции образования ичтерполиэлектролитного комплекса з целях определения концентрации гепарина в плазме крови.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ:

Впервые исследована зависимость антигепариновой активности и зстрой токсичности от строения мономерного звена гомо- и сополимеров {а основе и-винмлазолов.Изучено собственное действие поликатионов 1а основе и~винилвзолов на свертываемость крови.Установлено,что наи-5олее эффективным антагонистом гепарина в исследованном ряду являет-:я сополимер йодида 1-винил-3-м§тялимидвзолия с диэтиловым эфиром галэиновой кислоты с соотношением компонентов 86:14(мольЖ).Разработан способ определения концентрации гепарина в плазме крови методом ¡одориметрии путем последовательного дооавления к образцу плазмы во-дерастсоримого нестехиометрического интерполизлектролитного комплек-

са.образованного меченной флуоресцентными метками солью поликарбоно-вой кислоты и полимерным основанием .которое является тушителем флуоресценции'Положительное клонив по заявке N 4'/86Ь72 от 25.I2.S0.).

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ:

Найден нобий эффективный антагонист гепарина - сополимер йодида I-винил-З-метилимидазофя с дмэтиловым эфиром малаиновой кислоты с соотношением компонентов 86:14(мольА) .сочетающий высокую антигепариновую активность и низкую острую токсичность,что позволяет отдать предпочтение »тому поликатиону перед'известными антагонистами гепарина природного и синтетического происхождения.

Разработан метод определения гепарина в плазме крови,разрешающая способность KQTopqro превосходит используемые метода титрования гепарина почти в 20 раз и сокращающий время исследования в 4-Ь раз.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ:

Основные положения диссертационной работы долошнк и обсуждены на VI конференции молодых ученых-химиков i Иркутск,1988),на VIII Всесоюзном научном симпозиуме "Синтетические полимеры медицинского назначения" (Киев,1989),на X молодежной конференции по синтетическим и природным физиологически активным соединениям iЕреван,í950).на IV Всесоюзной конференции "Водорастворимые полимеры и их применение" (Иркутск,1991),на совместном заседании секции органического синтеза и каРэдрн высокомолекулярных соединений Иркутского государственного университета и института нефте- и углеышического синтеза при ИГУ.

Аг.фооация работы проведена на совместной научной конференции отдела фармакологии гемостаза,кафедры фармакологии 2-го ШЛГШ им. Н.И.Пирогоьа и кафедры биохимии Государственной медицинской академии им.И.М.Сеченова.

- С -

ПУБЛИКАЦИИ:

По материалам диссертации получено положительное решение на изобретение,опубликовано Щ,печатных 'ра^от в центральных журналах и сборниках.

ОБ ГОЛ И СТРУКТУРА РАБОТЫ:

Диссертация состоит из введения, обзора .ытературн, материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы.

Диссертация изложена нъ /5D стршткичх машинописного текста,содержит 23 таблицы я II рисунков.Список цитируемой.литературы включает 233 наименования,кз mu 90 отечественных и 143 иностранных.

_МЛТЕГ!ШЫ_й_МЕТОЛЫ_.

В опытах "in vivo" использованы Ш5 кроликов-самцов весом 2,53,0 кг; острую токсичность определяли на 030 белых Оеспородньх мышах весом 15-20 г .Проведено порядка 1Г--00 исследований образцов крови с использованием следующих методов: времени рекальцификации (Bergen-hof,ЙосКа,1954) и толерантности крови к гепарину(Marbet.B модификации .Iurgens,l962) .тромбопластчнового времени по Квику(Quick,1972), тромбоэластс1графии(5о1ше1аег et al, 1962) .Кроме того,подсчитывали количество тромбоцитов с помощью автоматического счетчика частиц,определяли их агрегационную способность(Вот,1962) и высвобождение АТФ, определяли концентрацию фибриногена(Goodwin,1965,в модификации Sampling, 1976), активность факторов свертывания крови(с помощью с, лдар-тных реагентов).Определение интенсивности ме' .ароматической реакции основного красителя в вс..цой среде при добавлении известных количеств гепарина проводи.™ по методу Maointosli(i94i)•

Остру» токсичность (ЛД^) определяла по формуле Кербера(Беленький M.JÍ. ,1?Г:9) .Статистическая обработка результатов проведена по

критерию Стьвдента с использованием компьютера М-240 "Olivetti".

В работе использованы полккатионы на основе N-винилазолов,синтезированные в лаборатории полимеризационных процессов Иркутского госуниверситэта(Табл.1),гепарин фирмы "Рихтер",реагенты фирм "Marz-t Dade" и "Boehringer Mannheim". .

_1ж®1!ш_с0бствйий_иссждований_

С целью поиска новых высокоэффективных антагонистов гепарина были исследованы гидрохлорида поли-ы-винилезолов.Установлено,что в водной среде эти соединения связывают гепарин,причем аитигепаринов активность возрастает по мера увеличения М.М. Однако в крови нейтрг лизации антикоагулянтного действия гепарина не происходило¡более тс го,в исследуемых образцах плазмы наблюдалось выпадение в осадок денатурированных белков.

Исследование кватернизованних йодистым метилом поли-м-винилазс лов, со держащих 2,3 и 4 атома азота в гетероцикле(йодидов nojai-I-BH-нил-4-метил-5-аминотетразодая1ВЫАТИ),поош-1-винил-4-метил-1,2,4-триазолия (ВМТИ) и пож--1-вишл-3-метилоензишдазолия(ЕМБ1№),показало, что все они обладают антигепариновой активностью.Уменьшение кода чества атомов третичного азота в структуре гетероцикла.при наличии одного четвертичного,приводит к снижению весового(мг:мг) нейтрализм ющего соотношения поликатион¡гепарин в ряду:

ВМАТЩ5:1) —>*аМТИ(3:Т) —* ВМВИИ(1,4:1)

Обнаружено,что лучший в исследованном ряду поликатион БМБИИ ос ладает способностью связывать гепарин не только в простых,ко и в сложных средах,таких как плазма и цельная кровь.

Йодид гюли-1-вшил-3-метилбензимидазолия(143000)проявлял одинаковую антигепариновую .активность в условиях "in vitro".a также при введении вещества в кровоток кивэткых.Совпадение нейтрализующие

тлаищл I.

ТРУКТУРП ИССЛЕНОВЯННЫХ ПОЛИКЯТИОНОВ Hfl OUIUBE H- ВИПИЛЛ30Л0Й,

СТРУКТУРНАЯ юш 1 К.!;.ШЧЬС1«Ж НЛЗЗАШЕ i УСЛОВНОЕ 1 " . I СГ03НЛЧЕГО1Е

ÍH5c4 Uty ñj 1 J 1 -CH— л> Y ~СНг- ПЖ-1-1Ш1Л-4-1.ЕШ-5- А№««щ.тгАзоаия йодм ВИТИ

'H,£îl 1 V1 CH- V _снг- ilГ:Л ;1 -1 -ВИН! L'l - ШСГИЛ-1,2,4- тг;«?сллл ЭД>эд ВЖ1

о 1--' -CH снг п с Jii i -1 -п: n üt л ПЕ1 í3í и; i дд зол ; if! Kt- ГНДГ0ХЛС1ГЛ з-мкш яидэд ВЫГХ ■ • имши

U /t/ i • — CH—с нг- nunt-1 - зкнил-3 -иьтяшмда- ЗЛ1ЧИ эдц' в:,ши

г / r\ Г m сшаяажр ымми-з-нш*- Ш1ВД30ЛИИ îl'VUUA U I -1)11- мл-п-клгсошданшгагго-ждоюм i вмин-' Ь'1

и , 1 --СИ—CM L. i --СИ—CH¿—

j-YffT 1 Л1- Q- С. 0-Ç 0 Ó 1 1 СОПОЛИМЕР 1-иИ1МЛШИДЛ30- - да с диэшови» эфигсм :ше;;нзвоя ¡с,СЛОТЫ I?,- З-«ЕШ ЯОДЭД ß,- З-ЭТИЛ БГОЗД Rj- 3-!4ПГИЛ МгГШСУЛЬИТ гжи- ЛЭМК вгнБ-дэ:лк ЕШМС-¿Э.'.М

n m

соотношений позволяет считать,что гепарин и подикатион связываются в эквивалентных количествах и оорззуют ствхиометрический интерполиэлек-тролитный комплекс,несмотря на присутствие белковых и клеточных элементов крови.

Однако ВМБИИ оказывал собственное действие на кровь,которое проявлялось в гипокоагуляции,отражаемой"всеми используемыми показателями. Гипокоагуляция возникала сразу после введения поликатиона и продолжалась в течение суток.

Исследование ВМБИИ с меньшей M.M.(I70uQ) показало,что антигепариновая активность не изменилась,но при атом значительно снизилось повреждающее воздействие на активность факторов протромоинового комплекса и тромбоцитарное звено гемостаза.

Таким образом.минимальное значение молекулярной массы в испытанном ряду находится б пределах необходимой химической комплемен-тарности к молекулам полианиона - гепарина.Это представляется существенным для теории нейтрализации гепарина,поскольку одним из важнейших и общих свойств кооперативных мешакромолекуляршх реакций является сильная зависимость устойчивости их продуктов - поликомплексов - от молекулярной массы взаимодействующих противоположно заряженных макромолекул(Кабанов В.А. и соавт.,1980).

В случае использования для нейтрализации гепарина йодада шли-1 . -винил-3-метилбензимидазолия р неэквивалентных гепарину соотношениях в кроьи могут образовываться нестехиометрические интерполиэлактролит ше комплексы,состоящие из звеньев поликатиона,взятого в избытке,и собственно поликомплекса(скородинская A.M. и соавт.,1984).Нэстехио-метрическлй полиэлектролитный комплекс удерживается в растворе благодаря наличию гидрофильных участков поликатиона,взятого в избытке. Избыток поликатиона всегда чреват различными побочными воздействиям

на кровь и,видимо,поэтому такие отрицательные момента как воздействие на активность факторов протромбинового комплекса и тромбоцитар-ное звено гемостаза при исследовании этого соединения выражены значительно сильнее по сравнению с образцом с меньшей молекулярной массой.

Подтверждая принципиальную способность йодидэ поли-1-винил-З-метилбензимидааолия к связыванию гепарина как "in vitro",так и в условиях кровотока,нельзя не отметить,что независимо от молекулярной массы эта структура существенно проигрывает как ira весовому нейтрализующему соотношению,так и по показателю острой токсичности ранее изученным ш.яжэгионам 2,5-ионвну и ЧА0-0-25 конидина(Ефимов B.C. и соавт.,1978;Чернова 0.В.,1983).

Существенное влияние на молекулярную массу поликатиона может оказывать присутствие бензольного кольца.Поэтому был исследован по-ликатион.но имеющий гидрофобного заместителя и близкий по химической структуре - йодид иоли-Г-винил-З-метилимидайо.пижшК'Л).

Оценивая эффективность комплексообразования между гепарином .и БМИИ с М.М. 325G00 s опытах "in vitro" мы обнаружили,что весовое нейтрализующее соотношение участников этой реакции снизилось <я составило Itl.Острая токсичность=88 мг/кг.В крови животных,несмотря на присутствие белков и клеток,интерполиэлектролитный комплекс ВМИИ - гепарин образовывался в том же соотношении с быстрой отменой биологического действия антикоагулянта¿Увеличение весового нейтрализу-щего соотношения поликатион:гепарин приводит к возникновению глубокой трсмбоцитолении.Лолу ченшо данные указывают на правильность установления оптимального соотношения и на высокую селективность этой реакции.

Очень важным при изучении биологической активности полимеров -

антагонистов гепарина является вопрос о влиянии их на клетки крови. В этом-плане существенно,что ВМИИ обладает слабым тромооцитопеничес ким действием и не оказывает воздействия на агрегационную способность тромбоцитов.Это позволяет считать,что образуемый в условиях переизбытка этого полимера стехиометрический интерполйёлектролитный комплекс поликатион - гепарин способен проявлять биологическую акти. ность за счет свободных звеньев ВМИИ,который оказывает меньшее влияние на клетки крови,чем другие поликатионы.По мере приближения соотношения к стехиометрическому собственная биологическая активность ВМИИ при связывании его в интерполизлектролитный комплекс значительно снижается.

Возможность изменения молекулярной массы ВМИИ была использована для установления оптимальной величины макромолекулы по сочетанию высокой антигепариновой активности и наиболее низкой токсичности. Для этого были исследованы 5 образцов,М.М. которых находилась в пределах от 28000 до 289000.Все они проявили "in vitro" высокую антигепариновую активность.Были обнаружены пределы M.W.<149000-171000), в которых нейтрализующая активность наиболее высокая(О,5:1).В этом ряду зависимости показателя острой токсичности от изучаемой макро-молекулярной характеристики установить,не удалось.

Для широкого исследования в условиях организма был выбран поликатион с М.М.171000.При его введении свертываемость крови,нарушенная гепарином,возвращалась к исходам знпэниям через 5 мин.

При исследовании влияния степени.кватернизации ВШИ на антигепариновую активность были получены данные,которые совпадают с сущес-твуюидеми представлениями о зависимости активности от этого показателя.

В методическом аспекте важно отметить тот факт,что в исследова-

ниях "in vitro" наблюдается расхождение нейтрализующих весовых соот-

LÍ

ношений,полученных в водной среде и в плазме крови.Расхождение составляет около 0,3-0,5:1(мг:мг).Белее правильным является ориентирование на данные,полученные в плазме,так как по существу в этой среде протекает взаимодействие противоположно заряженных полимеров в организме. Справедливость этого доказана исследованиями "in vivo".Поэтому соотношения,полученные с помощью реакции метахромазии,могут рассматриваться лишь как продварительные,демонстрирующие принципиальное наличие или отсутствие связывания гепарина,а точные представления о о величине весоЕого соотношения поликатион:гепарин мокко получать только после исследований в среде плазмы крови.

Гомополимеры на основа N-винилазолов относятся к большой группе соединений,под которые,по-видимому,в организме теплокровных нет метаоолизирущих систем.Увеличить безвредность таких поликатионов можно путем уменьшения М".М. или введения в полимер индифферентных и разрушаемых групп.Наиболее перспективным и доступным для изучаемых структур оказался путь создания сополимеров.С этой целью были синтезированы сополимер йодида I-винил-З-метилимидазолия с 1-ви-нил-2-карбонилвинилпирролидоном(ВМШ-ВП) и сополимер того же мономера с диэтиловым эфиром малеиновой кислоты(ВМИИ-ДЗМК).

Как показали проведенные исследования испытанные сополимеры обладают высокой антигепариновой активностью при низкой острой токсичности.Введение неактивных групп(ВП и ДЭМК) в полимерную молекулу позволило сшзить токсичность ВМШ почти в 2 раза, сохранив при этом антигепариновую активность на том же урочне(0,6:1;мг:мг).

Сопоставление результатов нейтрализации гепарина сополимером ВМИИ-ВП с результатами его собственного действия обнарузкивает ряд совпадающих проявлений.Зто выражалось в укорочении времени рекальци-

фикашга и толерантности крови к гепарину через сутки,в уменьшении параметра "г" тромбоэластограммы на 60-180-й мин,в снижении агрега-ционной способности тромбоцитов на 120-180 мин эксперимента и в значительном (хотя и недостоверном) снижении количества тромбоцитов,которое не восстанавливалось даже через сутки.Кроме того,у всех животных в первые 15-60 мин после введения вещества развивались явления спазма периферических сосудов,что затрудняло взятие крови.

Более предпочтительным оказался сополимер ВМШ-ДЭМК.Принципиальное улучшение переносимости этого сополимера при сохранении высокой антигепариновой активности определило необходимость установления оптимального соотношения сомономерных грушиРис.1).

Рисунок i . Зависимость ант:;гепариновоЯ ахтияиост;: и остроЯ токсичности от содержания тилсвого эф;.ра налгиновсЯ киплотп в м-лекуле. Педида поля-1-винал-З-нстк лик;--лязолня. .

И в опытах "in vitro",и "in vive" установлено,что наибольшая штигепариноваям активность наблюдается при содержании 14-21 моль% ДЭМН(весовое нейтрализующее соотношение 0,5-0,6:1).При увеличении содержания ДЭМК до 26 моль» наблюдалось резкое снижение активности.

Максимальную активность в изученном ряду проявляет сополимер,содержащий 14 мольй ДЭМК.Введение такого количества индифферентных груш в молекулу ВМИИ практически не влияет на антигепариновую активность (она остается на уровне таковой у гомополимера;,но при атом значите-

г

льно(в 2 раза) снижаем острую токсичность(ЛД50=120 мг/кг) и побочные .действия (Табл.2).

Восстановление свертываемости крови,нарушенной введением гепарина,носит устойчивый характер весь период наблюдений.При этом выраженная тромбоцитопения,характерная для всех известных антигепарина-тов биологического и синтетического происхождения.отсутствует(Рис.2).

Ригунок 2 . Узменениз количества трсмбоцитсв после введения полккагиоиоз на основе виноазолов на фо-ие действия гепарина.

Наблюдаемое незначительное снижение количества тромбоцитов макет происходить за счет депонирования клеток в малом круге кровообращения (легких ) и даченИ(Ефнмов B.C. и соавт.,1979).Эффект собственного тромбоцитопенического действия-синтетических поликатионов возникает, как правило,в условиях незаблокированных положительно заряженных центров.Это случается при передозировках антигепаршатов.Лри

Таблица 2.

ДИНАМИКА ПОКАЗАТЕЛЕЙ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ ПРИ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ ГЕПАРИНА СОПОЛИМЕРОМ ЙОДКДА 1-ВИНИЛ-3-МЕТ1ШМШ30ЛИЯ С ДИЭТИЛОВЫМ ЭФИРОМ МАЛЕИНОВОП КИСЛОТУ(86:14;модь%) (весовое нейтрализующее соотношение 1:0,6).

этапы тромбоэластограмма г 1 1 ¡время ре калши- . - время толерантности

исследования "г" (сек) 1 "К" 1 (сек) I Am (MM.) фикации крови ! iсек) t ° i крови к гепарину 1 (сек) i

Исходное состояние 257,1+24,4 i 128,6+12,61 67,7+1 Ci 1 99.9+4, I J24.0+5,I

Гепариновый фон 5 мин п/н — J —

Í7I,4±I5,¿ 98,6+8,6 1 69,6±I R t 93,4+4, 6 104,6+7,5"

15 мин п/н Í32,9íl7,l" • 77,1+3,У* 70,4+1 0 i t'lf) T tO 4 113,9+12,8

30 мин п/н юо.о+га.с"' 60,0+6,0*1 69,3+2 » ^ 90,0+7, 4 113,7+9,9

60 мин п/н 180,0+22,4 102,9i29,2 J 67,1+2 ,5 J 93,4+6, 0 107,7+4,4 *

120 мин п/н 180,0+21", Т 102,9+11,11 67,6+I ,5 1 98,4+6, 4 106,4+7,2

180 мин п/н 248,6+31,3 132,9+18 3| 64,1+2 ,8 { 95,6+2, 5 110,7+6,7

24 час п/н 90,0i8,0*| .......................i. 73,7+2 ,2 1 88,4+5, i 7 108,2x9,1 .

продолжение таблицы

этапы исследования

Исходное состояние

Гепариновый

фон

5 мин п/н 15 мин п/н 30 мин п/н 60 МИН П/К 120 мин п/н 180 мин п/н 24 час п/н

агрегация тромбоцитов¡количество |протром-|

„ I ТрОМООЦИТОВ ОННОВЫЙ i

I (['/л.' ¡индекс I угол "а" "Ам ' I I \%) i

(град; u.w) j

68,4.t 1,7

28,2i3,9 jo68,4i66.9 | 100 |

71,8±2,3 j 35,3i3,I j670,6±78,3 j 30*

67,6+5,8 ! 38,6+4,5 j561,Ti62,5 ¡ r,8

72,2+2,0 32,7+3,6 |б35,6*63,3 j 100

72,7+2,1 33,2+4,1 |457,Ii43,4*Í 08

62,8+6,8 29,2 ±C, 6 ¡608,7+81,6 j 100

63,0+5,4 31,4*7,4 ¡50y,7±7á,0 | 100

62,8+5,3 ■ 27,4i6,7 ¡54Ü.3-54,I j 100

B't,3+4,3 33,0±4,0 1573,OÍ68,2 ¡ 100

Примечание: * - достоверно по отношению к исходному состоянию (р<0,05); п = 7

- К, -

этом положительно заряженные полимерные макромолекулы взаимодействуют с клеточными элементами крови,приводя, к образованию тромбоцитар-ных агрегатов.Эти сведения являются необходимыми для. оценки безопасности применения антагониста гепарина,особенно при отсутствии точной информации о концентрации антикоагулянта в кровотоке.

Исследование сополимера ВМШ-ДЭМК(86:14;моль%),имитирующее двукратную передозировку,позволило установить,что данный поликатион практически не влияет на состояние свертывающей системы крови.

Выраженные отклонения от нормальной коагуляции имели место лишь в случае превышения нейтрализующей дозы антигепарината в 4 раза.При этом гипокоагуляциошше изменения впервые возникали на 1^0-180 мин после инъекции сополимера.В дальнейшем начиналось восстановление коагуляционных свойств крови,однако,почти все показатели свертывания крови были изменены по сравнению с контролем в сторону гипокоагуля-ции.Исследование активности факторов свертывания крови подтвердило очевидность взаимодействия положительно заряженных макромолекул сополимера с белковыми факторами.

В условиях значительного превышения нейтрализующей дозы сополимера БМШ-ДЭМК снижается активность как факторов "внешнего",так и "внутреннего" путей образования тромбина.В целом снижение свертываемости крови в первые 30 мин после введения сополимера,вероятно,обусловлено развивающейся тром.боцитсшенией и снижением активности факторов v и VIII.несмотря на то,что при этом повышена активность факторов II,IX и X. В солее отдаленные сроки эксперимента(60-240 мин) снижается активность всех без исключения факторов свертывания.Вероятно поэтому на 180-240-й мин после введения поликатиона фиксируется гипокоагуляционный сдвиг на тромбоэластограмме.Двухфазность изменения активности плазменных факторов(сначала - повышение,затем - рез-

кое снижение; характерна для всех факторов,кроме v и уШ.

Но механизму возникновения собственного антикоагулянтного дейс-твия(за счет инактивации факторов 7 и flll) сополимер ВМШ-ДЗМК подобен действию протаминов и полиорена(Вг!иеп,1965),которое эти антагонисты проявляют в существенно меньших дозах.Собственный антикоа-гулянтный эффект присущ всем изученным представителям класса алифатических иоЬэнов за исключением 2,5-ионена¡Ефимов В.С*, 1 í/78), состояние передозировки которого сопровождается даже некотором усилением гемо-коагуляции за счет активации фактора 1. В работе Усмановой Д.М. (1980) показано снижение4свертываемости крови при двукратной передозировке йодэтилата полиметакрилоил лупинина с М.М.20000 за счет снижения активности факторов 711 и VIII свертывания крови и развития' тромбоцитопэнии.

Принимая во внимание предыдущие работы по изучению сооственного

действия синтетических поликатмсчов,можно предположить,что сополимер

ВМШ-ДЗМК,в первую очередь,взаимодействует с эндогенным гепарином,

образуя неактивный в биологическом отношении интерполиэлектролитный

комплекс.Отсутствие влияния антигепарината при двукратной передози-

х

ровк? во многом зависит от связывания поликатиона с эндогенным гепарином. Так как запасы его в организме невелики,ингиоирующее влияние сополимера при четырехкратной передозировке,возможно,может быть связано с исчерпанием этих запасов,вследствие чег^ антагонист гепарина вступает во взаимодействие с другими заряженными компонентами крови, в частности с белковыми факторами свертывание.

Известно,что поликатионы - антагонисты гепарина - способны агрегировать кровяные пластинки Л'ээтому,помимо исследования влиянии передо ировки сополимера ЫШ-ДЭМК на активность фчкторов свертывания крови было рассмотрено его влияние на агр*гациоцнут способность

клеток крови.Для подтверждения существования Эффекта вещества мы исследовали прямое взаимодействие тромбоцитов с сополимером ЬМИМ-ДЭМК,который бил использован в качестве индуктора клеточной агрегации.

Установлено,что изучаешь поликатион начинает агрегировать тромбоцита лишь в концентрации 0,144 мг/кг,что ь условиях кровотока может случиться при восьмикратном превышении необходимого для нейтрализации количества антигепарината.Дозовой зависимости эффекта'обнаружено не было.Количества высвобождаемой АТФ изменялась в пределах 0,3-6x10"%. Процесс был максимально выражен на 5-10 мин взаимодействия клеток с поликатионом.

При добавлении разных концентраций сополимера ВМШ-ДЭМН к взвеси эритроцитов оыло обнаружено,что только в концентрациях 0,0720,144 мг/кг,соответствующих четырех-восьмикратной передозировке.наблюдался агрегационный эффект.Образование зритроцитарных агрегатов начиналось на 4-6 мин .от момента внесенияссполимера Б кявету с эритроцитарной взвесью.

Таим образом,в условиях соблюдения терапевтических дозировок сополимера ВМИИ-ДЭМК.сн активно связывает гепарин,не проявляя побочных эффектов.В изученном ряду соединений сополммеризация ВШШ с ДЭМК является перспективным приемом создания высокоэффективного антагониста гепарина.

* * *

Для предупреждения нежелательных последствий передозировки антагонистов гепарина необходимо быстро получить правильную информацию о концентрации гепарина в крови к моменту введения антигвпаринята. Опубликованные к настоящему времени работы не содержат удовлетворительной методики быстрого и точного определения гепарина в крови и

расчета нейтрализующей дозы антагониста.

С целью гювшаения точности и сокращения времени исследования концентрации гепарина в плазме крови наш разработан спосоо определения концентрации гепарина метолом флуориметрии при последователь-^ ном добавлении к образцу плазмы водорастворимого нестехиометричес-кого интсрполиэлектродитного комплекса*в концентрации iu~b-iu_,;i ос-новомоль/л,образованного меченной флуоресцентными метками солью по-ликарбоновой vcиcлoты и полимерным основанием,которое является тушителем флуоресценции.Флуоресцентная метка в интерполиэлектролитном комплексе затушена.

При появлении сильного полианиона,каковым является природный полисульфоанион гепарин,происходит вытеснение из инторполиэлектро-литного комплекса слабой поликарооновой кислоты.Ь реакционной среде возникают стехиометрические комплексы сильного полиоснования и сильной пеликислоты,а также свободная пеликаоооновая кислота.При этом, флуоресцентные метки поликарооновой кислоты освобождены от контактз со звеньями-тушителями полимерного основания и интенсивность флуоресценции раствора резко возрастает в зависимости от количества присутствующего гепарина.После связывания всего находящегося в растворе сильного полимерного аниона в интерполимерный комплекс,наблюдается лишь незначительный прирост интенсивности флуоресценции,обусловленной только собственной флуоресценцией интерполимерного комплекса.По точке излома на кривой зависимости интенсивности флуоресценции раствора от введенного количества интерполиэ.'пктролитного комплекса определяют точку эквивалентности.Искомую концентрацию гепарина определяют по калибровочному графикуtfue.i .

- ;:з -

а

Ео/мл

0,025 г

0,03

0,025 0,132 0,015 0,01 0(С05

10 30 33 70 ео ММЛНП2К

20 40 Ш 80

Рисунок 3 . График высвобождения флуоресцентных метзк ■ при титровании гепарина раствором НПЗХ.

Титрование гепарина в плазме крови позволяет установить высокую чувствительность(предел .обнаружения гепарина в плазме составляет 0,005 Ед/мл) и быстроту получения результата(не более 60 секунд) за счет определения концентрашш гепарина только в одном обьеке плазмы крови при многократно повторяемой манипуляции последовательного добавления к ней постоянного объема водорастворимого нестехио-метрического интерполнэлектролитного комплекса,содержащего флуоресцентную метку.

' Ешода

I. Среди изученных синтетических катионных гсмополимеров на основе Ы-винилазолов только йодады поли-1-вишл-З-метилбензимидазолия и поли-1-винил-З-метилимидазолия эффективно связывают гепарин как в простых,так и сложных средах.Антигвпариновая активность этих соединений пропорциональна степени' кватернизацш атомов азота в структуре их макромолекул.Наибольшая специфическая активность

о

проявляется при наличии в каждом мономерном звене четвертичного атома азота.

2. Среди изученных катионных гомополимеров наиоолее эффективными антагонистами гепарина являются йодиды 1-ринил-з-метилимидазолия с молекулярной массой от 14УООО до 171000,проявляющие высокую активность (Еесовое нейтрализующее соотношение поликатион:гепарин 0,5:1).Острая токсичность соединений 66-74 мг/кг.

8. Введение групп 1-винил-2-кзроонилвинилпирролид?)нз или диэтилового эфира малепиозой кислоты в молекулу йодида поли-1-винил-З-метил-имидазолия сохраняет высокую антигепариновую активность поликатиона данной структуры,снижая при этом острую токсичность в 2 раза'. Наиболее благоприятным сочетанием этих свойств обладает сополимер йодида 1-винил-з-метилпмидазолия с диэтиловым эфиром малекновой ' кислоты IВМИИ-ДЭМК), содержаиий ьб моль?» ВШИ и 14 моль'.4 ДЭМК.

4. Собственное воздействие на свертывающую систему крови сополимера йодида 1-винкл-3-м9Тилимидазолил с диэтилознм эфиром малеиновой кислоты(86:14;моль»),проявляющееся только при значительном превышении терапевтической дезы.рыражаетея в развитии гипог.оагуляции за счет угнетения активности факторов у и 7111 свертывания крови, умеренном снижении количества тромооиптов.

5." Разработанный нами способ определения концентрации.гепарина в в плазме крови на основе высвобождения флуоресцентной метки в реакции полиэлектрилитного комплекса с гепарином позволяет повысить разрешающую способность титрования до 0,005 Кд/мл гепарина.

_ПРАК11ЧЕСККЕ _РЕК О^ЩАШМ _

I. Дальнейший поиск высокоэффективных антагонистов гепарина

целесообразно проводить в ряду поликатионов на основе м-винидазолов.

л

■2. Для установления оптимального весового нейтрализующего соотношения поликатион гепарин необходимо проводить исследования в опытах "in vitro" в плазме и цельной крови.

3. Разработанный быотрый и точный метод определения концентрации гепарина в плазма крови можно рекомендовать для использования в клиниках, приме някхцих данный препарат в своей практике.

СПИСОК РАБОТ рПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРШШ

1. Гидрофильный гель на основе сетчатого гюли-1-вшйш».ждазола//Сб. , тезисов VI конференции молодых ученых-химиков.-Иркутек.-1988.-

С.3(ооавт.A.A. Антонович).

2. Имидазолсодержащие полимеры - новые антагонисты гепарина//Сб.тезисов VIII Всесоюзн.научн.симпозиума "Синтетические полимеры медицинского назначения".-Киев.-1983.-С.217 Í соавт.А.Н.Смирнов, А. А. Антонович, В. Н.Кикняев, Е. И. Бирюкова .B.C. Б£имов).

3. Некоторые аспекты возможного использования полмеров имидазолов// Об.тезисов X молодежной конференции по синтетическим и природным физиологически активным соединениям.-Ереван.-1990.-С.20 (соавт. В.Н.В.Н.Кикняев,Т.В.Нефедова,А.А.Антонович,Е.И.Бирюкова,Т.Л.Казакова ).

4. Синтетические антнгепаринаты поливинилазолов//Там ке.-С.35(соавт. А.А.Антонович;.

5. Антигепариновая активность поликатионов на основе 1-винилазолов// Хим.-фарм.журнал.-1990.-Т.24,N4.-С.28-30(соавт.А.И.Смирнов,А.А. Антонович,В.Н.Кижняев,0.В.Чернова,В.С.Ефимов).

6. Способ определения гепарина в плазме крови//Авторская заявка N4786572/14,положительное решение от 25.12.90.(соавт.В.С.Ефимов, М.Я.Розкин,В.А.К абанов,А.В.Зезин,В.А.Изумру дов,А.И.Смирнов).

7. Влияние сополимера 1-винил~3-метил имидазолий йодида с диэтиловым эфиром малеиновой кислоты на свертываемость крови в эксперименте //Фармакол. и токсикол.-IЭ91.-Т.5 4,N5.-С.31-33(соавт.Л.А.Антоне-вич,В.С.Ефимов,А.И.Смирнов).

-8. Лнтигепариновая активность сополимера 1-эинил~3-кетилимидаэолий

«

йодида с диоти;;малеинатом//Сб .тезисов IX Всесоюзн.научн.симпозиума "Синтетические полимеры медицинского назначения".-Звени-город.-1991.-С Л72(соавт.А.И.Смирнов,В.Н.Кижняев.В.С.Ефимов).

Подписано и печати 26.01.92. Заказ 2.

Объем 1.0 п.л. Формат 60 х 90. I/I6. Тира« 100 экз.

Подразделение оперативной полиграфии Иркутского государственного университета 664003, Г.Иркуток, б.Гагарина, 36