Влияние факторов экзогенного и эндогенного происхождения на функциональную активность гемопоэтической стволовой клетки в норме и при аутоиммунной патологии

Феофанова, Наталья Александровна

Диссертации по медицине → Клиническая иммунология, аллергология

Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Влияние факторов экзогенного и эндогенного происхождения на функциональную активность гемопоэтической стволовой клетки в норме и при аутоиммунной патологии

ДИССЕРТАЦИЯ

Влияние факторов экзогенного и эндогенного происхождения на функциональную активность гемопоэтической стволовой клетки в норме и при аутоиммунной патологии - диссертация, тема по медицине

АВТОРЕФЕРАТ

Феофанова, Наталья Александровна Новосибирск 2010 г.

Ученая степень: кандидата биологических наук

ВАК РФ: 14.03.09

Автореферат диссертации по медицине на тему Влияние факторов экзогенного и эндогенного происхождения на функциональную активность гемопоэтической стволовой клетки в норме и при аутоиммунной патологии

064683086

На правах рукописи

ФЕОФАНОВА Наталья Александровна

Влияние факторов экзогенного и эндогенного происхождения на функциональную активность гемопоэтической стволовой клетки в норме и при аутоиммунной патологии

14.03.09 — клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 2010

004603086

Работа выполнена в Учреждении РАМН Научно-исследовательском институте клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Орловская Ирина Анатольевна Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Останин Александр Анатольевич

доктор медицинских наук, профессор Шурлыгина Анна Вениаминовна

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (г. Москва)

Защита состоится «!' »2010 года в часов на заседании

- 7/'

диссертационного совета Д 001.001.01 НИИ клинической иммунологии СО РАМН по адресу: 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ клинической иммунологии СО РАМН

Автореферат разослан «//»

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук Кудаева Ольга Тимофеевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Эффективность трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) при той или иной патологии зависит, прежде всего, от функционального состояния трансплантируемых клеток. Для ГСК основными функциональными характеристиками являются способность к миграции в костномозговую нишу (хоминг), дальнейшему самоподдержанию, пролиферации и дифференцировке в зрелые клетки гемопоэтической и лимфоидной систем. Актуальным является поиск методов воздействия на функциональную активность ГСК с целью повышения эффективности трансплантации и ускорения восстановления кроветворной системы.

В процессе трансплантации в первую очередь должен произойти хоминг ГСК, этот этап является одним из определяющих факторов успеха трансплантации. Хоминг ГСК протекает с участием хемокинов, молекул адгезии (CXCR4/SDF1, VLA4/VCAM1, LFA-1/ICAM-1, CD44/HA, c-kit/KL) и заканчивается "заякориванием" клетки в своей нише. Взаимодействие адгезивного рецептора CD44 с лигандом - гиалуроновой кислотой (ГК) играет важную роль в процессах хоминга ГСК и репопуляции кроветворных органов [Legras et al., 1997; Peled et al., 2000; Avigdor et al., 2004]. ГК продуцируется клетками гемопоэтического микроокружения и является одним из важнейших компонентов экстрацеллюлярного матрикса («структурный организатор»). ГК поддерживает адгезию, рост, дифференцировку и регулирует миграцию клеток [Lee, Spicer, 2000]. В условиях тотального облучения организма в кроветворных органах происходит быстрое снижение уровня ГК, нарушение ее синтеза отмечается и под действием химиотерапевтических воздействий [Young et al., 1994; Rehakova et al., 1994]. Таким образом, воздействие на хоминг ГСК посредством модулирования свойств костномозговой ниши с помощью введения гиалуроновой кислоты актуально для совершенствования трансплантационных технологий.

Следующим этапом в процессе трансплантации после закрепленя ГСК в костномозговой нише является пролиферация и дальнейшая дифференцировка в зрелые клеточные элементы. Важно, чтобы в процессе пролиферации не происходило истощения пула ГСК, т.е. сохранялась способность ГСК к самоподдержанию. Усиление пролиферативной активности под действием цитокиновых коктейлей in vitro, как правило, ассоциировано с потерей способности к самоподдержанию ГСК [Zandstra et al., 1997, Henschler et al., 1994]. В последние годы были открыты внутриклеточные сигнальные пути, отвечающие за регуляцию самоподдержания ГСК, такие как Notch, Wnt и Hedgehog [Stier et al., 2002; Reya et al., 2003; Bhardwaj et al., 2001], однако возможность управлять ими с помощью фармакологических воздействий на сегодня ограничивается достаточно малым числом известных препаратов. К таким веществам относятся ингибиторы гистондеацетилаз [Young, 2004], ингибиторы GSK3beta [De Felice et al., 2005], ретиноевая кислота [Purton et al., 1999], с помощью которых удается достигнуть существенной экспансии ГСК in vitro. Актуальным является изучение функциональной активности ГСК после стимуляции самоподцержания in vitro в условиях трансплантации, разработка подходов, сочетающих фармакологические воздействия на ГСК с подходами клеточной терапии.

Трансплантацию ГСК в терапии тяжелых аутоиммунных заболеваний (АИЗ) начали применять в конце 1990 годов после ряда успешных преклинических исследований на экспериментальных моделях. Комбинация иммуносупрессивной терапии с трансплантацией аутологичных стволовых клеток позволяет достичь улучшения в течении АИЗ (системная красная волчанка, рассеянный склероз) [Burt et al., 2008; Jayne et al., 2004; Tyndall, Gratwohl, 2009]. Имеются основания полагать, что АИЗ, наряду с лимфопролиферативными, являются следствием дефекта функциональной активности ГСК. Некоторые авторы рассматривают системные и органоспецифические АИЗ как «болезнь стволовой клетки» (polyclonal hemopoietic stem cell proliferative syndrome) [Ikehara, 2003]. ГСК мышей MRL-lpr/lpr с аутоиммунной патологией (животная модель системной красной волчанки) отличаются повышенной радиорезистентностью, изменение их пролиферативно-дифференцировочных потенций проявляется уже на ранней стадии, до клинических проявлений заболевания [Ikehara, 2001; Топоркова и др., 2002]. Исследование количественных и функциональных характеристик ГСК при аутоиммунной патологии, помимо научного, имеет и клинический интерес, с целью их последующей коррекции, в том числе при оптимизации технологий трансплантации ГСК. Поскольку усиление пролиферативной активности ГСК может быть обусловлено дефектом апоптоза, можно полагать, что коррекция пролиферации и дифференцировки ГСК с помощью воздействий, регулирующих апоптоз, позволит создать условия для более эффективной трансплантации гемопоэтических клеток при аутоиммунной патологии.

Цель работы - исследование эффективности трансплантации клеток костного мозга при модуляции функциональной активности ГСК в норме и при аутоиммунной патологии.

Задачи

1. Исследовать влияние гиалуроновой кислоты на процесс хоминга ГСК в костный мозг методом прижизненного мечения.

2. Исследовать параметры восстановления гемопоэза летально облученных мышей после трансплантации клеток костного мозга при введении гиалуроновой кислоты реципиентам.

3. Исследовать параметры восстановления гемопоэза летально облученных реципиентов, восстановленных клетками костного мозга, обработанными вальпроевой и региноевой кислотами, усиливающими функцию самоподдержания ГСК.

4. Изучить функциональньные параметры ГСК (пролиферация, апоптоз, диффсренцировка) в процессе развития аутоиммунной патологии у мышей MKL-Ipr/lpr.

5. Исследовать влияние препаратов, стимулирующих апоптоз (вортманнин, ролипрам, Н7), на функциональную активность ГСК у мышей MRL-Ipr/lpr.

Научная новизна

Впервые показана способность гиалуроновной кислоты повышать эффективность хоминга ГСК в кроветворные органы при внутривенном введении реципиентам в сочетании с сингенной трансплантацией клеток костного мозга.

Впервые показано повышение эффективности трансплантации клеток костного мозга (усиление гемопоэза и повышение выживаемости) при внутривенном введении реципиентам гиапуроновой кислоты.

Впервые показано отсутствие преимуществ трансплантации клеток костного мозга, инкубированных с вальпроевой кислотой, по сравнению с интактными клетками костного мозга. Показан негативный эффект преинкубации клеток костного мозга с вальпроевой кислотой перед трансплантацией на выживаемость реципиентов.

Впервые показано, что в процессе развития аутоиммунного заболевания мышей MRL-Ipr/lpr происходит изменение функциональных характеристик CD34+icieTOK костного мозга: снижается относительное количество CD34+ клеток в костном мозге, уменьшается процент CD34+ клеток, находящихся в состоянии апоптоза.

Впервые показана способность фармакологических стимуляторов апоптоза модулировать функциональную активность ГСК аутоиммунных мышей MRL-Ipr/lpr. усиление апоптоза CD34+ клеток под действием ингибитора протеинкиназы С (Н7) и ингибитора фосфодиэстеразы 4 (ролипрам), подавление дифференцировки ГСК в эритроидном направлении под действием ингибитора протеинкиназы С (Н7) и ингибитора фосфоинозитид-3-киназы (вортманнин).

Впервые показано, что в условиях трансплантации клеток костного мозга сочетание усиления апоптоза и подавления эритроидной дифференцировки ГСК аутоиммунных мышей MRL-lpr/lpr под действием ингибитора протеинкиназы С (Н7) угнетает костномозговое кроветвоение реципиентов.

Научно-практическая значимость

Экспериментальные данные, полученные в работе, расширяют представления о механизмах регуляции функциональной активности гемопоэтической стволовой клетки, открывают возможность разработки нового подхода к повышению эффективности трансплантации ГСК, основанного на усилении процесса миграции ГСК в костномозговую нишу (хоминга) с помощью введения гиалуроновой кислоты реципиентам.

Положения, выносимые на защиту

1. Введение гиалуроновой кислоты реципиентам при трансплантации клеток костного мозга усиливает процесс хоминга ГСК в костномозговую нишу, стимулирует гемопоэз и повышает выживаемость реципиентов.

2. Стимуляция сниженного апоптоза CD34+ клеток аутоиммунных мышей MRL-Ipr/lpr спровождается снижением уровня эритроидной дифференцировки ГСК мышей MRL-lpr/lpr in vitro до контрольных показателей.

3. Усиление апоптоза CD34+ клеток аутоиммунных мышей MRL-lpr/lpr и снижение эритроидной дифференцировки не оказывает положительного влияния на репопуляцию кроветворных органов реципиентов при трансплантации клеток костного мозга.

Апробация диссертации

Результаты работы представлены на международных конференциях Progress in fundamental and applied sciences for human health. International Multidisciplinary Congress, Sudak, Ukraine, June 10-21, 2004; Международной конференции «Клинические и фундаментальные проблемы клеточных биотехнологий»,

Новосибирск, Россия, 1-2 декабря 2005г; 2009 World Stem Cell Summit, Baltimore, USA, September 21-23, 2009.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Материал изложен на 101 странице машинописного текста, вкючающего 5 таблиц и 29 рисунков. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 194 литературных источника, в том числе, 187 иностранных.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 3 статьи в журналах, определенных ВАК РФ для публикации научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Автор выражает благодарность с.н.с. лаборатории иммунобиологии стволовой клетки Топорковой Л.Б., с.н.с. лаборатории молекулярной иммунологии Лопатниковой Ю.А., зав. лаборатории клеточной иммунотерапии д.м.н. Черных Е.Р. и с.н.с. лаборатории клеточной иммунотерапии Тихоновой М.А. за помощь и поддержку, оказанную при выполнении работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные. В экспериментах использовали мышей (CBAxC57Bl/6)Fl, С57В1/6 в возрасте 2-6 мес., полученных из лаборатории экспериментальных животных (моделей) Института клинической иммунологии СО РАМН, мышей MRL-lpr/lpr, полученных из вивария Института цитологии и генетики СО РАН. Животных содержали в условиях вивария в пластиковых клетках на сбалансированном питании и свободном доступе к воде. Всего в работе использовано около 1000 животных.

Реактивы и среды. Среда RPMI-1640, L-глутамин сухой стерильный, фосфатный буфер, сыворотка крупного рогатого скота (КРС) получены из ГНЦ вирусологии и биотехнологии "Вектор", Новосибирская обл., п. Кольцово. Среда M 3434, содержащая КРС, эритропоэтин, IL3, IL6 - от Stem Cell Technologies, Canada. Антитела анти-С034 мыши, коньюгированные с РЕ, получены от Ebioscience, PharMingen, San Diego, США. ДМСО, бычий сывороточный альбумин (БСА), пропидиум иодид, вальпроевая кислота, ретиноевая кислота, гиалуроновая кислота петушиного гребня и человеческой пуповины получены от Sigma-Aldrich. Вортманнин, Н7 и ролипрам получены от ICN. Carboxyfluorescein diacetate succinímidyl ester (CFSE) получен от Molecular Probes.

Прижизненное мечение клеток костного мозга флуоресцентной меткой CFSE

1. Клетки в количестве 5-10х106 ресуспендировали в 1 мл фосфатного буфера, содержащего 5% сыворотки КРС в новой пробирке.

2. Помещали пробирку горизонтально, добавляли 110 мкл фосфатного буфера на несмоченную поверхность пластика верха пробирки и ресуспендировали в нем 1,1 мкл 5мМ стока CFSE .

3. Закрывали пробирку, быстро переворачивали несколько раз и перемешивали на вортексе.

4. После смешивания оставляли клетки для мечения на 5 минут при температуре 37С в темноте.

5. Дважды отмывали клетки 10 объемами фосфатного буфера, содержащего 5% сыворотки КРС, центрифугированием при 300g 5 минут с удалением супернатанта [Parish, Warren, 2001].

Мечение антителами, конъюгированными с флуоресцентной меткой

Мечение осуществляли согласно рекомендациям фирмы-производителя антител.

1. К клеткам в количестве 200х103 в 50 мкл добавляли антитела в дозе 1мкл на пробу.

2. Инкубировали 20 минут при комнатной температуре в темноте.

3. Дважды отмывали клетки в 1 мл фосфатного буфера центрифугированием при 1500 об/мин. с удалением супернатанта.

5. Осадок ресуспендировали в 500 мкл фосфатного буфера.

Анализ клеточного цикла производили методом проточной цитофлюориметрии (FACSCallibur, Becton Dickinson).

Анализ клеточного цикла. Клеточный цикл определяли по содержанию ДНК в клетках, окрашенных пропидиум иодидом (4 мкг/мл): определяли относительное содержание клеток с диплоидным (клетки в Go/Gi фазах клеточного цикла) и гипердиплоидным (клетки в S/G2M фазах клеточного цикла) набором ДНК. Апоптотические клетки, ДНК которых подвергалась фрагментации, формировали характерный гиподиплоидный пик. Анализ клеточного цикла производили методом проточной цитофлюориметрии (FACSCallibur, Becton Dickinson).

Определение количества белка в моче. Количество белка в моче определяли колориметрически с красителем Кумасси бриллиантовый синий по методу Брэдфорд [Bradford, 1976], концентрацию белка рассчитывали по калибровочной кривой, построенной по БСА (100-1000 мкг/мл), результаты выражали в мг/мл.

Облучение животных. Облучение животных производили на аппарате РУМ-25 при мощности 0,5 Гр/мин, напряжении 130 кВ, силе тока ЮмА. Летальная доза составляла 7.0 - 8.5 Гр в соответствии с индивидуальной радиочувствительностью используемых линий мышей. Сублетальная доза составляла 6,5 Гр для мышей (CBAxC57Bl/6)F 1.

Оценка колониеобразующей активности костного мозга методом полутвердых культур. Реципиентов облучали в летальной дозе, через 24 часа вводили исследуемую клеточную суспензию внутривенно в концентрации 1х10б клеток/мышь. Через 7 суток оценивали колониеобразующую активность костного мозга реципиентов. Осуществляли забой животных, костный мозг вымывали из бедренной кости с помощью шприца кондиционной средой RPMI1640, содержащей 10% КРС, и подсчитывали количество клеток в 1 мл. Для определения числа коммитированных предшественников клетки костного мозга в концентрации 50х103/мл инкубировались в 24-луночных планшетах в метилцеллюлозной среде М 3434. Гранулоцитарно-макрофагальные (КОЕ-ГМ), эритроидные (КОЕ-Э) и смешанные (КОЕ-ГЭММ) колонии подсчитывались под инвертированным

микроскопом после 14-дневной инкубации при температуре 37°С, 5% С02 согласно рекомендациям Stem Cell Techologies, Canada.

Определение количества колониеобразующих единиц селезенки КОЕ-с8.

Клетки костного мозга в количестве 0,5x105/мышь вводили внутривенно летально облученным реципиентам. На 8-е сутки производили забой реципиентов, после фиксации селезенок в реагенте Телесницкого (состав: уксусная кислота и этиловый спирт в объемном соотношении 1:4) подсчитывали число макроскопически видимых колоний в селезенках [по Till, McCuloch, 1964].

Определение количества форменных элементов крови. Количество форменных элементов (лейкоцитов и тромбоцитов) периферической крови определяли в образцах крови объемом 40 мкл, взятых из кончика хвоста животного, с помощью гематологического анализатора ERMA PCI90 (Япония). Забор крови производили у 5 животных из группы, выбранных случайным образом; размер каждой экспериментальной группы составлял 10 животных.

Статистическая обработка данных. Статистическая обработка данных проводилась с помощью пакета статистических программ "STATISTICA 5.0". Достоверность обнаруженных межгрупповых различий оценивали с использованием t-критерия Стьюдента. Данные представлены как среднее значение ± ошибка среднего значения. Обработку данных по выживаемости животных проводили с использованием критерия Каплан-Мейера.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Влияние внутривенного введения гиалуроновой кислоты на эффективность хоминга гемопоэтических предшественников при трансплантации клеток костного мозга

Взаимодействие поверхностного рецептора адгезии CD44 со своим лигандом -гиалуроновой кислотой (ГК) играет одну из ведущих ролей в процессах хоминга ГСК и репопуляции костномозговой ниши [Avigdor et al., 2004]. В отличие от взаимодействий адгезивной молекулы VLA4 со своим рецептором VCAM, необходимых для закрепления ГСК только в костномозговых нишах, CD44/TK взаимодействия необходимы для хоминга ГСК как в костном мозге, так и в селезенке [Verraeulen et al., 1998]. В условиях тотального облучения организма в костном мозге и селезенке происходит быстрое снижение уровня гликозаминогликанов, включая ГК [Rehakova et al., 1994]. При внутривенном введении ГК уже через 4 часа происходит ее специфическое накопление в печени, лимфатических узлах, селезенке и костном мозге, максимальная концентрация ГК в этих органах сохраняется и через 24 часа после введения [Fraser et al., 1983]. Таким образом, происходит длительное изменение концентрации ГК и модуляция микроокружения ГСК в кроветворных органах. Можно предположить, что введение в организм реципиентов ГК совместно с трансплантацией ГСК окажет воздействие на эффективность хоминга и закрепления ГСК в своей нише.

Чтобы выяснить, оказывает ли внутривенное введение в организм гиалуроновой кислоты влияние на процессы хоминга ГСК и репопуляции органов кроветворения у мышей (CBAxC57Bl/6)Fl, мы использовали следующую экспериментальную схему: реципиентам опытной группы вводили внутривенно гиалуроновую кислоту, растворенную в 200 мкл среды RPMI1640 в количестве

ЮОмкг/мышь (доза единичного введения) в день облучения за час до и через час после облучения, а также на следующий день за два часа до трансплантации ККМ. Реципиентам контрольной группы вводили среду КРМ11640. Были протестированы препараты гиалуроновой кислоты, полученые из петушиного гребня и человеческой пуповины.

Для оценки эффективности хоминга кроветворных предшественников летально облученным реципиентам контрольной и опытной групп трансплантировали меченые флуоресцентной меткой СР5Е клетки костного мозга в количестве 107 клеток на мышь. Через 21 час после трансплантации определяли процент трансплантированных клеток (СР5Е+) в лейкоцитарной фракции суспензии клеток костного мозга и селезенки методом проточной цитофлюориметрии. Отдельно определяли процент трансплантированных кроветворных предшественников СЭ34+ популяции (СР8Е+С034+) от всех клеток лейкоцитарной фракции кроветворного органа реципиента. Результаты суммированы в таблице 1.

Таблица 1. Влияние внутривенного введения гиалуроновой кислоты на локализацию в кроветворных органах прижизненно меченых (СР8Е+) клеток костного мозга и популяции СВ34+ (СР8Е+СБ34+) через 21 час после

Селезенка Костный мозг

СР8Е+ (п=8) СР8Е+С034+ (п=8) СРЭЕ+ (п=8) СР8Е+С034+ (п=8)

контроль 3,7±0,4 0,2±0,04 1,5±0,15 0,075±0,025

ГКпетушиного гребня 4,25±0,5 *0,325±0,025 1,175±0,2 *0,175 ±0,048

ГКчеловеческой пуповины *5,25±0,16 0,225±0,025 1,05 ±0,17 *0,175 ±0,025

*- достоверные отличия по сравнению с контролем, р<0,05

Введение реципиентам ГК из человеческой пуповины (ГКп) достоверно повышало процент трансплантированных ККМ, мигрировавших в селезенку, однако при этом содержание ранних кроветворных предшественников СВ34+ среди этих клеток не отличалось от такового в контроле. ГК из петушиного гребня (ГКг) достоверно увеличивала число трансплантированных С034+ клеток как в костном мозге, так и в селезенке. В костном мозге оба препарата ГК повышали процент трансплантированных СЭ34+ клеток более чем в два раза по сравнению с контролем. Усиление хоминга гемопоэтических предшественников в костный мозг под воздействием ГК оказывало, очевидно, влияние на интенсивность кроветворения в костном мозге: на 7 сутки после трансплантации ККМ у животных опытных групп число КОЕ-ГМ было достоверно выше, чем у контрольных животных. Количество КОЕ-Э не изменялось по сравнению с контрольными значениями (рис. 1).

Число КОЕс8 у животных, получавших ГКг, было достоверно выше, чем у животных контрольной группы, в то время как ГКп не оказывала эффекта на колониеобразование в селезенке (рис. 2). По-видимому, эффективность хоминга ГСК в кроветворные органы в течение первых суток после трансплантации определяет интенсивность дальнейшей репопуляции кроветворных органов.

а. б.

Рис. 1. Влияние внутривенного введения ГКг (а) и ГКп (б) реципиентам на колониеобразующую способность костномозговых гемопоэтических предшественников на 7 сутки после трансплантации ККМ. Контроль п=8, ГКг п=8, ГКп п=8. * - достоверные отличия по сравнению с контролем, р <0,05.

го

о 20

О 15 Ч

контроль

ГКг

315 ш О * 10

5 -

контроль

ГКп

а. б.

Рис. 2. Колониеобразование в селезенке мышей, облученных и восстановленных ККМ, при введении ГКг (а) и ГКп (б) реципиентам. Контроль п=10, ГКг п=10, ГКп п=10. * - достоверные отличия по сравнению с контролем, р <0,05.

Интересно, что существенная стимуляция колониеобразования в костном мозге и селезенке, индуцированная ГКг, не влияла на динамику восстановления числа лейкоцитов и тромбоцитов в крови реципиентов в посттрансплантационном периоде (рис. 3). ГКп также не оказывала воздействия на скорость восстановления числа лейкоцитов в периферической крови реципиентов, однако существенно влияла на динамику тромбоцитопоэза: восстановление количества тромбоцитов до исходного уровня у животных опытной группы происходило на 17 сутки и в дальнейшем оставалось повышенным по сравнению с показателями животных контрольной группы. У животных контрольной группы количество тромбоцитов восстанавливалось до исходного уровня лишь на 23 сутки (рис. 4).

5 10 15 20 25 дни после трансплантации

О 5 10 15 20 25 30 дни после трансплантации

б.

Рис. 3. Динамика восстановления количества лейкоцитов (а) и тромбоцитов (б) в периферической крови облученных и восстановленных ККМ реципиентов, при введении ГКг.

5 10 15 20 25 дни после трансплантации

б.

Рис. 4. Динамика восстановления количества лейкоцитов (а) и тромбоцитов (б) в периферической крови облученных и восстановленных ККМ реципиентов, при введении ГКп. *— достоверные отличия по сравнению с контролем, р <0,05

Для того, чтобы выяснить, является ли данный эффект следствием влияния ГК на хоминг ГСК, или он обусловлен иными причинами, был проведен эксперимент, в котором животные получали сублетальную дозу облучения, при этом трансплантацию ККМ им не производили. В таких условиях восстановление кроветворения происходит за счет эндогенных ГСК, некоторый процент которых сохраняется в костном мозге после облучения в сублетальной дозе, т.е. отсутствует этап миграции ГСК в кроветворные органы. Режим введения ГК животным опытной группы оставался прежним: вводили ЮОмкг/мышь (доза единичного введения) в день облучения за час до и через час после облучения, а также один раз на следующий день после облучения. В этом эксперименте разница в динамике восстановления числа тромбоцитов у животных контрольной и опытной групп была сходна с таковой в условиях трансплантации ГСК, хотя отличия в этом случае не были статистически достоверны (рис. 5).

Известна способность ГК стимулировать мегакариоцитопоэз in vitro [Han et al., 1996]. В то же время, имеются сведения о взаимосвязи эффективности хоминга ГСК и динамики восстановления количества тромбоцитов после трансплантации.

— контроль

- ГКп

5 10 15 20 дни посте облучения

Рис. 5. Динамика восстановления количества тромбоцитов в периферической крови мышей, облученных в сублетальной дозе, при введении ГКг

Показано, что у старых C57BL/6 мышей-реципиентов снижена как способность ГСК к хомингу, так и скорость восстановления числа тромбоцитов, по сравнению с клетками периферической крови других типов [Liang et al., 2005]. По-видимому, ускорение восстановления количества тромбоцитов при введении животным ГКп обусловлено как усилением хоминга трансплантированных

предшественников в костный мозг, так и непосредственной стимуляцией тромбоцитопоэза за счет повышенного содержания ГК в костном мозге реципиентов.

Выживаемость реципиентов оценивалась в условиях трансплантации летально облученным реципиентам количества клеток, обеспечивающего примерно 50% выживаемость в контрольной группе (0,5х105 клеток/мышь). При введении ГКп не наблюдалось достоверных отличий в выживаемости между контрольной (66%) и опытной группами (48%), в то время как ГКг достоверно повышала этот показатель. Процент выживших животных в группе мышей, получавших ГКг, составлял 82%, в контрольной группе он составлял 29% (рис. 6).

X 100% -контроль X 100%

3 z 90% 'ft.-, —Гкг 2 f 90%

& ю 80% ^_ Б m 80%

S * 70% 70%

X s 60% X S 60%

3 ш s 50% ь 3 СО к 50%

X 2 40% * л 40%

ш 30% 1 а 30%

ф 20% 0) ZS 20%

о о. 10% о о. 10%

0% 0%

- контроль

-— ГКп

25 30

10 15 20 25 30

дни после трансплантации дни после трансплантации

а. б.

Рис. 6. Выживаемость облученных и восстановленных ККМ реципиентов при введении ГКг (а), ГКп (б). Контроль п=30, ГКг п=30, ГКп п=30.

Основными причинами гибели животных в период с 7 по 20 сутки являются инфекционные осложнения и недостаточность системы гемостаза, обусловливающая развитие геморрагического синдрома. Известно, что трансфузия тромбоцтарной массы облученным животным в этот период обладает высокой терапевтической эффективностью, даже в отсутствие трансплантации ГСК [Бутомо, 1970]. Положительное влияние ГКп на выживаемость реципиентов может

быть связано с тем, что ГК модулирует процессы свертывания крови: показана ее способность ингибировать антитромбин, усиливая свертываемость [Chang X, 2005]. Возможно, это свойство ГК оказывается существенным в условиях недостаточности системы гемостаза. Разница в эффектах, которые оказывает на процессы кроветворения и выживаемость реципиентов ГК из разных источников, вероятно, связана с различиями в молекулярной массе полимеров гиалуроновой кислоты - масса ГК петушиного гребня составляет в среднем 80-750 кДа, а ГК человеческой пуповины 1-4 МДа.

Влияние вальпроееой кислоты па функциональную активность ГСК при трансплантации ККМлетально облученным реципиентам.

Вальпроевая кислота является одновременно ингибитором GSK3beta и гистондеацетилаз, показана ее способность стимулировать пролиферацию ГСК без потери самоподдержания [De Felice et al., 2005]. Мы предположили, что стимуляция самоподцержания ГСК с помощью вальпроевой кислоты (VPA) позсшит повысить репопулируюпдай потенциал ГСК, что положительно повлияет на процесс восстановления кроветворения. Реципиентам опытной группы вводили ККМ, инкубированные с VPA в концентрации 150 мкг/мл в течение 24 часов. Время инкубации было выбрано таким образом, чтобы стимулировать самоподдержание ГСК, но не увеличение количества ГСК в трансплантате. Реципиентам контрольной группы вводили равное количество ККМ, инкубированных в тех же условиях в отсутствии VP А. Параметры восстановления кроветворения оценивали по числу колониеобразующих единиц различных ростков кроветворения в костном мозге реципиентов (КОЕ-ГМ, КОЕ-Э, КОЕ-ГЭММ) на 7 сутки после трансплантации ККМ и числу колониеобразующих единиц селезенки КОЕс8. Также осуществляли мониторинг количества лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов в периферической крови в течение месяца после трансплантации ККМ, оценивали выживаемость реципиентов.

Чтобы убедиться, что в наших экспериментальных условиях VPA индуцирует пролиферацию ГСК, была проведена оценка числа ГСК, находящихся в S-фазе клеточного цикла. Митотическую активность КОЕс-8 оценивали по включению цитозин-арабинозида - аналога цитидина (агаС), обладающего селективным цитотоксическим действием в отношении пролиферирующих клеток. Разница между числом КОЕс-8, полученных после трансплантации летально облученным реципиентам ККМ, инкубированных без агаС и в присутствии агаС (ImM), составляет процент КОЕс-8, находящихся в S-фазе клеточного цикла. В соответствии с литературными данными, отмечалось значительное усиление пролиферативной активности ГСК под действием VPA (таблица 2).

Таблица 2. Процентное содержание КОЕс-8 в Б фазе клеточного цикла после преинкубации ККМ с вальпроевой кислотой (УРА).

число КОЕс-8 на 0,5x105 ККМ КОЕс в S фазе,%

без агаС (п=10) с агаС (п=10)

контрольные ККМ 1,11±0,37 1,05±0,35 5,2

ККМ + VPA 3,3±0,5 1,3±0,45 59,6

Число КОЕс8 у животных, которым трансплантировали ККМ, обработанные УРА, было достоверно выше, чем у животных контрольной группы (рис. 7).

В костном мозге реципиентов, которым трансплантировали ККМ, обработанные УРА на 7 сутки отмечалось повышение числа как КОЕ-ГМ, так и КОЕ-Э (рис. 8).

«9 25 й 20-о 15

5 10 Н

а>

£ 5-

контроль

УРА

35 30 25 20 15 Ч 10 5 0

□ контроль ,

1УРА г£

Рис. 7. Колониеобразование в селезенке мышей, облученных и восстановленных. преинкубированны-ми с вальпроевой кислотой ККМ Контроль п=10, УРА п=10.

КОЕ-Э КОЕ-ГМ

Рис. 8. Влияние инкубации ККМ с вальпроевой кислотой (УРА) на колониеобразующую способность костномозговых гемопоэтических предшественников на 7 сутки после трансплантации ККМ. Контроль п=8, УРА п=8.

*- достоверные отличия по сравнению с контролем, р <0,05

Повышение интенсивности кроветворных процессов оказывало воздействие и на динамику восстановления числа лейкоцитов в периферической крови реципиентов. Восстановление этого параметра происходило у животных контрольной и опытной групп практически одновременно — на 24 и 22 сутки соответственно. Однако после этого момента, когда у животных контрольной группы число лейкоцитов стабилизировалось на уровне 10 млн/мл, у животных опытной группы до 29 суток продолжалось прогрессивное увеличение количества лейкоцитов до 15 млн/мл, затем оно стабилизировалось на этом уровне до конца периода наблюдения (рис. 9). Неожиданными оказались результаты, полученные в экспериментах по оценке выживаемости реципиентов. У животных, которым трансплантировали ККМ, обработанные УРА, выживаемость оказалась достоверно ниже (52%), чем у реципиентов контрольной группы (80%) (рис. 10). По-видимому, усиленная пролиферация ГСК в условиях трансплантации ККМ препятствовала своевременной дифференцировке ранних кроветворных предшественников в зрелые клеточные элементы, что послужило причиной гибели реципиентов. Запуск процесса дифференцировки не отменялся, но был отложен во времени, как следует из прогрессивного повышения числа лейкоцитов в периферической крови реципиентов опытной группы после 24 суток.

Таким образом, вальпроевая кислота, стимулируя пролиферацию ГСК с сохранением самоподдержания, приводит к усилению кроветвориения в костном мозге и селезенке, однако не вызывает ускорения восстановления лейкоцитов в

периферической крови и негативно сказывается на выживаемости реципиентов.

дни после трансплантации

100%

X 1 90%

о 80%

s X 70%

X s 60%

3 m 50%

1 3 40%

о н 30%

X ê 20%

о а 10%

-контроль — VPA

S 10 15 20 25 30 дни после трансплантации

Рис. 9. Динамика восстановления Рис. 10. Выживаемость реципиентов,

количества лейкоцитов в пери- облученных и восстановленных ККМ

ферической крови реципиентов, после инкубации с вальпроевой

облученных и восстановленных ККМ кислотой (VPA). Контроль n=30, VPA

после инкубации с вальпроевой кислотой п=30. (VPA).

* - достоверные отличия по сравнению с контролем, р <0,05

Коррекция апоптоза и дифференцировки ГСК мышей MRL-lpr/lpr через воздействия на внутриклеточные сигнальные пути

В последние годы накапливаются данные об изменениях функциональной активности ГСК при аутоиммунных заболеваниях (АИЗ); делаются предположения о патогенетической роли этих изменений [Wang et al., 2007, Andryushkova et al., 2007], что дает основания рассматривать ГСК и ранние гемопоэтические предшественники как возможную мишень для терапевтических воздействий.

В качестве модели АИЗ были использованы мышы линии MRL-lpr/lpr, несущие мутацию в гене 1рг, кодирующем рецептор Fas. Следствием этого является нарушение Fas-зависимого пути апоптоза иммунокомпетентных клеток, приводящее спонтанному развитию системного аутоиммунного заболевания, характерезующегося тяжелой лимфоаденопатией, продукцией разнообразных аутоантител, иммунных комплексов, а также гломерулонефритом [Nagata et al., 1995, Watanabe-Fukunaga et al., 1992]. Fas/FasL взаимодействия играют существенную роль и в регуляции кроветворения. ГСК мышей MRL-lpr/lpr отличаются повышенной радиорезистентностью, изменение их пролиферативно-дифференцировочных потенций проявляется еще до клинических проявлений заболевания [Ikehara, 2001]. Увеличение количества эритроидных колоний в костном мозге мышей MRL-lpr/lpr происходит уже на ранних стадиях развития АИЗ, до появления протеинурии [Топоркова и др., 2002].

Поскольку усиление пролиферативной активности ГСК у мышей MRL-lpr/lpr может быть связано с дефектом апоптоза, мы провели исследование таких характеристик как прогрессия по клеточному циклу и процент клеток в состоянии апоптоза в популяции CD34+ кроветворных предшественников в процессе развития АИЗ у мышей MRL-lpr/lpr. Были сформированы три группы мышей, характеризующие разные стадии формирования АИЗ: 1) молодые мыши (4-5

недельные) без протеинурии (п=14); 2) 24-недельные мыши без протеинурии, находящиеся на стадии предболезни (п=10); 3) 24-недельные мыши с выраженными признаками АИЗ (протеинурия более 3 мг/мл) - группа «АИЗ» (п=20). Контрольными служили показатели, полученные при исследовании характеристик СБ34+ клеток у мышей (СВАхС57В1/6)Р1 (п=10).

Было показано, что развитие заболевания сопровождается снижением относительного количества СБ34+ клеток в лейкоцитарной фракции клеток костного мозга мышей МШ.-1рг/1рг (рис. 11): в группе АИЗ процент СБ34+ клеток оказался достоверно ниже, чем во всех других группах. Уровень апоптоза С0341 клеток, достоверно повышенный у молодых здоровых мышей МКЬ-1ргДрг по сравнению с контролем, снижается по мере развития заболевания, достигая достоверных различий в группе АИЗ по сравнению с уровнем апоптоза С034+ клеток в других группах (рис. 12).

контроль молодые гредболезнь АИЗ

ав

контроль молодые гредболезнь АИЗ

Рис. 11. Процент СОЭ4+ клеток среди клеток лейкоцитарной фракции клеток костного мозга. клеток костного мозга.

* - достоверные отличия по сравнению с контролем, р <0,05

Рис. 12. Процент СШ4+ клеток в состоянии апоптоза, среди СБ34+

У мышей М Ш*-1рг/1рг всех групп было обнаружено повышение пролиферативной активности (Э/СгМ фазы клеточного цикла) популяции СБ34+ клеток по сравнению с контролем. Относительное количество СЭ34+ клеток, пребывающих в фазах Ог/в, клеточного цикла, было достоверно снижено по сравнению с контролем в группах молодых мышей и АИЗ (рис. 13).

Мы предположили, что отклонения в пролиферации и преимущественной дифференцировке ГСК мышей МЮ--1рг/1рг в эритроидном направлении могут быть скорректированы с помощью воздействий, регулирующих апоптоз. Для коррекции функциональной активности кроветворных предшественников Раз-дефектных мышей МКЬ-1рг/1рг были выбраны воздействия, направленные на повышение апоптоза СР34+ клеток, замедление их прогрессии по клеточному циклу и подавление эритроидной дифференцировки: ингибитор Р13К. вортманнин, ингибитор РКС Н7 и ингибитор РОЕ4 ролипрам.

■ G0/G1 □ S/G2M

Рис. 13. Процент СЭ34+ клеток, находящихся в различных фазах клеточного цикла, среди СБ34+ клеток костного мозга. *р<0,05 по сравнению с контролем.

контроль молодые предбопезнь АИЗ

Влияние препаратов на прогрессию клеточного цикла и апоптоз определяли в популяции СБ34* клеток 24-недельных мышей МШ*-1рг/1рг с протеинурией после инкубации ККМ с каждым из препаратов в течение 24 часов в следующих концентрациях: 20 мкМ Н7, 500 нМ вортманнин, 10 мкМ ролипрам. Затем методом проточной цитофлюориметрии определяли процент клеток, находящихся в различных фазах клеточного цикла и процент клеток в состоянии апоптоза. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3. Модуляция параметров клеточного цикла и апоптоза СВ34+ клеток костного мозга старых больных мышей МЯЫргЛрг в условиях ингибирования

показатель контроль (п=16) вортманнин (п=14) Н7 (п=16) ролипрам (п=16)

CD34 (%) 3,2±0,6 2,3±0,2 2,8±0,4 2,4±0,3

апоптоз(%) 7,8±1,5 13±4,2 18±2,6* 16±3,2*

G0/G1 (%) 76±5,4 69±6,2 70±5,1 71±5

S/G2M (%) 16±4,6 17±3,9 12±3,5 13±3,7

*р<0,05 по сравнению с контролем

Все анализируемые препараты усиливали апоптоз костномозговых CD34+ клеток: вортманнин - в виде тенденции, Н7 и ролипрам - достоверно. При этом усиление апоптоза в присутствии Н7 и ролипрама ассоциировалось с тенденцией к снижению количества клеток, находящихся в S/G2M фазах клеточного цикла. При анализе корреляционных связей были выявлены различия модулирующей активности анализируемых веществ. Так, в контрольной группе (без воздействий) и в присутствии вортманнина уровень апоптоза обратно коррелирует с долей G0/G1 клеток. В присутствии Н7 уровень апоптоза обратно коррелирует не только с количеством клеток в G0/G1, но и с индексом соотношения клеток в G0/G1 и S/G2M. Т.е. усиление апоптоза данным модулятором было ассоциировано с изменением клеточного цикла. И хотя ролипрам также достоверно усиливал апоптоз, это не отражалось на соотношении клеток в G0/G1 и S/G2M). Таким образом, из трех препаратов, усиливающих апоптоз, только Н7 при этом оказывал воздействие на клеточный цикл.

Помимо влияния на клеточный цикл, была протестирована активность ингибиторов в отношении регуляции дифференцировки ГСК 24-недельных мышей МЫ,-1ргЛрг с протеинурией, в костном мозге которых отмечается значительное повышение числа эритроидных колоний. Все препараты снижали число КОЕ-Э, при этом воздействие вортманнина и Н7 приводило к достоверному снижению их количества (рис. 14).

Рис. 14. Влияние ингибиторов Р13К (вортманнин), РКС (Н-7) и РОЕ4 (ролипрам) на формирование гемо-поэтических колоний ККМ 24-недельных мышей МЮ.-1ргДрг с протеинурией. 1 - контроль (п=12), 2 - вортманнин (п=12), 3 - Н7 (п=12), 4 - ролипрам (п=12). * - достоверные различия по сравнению с контролем (р<0,05)

Полученные нами данные о коррекции функциональных параметров ГСК при аутоиммунной патологии (мыши МЫ.-1рг/1рг) позволяют предполагать возможность исследования роли стимуляторов апоптоза в терапии АИЗ, в том числе при трансплантациях клеток костного мозга.

Для того чтобы проверить, каким образом изменения функциональной активности ГСК мышей МШАргПрг влияют на поведение ГСК в условиях трансплантации, было проведено восстановление летально облученных реципиентов клетками костного мозга мышей МЯЬ-1рг/1рг, находящихся в стадии манифестации АИЗ. Реципиентам опытных групп трансплантировали равное количество ККМ, инкубированных с каждым из препаратов в течение 3,5 часов. Реципиентам контрольной группы вводили ККМ, инкубированных в тех же условиях в отсутствии препаратов. Поскольку количество доступных для эксперимента животных не позволяло провести сингенную трансплантацию, в качестве реципиентов были выбраны мыши линии С57В1/6. Линия С57В1/6 присутствует в составе генетической основы линии МЯЬ-1рг/1рг, но трансплантация ККМ в таких условиях является аллогенной и связана с риском развития «реакции трансплантат против хозяина», которая может стать причиной гибели животных в эксперименте на 7-20 сутки после трансплантации. В связи с этим мы оценивали, прежде всего, те параметры восстановления кроветворения, которые возможно определить на ранних сроках: количество колониеобразующих единиц селезенки КОЕс8 и колическтво колониеобразующих единиц различных ростков кроветворения в костном мозге реципиентов на 7 сутки после трансплантации ККМ.

Ни один из исследуемых препаратов не оказывал влияния на количество КОЕс-8 (рис. 15). Н7 угнетал колониеобразование всех ростков кроветворения в костном мозге реципиентов. Остальные препараты не оказывали влияния на процесс костномозгового кроветворения (рис. 16). Таким образом, повышение сниженного апоптоза СИ34+ клеток мышей МЯЬ-1рг/1рг с помощью вортманнина и ролипрама не влияет на эффективность репопуляции кроветворных органов при трансплантации ККМ, а сочетание подавления апоптоза и эритроидной дифференцировки с помощью Н7 проявляет в этом отношении негативный эффект.

Рис. 15. Колониеобразование в Рис. 16. Влияние инкубации ККМ с селезенке мышей, облученных и ингибиторами РБК (вортманнин), РКС восстановленных ККМ, мышей (Н-7) и PDE4 (ролипрам) на колоние-MRL-lpr/lpr после инкубации с образующую способность костномозго-ингибиторами PI3K (вортманнин), вых гемопоэтических предшественников РКС (Н-7) и PDE4 (ролипрам), на 7 сутки после трансплантации ККМ

мышей MRL-lpr/lpr. 1 - контроль (п=10), 2 - вортманнин (п=10), 3 -Н7 (п=10), 4-ролипрам (п=10)

Поскольку к 15 суткам после трансплантации все животные в контрольной и опытных группах погибли, не удалось провести оценку динамики восстановления количества клеток периферической крови.

ВЫВОДЫ

1. Низкомолекулярная гиалуроновная кислота из петушиного гребня при внутривенном введении реципиентам в сочетании с сингенной трансплантацией ККМ повышает эффективность хоминга ГСК в костный мозг и селезенку, усиливает гемопоэз и повышает выживаемость реципиентов.

2. Высокомолекулярная гиалуроновная кислота из человеческой пуповины при внутривенном введении реципиентам в сочетании с сингенной трансплантацией ККМ повышает эффективность хоминга ГСК в костный мозг, усиливает костномозговое колониеобразование и ускоряет восстановление числа тромбоцитов в периферической крови в постгрансплантационном периоде.

3. Повышение самоподдержания ГСК, индуцированное вальпроевой кислотой in vitro, вызывает усиление пролиферации гемопоэтических предшественников в кроветворных органах после трансплантации ККМ, но не приводит к ускорению восстановления количества зрелых клеток крови и негативно сказывается на выживаемости реципиентов.

4. Развитию аутоиммунного заболевания у мышей MRL-lpr/lpr предшествует усиление пролиферации CD34+ клеток, процесс развития заболевания сопровождается снижением относительного количества CD34+ клеток в костном мозге и уменьшением процента CD34+ клеток, находящихся в состоянии апоптоза.

5. Н7 и ролипрам стимулируют апоптоз CD34+ клеток мышей MRL-lpr/lpr, при этом Н7 подавляет эритроидную дифференцировку ГСК мышей MRL-lpr/lpr in vitro. Вортманнин подавляет эритроидную дифференцировку, не влияя на апоптоз CD34+ клеток. В условиях трансплантации ККМ, инкубированных с препаратами, Н7 подавляет кроветворение в костном мозге реципиентов, вортманнин и ролипрам не оказывают влияния на этот процесс.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Toporkova LB, Orlovskaya IA, Feofanova NA, Nevinsky GA., 2004, Signal transduction pathways in regulation of hematopoietic stem cell functional activity in autoimmune mice. Progress in fundamental and applied sciences for human health. International Multidisciplinary Congress, Crimea, Ukraine, p. 151.

2. Орловская И.А., Топоркова Л.Б., Феофанова H.A., Невинский Г.А., Козлов В.А., 2005, Внутриклеточные сигнальные пути как мишень для направленной дифференцировки стволовой кроветворной клетки. Тезисы докладов международной конференции «Клинические и фундаментальные проблемы клеточных биотехнологий», Новосибирск, стр. 42.

3. Феофанова Н.А., Топоркова Л.Б., Тихонова М.А., Невинский Г.А., Козлов В.А., Орловская И.А., 2006, Клеточный цикл костномозговых CD34+ клеток в процессе развития аутоиммунного заболевания у мышей MRLMpJ/lpr. Клеточные технологии в биологии и медицине, № 3, стр. 154-156.

4. Феофанова Н.А., Топоркова Л.Б., Тихонова М.А., Черных Е.Р., Невинский Г.А., Козлов В.А., Орловская И.А., 2008, Подходы к коррекции функциональных параметров гемопоэтической стволовой клетки у аутоиммунных мышей MRL lpr/lpr. Бюллетень СО РАМН, № 4 (132), стр. 85-88.

5. Феофанова Н. А., Топоркова Л. Б., Орловская И. А., 2009, PI-киназы в иммунопатологии. Иммунология, №30 (2), стр. 136-139.

6. Феофанова Н.А., Орловская И.А., Козлов В.А., 2009, Гемопоэтические стволовые клетки: характеристика, функциональные свойства, использование в клинической практике. Клеточные технологии: теоретические и прикладные аспекты. Под ред. В.А. Козлова, С.В. Сенникова, Е.Р. Черных, А.А. Останина. Новосибирск, «Наука», стр. 13-25.

7. Feofanova NA, Toporkova LB, Orlovskaya IA., 2009, Pre-treatment of mouse hematopoietic stem cells with valproic acid impairs recovery of hematopoietic system after syngeneic transplantation. World Stem Cell Summit Poster Forum, Baltimore, Maryland, USA, p. 107.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АИЗ — аутоиммунные заболевания ГК - гиалуроновая кислота

ГКг - гиалуроновая кислота из петушиного гребня ГКп - гиалуроновая кислота из человеческой пуповины ГСК - гемопоэтическая стволовая клетка ККМ - клетки костного мозга

КОЕ-ГМ - колониеобразующая единица гранулоцитов-макрофагов КОЕ-ГЭММ - колониеобразующая единица гранулоцитов, эритроцитов, моноцитов/макрофагов, мегакариоцитов

КОЕс-8 - восьмисуточная колониеобразующая единица селезенки

КОЕ-Э - эритроидная колониеобразующая единица

CFSE - carboxyfluorescein succinimidyl ester

GSK3beta - glycogen synthase kinase-3 beta

PDE4 - phosphodiesterase-4

PI3K - phosphoinositid-3-kinase

PKC - proteinkinase С

VPA - valproic acid

Подписано в печать 15.02.2010 Формат - 60x84 1/16. Усл. печ. л. 1,5

Бумага офсетная. Печать офсетная. Тираж: 80 экз. Номер заказа 239. Типография ООО «Альфа Виста», ИНН 5407194969, г. Новосибирск, пр. Димитрова, д. 4

Оглавление диссертации Феофанова, Наталья Александровна :: 2010 :: Новосибирск

ВВЕДЕНИЕ.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. Трансплантация ГСК в клинической практике.

1.1. Источники ГСК для трансплантации в клинической практике.

1.2. Популяционная структура ГСК.

ГЛАВА 2. Функциональная активность ГСК.

2.1. Функциональные характеристики ГСК.

2.2. Регуляция самоподдержания ГСК.

2.3. ГСК и ее микроокружение. Миграция и хоминг ГСК.

2.3.1. Роль гиалуроновой кислоты в гемопоэзе.

ЧАСТЬ II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные.

Реактивы и среды.

Прижизненное мечение клеток костного мозга флуоресцентной меткой СГБЕ.

Мечение антителами, конъюгированными с флюоресцентной меткой

Анализ клеточного цикла.

Определение количества белка в моче.

Облучение животных.

Оценка колониеобразующей активности костного мозга методом полутвердых культур.

Определение количества колониеобразующих единиц селезенки КОЕс.

Определение количества форменных элементов крови.

Статистическая обработка данных.

ЧАСТЬ III. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

ГЛАВА 3. Влияние внутривенного введения гиалуроновой кислоты на эффективность хоминга гемопоэтических предшественников при трансплантации клеток костного мозга.

ГЛАВА 4. Влияние вальпроевой кислоты и ретиноевой кислоты на функциональную активность ГСК при трансплантации клеток костного мозга летально облученным реципиентам.

ГЛАВА 5. Коррекция апоптоза и дифференцировки ГСК мышей MRL-lprApr через воздействия на внутриклеточные сигнальные пути.

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

Введение диссертации по теме "Клиническая иммунология, аллергология", Феофанова, Наталья Александровна, автореферат

Актуальность проблемы

В процессе трансплантации в первую очередь должен произойти хоминг ГСК, этот этап является одним из определяющих факторов успеха трансплантации. Хоминг ГСК протекает с участием хемокинов, молекул адгезии (CXCR4/SDF1, VLA4/VCAM1, LFA-1ЯСАМ-1, CD44/HA, c-kit/KL) и заканчивается "заякориванием" клетки в своей нише. Взаимодействие адгезивного рецептора CD44 с лигандом - гиалуроновой кислотой (ГК) играет важную роль в процессах хоминга и репопуляции кроветворных органов [Legras et al., 1997; Peled et al., 2000; Avigdor et al., 2004]. ГК продуцируется клетками гемопоэтического микроокружения и является одним из важнейших компонентов экстрацеллюлярного матрикса («структурный организатор»). ГК поддерживает адгезию, рост, дифференцировку и регулирует миграцию клеток [Lee, Spicer, 2000]. В условиях тотального облучения организма в кроветворных органах происходит быстрое снижение уровня ГК, нарушение ее синтеза отмечается и под действием химиотерапевтических воздействий [Young et al., 1994; Rehakova et al., 1994]. Таким образом, воздействие на хоминг ГСК посредством модулирования свойств костномозговой ниши с помощью введения гиалуроновой кислоты актуально для совершенствования трансплантационных технологий.

Следующим этапом в процессе трансплантации после закрепленя ГСК в костномозговой нише является пролиферация и дальнейшая дифференцировка в зрелые клеточные элементы. Важно, чтобы в процессе пролиферации не происходило истощения пула ГСК, т.е сохранялась способность ГСК к самоподдержанию. Усиление пролиферативной активности под действием цитокиновых коктейлей in vitro, как правило, ассоциировано с потерей способности к самоподдержанию ГСК [Zandstra et al., 1997, Henschler et al., 1994]. В последние годы были открыты внутриклеточные сигнальные пути, отвечающие за регуляцию самоподдержания ГСК, таке как Notch, Wnt и Hedgehog [Stier et al., 2002; Reya et al., 2003; Bhardwaj et al., 2001], однако возможность управлять ими с помощью фармакологических воздействий на сегодня ограничивается достаточно малым числом известных препаратов. К таким веществам относятся ингибиторы гистондеацетилаз [Young, 2004], ингибиторы GSK3beta [De Felice et al., 2005], ретиноевая кислота [Purton et al., 1999], с помощью которых удается достигнуть существенной экспансии ГСК in vitro. Актуальным является изучение функциональной активности ГСК после стимуляции самоподдержания in vitro в условиях трансплантации, разработка подходов, сочетающих фармакологические воздействия на ГСК с подходами клеточной терапии.

Трансплантацию ГСК в терапии тяжелых аутоиммунных заболеваний (АИЗ) начали применять в конце 1990 годов после ряда успешных преклинических исследований на экспериментальных моделях. В настоящее время становится очевидным, что комбинация иммуносупрессивной терапии с трансплантацией аутологичных стволовых клеток позволяет достичь улучшения в течении АИЗ (системная красная волчанка, рассеянный склероз) [Burt et al., 2008; Jayne et al., 2004; Tyndall, Gratwohl, 2009]. Имеются основания полагать, что АИЗ, наряду с лимфопролиферативными, являются следствием дефекта функциональной активности ГСК. Некоторые авторы рассматривают системные и органоспецифические АИЗ как «болезнь стволовой клетки» (polyclonal hemopoietic stem cell proliferative syndrome) [Ikehara, 2003]. У Fas-дефектных мышей MRL-lpr/lpr нарушен апоптоз иммунокомпетентных клеток, что приводит к появлению большого количества CD4"CD8"-KneTOK с формированием лимфоаденопатии, сопровождаемой продукцией разнообразных аутоантител, иммунных комплексов, а также гломерулонефритом [Nagata et al., 1995, Watanabe-Fukunaga et al., 1992]. В последние годы стало ясно, что Fas/FasL взаимодействия играют существенную роль и в регуляции гемопоэза. У мышей, дефектных по Раз(1рг) и РазЬ^Ш), отмечается значительное увеличение числа гемопоэтических предшественников в периферической крови и селезенке, ГСК мышей МКЬ-1рг/1рг отличаются повышенной радиорезистентностью, изменение их пролиферативно-дифференцировочных потенций проявляется уже на ранней стадии, до клинических проявлений заболевания [1кеЬага, 2001]. Исследование количественных и функциональных характеристик ГСК при аутоиммунной патологии, помимо научного, имеет и клинический интерес, с целью их последующей коррекции, в том числе при оптимизации технологий трансплантации ГСК. Поскольку усиление пролиферативной активности ГСК может быть обусловлено дефектом апоптоза, можно полагать, что коррекция пролиферации и дифференцировки ГСК с помощью воздействий, регулирующих апоптоз, позволит создать условия для более эффективной трансплантации гемопоэтических клеток при аутоиммунной патологии.

Задачи

3. Исследовать параметры восстановления гемопоэза летально облученных реципиентов, восстановленных клетками костного мозга, обработанными вальпроевой и ретиноевой кислотами, усиливающими функцию самоподдержания ГСК.

4. Изучить функциональньные параметры ГСК (пролиферация, апоптоз, дифференцировка) в процессе развития аутоиммунной патологии у мышей МЯГ-1рг/1рг.

5. Исследовать влияние препаратов, стимулирующих апоптоз (вортманнин, ролипрам, Н7), на функциональную активность ГСК у мышей ЪШЬ-1рг/1рг.

Научная новизна

Впервые показано повышение эффективности трансплантации клеток костного мозга (усиление гемопоэза и повышение выживаемости) при внутривенном введении реципиентам гиалуроновой кислоты.

Впервые показано, что в процессе развития аутоиммунного заболевания мышей МКЬ-1рг/!рг происходит изменение функциональных характеристик СБ34+клеток костного мозга: снижается относительное количество С034+ клеток в костном мозге, уменьшается процент СВ34+ клеток, находящихся в состоянии апоптоза.

Впервые показана способность фармакологических стимуляторов апоптоза модулировать функциональную активность ГСК аутоиммунных мышей МИЬ-1рг/1рк усиление апоптоза СБ34+ клеток под действием ингибитора протеинкиназы С (Н7) и ингибитора фосфодиэстеразы 4 (ролипрам), подавление дифференцировки ГСК в эритроидном направлении под действием ингибитора протеинкиназы С (Н7) и ингибитора фосфоинозитид-3-киназы (вортманнин).

Научно-практическая значимость

Положения, выносимые на защиту

2. Стимуляция сниженного апоптоза CD34+ клеток аутоиммунных мышей MRL-lpr/lpr спровождается снижением уровня эритроидной дифференцировки ГСК мышей MRL-Ipr/lpr in vitro до контрольных показателей.

Апробация диссертации

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, определенных ВАК РФ для публикации научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертационного исследования на тему "Влияние факторов экзогенного и эндогенного происхождения на функциональную активность гемопоэтической стволовой клетки в норме и при аутоиммунной патологии"

ВЫВОДЫ

2. Высокомолекулярная гиалуроновная кислота из человеческой пуповины при внутривенном введении реципиентам в сочетании с сингенной трансплантацией ККМ повышает эффективность хоминга ГСК в костный мозг, усиливает костномозговое колониеобразование и ускоряет восстановление числа тромбоцитов в периферической крови в посттрансплантационном периоде.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2010 года, Феофанова, Наталья Александровна

1. Бутомо Н.В., 1970, Трансплантация костного мозга при лучевых поражениях, Медицина, Ленинград, с. 6-8.

2. Зюзьков Г.Н, Жданов В.В., Дыгай A.M., Гольдберг Е.Д., 2007, Роль гиалуронидазы в регуляции гемопоэза, Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 144, 12, 690-695.

3. Орловская И.А., Козлов В.А., Топоркова Л.Б. 2006, Внутриклеточные сигнальные системы в регуляции апоптоза эритроидных клеток, Иммунология, 27(5), 312-316.

4. Топоркова Л.Б., Халдояниди С.К., Орловская И.А., 2008, Механизмы регуляции самоподдержания гемопоэтической стволовой клетки, Успехи современной биологии, 128(5), 458-466.

5. Шиффман Ф.Дж., 2000, Патофизиология крови. Пер. с англ., Москва, Издательство БИНОМ, с. 307-308.

6. Ястребов А.П., Юшков Б.Г., Савельев Л.И., 1991, Роль гликозаминогликанов в регуляции кроветворения при экстремальных воздействиях на организм, патологическая физиология и экспериментальная терапия, 3, 10-12.

7. Akala О.О., Clarke M.F., 2006, Hematopoietic stem cell self-renewal, Curr. Opin. Genet. Dev., 16(5), 496-501.

8. Benbernou N, Muegge K, Durum S.K, 2000, Interleukin IL-7 induces rapid activation of Pyk2, which is bound to Janus kinase 1 and IL-7Ralpha, J. Biol. Chem, 275(10), 7060-7065.

9. Bender J.G, To L.B, Williams S, Schwartzberg L.S, 1992, Defining a therapeutic dose of peripheral blood stem cells, J. Hematother, 1, 329-341.

10. Bhardwaj G, Murdoch B, Wu D, Baker D.P, Williams K.P, Chadwick K, Ling L.E, Karanu F.N, Bhatia M, 2001, Sonic hedgehog induces the proliferation of primitive human hematopoietic cells via BMP regulation, Nat. Immunol, 2(2), 172-180.

11. Bradford G.B, Williams B„ Rossi R, Bertoncello I, 1997, Quiescence, cycling, and turnover in the primitive hematopoietic stem cell compartment, Exp. Hematol, 25(5), 445453.

12. Bradford M.M., 1976, A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem., 7(72), 248-254.

13. Brinck J., Heldin P., 1999, Expression of recombinant hyaluronan synthase (HAS) isoforms in CHO cells reduces cell migration and cell surface CD44, Exp. Cell. Res., 252(2), 342-345.

14. Brown J.A., Boussiotis V.A., 2008, Umbilical cord blood transplantation: basic biology and clinical challenges to immune reconstitution, Clin. Immunol., 127(3), 286-297.

15. Bryder D., Jacobsen S.E., 2000, Interleukin-3 supports expansion of long-term multilineage repopulating activity after multiple stem cell divisions in vitro, Blood, 96(5), 1748-1755.

16. Burt R.K., Loh Y., Pearce W., Beohar N., Barr W.G., Craig R., Wen Y., Rapp J.A., Kessler J., 2008, Clinical applications of blood-derived and marrow-derived stem cells for nonmalignant diseases, JAMA, 299(8), 925-936.

17. Cadigan K.M., Nusse R., 1997, Wnt signaling: a common theme in animal development, Genes Dev., 11(24), 3286-3305.

18. Campbell A.D., Long M.W., Wicha M.S., 1987, Haemonectin, a bone marrow adhesion protein specific for cells of granulocyte lineage, Nature, 329, 744-746.

19. Carlesso N., Aster J.C., Sklar J., Scadden D.T., 1999, Notch 1-induced delay of human hematopoietic progenitor cell differentiation is associated with altered cell cycle kinetics, Blood, 93(3), 838-848.

20. Chang X., Yamada R., Yamamoto K., 2005, Inhibition of antithrombin by hyaluronic acid may be involved in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Arthritis Res. Ther., 7(2), 268-273.

21. Cheng T., Rodrigues N., Shen H., Yang Y., Dombkowski D., Sykes M., Scadden D.T., 2000, Hematopoietic stem cell quiescence maintained by p21cipl/wafl, Science, 287(5459), 1804-1808.

22. Cooper M.D., 2003, Robert A. Good IN MEMORIAM, The Journal of Immunology, 171,6318-6319.

23. Degos L., Wang Z.Y., 2001, All-trans retinoic acid in acute promyelocytic leukemia. Oncogene, 20(49), 7140-7145.

24. Deguchi T., Komada Y., 2000, Homing-associated cell adhesion molecule (H-CAM/CD44) on human CD34+ hematopoietic progenitor cells, Leuk. Lymphoma, 40, 25-37.

25. Del Rosso M., Cappelletti R., Dini G., Fibbi G., Vannucchi S., Chiarugi V., Guazzelli C., 1981, Involvement of glycosaminoglycans in detachment of early myeloid precursors from bone-marrow stromal cells, Biochim. Biophys. Acta, 676(2), 129-136.

26. Delaney C., Varaum-Finney B., Aoyama K. et al., 2005, Dose-dependent effects of the Notch ligand Deltal on ex vivo differentiation and in vivo marrow repopulating ability of cord blood cells, Blood, 106, 2693-2699.

27. Dorshkind K., 1990, Regulation of hemopoiesis by bone marrow stromal cells and their products., Annu. Rev. Immunol., 8, 111-137

28. Douer D., Koeffler H., 1982, Retinoic acid enhances colony-stimulating factor-induced clonal growth of normal human myeloid progenitor cells in vitro, Exp. Cell. Res., 138, 193-198.

29. Duarte R.F., Frank D.A., 2000, SCF and G-CSF lead to the synergistic induction of proliferation and gene expression through complementary signaling pathways, Blood, 96(10), 3422-3430

30. Duester G., 2000, Families of retinoid dehydrogenases regulating vitamin A function: production of visual pigment and retinoic acid, European Journal of Biochemistry, 267, 4315-4324.

31. Duncan A.W., Rattis F.M., DiMascio L.N., Congdon K.L., Pazianos G., Zhao C., Yoon K., Cook J.M., Willert K., Gaiano N., Reya T., 2005, Integration of Notch and Wnt signaling in hematopoietic stem cell maintenance, Nat. Immunol., 6(3), 314-322.

32. Eastman Q., Grosschedl R., 1999, Regulation of LEF-1/TCF transcription factors by Wnt and other signals, Curr. Opin. Cell. Biol., 11(2), 233-240.

33. Elford P.R., Cooper P.H., 1991, Induction of neutrophil-mediated cartilage degradation by interleukin-8, Arthritis Rheum., 34(3), 325-332.

34. Franke K., Pompe T., Bornhäuser M., Werner C., 2007, Engineered matrix coatings to modulate the adhesion of CD 133+ human hematopoietic progenitor cells, Biomaterials, 28(5), 836-843.

35. Fräser J.R., Appelgren L.E., Laurent T.C., 1983, Tissue uptake of circulating hyaluronic acid. A whole body autoradiographic study, Cell. Tissue Res., 233(2), 285293.

36. Gordon M.Y., Riley G.P., Watts S.M., Greaves M.F., 1987, Compartmentalization of a haematopoietic growth factor (GM-CSF) by glycosaminoglycans in the bone marrow microenvironment, Nature, 326, 403-405.

37. Grunstein M., 1997, Histone acetylation in chromatin structure and transcription, Nature, 389(6649), 349-352.

38. Guenechea G., Gan O.I., Dorrell C., Dick J.E., 2001, Distinct classes of human stem cells that differ in proliferative and self-renewal potential, Nat. Immunol., 2(1),75-82.

39. Gurvich N., Tsygankova O.M., Meinkoth J.L., Klein P.S., 2004, Histone deacetylase is a target of valproic acid-mediated cellular differentiation, Cancer Res., 64(3), 10791086.

40. Han Z.C., Bellucci S., Shen Z.X., Maffrand J.P., Pascal M., Petitou M., Lormeau J., Caen J.P., 1996, Glycosaminoglycans enhance megakaryocytopoiesis by modifying the activities of hematopoietic growth regulators, J. Cell. Physiol., 168(1), 97-104.

41. Handgretinger R., Lang P., 2008, The history and future prospective of haplo-identical stem cell transplantation, Cytotherapy, 10(5), 443-451.

42. Harris D.T., Schumacher M.J., Locascio J., Besencon F.J., Olson G.B., DeLuca D., Shenker L., Bard J., Boyse E.A., 1992, Phenotypic and functional immaturity of human umbilical cord blood T lymphocytes, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89(21), 1000610010.

43. Henschler R., Brugger W., Luft T., Frey T., Mertelsmann R., Kanz L., 1994, Maintenance of transplantation potential in ex vivo expanded CD34(+)-selected human peripheral blood progenitor cells, Blood, 84(9), 2898-2903.

44. Hoggatt J., Singh P., Sampath J., Pelus L.M., 2009, Prostaglandin E2 enhances hematopoietic stem cell homing, survival, and proliferation, Blood, 113, 5444-5455.

45. Ikehara S., 2001, Treatment of autoimmune diseases by hematopoietic stem cell transplantation., Exp. Hematol., 29(6), 661-669.73.1kehara S, 2003, A new concept of stem cell disorders and their new therapy, J Hematother. Stem Cell Res, 12(6), 643-653.

46. Jacobsen S.E, 2005, Defining 'sternness': Notch and Wnt join forces?, Nat. Immunol, 6(3), 234-623.

47. Jayne D, Passweg J, Marmont A. et al, 2004, European Group for Blood and Marrow Transplantation, European League Against Rheumatism Registry. Autologous stem cell transplantation for systemic lupus erythematosus, Lupus, 13(3), 168-176.

48. Jenuwein T, Allis C.D, 2001, Translating the histone code, Science, 293(5532), 10741080.

49. Johnson B.S., Mueller L., Si J., Collins S.J., 2002, The cytokines IL-3 and GM-CSF regulate the transcriptional activity of retinoic acid receptors in different in vitro models of myeloid differentiation, Blood, 99, 746-753.

50. Kao H.Y., Downes M., Ordentlich P., Evans R.M., 2000, Isolation of a novel histone deacetylase reveals that class I and class II deacetylases promote SMRT-mediated repression, Genes Dev., 14(1), 55-66.

51. Kawabata K., Ujikawa M., Egawa T., Kawamoto H., Tachibana K., Iizasa H., Katsura Y, Kishimoto T., Nagasawa T., 1999, A cell-autonomous requirement for CXCR4 in long-term lymphoid and myeloid reconstitution, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 96, 5663-5667.

52. Khaldoyanidi S., Denzel A., Zoller M., 1996, Requirement for CD44 in proliferation and homing of hematopoietic precursor cells, J. Leukoc. Biol., 60, 579-592.

53. Klein G., Beck S., Müller C.A., 1993, Tenascin is a cytoadhesive extracellular matrix component of the human hematopoietic microenvironment, J. Cell. Biol., 123, 10271035.

54. Klein G., Müller C.A., Tillet E., Chu M-L., Timpl R., 1995, Collagen type VI in the human bone marrow microenvironment: A strong cytoadhesive component, Blood, 86, 1740-1748.

55. Koenigsmann M., Griffin J.D., DiCarlo J., Cannistra S.A., 1992, Myeloid and erythroid progenitor cells from normal bone marrow adhere to collagen type I, Blood, 79, 657665.

56. Kondo M., Scherer D.C., Miyamoto T., King A.G., Akashi K., Sugamura K., Weissman I.L., 2000, Cell-fate conversion of lymphoid-committed progenitors by instructive actions of cytokines, Nature, 407(6802), 383-386.

57. Kovach N.L., Lin N., Yednock T., Harlan J.M., Broudy V.C., 1995, Stem cell factor modulates activity of a4bl and a5bl integrins expressed on hematopoietic cell lines, Blood, 85(1), 59-167.

58. Kuwata T., Wang I.M., Tamura T., Ponnamperuma R.M., Levine R., Holmes K.L., Morse H.C., De Luca L.M., Ozato K., 2000, Vitamin A deficiency in mice causes a systemic expansion of myeloid cells, Blood, 95, 3349-3356.

59. Lapcik L., De Smedt S., Demeester J., Chabrecek P., 1998, Hyaluronan: Preparation, Structure, Properties, and Applications, Chem Rev., 98(8), 2663-2684.

60. Lapidot T., Dar A., Kollet O., 2005, How do stem cells find their way home?, Blood, 106(6), 1901-1910.

61. Lapidot T., Kollet O., 2002, The essential roles of the chemokine SDF-1 and its receptor CXCR4 in human stem cell homing and repopulation of transplanted immune-deficient NOD/SCID and NOD/SCID/B2m(null) mice, Leukemia, 16, 1992-2003.

62. Lapidot T., Petit I., 2002, Current understanding of stem cell mobilization: the roles of chemokines, proteolytic enzymes, adhesion molecules, cytokines, and stromal cells, Exp. Hematol., 30, 973-981.

63. Lee J.Y., Spicer A.P., 2000, Hyaluronan: a multifunctional, megaDalton, stealth molecule., Curr. Opin. Cell. Biol., 12(5), 581-586

64. Legras S., Levesque J.P., Charrad R., Morimoto K., Le Bousse C., Clay D., Jasmin C., Smadja-Joffe F., 1997, CD44-mediated adhesiveness of human hematopoietic progenitors to hyaluronan is modulated by cytokines, Blood, 89(6), 1905-1914.

65. Levesque J.P., Haylock D.N., Simmons P.J., 1996, Cytokine regulation of proliferation and cell adhesion are correlated events in human CD34/ hemopoietic progenitors, Blood, 88(4), 1168-1176.

66. Levesque J.P., Hendy J., Takamatsu Y., Simmons P.J., Bendall L.J., 2003, Disruption of the CXCR4/CXCL12 chemotactic interaction during hematopoietic stem cell mobilization induced by GCSF or cyclophosphamide, J. Clin. Invest., Ill, 187-196.

67. Levesque J.P., Leavesley D.I., Niutta S., Vadas M., Simmons P.J., 1995, Cytokines increase human hemopoietic cell adhesiveness by activation of very late antigen (VLA)-4 and VLA-5 integrins, J. Exp. Med., 181(5), 1805-1815,

68. Lewis J.L., Marley S.B., Ojo M., Gordon M.Y., 2004, Opposing effect of PI3 kinase pathway activation on human myeloid and erythroid progenitor cell proliferation and differentiation in vitro, Exp. Hematol., 32(1), 36-44.

69. Liang Y., Van Zant G., Szilvassy S.J., 2005, Effects of aging on the homing and engraftment of murine hematopoietic stem and progenitor cells, Blood, 106(4), 14791487.

70. Linker A., Mayer K., 1954, Production of unsaturated uronides by bacterial hyaluronidases, Nature, 25, 174(4443), 1192-1193.

71. Liu B., Buckley S.M., Lewis I.D., Goldman A.I., Wagner J.E., van der Loo J.C., 2003, Homing defect of cultured human hematopoietic cells in the NOD/SCID mouse is mediated by Fas/CD95, Exp. Hematol., 31(9), 824-832.

72. Liu M., Iavarone A., Freedman L.P., 1996, Transcriptional activation of the human p21(WAFl/CIPl) gene by retinoic acid receptor. Correlation with retinoid induction of U937 cell differentiation, J. Biol. Chem., 271, 31723-31728.

73. Locatelli F., Rocha V., Chastang C., Arcese W., Michel G., Abecasis M., Messina C., Ortega J., Badell-Serra I., Plouvier E., Souillet G., Jouet J.P., Pasquini R, Ferreira E.,

74. Gamier F., Gluckman E., 1999, Factors associated with outcome after cord blood transplantation in children with acute leukemia. Eurocord-Cord Blood Transplant Group, Blood, 93(11), 3662-3671.

75. Long M.W., Dixit V.M., 1990, Thrombospondin functions as a cytoadhesion molecule for human hematopoietic progenitor cells, Blood, 75, 2311-2318.

76. Ma, Q., Jones, D., Springer, T.A., 1999, The chemokine receptor CXCR4 is required for the retention of lineage and granulocytic precursors within the bone marrow microenvironment, Immunity, 10, 463-471.

77. Mackay I.R., 2009, Clustering and commonalities among autoimmune diseases, J. Autoimmun., 33(3-4), 170-177.

78. Madhusudhan T., Majumdar S.S., Mukhopadhyay A., 2004, Degeneration of stroma reduces retention of homed cells in bone marrow of lethally irradiated mice. Stem Cells Dev., 13(2), 173-182.

79. McQuibban G.A., Butler G.S., Gong J.H., Bendall L., Power C., Clark-Lewis I., Overall C.M., 2001, Matrix metalloproteinase activity inactivates the CXC chemokine stromal cell-derived factor-1, J. Biol. Chem., 276,43503-43508.

80. Moore K.A., Lemischka I.R., 2006, Stem cells and their niches, Science, 311(5769), 1880-1885.

81. Myklebust J.H., Smeland E.B., Josefsen D., Sioud M, 2000, Protein kinase C-alpha isoform is involved in erythropoietin-induced erythroid differentiation of CD34(+) progenitor cells from human bone marrow, Blood, 95, 510-518.

82. Nagata S., Suda T, 1995, Fas and Fas ligand: lpr and gld mutations, Immunol. Today, 16,39-43.

83. Necas E., 1985, Stem cells: an autonomous cell producing system, Leuk. Res., 9(9), 1209-1212.

84. Nishida Y., Knudson W., Knudson C.B., Ishiguro N., 2005, Antisense inhibition of hyaluronan synthase-2 in human osteosarcoma cells inhibits hyaluronan retention and tumorigenicity, Exp. Cell. Res., 307(1), 194-203.

85. Newman P.J., 1997, The biology ofPECAM-1, J. Clin. Invest., 99(1), 3-8.

86. Oostendorp R.A., Ghaffari S., Eaves C.J., 2000, Kinetics of in vivo homing and recruitment into cycle of hematopoietic cells are organ-specific but CD44-independent, Bone Marrow Transplant., 26, 559-566.

87. Papayannopoulou T., Nakamoto B., 1993, Peripheralization of hemopoietic progenitors in primates treated with anti-VLA4 integrin, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90, 9374-9378.

88. Parish C.R, Warren H.S, 2001, Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation, Current protocols in immunology, John Wiley & Sons Inc. Hoboken, New Jersey, USA, Unit 4.9.1.

89. Peled A, Petit I, Kollet O, Magid M, Ponomaryov T, Byk T, Nagler A, Ben-Hur H, Many A, Shultz L, Lider O, Alon R, Zipori D, Lapidot T, 1999, Dependence of human stem cell engraftment and repopulation of NOD/SCID mice on CXCR4, Science, 283, 845-848.

90. Pemrick S.M, Lucas D.A, Grippo J.F, 1994, The retinoid receptors, Leukemia, 8, 1797-1806.

91. Pilarski L.M, Pruski E, Wizniak J, Paine D, Seeberger K, Mant M.J, Brown C.B, Belch A.R, 1999, Potential role for hyaluronan and the hyaluronan receptor RHAMMin mobilization and trafficking of hematopoietic progenitor cells, Blood, 93(9), 29182927.

92. Powell J.L., Hingorani P., Grupp S.A., Kolb E.A., 2009, Hematopoietic Stem Cell Transplantation, URL: http://emedicine.medscape.com/article/991032-overview

93. Prehm P., 1989, Identification and regulation of the eukaryotic hyaluronate synthase, Ciba Found. Symp., 143,21-30.

94. Purton L.E., Bernstein I.D., Collins S.J., 2000, All-trans retinoic acid enhances the long-term repopulating activity of cultured hematopoietic stem cells, Blood, 2000, 95(2), 470-477.

95. Rehakova M., Bakos D., Soldán M., Vizarova K., 1994, Depolymerization reactions of hyaluronic acid in solution, Int. J. Biol. Macromol., 16(3), 121-124.

96. Reya T., Duncan A.W., Ailles L., Domen J., Scherer D.C., Willert K., Hintz L., Nusse R., Weissman I.L., 2003, A role for Wnt signalling in self-renewal of haematopoietic stem cells, Nature, 423(6938), 409-414.

97. Roberts R., Gallagher J., Spooncer E., Allen T.D., Bloomfield F., Dexter T.M., 1988, Heparan sulphate bound growth factors: a mechanism for stromal cell mediated haemopoiesis. Nature, 332, 376-378.

98. Sable C.A., Donowitz G.R., 1994, Infections in bone marrow transplant recipients, Clin. Infect. Dis., 18(3), 273-281.

99. Sato T., Laver J.H., Ogawa M., 1999, Reversible expression of CD34 by murine hematopoietic stem cells, Blood, 94(8), 2548-2554.

100. Scheller M., Huelsken J., Rosenbauer F., Taketo M.M., Birchmeier W., Tenen D.G., Leutz A., 2006, Hematopoietic stem cell and multilineage defects generated by constitutive beta-catenin activation, Nat. Immunol., 7(10), 1037-1047.

101. Schlaepfer D.D., Hanks S.K., Hunter T., Van Der Geer P., 1994, Integrin-mediated signal transduction linked to ras pathway by GRB2 binding to focal adhesion kinase, Nature, 372, 786.

102. Shpall E.J., Quinones R., Giller R. et al., 2002, Transplantation of ex vivo expanded cord blood, Biol. Blood Marrow Transplant., 8,368-376.

103. Shyjan A.M., Heldin P., Butcher E.C., Yoshino T., Briskin M.J., 1996, Functional cloning of the cDNA for a human hyaluronan synthase, J. Biol. Chem., 271(38), 2339523399.

104. Si J., Collins S.J., 2002, IL-3-induced enhancement of retinoic acid receptor activity is mediated through Stat5, which physically associates with retinoic acid receptors in an IL-3-dependent manner, Blood, 100(13), 4401-4409.

105. Siczkowski M., Andrew T., Amos S., Gordon M.Y., 1993, Hyaluronic acid regulates the function and distribution of sulfated glycosaminoglycans in bone marrow stromal cultures, Exp. Hematol., 21(1), 126-130.

106. Simmons P.J., Masinovsky B., Longenecker B.M., Berenson R., Torok-Storb B., Gallatin W.M., 1992, Vascular cell adhesion molecule-1 expressed by bone marrow stromal cells mediates the binding of hematopoietic progenitor cells, Blood, 80, 388395.

107. Simmons P.J., Torok-Storb B., 1991, CD34 expression by stromal precursors in normal human adult bone marrow, Blood, 78(11), 2848-2853.

108. Socinski M.A., Cannistra S.A., Elias A., Antman K.H., Schnipper L., Griffin J.D., 1988, Granulocyte-macrophage colony stimulating factor expands the circulating haemopoietic progenitor cell compartment in man, Lancet, 1(8596), 1194-1198.

109. Spessotto P., Rossi F.M., Degan M., Di Francia R., Perris R, Colombatti A., Gattei V., 2002, Hyaluronan-CD44 interaction hampers migration of osteoclast-like cells by down-regulating MMP-9, J. Cell Biol., 158(6), 1133-1144.

110. Spicer A.P., McDonald J.A., 1998, Characterization and molecular evolution of a vertebrate hyaluronan synthase gene family, J. Biol. Chem., 273(4), 1923-1932.

111. Spicer A.P., Olson J.S., McDonald J.A., 1997, Molecular cloning and characterization of a cDNA encoding the third putative mammalian hyaluronan synthase, J. Biol. Chem., 272(14), 8957-8961.

112. Stier S., Cheng T., Dombkowski D., Carlesso N., Scadden D.T., 2002, Notchl activation increases hematopoietic stem cell self-renewal in vivo and favors lymphoid over myeloid lineage outcome, Blood, 99(7), 2369-2378.

113. Tajima F., Deguchi T., Laver J.H., Zeng H., Ogawa M., 2001, Reciprocal expression of CD38 and CD34 by adult murine hematopoietic stem cells, Blood, 97(9), 2618-2624.

114. Tammi M.I., Day A.J., Turley E.A., 2002, Hyaluronan and homeostasis: a balancing act, J. Biol. Chem., 277(7), 4581-4584.

115. Thomas E.D., Lochte H.L., Lu W.C., Ferrebee J.W., 1957, Intravenous infusion of bone marrow in patients receiving radiation and chemotherapy, N. Engl. J. Med., 257, 491-496.

116. Till J.E., McCulloch E.A., Siminovitch L., 1964, A stochastic model of stem cell proliferation, based on the growth of spleen colony-forming cells, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 51,29-36.

117. Tohda S., Minden M.D., McCulloch E.A., 1991, Interactions between retinoic acid and colony-stimulating factors affecting the blast cells of acute myeloblasts leukemia, Leukemia, 5, 951-957.

118. Tsiganos C.P., Hardingham T.E., Muir H., 1972, Aggregation of cartilage proteoglycans, Biochem. J., 128(4), 121.

119. Tyndall A., Gratwohl A., 2009, Adult stem cell transplantation in autoimmune disease, Curr. Opin. Hematol., 16(4), 285-291.

120. Uchida N., Tsukamoto A., He D., Friera A.M., Scollay R., Weissman I.L., 1998, High doses of purified stem cells cause early hematopoietic recovery in syngeneic and allogeneic hosts, J. Clin. Invest., 101(5), 961-966.

121. Vermeulen M., Le Pesteur R., Gagnerault M.C., Mary J.Y, Sainteny R., Lepault R., 1998, Role of adhesion molecules in the homing and mobilization of murine hematopoietic stem and progenitor cells, Blood, 92, 894-900.

122. Wang X., Hisha H., Cui W. et al., 2007, The characteristics of hematopoietic stem cells from autoimmune-prone mice and the role of neural cell adhesion molecules in abnormal proliferation of these cells in MRL/lpr mice, Haematologica, 92, 300-307.

123. Watanabe K., Yamaguchi Y., 1996, Molecular identification of a putative human hyaluronan synthase, J. Biol. Chem., 271(38), 22945-22948.

124. Watanabe-Fukunaga R., Brannan C.I., Copeland N.G., Jenkins N.A., Nagata S., 1992, Lymphoproliferation disorder in mice explained by defects in Fas antigen that mediates apoptosis, Nature, 356, 314-317.

125. Young A.V., Hehn B.M., Cheng K.M., Shah R.M., 1994, A comparative study on the effects of 5-fluorouracil on glycosaminoglycan synthesis during palate development in quail and hamster. Histol. Histopathol., 9(3), 515-523.101

126. Young J.C., Wu S., Hansteen G., Du C., Sambucetti L., Remiszewski S., O'Farrell A.M., Hill B., Lavau C., Murray L.J., 2004, Inhibitors of histone deacetylases promote hematopoietic stem cell self-renewal, Cytotherapy, 6, 328-336.

127. Zandstra P.W., Conneally E., Petzer A.L., Piret J.M., Eaves C.J., 1997, Cytokine manipulation of primitive human hematopoietic cell self-renewal, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 94(9), 4698-4703.

128. Zhang P., Behre G., Pan J., Iwama A., Wara-Aswapati N., Radomska H.S., Auron P.E., Tenen D.G., Sun Z., 1999, Negative cross-talk between hematopoietic regulators: GATA proteins repress PU.l, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 96(15), 8705-8710.

129. Zhang Z., Vuori K., Reed J.C., Ruoslahti E., 1995, The alfa 5 betal integrin supports survival of cells on fibronectin and up-regulates Bcl-2 expression, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92(13), 6161-6165.

130. Zuckerman K.S., Wicha M.S., 1983, Extracellular matrix production by the adherent cells of long-term murine bone marrow cultures, Blood, 61, 540-547.

Оглавление диссертации Феофанова, Наталья Александровна :: 2010 :: Новосибирск

Введение диссертации по теме "Клиническая иммунология, аллергология", Феофанова, Наталья Александровна, автореферат

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2010 года, Феофанова, Наталья Александровна

Похожие научные работы

Каталог диссертаций