Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Роль эндогенных стволовых и прогениторных клеток в патогенезе пневмофиброза и антифибротическом эффекте резерпина (экспериментальное исследование)

КРУПИН ВЯЧЕСЛАВ АНДРЕЕВИЧ

РОЛЬ ЭНДОГЕННЫХ СТВОЛОВЫХ И ПРОГЕНИТОРНЫХ КЛЕТОК В ПАТОГЕНЕЗЕ ПНЕВМОФИБРОЗА И АНТИФИБРОТИЧЕСКОМ ЭФФЕКТЕ РЕЗЕРПИНА

(экспериментальное исследование)

14.03.03 - Патологическая физиология 14.03.06 - Фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 8 НОЯ 2013

Томск - 2013

005540278

005540278

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор, Дыгай Александр Михайлович академик РАМН, заслуженный деятель науки РФ

доктор медицинских наук, профессор Скурихин Евгений Германович

Официальные оппоненты:

Шерстобоев Евгений Юрьевич, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, лаборатория им-мунофармакологии, заведующий лабораторией

Ваизова Ольга Евгеньевна, доктор медицинских наук, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра фармакологии, профессор кафедры

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт физиологии и фундаментальной медицины» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Защита состоится «У9» ьоь-зухЗ 2013 г. в 5 часов на заседании диссертационного совета Д 001.031.01. при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Автореферат разослан «/?» ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук

Амосова Евдокия Наумовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Идиопатический фиброз лёгкого (ИФЛ) является хроническим прогрессирующим заболеванием неизвестной этиологии. Прогноз ИФЛ в большинстве своём неблагоприятный, состояние пациентов ухудшается быстрыми темпами. Продолжительность жизни с момента постановки диагноза составляет от 2 до 4 лет. Существующий набор лечебных мероприятий для лёгочного фиброза ограничен и не эффективен. Клиническая практика сосредоточена преимущественно на лечении осложнений и поддерживающей терапии [Khalil N. et al., 2004; Horowitz J.C. et al., 2006; Kim D.S. et at., 2006; Meltzer E.B. et al., 2008].

В последнее время огромное внимание уделяется такому направлению лечения, как терапия стволовыми клетками (СК) [Siniscalco D. et al., 2008; Uccelli A. et al., 2008]. Трансплантация гемопоэтических СК (ГСК) используется для лечения Т-клеточного лейкоза у взрослых, лимфомы, множественной миеломы и др. Известны случаи лечения донорскими мезенхимальными СК (МСК) нейродегенеративных и гастроинтерстициальных заболеваний, инфарктов и инсультов, лейкозов, лимфом, реакции «трансллант против хозяина», диабета, костных (хрящевых) заболеваний [Trounson A., et al., 2011]. Клеточная терапия с использованием СК мезенхимального происхождения рассматривается как перспективный подход лечения хронических заболеваний лёгких, в том числе, лёгочного фиброза [Ortiz L.A. et al., 2003; Loebinger M.R. et al., 2008; Siniscalco D. et al., 2008; Moodley Y. et al., 2009; Shukla M.N. et al., 2009].

Помимо лечебных эффектов донорские СК оказывают неспецифическое иммуносупрессивное действие. У пациентов, получающих МСК-терапию, повышается риск развития вирусных, грибковых и бактериальных инфекционных заболеваний, аллергических реакций [Benjamin D.K. et al., 2002; Engelhard D. et al., 2002]. Возможен рецидив лейкоза в связи с ослаблением реакции «трансплантат против лейкоза» [Horowitz M. M. et al., 1990]. В клинике для клеточной терапии применяются прекультивированные мононукле-ары. В некоторых случаях это может привести к изменению фенотипа и функций СК [Banfi A. et al., 2000; 2002], в том числе, приобретению неопластических свойств [Lalu М.М. et al., 2012]. Выделенные из костного мозга реципиентов МСК в различные сроки после трансплантации демонстрируют черты частичного, а чаще, полного химеризма [Lee S.T. et al., 2002; Le Blanc К. et al., 2007]. Существуют данные о достаточно большой вариабельности иммуномодулирующих свойств МСК [Tse W.T. et al., 2003]. Ряд авторов придерживается мнения, что эффекты трансплантированных МСК связаны с па-ракринными механизмами [Kang S.K. et al., 2012]. В этой связи можно говорить о том, что при клеточной терапии донорские МСК не реализуют свой регенераторный потенциал.

До настоящего времени не ясно, с какими из СК связаны лечебные эффекты клеточной терапии. Отдельно взятые клоны МСК отличаются друг от друга по экспрессии генов, фенотипу, способности к дифференцировке и экспансии [Muraglia A. et al., 2000; Tremain N. et al., 2001]. Такая нестабильность эффектов клеточной терапии, отсутствие стандартизированных и эф-

фективных методов получения достаточного количества клеточного материала с заданными свойствами для трансплантации выступают серьёзным препятствием для развития терапии СК [Garcia-Castro J. et al, 2008]. Есть сомнения в том, что индуцированные донорские плюрипотентные СК взрослого организма эквивалентны эмбриональным СК по свойствам [Robinton D.A. et al., 2012]. Вышеизложенные негативные эффекты трансплантации предопределили поиск новых подходов лечения стволовыми клетками.

Практически во всех органах и тканях существуют так называемые регионарные СК (РСК) [Meirelles L.S. et al., 2006; Prunet-Marcassus В. et al., 2006; Krampera M. et al., 2007]. Фармакологическая модуляция функций РСК может явиться более безопасным методом лечения многих хронических заболеваний по сравнению с трансплантацией СК. Однако на сегодняшний день роль РСК различных тканей и органов в патогенезе хронических заболеваний и процессах регенерации остаётся малоизученной. Это затрудняет разработку тактики медикаментозного лечения с использованием средств, модулирующих функции эндогенных СК взрослого организма.

Ряд исследователей связывают синтез коллагеновых волокон в лёгких с активностью адренергической системы [Berg R.A. et al., 1981; Giri S.N. et al., 1987]. Островки нейроэндокринных клеток ткани легких секретируют биогенные амины и пептиды, регулирующие рост эпителиоцитов в норме и при патологии [Polak J.M. et al., 1993; Lauweiyns J.M. et al.,1997; Reynolds S.D. et al., 2000]. Исходя из этого, возникло предположение о том, что соединения, модулирующие активность адренергической системы, могут влиять на фиб-рогенез в лёгких.

Принимая во внимание вышеизложенное, представляет несомненный интерес изучение роли костномозговых и регионарных СК, а также прогениторных клеток гемо- и мезенхимопоэза в патогенезе токсического пневмофиброза. Исследование актуально и с той точки зрения, что оно позволит оценить целесообразность коррекции фиброгенеза симпатолитиком.

Цель исследования. Изучить роль эндогенных стволовых и прогениторных клеток различных классов взрослого организма в развитии пневмофиброза. Дать патогенетическую оценку целесообразности применения сим-патолитика в коррекции фиброзного заболевания лёгких.

Задачи исследования:

1. Изучить состояние гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток в условиях блеомицин-индуцированного пневмофиброза.

2. Оценить функциональную активность костномозговых и регионарных мезенхимальных стволовых и прогениторных клеток при фиброзе лёгких.

3. В условиях введения блеомицина исследовать возможность коррекции резерпином воспалительной реакции и фиброгенеза в лёгких.

4. Изучить действие резерпина на костномозговые и регионарные стволовые и прогениторные клетки гемо- и мезенхимопоэза при пневмофиброзе.

Научная новизна работы. В работе изучена роль эндогенных стволовых и прогениторных клеток гемопоэтического и мезенхимального происхождения взрослого организма в развитии блеомицин-индуцированного воспаления и фиброгенеза в лёгких у мышей линии C57BL/6. Продемонстрировано, что одновременно с инфильтрацией интерстиция альвеол и альвеолярных ходов воспалительными клетками (лимфоциты, плазматические клетки, макрофаги и нейтрофилы) отмечается лейкоцитоз в периферической крови и гиперплазия костномозгового гемопоэза. Причиной системного увеличения количества морфологически распознаваемых гемопоэтических клеток (костный мозг, кровь, лёгкие) выступает стимуляция ГСК (Lin~, Sca-1+, c-Kit+, CD34") и прогениторных CD45+-клеток (формирующих гранулоцито-эритроидно-макрофагально-мегакариоцитарные, гранулоцитарные и эритро-идные колонии) костномозгового происхождения с последующей их мобилизацией в кровь. Фибротическая фаза пневмофиброза характеризуется экспансией лёгких прогениторными СЭ45'-клетками с высокой клональной активностью (образование фибробластных колоний) и МСК (CD31, CD34", CD45", CD441", CD73+, CD90+, CD106+), интенсивно дифференцирующимися в фиб-робластные клетки. Кроме этого, в костном мозге и крови выявлено существенное повышение числа фибробластных предшественников и прилипающих к пластику клеток, демонстрирующих МСК-подобный фенотип.

Показано, что в условиях введения блеомицина симпатолитик резерпин снижает интенсивность деструктивных процессов в лёгких мышей, уменьшает инфильтрацию интерстиция альвеол и альвеолярных ходов воспалительными клетками и интенсивность отложения коллагеновых волокон в паренхиме.

Выявлено влияние резерпина на гемопоэтические и мезенхимальные стволовые и прогениторные клетки при пневмофиброзе. В фазу воспаления симпатолитик уменьшает количество костномозговых и циркулирующих в крови колониеобразующих единиц (КОЕ) гранулоцито-эритроидно-макрофагально-мегакариоцитарного и 1ранулоцитарного типа, снижает функциональную активность (дифференцировку в прогениторные гранулоцитарные клетки) ГСК костного мозга. В фазу интенсивного отложения коллагеновых волокон в паренхиме лёгких резерпин угнетает дифференцировку лёгочных МСК в направлении фибробластоподобных клеток и понижает клональную активность прогениторных СГ)45"-клеток в костном мозге, крови и лёгких.

Практическое значение работы. Продемонстрирована реакция морфологически распознаваемых клеток периферической крови и костного мозга в условиях интратрахеального введения блеомицина. Определена роль эндогенных СК и прогениторных клеток гемо- и мезенхимопоэза взрослого организма в патогенезе пневмофиброза. Полученные данные вносят существенный вклад в понимание клеточных механизмов индукции и развития воспалительной реакции в интерстиции легких, а также фиброгенеза и могут слу-

жить основой для создания новых более эффективных методов диагностики и терапии ИФЛ.

Материалы исследования эффектов и механизмов действия симпатоли-тика резерпина можно использовать при разработке нового метода терапии ИФЛ стволовыми клетками, основанного на избирательной модуляции функций эндогенных стволовых и прогениторных клеток взрослого организма с помощью нейро-фармакологических агентов.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на II Российском конгрессе с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины: возможное и реальное» (Санкт-Петербург, 2012), IV съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012), 5th International Conference on Drug Discovery & Therapy (Dubai, 2013), 6th Annual World Congress of Regenerative Medicine & Stern Cell (Dalian, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 1 статья в иностранном журнале и 3 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ. Получен 1 патент (RU) на изобретение № 2479312 «Средство, обладающее противовоспалительным и антифибротическим действием в лёгочной ткани при ци-тостатическом воздействии» (опубл. 20.04.2013, Бюл. №11).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста, иллюстрирована 11 рисунками, 12 таблицами и состоит из введения, 4 глав, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 341 источника, из них 27 отечественных и 314 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на 590 мышах-самцах линии C57BL/6 в возрасте 8-10 недель. Животные 1 категории (конвенциональные линейные мыши) получены из питомника ФГБУ «Научно-исследовательский институт фармакологии им. Е.Д. Гольдберга» СО РАМН (сертификат имеется). Содержание животных и дизайн экспериментов были одобрены этическим комитетом ФГБУ «НИИ фармакологии им. Е.Д. Гольдберга» СО РАМН.

Для моделирования пневмофиброза использовали блеомицин (Blenoxane®; «Säo Paulo», Бразилия), который непосредственно перед применением растворяли в 30 мкл стерильного физиологического раствора и вводили однократно интратрахеально в дозе 80 мкг/мышь.

Для исследования действия резерпина («Sigma», США) на костномозговые и регионарные стволовые и прогениторные клетки гемо- и мезенхимо-поэза симпатолитик вводили внутрибрюшинно в дозе 1 мг/кг в 100 мкл стерильного физиологического раствора на 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 9-е сут после инъекции блеомицина. На 3, 7, 14, 21, 25, 40, 60-е сут после введения блеомицина

проводили забор материала: костный мозг, периферическая кровь, легкие.

Животным контрольных групп во всех сериях экспериментов в аналогичных условиях вводили эквивалентный объем физиологического раствора. Фоновые показатели получали при использовании интактных животных.

Гистологическое исследование ткани легких выполняли по стандартной методике, окрашивали гематоксилин-эозином, азур-эозином и пикрофукси-ном по Ван-Гизону [Лилли Р., 1969; Меркулов Г.А., 1969]. Клеточный состав периферической крови и костного мозга определяли стандартными гематологическими методами [Гольдберг Е.Д. и др., 1992]. Определение экспрессии мембранных рецепторов анализировали с использованием мышиных мо-ноклональных антител («BD Biosciences», США). Клональную активность CD45"- и CD45+-mieTOK определяли клональными методами в нашей модификации [Ventura G.J. et al., 1990; Гольдберг Е.Д. и др., 1992]. Исследовали формирование колониеобразующих единиц недифференцированного (КОЕ-Н), гранулоцито-эритроидно-макрофагально-мегакариоцитарного (КОЕ-ГЭММ), гранулоцитарного (КОЕ-Г), эритроидного (КОЕ-Э) и фиб-робластного (КОЕ-Ф) типа. Дополнительно методом лимитирующих разведений определяли количество костномозговых и циркулирующих в крови С045+-мононуклеаров, способных формировать КОЕ-Н [Ventura G.J. et al., 1990]. В условиях длительного культивирования оценивали способность МСК легких к самоподдержанию [Mensing N. et al., 2011; Скурихин Е.Г. и др., 2012]. Изучали дифференцировку МСК легких в клетки стромальных линий: остеобласты, адипоциты, хондроциты и фибробласты [Скурихин Е.Г. и др., 2012; Pershina О., Skurikhin Е., Khmelevskaya Е., 2012]. Статистическую обработку полученных результатов проводили методами вариационной статистики с использованием программы статистики SPSS 12.0. Вычисляли среднее арифметическое (X), ошибку среднего арифметического (ш), значение вероятности (Р). Различие двух сравниваемых величин считали достоверным в том случае, если вероятность их тождества была меньше 5% (Р<0,05). В случаях нормального распределения признаков для статистической оценки применяли параметрический t-критерий Стьюдента, при больших отклонениях распределений признака от нормального вида - непарамат-рический U-критерий Уилкоксона [Гланц С., 1999; Гмурман В.Е., 2002].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе настоящего исследования проанализировано распределение стволовых и прогениторных клеток в костном мозге, крови и лёгких у мышей интактного контроля, при этом был использован подход, предложенный L.S. Meirelles и соавт. (2006). Поверхностные маркеры ГСК, МСК, прогениторных фибробластных и пан-гемопоэтических клеток всех исследованных тканях представлены в таблице 1. Исходя из изложенного, не исключается участие этих клеток в патогенезе пневмофиброза. Решению данной задачи был посвящен второй этап исследования.

Таблица 1

Стволовые и прогениторные клетки в костном мозге, крови и лёгких у интактных мышей линииС57В176_________

Мезенхимальные СК СОЗГ, СХ)34', С045~, С044+, СП73+, С090\ СШОб"

Прогениторные фибробластные клетки СЭ45~

Гемопоэтические СК ЫгГ, 5са-1+, с-Ки\ С034"

Пан-гемопоэтические клетки С1)45+

В классическом понимании токсический пневмофиброз - это поражение альвеолярного эпителия с последовательно развивающимися воспалением и фиброгенезом в паренхиме лёгких. Это было подтверждено результатами ги-стопатологических исследований лёгких мышей, получавших блеомицин. Так, на 3-й сут опыта отмечались венозное полнокровие в стенках альвеол, отёк эпителия межальвеолярных перегородок и воспалительная инфильтрация лёгочной ткани лимфоцитами, макрофагами и плазмоцитами, с преимущественной локализацией вокруг крупных сосудов и бронхов. На 7-е сут гиперемия и отек усиливались, повышалась интенсивность клеточной инфильтрации стенок альвеол, что приводило к их утолщению. В просвете альвеол появлялись плазматические клетки, нейтрофильные и эозинофильные лейкоциты, альвеолярные макрофаги, гистиоциты. К 14-м сут усиление отека и нарастающая диффузная инфильтрация лёгочного интерстиция и альвеолярных ходов воспалительными клетками приводила к значительному нарушению гисто-архитектоники лёгочной ткани. Стенки альвеол значительно утолщались по сравнению с 7-ми сут, а их просвет заполнялся слущенными альвеоцитами и клетками инфильтрата. У корня лёгкого встречались участки, где лёгочный рисунок отсутствовал за счёт массивной воспалительной инфильтрации. Нарушение структуры стенок альвеол приводило к образованию альвеолярных кист, что являлось начальным этапом формирования так называемого «сотового легкого». Своей максимальной активности воспаление достигало на 21-е сут опыта (рис. 1).

Отложение коллагеновых волокон в лёгочной ткани животных наблюдалось на 7 - 60-е сут после введения блеомицина (рис. 1, 2). На 7-е сут эксперимента соединительная ткань располагалась в основном периваскулярно и перибронхиально, к 14-м сут имело место диффузное распространение фибротических масс, отёк ткани усиливался, в альвеолах появлялся серозно-фибринозный экссудат, повышалось количество слущенных альвеоцитов и клеток инфильтрата. У корня лёгкого регистрировались участки, где лёгочный рисунок отсутствовал полностью. В бронхиолах образовывались мелкие кисты, разрушалась структура альвеол. На 25-е сут завершалось формирование «сотового лёгкого». Отложение соединительной ткани продолжалось и в более поздние сроки эксперимента: на 40, 60-е сут. Наибольшее депонирование волокон коллагена в паренхиме лёгких наблюдалось на 25-е сут после инсталляции блеомицина (530% по отношению к показателю у интактных мышей, р < 0,05) (рис. 2).

МШЕвиа

Рисунок 1. Морфологическая картина лёгких мышей линии С57ВЬ/6 на 21-е сут исследования. А, Г — мыши интактного контроля. Б, Д - мыши, получавшие блеомицин, В, Е — мыши, получавшие блеомицин и резерпин. А. Б, В — окраска гематоксилином и эозином, ув. ХЮ0. Г, Д, Е -окраска пикрофуксином по Ван-Гизону. ув. хЮО.

Рисунок 2. Динамика содержания соединительной ткани (% от общей площади ткани) в легких у мышей линии С57В1/6 в условиях интратрахе-ального введения блеомицина.

Показано, что после введения блеомицина инфильтрация лёгких клетками воспаления сопровождается высокой активностью костномозгового гемо-поэза и лейкоцитозом в периферической крови. Хронологически этому предшествует и/или сопутствует усиление клональной активности СБ45 -клеток костного мозга (формирование КОЕ-Н, КОЕ-ГЭММ, КОЕ-Г, КОЕ-Э) (рис. 3). Примечательно, что количество костномозговых ГСК у больных мышей не отличается от показателя в интактном контроле.

Клональная активность циркулирующих в крови С045+-клеток возрастала позднее, чем у мононуклеаров костного мозга: отмечался рост преимущественно КОЕ-Н (14-е сут) и КОЕ-ГЭММ (7-е сут), незначительно - КОЕ-Э (7-е сут) (рис. 3).

Следует отметить, что блеомицин уменьшал число ГСК в лёгких и не влиял на содержание пан-гемопоэтических клеток (СП45+).

Содержание КОЕ-Н в костном мозге

■ □ Интактный

■ контроль

2 2 " £ ! ■ Блеомшигн

1 ІіГ ............................................

1 1 ю = £

— 0 х и ■ ■ Ґ-В ■ 7 м :і Сроки исследования, сутки

Содержание КОЕ-Н в крови

40

Р Интактный контроль — ■ Блеомицин Щ!

3. I" 1

= £20 ■ ■

§ 2 10 ■ Л

ж 0 - ---

.> 1 14 21

Сроки исследования, о іки

Содержание КОЕ-ГЭММ в костном мозге

12

__□ Интактныи контроль

■ Блеомгашн

Сроки исследования. сутки

Содержание КОЕ-ГЭММ в крови

3 (г; і □ Интактный контроль ■Блеомишін

1 V''

= 3 05 . ....... ..................

1

3 14 21

Сроки исследования, сутки

Содержание КОЕ-Г в костном мозге

□ Интактный контроль

Сроки исследования, сутки

Содержание КОЕ-Э в костном мозге

5 * 25 і

0 с

іі І" 20 І

З ^ 15 4-

1 І 10 і •і І < і.

■■ ■ Блео:

І........ГИ................п

□ Интактный контроль ■ Блеомицин

■

14 21

Сроки исследования, сутки

5 7

В 5 б

I І5

І Р 4 I I 2

Содержание КОЕ-Г в крови

□ Интактный контроль

■Блеомишін

х °'8 §• 0,7

5 О 0,6 £ « 0/5

~ О

І 2 0,4 - Ьо,з

I — 0,2 ■Г 1 0.1

Сроки исследования, сутки

Содержание КОЕ-Э в крови

□ Интактный контроль

_........._...............-..................................._

Сроки исследования, сутки

Рисунок 3. Клональная активность (формирование КОЕ-Н, КОЕ-ГЭММ, КОЕ-Г, КОЕ-Э) С045+-клеток костного мозга и крови у мышей линии С57В176 в условиях интратрахеаль-ного введения блеомицина.

Представленные результаты цитометрических и культуральных исследований позволили нам предположить, что гемопоэтические стволовые и прогениторные клетки костного мозга вовлекаются в патогенез пневмофиб-роза. В качестве механизма провоспалительной активности незрелых гемопо-этических клеток может выступать их избирательная дифференцировка в клетки воспаления [Skurikhin Е., Pershina О., Dygai А., 2013]. Ранее высказывалось предположение о том, что зрелые гемопоэтические клетки способны мигрировать по кровеносному руслу к органам и, возможно, в лёгкие [Massberg S. et al., 2007]. По всей видимости, нейтрофилы, эозинофилы, моноциты-макрофаги рекрутируются из костного мозга в блеомициновые лёгкие, где за счёт выделения профибротических цитокинов поддерживают воспаление и продукцию коллагена фибробластами. Последовательное повышение уровня мультипотентных и олигопотентных предшественников гемопоэза в костном мозге и крови объясняется миграцией гемопоэтических предшественников различных классов (КОЕ-Н, КОЕ-ГЭММ, КОЕ-Г, КОЕ-Э) в кровь.

По современным представлениям фибробласты являются основным источником интерстициального коллагена. Благодаря энергичной репликации фибробластов и избыточному отложению внеклеточного матрикса, происходит уничтожение воздушного пространства лёгких. Считается, что происхождение фибробластов внутрилёгочное. Однако появились свидетельства о циркулирующих клетках крови (так называемых «фиброцитах»), которые обладают фибробластоподобными свойствами и способны мигрировать в повреждённые ткани [Abe R. et al., 2001]. Циркулирующие фибробластные клетки, возможно, мигрируют в лёгкие, «оседают» в формирующемся очаге воспаления и вовлекаются в фибротические изменения [Hardie W.D. et al., 2009; Wilson M.S. et al., 2010]. В своих исследованиях N. Hashimoto и соавт. (2004) показали миграцию донорских костномозговых GFP -клеток от трансгенных мышей в блеомициновые лёгкие химерных мышей. Одновременно в лёгких повышался уровень GFP+-ioieTOK, продуцирующих коллаген I типа [Hashimoto N. et al., 2004]. Результаты собственных исследований распределения С045*-клеток в тканях в фибротическую фазу пневмофиброза, с одной стороны, указывают на состоятельность гипотезы о циркулирующих фиб-робластах. С другой стороны, поднимают вопрос об участии костномозговых прогениторных фибробластных клеток в патогенезе пневмофиброза. В качестве доказательства приведены данные экспериментов по культивированию С045~-клеток. Так, одновременно с отложением коллагеновых волокон в паренхиме блеомициновых лёгких наблюдается поступательное увеличение количества легочных прогениторных фибробластных клеток с высокой мито-тической активностью (7, 14, 21-е сут). На 21-е сут значение показателя наибольшее. Такому течению событий в лёгких предшествует увеличение клональной активности С045"-клеток костного мозга (3, 7-е сут) и крови (7, 21-е сут) (рис. 4). На основании представленных данных можно предположить, что прогениторные фибробластные клетки лёгких костномозгового происхождения.

I I 35

- 30

Содержание КОЕ-Ф в костном мозге

.....□ Ннтакткьт. контроль

■ Блеомишш

N

m П-

14 21

Сроки исследования, сутки

25 X | С 20 I Л 1 | 15 Я § Ci >-. H10 Содержание КОЕ-Ф в ткани легких

□ Интакгиын контроль ■Блеомпшш É

■

л О © 2 5 1

X ■ 1

3 7 14 21

Сроки исследования, сутки

X '

. fo-8 :

9 ' S I 0.4

Содержание КОЕ-Ф в крови

□Кнтактньш контроль ■ Блеомишщ

. (

Срок» исследования, сутки

Рисунок 4. Клональная активность (формирование КОЕ-Ф) С045"-клеток костного мозга, крови и лёгких у мышей линии С57В176 в условиях интратрахеального введения блеомицина.

Не следует забывать об участии СК мезенхимального происхождения в патогенезе многих заболеваний. Это высказывание основывается на доказательстве того, что МСК способны мигрировать к повреждённым тканям [Le Blanc К. et al., 2005; Siniscalco D. et al., 2008]. В настоящей работе показано существенное повышение в костном мозге и лёгких у мышей линии C57BL/6 числа фибробластоподобных и прилипающих к пластику клеток, демонстрирующих МСК-подобный фенотип (СОЗГ, CD34', CD45", CD44+, CD73+, CD90+, CD106T), в фибротическую фазу развития болезни (21-е сут) на 250% и 118% от уровня интактных животных соответственно. Исходя из этого, можно сделать вывод о том, что увеличение количества МСК в легких происходит из-за их миграции из костного мозга.

Не исключено расширение популяции МСК блеомициновых лёгких за счёт усиления их митотической активности. При изучении длительных культур адгезирующих мононуклеаров лёгких, полученных у мышей в фибротическую фазу пневмофиброза (21-е сут), были получены доказательства данного положения. Прежде всего, была продемонстрирована возможность наращивания числа клеток со свойствами МСК (морфология, фенотип) в условиях длительного культивирования. Вторичные культуры наблюдались до 60-ти сут. Полученные во вторичных культурах МСК выдерживают 2-х и 3-х кратное пассирование и не теряют при этом морфологические, фенотипи-ческие и функциональные (самоподдержание) особенности СК мезенхимального происхождения.

В экспериментах, направленных на изучение in vitro дифференцировки МСК лёгких животных интактного контроля, была продемонстрирована их способность спонтанно и под влиянием ростовых факторов дифференциро-

ваться в хондроциты, остеобласты, адипоциты, фиброциты. Интратрахеально вводимый блеомицин изменяет активность дифференцировки в отдельные клеточные линии на 21-й день эксперимента. В фибротическую фазу пнев-мофиброза наблюдается избирательное увеличение дифференцировки легочных МСК в направление фибробластоподобных клеток. Интенсивность дифференцировки в зрелые хондрогенные и остеогенные клетки снижается. Таким образом при пневмофиброзе с участием МСК в паренхиме лёгких расширяется пул фибробластов - осноеных клеток-продуцентов коллагена (рис.5).

Осгеогеиная днфферениировка МСК

; г,00

=5 -г ЯП

II

ОИнтакпшй контроль ■Блеомицин

Алипотеяная лнффереиинровка МСК

14 □Йкгакшый

. . ......контроль

--1 Ш!)ЯеОМ1И1НН

Рисунок 3. Активность мультилинейной дифференцировки МСК легких мышей ЛИНИИ С57В1./6 в условиях интратрахеального введения блеомицина.

Все приведенные выше аргументы дают основание для пересмотра понимания происхождения фибробластов и клеток нейтрофильного ряда в легких. Как видно, костномозговые ГСК и МСК принимают активное участие в воспалении и фиброгенезе в легких у мышей при инсталляции блеомицина. ГСК являются источником клеток воспаления, МСК - фибробластов.

При изучении вопроса о возможном влиянии симпатолитика резерпина на развитие токсического пневмофиброза был выявлен ряд закономерностей. Так, резерпин заметно снижает интенсивность деструктивных процессов в лёгких мышей линии С57ВЬ/6 в условиях введения блеомицина. В воспалительную фазу пневмофиброза отмечается уменьшение инфильтрации интер-стиция альвеол и альвеолярных ходов воспалительными клетками (лимфоцитами, макрофагами, нейтрофилами, плазматическими клетками). В фибротическую фазу болезни симпатолитик препятствует разрастанию соединительной ткани в лёгочной паренхиме (рис. 1).

Фиброгеннан дифференцировки МСК

120 ......................................ОИнтэктньш

контроль ■ Блгюшшин

Итак, в условиях интратрахеального введения блеомицина симпатоли-тик резерпин оказывает противовоспалительное и антифибротическое действие.

Одновременно с противовоспалительной и антифибротической активностью резерпин отменяет нейтрофильный лейкоцитоз и лимфоцитоз в периферической крови. В костном мозге леченных животных количество нейтро-фильных гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов снижается до уровня мышей интактного контроля. Обнаруженная при пневмофиброзе гематотропная активность симпатолитика предопределила изучение механизма его действия на систему крови.

Показано, что симпатолитик снижает клональную активность костномозговых и циркулирующих в крови гранулоцито-эритроидно-макрофагально-мегакариоцитарных и гранулоцитарных прекурсоров на 3, 7, 14-е сут эксперимента. Полученные результаты позволяют связать проявление противоспалительной активности препарата с угнетением митотической активности прогениторных гемопоэтических клеток костного мозга и нарушением их мобилизации в кровеносное русло.

Далее было изучено действие резерпина на ГСК. На начальном этапе воспаления (3-й сут) симпатолитик существенно повышает клональную активность костномозговых клеток с фенотипом Lin", Sca-1+, c-Kit+, CD34". Позднее - на 7-е сут воспаления, наблюдается увеличение числа ГСК в костном мозге. Возможное объяснение этого эффекта резерпина на фоне замедления развития альвеолита мы нашли в гипотезе о «нишах» для ГСК. По современным представлениям, постнатальные костномозговые ГСК находятся в равновесии с небольшой фракцией циркулирующих ГСК. Предполагается, что при нарушении физиологического ритма жизнедеятельности (введение лекарственных препаратов, болезнь) происходит мобилизация ГСК. Стволовые клетки костного мозга мигрируют через эндотелиальный барьер и циркулируют в кровотоке без немедленного возврата (хоуминга) в костный мозг или другой орган [Wilson A. et al., 2006]. По мнению J. Zhang (2003), L.M. Calvi (2003) и соавт., ГСК расположены в непосредственном контакте с остеобластами, выстилающими переход коркового костного мозга (эндост) [Calvi L.M. et al.,2003; Zhang J. et al., 2003]. Другое возможное местоположение в костном мозге для ГСК - сосудистая «ниша». В сосудистой «нише» ГСК связаны с фенестрированным эндотелием специализированных сосудов костного мозга («слепые мешки»), названных синусоидами [Kiel M.J. et al., 2005]. Синусоиды костного мозга продуцируют молекулы, важные для мобилизации ГСК, хоуминга и приживления, включая цитокины, такие как хемокин CXCL-12 , молекулу клеточно-сосудистой адгезии 1 (VCAM-1), эндотелиальный клеточный (Е) селектин и другие молекулы адгезии. ГСК с глубоким дефектом клеточной миграции в результате потери комбинированной функции сигнальных путей CXCRL-4, ßl-интегринов и c-kit могут быть мобилизованными в больших количествах [Cancelas J.A. et al., 2005]. Природа «ниш» такова, что симпатические нервные волокна выступают одним из её элементов [Katayama Y. et al., 2006]. Остеобласты экспрессируют

Рг-адренергические рецепторы, являясь тем самым прямыми эффекторами передачи симпатических сигналов [Elefteriou F. et al., 2005]. Такая архитектоника способствует восстановлению костного мозга: катехоламины инициируют секрецию остеобластами цитокинов, действие которых связано со стимуляцией ГСК. По мнению Y. Katayama и соавт. (2006), симпатические нейроны не образуют синапсы с каждой клеткой «ниши». Передача сигнала к соседним клеткам, вероятно, осуществляется через прямые межклеточные контакты. Представленная картина во многом объясняет, каким образом ад-ренергическая система участвует в управлении процессами миграции ГСК.

Резерпин - ингибитор везикулярного захвата катехоламинов и серото-нина. Препарат оказывает двухфазное влияние на тоническую и рефлекторную активность симпатической нервной системы, а также на вазомоторные рефлексы [Каверина Н.В. и др., 1967; Турова А.Д. и др., 1984]. Первая де-примирующая фаза действия резерпина на центры вазомоторной регуляции обусловлена возбуждением высвобождаемыми моноаминами центральных тормозных моноаминергических структур. Эта фаза совпадает с увеличением содержания свободных, функционально активных форм моноаминов в мозге [Slotkin Т.А. et al., 1973; Carmichael S.W. et al., 1980; Каверина H. В. и др., 1984]. Вторая фаза действия развивается через 2-4 ч после введения и характеризуется увеличением тонической активности и вазомоторных рефлексов и полным устранением рефлекторного торможения в симпатических нервах. По времени вторая фаза совпадает с периодом истощения лабильного запаса моноаминов в мозговой ткани. Кратковременным повышенным уровнем свободных и функционально активных форм моноаминов в нервной системе в депримирующую фазу можно объяснить выход ГСК из «микроокружения» в условиях введения резерпина при пневмофиброзе. Примечательно, что «взрывной» рост клональной активности ГСК, инициированный резерпином, был обнаружен ранее в условиях цитостатической миелосупрессии [Дыгай A.M. и др., 2011]. Таким образом, реакция ГСК на введение симпатолитика резерпина во многом неспецифична, то есть не зависит от природы моделируемой патологии.

При анализе эффектов резерпина следует рассмотреть и состояние пула ГСК лёгких. По результатам цитометрических исследований следует, что симпатолитик не только замедляет темпы развития альвеолита у больных животных на 7-е сут эксперимента, но и повышает число клеток с фенотипом Lin", Sca-1+, c-Kit+, CD34" в лёгких. Вероятно, при пневмофиброзе следует говорить о повышении инфильтрации лёгких ГСК в фазу воспаления за счёт мобилизованных в кровь костномозговых ГСК.

Участие клеток мезенхималыюго происхождения в развитии пневмофиброза явилось основанием для изучения действия резерпина на МСК и прогениторные фибробластные клетки в период интенсивного отложения коллагена в лёгких (21-е сут). По нашим данным, препарат сокращает популяцию демонстрирующих фенотип мезенхимальных стволовых клеток (СОЗГ, CD34 , CD45~,CD44\ CD73+, CD90+, CD106+) в паренхиме фиброзированных лёгких. Кроме этого уменьшается

дифференцировка МСК в фибробластоподобные клетки и еще более нарушается адипогенез, остеогенез и хондрогенез [Скурихин Е.Г. и др., 2012]. Под действием симпатолитика заметно сокращается популяция костномозговых МСК.

На 21-е сут эксперимента резерпин оказывает ингибирующее действие и на прогениторные фибробластные клетки (CD45-) в фиброзированных лёгких, на что указывают данные цитометрических исследований. Одновременно уменьшается клональная активность С045"-мононуклеаров. В противоположность этому, содержание адгезирующих CD45"-KiieTOK с фибробластопо-добной морфологией в костном мозге леченых животных увеличивается.

Обращает на себя внимание и то обстоятельство, что в воспалительную фазу пневмофиброза (3, 7-й день) резерпин оказывает стимулирующее действие на клональную активность костномозговых и циркулирующих в крови прогениторных фибробластных клеток.

Из данных этой серии экспериментов следует, что снижение резерпином активности фиброгенеза связано с уменьшением содержания в повреждённой блеомицином паренхиме лёгких клеток мезенхимального происхождения (МСК, прогениторные фибробластные клетки). Выявленный эффект является следствием нарушения миграции МСК и прогениторных фибробластных клеток из костного мозга и, вероятно, других органов-депо в лёгкие. Не исключено, что симпатолитик может снижать интенсивность дифферен-цировки легочных мезенхимальных стволовых клеток в фибробласты.

Обсуждая вопрос об основах регенерации легких при введении симпатолитика следует учитывать то обстоятельство, что в популяцию CD45"-jcictok входят ке только МСК и прогениторные фибробластные клетки. Отсутствие CD45 рецептора характеризует стволовые клетки бронхиол, которые определяются как CD45", CD31", CD34", Sca-llow и AFIow (клетки Клара - предшественники эндотелиальных клеток) [Teisanu R.M. et al., 2009]. По результатам наших цитометрических исследований следует, что резерпин повышает количество лёгочных CD45", CD31", С034"-клеток. В этой связи не исключено, что восстановление эндотелиальной функции лёгких резерпином может происходить за счёт стимуляции клеток Клара.

Результаты фармакологического раздела настоящего исследования дают основание предложить новый подход в лечении лёгочного фиброза, в основе которого лежит избирательное действие симпатолитика на стволовые и прогениторные клетки.

ВЫВОДЫ

1. Блеомицин-индуцированная инфильтрация лёгочной ткани воспалительными клетками сопровождается развитием гиперплазии костномозгового гемопоэза и лейкоцитоза в периферической крови у мышей линии C57BL/6. Цитостатик увеличивает клональную активность ГСК (Lin-, Sca-1+, c-Kit+, CD34") и прогениторных С045+-клеток (КОЕ-ГЭММ, КОЕ-Г, КОЕ-Э) костного мозга, способствует их мобилизации в кровь.

2. Интратрахеальное введение блеомицина повышает клональную активность прогениторных фибробластных клеток (CD45~). В воспалительную фазу развития пневмофиброза увеличение образования КОЕ-Ф наблюдается в костном мозге и крови, в фибротическую фазу — в лёгких.

3. В фибротическую фазу в блеомициновых лёгких наблюдается увеличение количества клеток, прилипающих к пластику, с фибробластоподобной морфологией и фенотипом МСК (CD31, CD34", CD45", CD44+, CD73+, CD90+, CD106+). В культуре МСК-подобные клетки демонстрируют высокую митотическую активность и избирательную дифференцировку в направлении фибробластных клеток, при этом хондрогенез, остеогенез и адипогенез угнетаются.

4. Симпатолитик резерпин уменьшает инфильтрацию интерстиция альвеол и альвеолярных ходов воспалительными клетками и препятствует отложению соединительной ткани в паренхиме лёгких у мышей в условиях введения блеомицина.

5. В воспалительную фазу развития пневмофиброза резерпин уменьшает количество костномозговых и циркулирующих в крови прогениторных С045+-клеток, снижает их способность формировать in vitro колонии грану-лоцито-эритроидно-макрофагально-мегакариоцитарного и гранулоцитарного типов, в то же время число ГСК в костном мозге возрастает.

6. В фибротическую фазу пневмофиброза резерпин сокращает популяцию МСК-подобных клеток в костном мозге и лёгких, оказывает супрессирующее действие на клональную активность костномозговых, легочных и циркулирующих в крови прогениторных CD45"-KJieTOK.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Дыгай A.M., Скурихин Е.Г., Андреева Т.В., Ермолаева Л.А., Хмелев-ская Е.С., Першина О.В., Крупнн В.А., Резцова A.M., Степанова И.Э., Голь-дберг В.Е. Реакции системы крови и стволовых клеток в условиях блеомици-новой модели фиброза легких // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-2011.-Т. 152,№ 8. — С. 132-136.

2. Скурихин Е.Г., Хмелевская Е.С., Першина О.В., Андреева Т.В., Ермолаева Л.А., Крупин В.А., Ермакова H.H., Резцова A.M., Степанова И.Э., Дыгай A.M. Механизмы противовоспалительного и антифибротического действия симпатолитика в условиях токсического пневмофиброза // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. - Т. 153, № 5. - С. 590 -595.

3. Скурихин Е.Г., Хмелевская Е.С., Першина О.В., Ермакова H.H., Крупны В.А., Резцова A.M., Ермолаева Л.А., Якушина В.Д., Степанова И.Э., Резцова В.М., Чердынцева Н.В., Стахеева М.Н., Дыгай A.M. Дифференцировка мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток легких при пневмо-фиброзе // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2012. - № 4. - С. 192-199.

4. Дыгай A.M., Скурихин Е.Г., Першина О.В., Хмелевская Е.С., Ермакова Н.Н., Ермолаева Л.А., Крупин В.А., Резцова A.M., Степанова И.Э. Гемопоэтические и мезенхимальные стволовые клетки в патогенезе пневмофиброза // Материалы II Российского конгресса с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины: возможное и реальное». - СПб., 2012. - С. 239 - 240.

5. Дыгай A.M., Скурихин Е.Г., Першина О.В., Хмелевская Е.С., Ермакова Н.Н., Крупин В.А., Резцова A.M., Степанова И.Э., Артамонов А.В., Бекарев А.А., Киншт Д.Н., Мадонов П.Г. Стволовая клетка, как мишень в коррекции пневмофиброза // Материалы IV съезда фармакологов России «Инновации в современной фармакологии». - республика Татарстан г. Казань, 2012.-С. 61.

6. Skurikhin E.G., Khmelevskaya E.S., Pershina O.V., Ermakova N.N., Krupin V.A., Ermolaeva L.A., Yakushina V.D., Reztsova A.M., Reztsova V.M., Stepanova I.E., Dygai A.M. Antifibrotic effects of reserpine on lung fibrosis. Hematopoietic stem cells in the pathogenesis of pneumofibrosis // 5th International Conference on Drug Discovery & Therapy. - UAE Dubai, 2013. - P. 78.

7. Skurikhin E.G., Khmelevskaya E.S., Pershina O.V., Ermakova N.N., Krupin V.A., Ermolaeva L.A., Yakushina V.D., Reztsova A.M., Reztsova V.M., Stepanova I.E., Dygai A.M. Antifibrotic effects of reserpine on lung fibrosis: stem cells in the pathogenesis of pneumofibrosis // The Open Conference Proceedings Journal. - 2013. - Vol. 4.-P. 31 - 46.

8. Skurikhin E.G., Pershina O.V., Khmelevskaya E.S., Ermakova N.N., Krupin V.A., Reztsova A.M., Ermolaeva L.A., Reztsova V.M., Stepanova I.E., Dygai A.M. The role of endogenous stem cells and progenitor cells in the pathogenesis of myelosuppression, pneumofibrosis and diabetes // 6th Annual World Congress of Regenerative Medicine & Stem Cell (RMSC-2013). - China Dalian, 2013.-P. 645.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ИФЛ - идиопатический фиброз легких

КОЕ-Н, -ГЭММ, -Г, -Э, -Ф - колониеобразующая единица недифференцированная, гранулоцито-эритроидно-макрофагально-мегакариоцитарная, грану-лоцитарная, эритроидная, фибробластная

СК (ГСК, МСК, РСК) - стволовые клетки (гемопоэтические, мезенхимальные, регионарные)

c-Kit - рецептор для фактора стволовых клеток

CD (cluster of differentiation) - кластер дифференцировки

GFP (green fluorescence protein) - зеленый флуоресцентный протеин

Lin — линейный маркер стволовых клеток

Sea (stem cell antigen) - антиген стволовой клетки

Подписано в печать 11.11.2013 г. Формат А4/2. Ризография Печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ №4/11-13 Отпечатано в ООО «Позитив-НБ» 634050 г. Томск, пр. Ленина 34а