Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Близкодействующая регуляция пролиферации ранних гемопоэтических предшественников в норме и при аутоиммунной патологии (экспериментальные исследования)

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ КЛИНИЧЕСКОЙ шлгаологии

Для служебного пользования На правах рукописи

^'10 08

МАТРОСОВА ВЕРА ЮРЬЕВНА

ЕЛКЗК! ¡действующая регуляция пролйберацки РАННИК

ГЕШГОЭТИЧЕСКИХ ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ В НОРМЕ И ПРИ АУТОИММУННОЙ ПАТОЛОГИИ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ)

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 1995

Работа выполнена в Институте клинической иммунологии Сибирского отделения Российской Академии медицинских наук

Научный руководитель: член-корр. РАМН,

доктор медицинских наук, профессор КОЗЛОВ В.А.

Официальные оппоненты: академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор ТР2ГФАКИН В.А.

кандидат медицинских наук ОСТАНИН АЛ.

Ведущая организация: Институт иммунологии Ш России

Защита диссертации состоится "_"_1995 г.

в_часов на заседании специализированного защитного совета

Д.001.01.01. (Аллергология и иммунология) Института клинической иммунологии СО РАМН по адресу: 630091, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в ' библиотеке Института клинической иммунологии СО РАМН.

Автореферат разослан "_"_1995 г.

Ученый секретарь Специализированного совета Жслг&гЛтЯ^

кандидат биологических наук О.Т.КУДАЕВА

Актуальность проблемы. Важной задачей современной иммунологии является поиск путей и средств целенаправленной регуляции иммунопоэза. Одним из перспективных способов решения этой проблемы может стать изменение пролиферации и дифференцировки стволовой кроветворной клетки (СКК), являющейся общим предшественником для всех ростков гемопоэза и иммуногенеза (Максимов, 1917). С другой стороны, изучение функциональной активности СКК: пролиферации, миграции,дифференцировки и самоподдерхания является фундаментальным для понимания процессов гемопоэза как в норме, так и при патологических состояниях. Таким образом, данная проблема является ключевой как для гематологов, так и иммунологов и ее решение будет иметь выраженное практическое значение (при заболеваниях крови, в том числе и злокачественных, трансплантации клеток костного мозга и т.д.).

Литературные данные последних лет характеризуются накоплением огромного количества сведений об основных свойствах гемопо-этических клеток и их регуляции. Известно, что в норме стволовые клетки находятся в С0-периоде и только около 10% из них - в фазе синтеза ДНК (S-фазе) (Becker, 1965; Frindel, 1976; Меззпег, 1980; Paukovita е.а., 1990). Исследования показали, что ранние гемопоэгические предшественники отвечают пролиферацией на стимулы различной природы, в том числе на антигенное воздействие, на ионизирующее облучение и пр. (Frindel, 1973; Hamano, 1978; Staber, 1980; Козлов, 1983; Пдрлова, 1991). Кроме того, извео-тно, что при различных иммунопатологических состояниях у мышей, таких как Т-клеточная лейкемизированная лимфобластная лимфосаркома, при старении пролиферативная активность СКК возрастает (Орловская и др., 1989; 1991). При этом может меняться время продолжительности клеточного цикла, как это было показано при действии тестостерона (Козлов, Цырлова, 1978).Выдвинуто предположение, что выбор пути дифференцировки СКК непосредственно связан с данным временем.

В настоящее время накапливаются данные об естественных регуляторах гемопоэза, синтезированы их искусственные аналоги. Известно, что регуляцию гемопоэза обеспечивают сетевые взаимодействия цитокинов, таких как интерлейкины, колониестимулирунцие факторы. Нормальные гемопоэтические цитокины, могут контролировать аномальный рост различных типов лейкозннх клеток и подавлять его, индуцируя дифференцировку до зрелых неделящихся клеток. Они могут быть использованы в клинике для коррекции дефек-

тов гемопоэза у больных с различными патологиями. Однако, наиболее ваяен поиск факторов, действующих на наиболее ранние гемопо-этические прекурсоры для коррекции нарушений гемопоэза на самых начальных этапах. Одним из таких факторов является фактор, выделенный из костного мозга ребер свиней по методу Lord (1976), с молекулярной массой 17 kD, ингибирущий in vivo и In vitro про-лиферативвую активность предшественников гемопоэза.

Ранее показано наличие в костном мозге механизма близкодействующей регуляции пролиферативной активности КОЕс, включащего факторы, стимулирующий и ингибирущий переход клетки в фазу синтеза ДИК (Lord е.а., 1976; 1977). Однако, роль факторов-регуляторов пролиферации ранних гемопоэтических предшественников при различных иммунопатологических состояниях до сих пор не изучена. Остается невыясненным, существует ли изменения в продукции факторов при патологиях и связаны ли нарушения регуляции с развитием различных иммуногематологических растройств. Известно, например, что у старых мышей-гибридов CBF1 пролиферация КОЕс костного мозга возрастает, и в костномозговой суспензии клеток отсутствует продукция ингибиторной активности при наличии стиму-ляторной. У короткозивущих, быстростарещих мышей линии NZB, характеризующихся спонтанным развитием СКВ-подобного синдрома, рядом авторов отмечается увеличение пролиферативной активности клеток селезёнки и повышение количества эндогенных КОЕс и числа активно пролкферирукщих ранних гемопоэтических предшественников (Morton, Siegel, 1969; 1971; 1975; 1976; 1978; Warner, Moor, 1971; Dcehara e.a., 1990; ЕатесЬе e.a., 1990). Изучение процесса регуляции различными факторами пролиферативной активности СКК, возможных путей коррекции нарушений пролиферации и дифференци-ронки ранних гемопоэтических предшественников может быть перспективным в плане исследования патогенетической роли данных факторов при таком аутоиммунном заболевании, как СКВ-подобный синдром у мышей линии NZB.

Цель исследования. Исходя из вышеизложенного, целью настоящей работы было изучение патогенетической роли факторов-регуляторов пролиферативной активности СКК в формирование аутоиммунного заболевания у ыышей линии NZB и механизмов действия данных регуляторных факторов на ранние гемопоэгические предшественники.

При выполнении исследования ставились следующие задачи:

I. Изучить продукцию факторов, регулирующих пролиферативнув

активность СКК при аутоиммунном заболевании у ИВ мышей.

2. Изучить эффекты фактора, ингибируюцего пролиферативную активность СКК, на субпопуляционную структуру стволовой кроветворной клетки (КОЕс) у мышей линии ШВ.

3. Оценить продукцию стимулятора и ингибитора пролифератив-пой активности СКК после воздействий, вызыващих иммунодепрессию и имеющих оппозитные эффекты в отношении пролиферативной активности СКК (тестостерона пропионат и индометацин; гидрокортизон).

4. Оценить возможные механизмы реализации эффекта ингибитора пролифератишой активности СКК.

Основные результата исследований и их новизна.

Впервые показано изменение пролифератишой активности и субпопуляционной структуры КОЕс костного мозга при развитии аутоиммунного растройства у мышей литой 1ЙВ. Установлено,- что в костном мозге Ж В мышей с Кумбс-отрицательной реакцией в крови продуцируется как ингибитор, так и стимулятор пролифератинной активности КОЕс, тогда как в костном мозге больных мышей (с Кумбс-положительной реакцией) отмечено отсутствие синтеза ингибитора при сохранении продукции стимулятора. Шесте с тем, обнаружено, что развитие данного иммунопатологического состояния сопровождается серьезными изменениями в субпопуляционной структуре КОЕс: увеличение у больных животных числа КОЕс-5 и КОЕс-8, которые являются более зрельгот популяциями по сравнению с КОЕс-12.. Продемонстрировано корригирущее действие ФИЛ на КОЕс-5 и КОЕс-8 больных мышей ЖВ.

Показано, что изменение пролифзративной активности. СКК после различных воздействий, таких как ТОТ, ГК, индометацин, сопровождается изменениями в продукции костномозговых факторов-регуляторов пролиферации, причем, снижение пролифератишой активности КОЕс (после воздействия ГК) в костном мозге мышей СВР1-гибридов сопровождается синтезом ингибитора, а повышение пролиферации стволовых кроветворных клеток (после введения ТСП) - синтезом стимулятора.

Исследованы возможные механизмы регуляторного эффекта изучаемого ингибитора пролифзративной активности (ФИП) КОЕс костного мозга. Полученные данные свидетельствуют о том, что, по-видимому, действие ФИП не является простагландинзависимым. Вместе с тем, обнаружено влияние блокатора гистаминового рецептора Н^ на эффект изучаемого фактора. Предполагается, что действие ФИП опосредуется через данные рецепторы.

Научная и практическая ценность работы. Полученные даняныа oö изменении в продукции факторов-регуляторов пролиферативной активности СКК при различных иммунопатологических состояниях, таких как аутоиммунное заболевание у KZB мышей и иммунодепрес-сш, вызванной введением тестостерона или гидрокортизона, помогут выявить механизмы вовлечения СКК в формирование патологических состояний.

Оригинальным являются исследования механизмов действия ингибитора пролиферативной активности КОЕс (ФИЛ), которые вносят вклад в решение проблемы поиска путей реализации аффекта ингибитора.

Кроме того, полученные результаты, расширяя представление о роли изучаемых факторов в патогенезе ряда иммунологических нарушений, позволят определить подхода к иммунокоррекции этих заболеваний с помощью воздействий на функциональную активность СКК.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Повышение и снижение проли$еративной активности СКК в костном мозге при воздействии гормонами-иммунодепрессантами сопровождается изменением в продукции костномозговых факторов-регуляторов пролиферации ранних геиопоэтических предшественников.

2. Усиление пролиферативной активности СКК в процессе развития аутоиммунного заболевания у NZB мышей обусловлено отсутствием ингибиторной активности в костномозговых супернатаятах.

3. Применение ингибиторе пролиферации СКК (ФИП) обуславливает снижение численности субпопуляций КОЕс костного мозга у Сольных N2B мышей при введении In vitro.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены и обсуждены на I Всесоюзном съезде иммунологов (Новосибирск, 1992), на научных конференциях ИКИ СО РАМН (Новосибирск, 1992, 1994). Апробация диссертации состоялась на расширенном семинаре ИКИ СО РАМН (Новосибирск, 1995).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы.

Обьем и структура работы. Диссертация изложена на 151 листе машинописного текста, содержит 24 рисунка и 4 таблицы; состоит из введения, обзора литературы (глава I), описания материалов и методов исследования (глава II), изложения результатов собственных исследований (глава III), их обсуждения и выводов. Список ципфованной литературы включает 277 источников, в том числе 249 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В экспериментах использовались мыши (CBAxC57BL/6)Fj в возрасте 3-6 месяцев, полученные из питомника лабораторных животных "Столбовая" РАМН, а также из размноженных в экспериментально-биологической клинике лабораторных животных ИКИ СО РАМН из племенных ядер, полученных из питомника "Столбовая", мыши линии ВАЬВ/с в возрасте 3-6 месяцев, полученные из питомника "Столбовая". Мыши линии NZB в возрасте от Z до 18 месяцев были получены из вивария ИЦиГ СО РАН. Всего в работе использовано 3 тыс. животных.

В работе использовались следующие препараты: щцрокортизон ацетат ("Гедеон Рихтер"), который вводили однократно внутрибрю-шинно в дозе 125 мг/кг за 2-4 чеса до забоя животных; тестосто-рон-пропионат вводили однократно внутрибрппинно в дозе 100 мг/кг за 4-18 часов до забоя животных; индометацин (Indoisethaclne, Sigma) по 250 мкг/мышь в объеме 0,3 мл среды 199 внутрибркшин-но, дважды, за сутки и 2 часа до взятия костного мозга. В экспериментах In vitro на суспензии клеток костного мозга индометацин добавляли в инкубационную среду в конечной концентрации 10_6М (0,3 мкг/мл); пириламин (блокатор Hj-гистаминового рецептора) и ранизан (блокатор ^-гистаишового рецептора) применялись in vitro в концентрации 10-5М в течение 2 часов; форболовый эфир использовался в дозе 100 нг/мл в качестве активатора протеинкиназы С (длительность, инкубации - 10 мин.).

Снижение уровня пролиферации СКК проводили in vivo и in vitro с помощью фактора (ФИЛ), полученного по методу, описанному lord, 1976. In vivo экспериментальным животным фактор вводили в дозе 0,05 мкг/мышь. In vitro фактор инкубировали с клеточной суспензией в дозе 0.005 мкг/мл в течение 4 часов с последующим отмыванием клеток забуференным физраствором.

Облучение животных проводили на аппарате КУМ-25 при мощности дозы 0.5 Гр/мин, напряжении 130 кВ, силе тока 10 мА. Во всех экспериментах животные получали летальную дозу от 7 Гр до 9,5 Гр в зависимости от индивидуальной радиочувствительности.

Для определения числа активно пролиферирущих СКК, использовали методику "тимидинового самоубийства" (Becker et.al., 1965).

Количество АОК в селезенках мышей оценивали на 4-е сутки после внутривенной иммунизации эритроцитами барана (ЭБ). по количеству локальных зон гемолиза в полужидкой среде модифицирован-

вш методом (Cunningham, 1968).

Для определения количества КОЕс в костном мозге экспериментальных животных использовали метод экзогенного колониеобразова-ния (Till, McCullocb, 1961).

Для разделение клеток костного мозга в градиенте бычьего сывороточного альбумина (БСА) костномозговую клеточную суспензии, полученную от мышей после различных экспериментальных воздействий, наслаивали на вершину ступенчатого градиента БСА. Ступени градиента БСА готовили из 35Ж раствора (Dicke et.al., 1969), полученного из сухого БСА (Sigma, IBA), растворением в трис-хлор-буфере. Кондиционная среда, полученная от клеток, выделенных в плотности 1,062 г/ыл исследовалась на наличие иигиби-торной активности в тесте подавления высокой пролиферации КОЕс костного мозга, взятых от мышей, получившие инъекцию ТСП. Активность супернатанта от клеток с плотностью 1,078 г/мл оценивалась на наличие стимулятора по способности увеличивать процент КОЕс в S-фазе клеточного цикла в костном мозге интактных мышей-

Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с использованием t-критерия Стыодента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУДЦЕНИЕ Литературные данные последних лет говорят о существовании близкодействующей регуляции пролкфоративной активности полипо-тентной кроветворной клетки с помощью факторов, стимулирующего и ингибирущего пролиферацию колониеобразущих единиц селезенки (КОЕс) (Lord, Wright, 1982). Однако, остается не ясным существуют ли изменения в продукции факторов-регуляторов пролиферации КОЕс костного мозга при индуцированно высоком и низком уровнях пролиферации, при таких патологических состояниях как аутоиммунные заболевания.

В серии экспериментов оценивали продукцию костномозговых факторов в модели с высоким уровнем пролиферации КОЕс костного мозга, вызванным введением тестостерона-пропионата (ТСП). У мышей-гибридов (CBAxC57Bb/6)FI, обработанных ТСП, преинкубация клеток костного мозга (ККМ) с супернатантом, полученным от инги-битор-продуцируюцих клеток (СИПК) не снижала высокий уровень пролиферации КОЕс (контрольная груша - 32,9%, опытная группа -27,1%). Инкубация ККМ, полученных от интактных животных, с супернатантом от стимулятор-продуцирущих клеток (ССПК) обусловливала повышение пролиферативной активности КОЕс (контроль - 0%,

опыт - 23,635) (рис-Ш)). В супернатаяте, полученном от нераздь-ленных клеток костного мозга (СНК) отмечалась только стиаулятор-ная активность (рис. 1(11)). * КОЕс в !5-Фазе

12 34 1 2а 3 4а

I II

Рис.1. Процентов содержанке КОЕс костного мозга в S-фаза у мышей CCBAxC57BL/6)Fl после преинкубации клеток костного мозга (ККМ) с супернатантами от разделенной (D и неразделенной CID костномозговой популяции клеток животных, обработанный ТСП. 1 - ККМ интактных мышей 2 - ККМ интактных мшзэй+ССГК 3 - ККМ мышей посла ТСП 4 - ККМ мьешй после ТСП+СМПК 2а- ККМ интактнш мыаей+СНК 4а- ККМ мышей после ТСП+СНК

Имеется основания предполагать, что иммунодепрессивное действие ТСП (Kotant, 1975) моаёт бить опосредовано стимуляцией митотической активности полипотентных кроветворных клеток (Вугоп, 1970), вызванной отсутствием продукции ингибитора в костном мозге.

При изучении продукции костномозговых факторов у мышей-гибридов, получивших однократно инъекцию гидрокортизона (ГК), показано, что преинкубация ККМ, пролиферативная активность, которых стимулирована введением ГСП, с супернатантом, полученным от ингибитор-продуцьфукщих клеток ,(СИПК), приводит к снижению пролиферации КОЕс (контроль - 35,3%, опыт - 0,2%). Предварительная инкубация ККМ с супернатантом от стимулятор-продуцирущих клеток (ССПК) достоверно не изменяла пролиферативную активность ранних гемопоэтических предшественников (контроль - 0%, опыт -11%) (рис. 2(1)). В то же время, инкубация ККМ с кондиционной средой, полученной от неразделенных в градиенте БСА костномозговых клеток (СНК) и введение этих клеток летально облученным сш-

генным реципиентам приводили к снижению пролиферативной активности КОЕс с 23% до 10% (рис. 2(11)). То есть определялась ингиби-торная активность при отсутствии стимулягорной. В данном случае, ло-ввдшоыу, снижение пролиферации КОЕс (Цырлова, 1977) можно связывать с активностью ингибиторной фракции у мышей.

X КОЕс в Э-Фазе

43-

Рис.2. Процентное содержание КОЕс костного мозга в Б-фазе у мышей ССВАхС57В1У6ЭИ. после преинкубации клеток костного мозга (ККМ) с супернатантами от разделенной СП и неразделенной (II) костномозговой популяции клеток животных, обработанных ГК. 1 - ККМ интактных мышей 2 - КИМ интактных мышея+ССПК 3 - ККМ мышей после ТСП 4 - ККМ мышей после 7СП+СИПК 2а- ККМ интактных мьшей+СНК 4а- ККМ мьшей после ТСП+СНК

Таким образом, ингибитор пролиферации стволовой кроветворной клетки определялся в супернатанте ККМ, содержащих минимально пролиферирувдие КОЕс, в то время как в костном мозге с активной пролиферацией ранних гемопозтических предшественников определялась продукция стимулятора. Можно предположить, что пролиферация КОЕс костного мозга зависит от баланса продукции ингибитора и стимулятора костномозговыми клетками.

Понимание механизмов, регулирующих пролиферацию стволовой клетки, является важным вопросом в изучении регуляции функциональной активности нормальных кроветворных клеток и поисках путей коррекции различных иммуногематолопдческих расстройств. В данной работе была предпринята попытка объяснить, какие события могут быть вовлечены в ингибицию пролиферации КОЕс костного мозга, вызванную введением ФИП. Можно предположить, что простагландины, оказыващие ингибиторную акти-

вность на гемопоэз, участвуют в регуляции пролиферации стволовой клетки с помощью ФИП. Из рис. 3 видно, что ТСП-иидуцированний высокий уровень пролиферации КОЕс (ЗОЯ) был ингибирован 4х-часовой инкубацией с ФИП (7,556) и не увеличился при последующей инкубации с индоыетацином, блокатором синтеза ПГЕ^ (в предварительных экспериментах показано увеличение пролиферации КОЕс костн(?го мозга после введения индометацина).

X КОЕс в 15-фазе

30-

iir-гг г

Рчс. 3. Влияние индометацина на подавление пролиферации КОЕс костного мозга мшэй С СВАхС57В1У6)Е1 с помощью «МОТ.

1 - ККМ после ГСП

2 - ККМ после ТСГМШ

3 - ККМ после ТСП+ФИП-жндометашн

Исходя из представленных данных, по-видимому, могно предположить, что исследуемый механизм дэйсовия ФИП не является про-стагландинзависимвм.

Литературные даяние последних лет говоря г об участии гиста-мина в регуляции гемопоэза (Dy, Schneider, 1991). В серии экспериментов изучалось участие гасташшовнх рецепторов в реализация эффекта Ш1 на пролиферацию КОЕс костного мозга. Клеточную суспензию из бедренных костей мышей, получивших предварительно инъекцию ТСП, инкубировали параллельно с пириламином и ранизаном (соответственно блокаторы Hj- и Н^-гистаминовых рецепторов), затем клетки отмывали и инкубировали с ФИП. После инкубации определяли функциональную активность. КОЕс методом "тимидинового* самоубийства". Как показано на рис. 4, после преинкубации суспензии ККМ с пириламином эффекта ФИП не наблюдалось. Контроль ный уровень пролиферации КОЕс составил ЗОЖ, а в опытной группе с предварительной инкубацией с пириламином - 34% (достоверных отличий не наблюдается). Результаты, полученные при изучении воз-могного участия Н^-рецептора (с применением блокатора - раниза-на) в механизме ингибиции пролиферации КОЕс с помощью ФИП, гока-

звли, что предварительное воздействие ранизаном не отменяет эф-фэкта ФИЛ (рис. 4(11)). Пролиферация КОЕс в контрольной группе

X КОЕс в Б-фазо

ЭБ-П

Рис.4. Процентное содержание КОЕс костного мозга в S-фазе у мышей CCBAxC57BL/6)Fl после инкубации с пишламином CD и ранизаном (II) и ФИП.

1 - ККМ мышей после ТСП 2 - ККМ мышей после ТСП+ФИП 3 - ККМ мышей после ТСП+блокатор гистаминовых рецепторов+ФИП

составила 25%, в группе "опыт" - 0.5Ж. Таким образом, представленные данные указывают на возможную реализацию эффекта ФИП через Hj-гистаглиновые рецепторы. В литературе существуют данные о том, что при передаче сигналов через Hj-рацеотор происходит мобилизация внутриклеточного Ca2+ (Falus, Meretey, 1992). Показано, что некоторые ростовые факторы, связываясь с рецепторами поверхности клетки, вызывают усиленный обмен инозитолфосфатов, что приводит к увеличению внутриклеточного Са2+ и активации про-теинкиназы С (ПК-С)(Нок1п, 1985; McNeil е.а., 1985). В связи с этим, изучалось участие ПК-С в реализации эффекта ФИП. В экспериментах был использован активатор ПК-С, фэрболовый эф1ф (ФЭ). Представленные данные (рис. 5) свидетельствуют о том, что, очевидно, активация ПК-С индуцирует стимуляцию пролиферации КОЕс костного мозга. Так, контрольный уровень пролиферации КОЕс составлял 11%, после активации ПК-С процент клеток, находящихся в S-фазе клеточного цикла увеличился до 43Ж. Инкубация с ФИП в течение 4 часов снижала пролиферативную активность КОЕс до 16%. Можно предположить, что ФИП снижает активность ПК-С и, как следствие, снижается пролиферация ранних гемопозтических предаест-

вепников, хотя нельзя исключить тот факт, что за 4 часа ЕЕкуба-цш с (ШП уровень активности ПК-С снизился яозавясшо от действия Ш1.

X КОЕс в Б-Фазе

45 т1 ^

43-

Рис.5. Влияние ФЭ на подавление пролиферации КОЕс костного шзга с поиощью СИП у 1яшей-ги5рндов С СВАхС57В1/6)И..

1 - КИМ интактнкх ышиэй

2 - ККМ интактных ыышай-иНЗ

3 - ККМ интактных мькей+ФЭ+ФИП

35'-' 30" 25-' 2015-Ю-5";

1

2

3

Имевдиеся в настоящее время данные позволяют сделать предположение о существовании близкодействующего механизма, оыроде-лящего изменение уровня пролиферации стволовой метки, связанного с продукцией ингибитора и стимулятора клетками костного мозга, наряду с другими известны!.™ позитивными и негативными регуляторами пролхэферативной активности ранних гешшоэтических предшественников. В наших исследованиях выявлено, что у мышей линии ЖВ с антиэритроцитарными аутоантитела'ли в крот уровень пролиферации КОЕс повышен (31Я), тогда как у здоровых ЖВ мышей уровень пролиферации составляет 456, как и у шшей (СВАхС57ВЬ/6)Р1-гибридов. В связи с зим представляло интерес выяснить как это мозет быть связано с продукцией изучаемых костномозговых факторов. Оказалось, что клетки костного мозга здоровых мышей линии ИВ (отрицательный титр аутоантител в крови), разделенные в градиенте плотности БОА, способны продуцировать как стимулятор, так и ингибитор пролифератишой активности КОЕс, что соответствует литературным данши о молодых здоровых мышах-гибридах (рис. 6(1)). В супернатанте от неразделенной популяции клеток костного мозга определяется лишь ингибиторная активность (рис.6(11)).

Иная картина наблвдатся у мышей Л2В при развитии аутоиммунного процесса. Так, стшулятор-продуцирущке клетки сохраняют свои активность: при обработке ККМ супэрнатантоа, полученный от

* КОБс B.S-фаза

45

Рис. 6. Процентное содержание КОЕс костного мозга в З-Фазе у мышей после преинкубадаи клеток костного мозга С ККМ) с супернатантами от разделенной СП и неразделенной СП) костномозговой популяции клеток здоровых мышей №В. 1 - ККМ интактньш мьшей 2 - ККМ интактных мьшей+ССПК 3 - ККМ мышей после ЮТ 4 - ККМ мьшей после ТСП+СИПК 2а- ККМ интактных мышей+СНК 4а- ККМ мышей после ТСП+СНК

г коес в S-фазе

12 34 1 2а 3 4а

I II

Рис.7. Процентное содержание КОЕс костного мозга в S-Фазе у мышей после преинкубации клеток костного мозга СККМ) с супернатантами от разделенной CI) и неразделенной CII) костномозговой популяции клеток больных мышей NZB. 1 - ККМ(интактных мышей 2 - ККМ интактных мьшей+ССПК 3 - ККМ мышей после ТСП 4 - ККМ мышей после ТСП+СИПК 2а- ККМ интактных мышей+СНК 4а- ККМ мышей после ТСП+СНК

стмлулятор-про ду цирущих клеток, пролиферация КОЕс интактяого костного мозга возрастает (с 8,255 до 3656), а супернатант от ин-гибитор-продуцируодих клеток не ингибирует высокий уровень пролиферации ранних гемопоэтических предшественников мышей, обработанных ТОТ <29,258 и 35,335 соответственно Ирис. 7(1)). Кондиционная среда, полученная после инкубации неразделенных ККМ, также проявляет только стиыуляторную активность (рис. 7(H)).

Описанные изменения в микроокружении полипотентной кроветворной клетки (синтез стимулятора и отсутствие продукции ингибитора) у мышей линии NZB с Куыбс-положительной реакцией могут, по-видимоыу, играть роль в формировании повышенного пролифератишого статуса ранних гемопоэтических предшественников.

Высокий уровень пролиферации КОЕс костного мозга, вероятно, не может не сказаться на субпопуляционной структуре КОЕс. Изучались "возрастная структура" КОЕс и эффекты Ш1 на отдельные популяции гемопоэтических предшественников в костном мозге мышей NZB в процессе формирования аутоиммунного заболевания. На рис. 8 представлены данные об эффектах ФИП на численность субпопуляций КОЕс-5, -8, -12 после обработки 1л vitro ККМ здоровых мышей NZB, а также мышей с Куыбс-положительной реакцией. Из рисунка видно.

Число

', '----> , т 1 LJ -1-1-1 11 г

КОЕс-5 КОЕс-8 КОЕс-12 КОЕс-5 КОЕс-8 КОЕс-12

I II

Рис.8. Влияние ФИП на число КОЕс в костном мозге здоровых CI)

и больных СП) мышей линии NZB. * - р<0.05, ** - р<0.01

что число КОЕс-5 и KOEc-8/IO5 вводимых ККМ, достоверно вше у больных мышей, по сравнению с аналогичными показателями здоровых мышей. Можно видеть также, что ФИЛ не оказывал эффекта на численность субпопуляций КОЕс, взятых от молодых здоровых мышей с нормальной пролиферативной активностью КОЕс; в то se время, мы наблвдали снижение численности всех субпопуляций КОЕс (в случае KOEc-5/IO5 ККМ недостоверное) у больных мышей под влиянием ФИП.

Таким образом, повышение пролиферативной активности КОЕс в костном мозге больных ыышей ÍÍZB сопровождается возрастанием количества КОЕс-5 и К0Ес-8. Преинкубация ККМ с ФИП у мышей с Кумбс-положительной реакцией приводит к нормализации пролиферативной активности КОЕс, снижению числа КОЕс-8 и КОЕс-12.

Бри хроническом введении ФИП мышам линии NZB 1п vivo наблюдалась отсрочка появления аутоангител у животных, получавпаи предварительно, в течение трех недель, фактор (рас. 9). В группе "опыт" через 1,5 мес. с начала эксперимента лишь у 21% мышей (3 животных) определялись аутоантитела, тогда как в контрольной груше у 54% животных (7 мышей) отмечалась Кумбс-полокительная реакция. Данное соотношение сохранялось в течение 2,5 мес исследования. Полученные результаты свидетельствуют о возможности коррекции данного показателя с помощью ФИЛ.

Рис.9. Динамика выявления аутоантител.у мышей MZB после введения <ШП. ( + ) - контроль С - ) - опт-

время С мес.3

О 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

Увеличение пролиферативной активности КОЕс костного мозга у больных мышей ШВ сопровождается повышением числа ранних зритроидных предшественников и снижением предшественников гранулоцитарно-макрофагальногс направления по сравнена» с

показателями здоровых мышей (Халдояниди, 1993). Следовательно, вероятно, у мышей NZB можно оявдать подавление гуморального звена иммунитета. После трехнедельного введения ФЮТ ln vivo животных иммунизировали 5Ж эритроцитами барана и оценивали формирование антителообразупцих клеток (АОК) в селезенках мышей. Действительно, абсолютное число АОК после иммунизации 556 Э5 достоверно вше у интактных мышей-гибридов (CBAXC57BL/6) (р<0,05), чем у »швей NZB, которым предварительно в течение 3 недель вводили внутрибршинно среду Хенкса, и вше, но достоверно не отличалось от NZB мышей, которым вводился ФИП (р>0,05) (рис. 10). Было обнаружено, что введение ФИП по описанной схеме вызывает значительную, хотя и недостоверную, стимуляцию продукции АОК к ЭБ у аутоиммунных мышей линии NZB.

Абсолютное число

АОК С тыс.)

Полученные в работе результаты говорят, очевидно, о нарушении близкодействующей регуляции пролиферации СКК у ШВ мышей, что может играть существенную роль в патогенезе различных заболеваний. Понимание механизмов, регулирующих пролиферацию ранних гемопоэтических предшественников, является важным вопросом в изучении регуляции функциональной активности нормальных кроветворных клеток и поисках возможных путей коррекции, направленных против развития лейкемических трансформаций и других иммуногематологических растройств. Анализ литературных данных показывает, что в настоящее время появляется все больше различных факторов-ингибиторов пролиферации СКК. Некоторые из них уже сегодня используется в радио- и химиотерапии,

Рис.10. Влияние ФИП на абсолютное число АОК в селезенке мышей линии ЖВ после иммунизации ЭБ.

1-мъпш-гибшяы С СВАхС57ВЬ/6) И.

2-мыш ЖВ, которым вводилась среда Хенкса

3-мыши ГСВ. которым вводился ФИП

и, вероятно, в ближайшем будущем их использование в медицине принесет ощутимые результаты. К ингибиторам пролиферации ранних гемопоэтических предшественников относится ФИП, выделенный из костного мозга ребер свиньи. Наши исследования показывают, что Ш1 оказывает свое действие ва КОЕс костного мозга через гиста-миноше ^-рецепторы.

Наш результаты подтверждают данные о том, что ФИП, очевидно, является одним из немногочисленных факторов, способных подавлять пролиферативвую активность ранних гемопоэтических предшественников в костном мозге, а, следовательно, и вызывать перераспределение в направлениях диффереицировки.

вывода

1. Костномозговые клетки мышей-гибридов (СВАхС57ВЬ/6)Г1, получивших однократно инъекцию ТСП, продуцируют стимуляторную активность. Супернатант от стимулятор-лродуцирущей фракции клеток увеличивает процент КОЕс интактного костного мозга в фазе синтеза ДНК. Клетки костного мозга мшей-гибридов, получивших однократно инъекцию ГК, нарабатывают, в основном, активность, ингибируюцую пролиферацию КОЕс костного мозга (стимулированную введением ТСП).

2. Ингибитор пролиферативной активности ранних гемопоэтических предшественников (ФИП) оказывает свое действие на полипотентнне кроветворные клетки через Н-^гистаминовые рецепторы. Воздействие блокатором Н^-рецептора, пириламином, вызывало последующую отмену эффекта ФИП.

3. Эффект ФИП на функциональную активность КОЕс костного мозга не является просгаглавданзависимш, так как воздействие блокатором синтеза ПГЕ2. ивдометацивоы, не приводило к стимуляции пролиферации стволовой кроветворной клетки.

4. Развитие аутоиммунного заболевания у мышей линии №В характеризуется повышением пролиферативной активности КОЕс костного мозга: пролиферация ранних гемопоэтических предшественников у животных с антиэритроцитарными аутоантителами в крови составляет 31Ж, тогда как у здоровых животных (с Кумбс-отрицательной реакцией) данный показатель остается в пределах нормы (4%).

5. Повышение пролиферативной активности КОЕс у ЮВ мышей сопровоадается изменением в продукции костномозговых

супернатантов. Клетки костного мозга от мшей о антиэритроцитарными аутоантителами в крови продуцируют преимущественно активность, стимулирувдую пролиферацию КСЕс костного мозга, определяемую по увеличению числа стволовых клеток, находящихся в S-фазв клеточного цикла.

6. ФИП оказывает корригирущее действие на субпопуляциопную структуру КОЕс костного мозга мышей NZB: преинкубация клеток костного мозга больных мышей приводит к нормализации числа КОЗс-8, повышенного у -больных животных и снижает количество КОЕс-12 колоний.

7. СКК, шляясь предшественником всех ростков гемопоэза и иммуногенеза, вовлекается в иммунопатологические процессы через изменения в близкодействующей регуляции функциональной активности стволовой кроветворной клетки.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИЯ.

1. Orlovakaya I.A., Matrosova V.Ï-., Тзуг1ота I.G.-, Kozlov 7.А. Production of bone'marrow îactora regulatory CPOs prolifération in NZB-mice // 2nd International Symposium oi Molecular Blology oî Haematopoiesis. - Âiistrla. - 1991. - P. 78.

2. Матросова В.Ю., Орловская И.А. Продукция костно-мозговвх факторов, регулирующих пролиферативную активность СКК у шшей после воздействия гормонами, вызывающими гагмунодепрессиЕЗЕЙ эффект. //Тез.докл. I съезда иммунологов России. - Новосибирск. - 1992. - С. 294-295.

3. Орловская И.А., Матросова В.Ю. Халдояниди С.К. Нолониеобразу-яцая активность клеток костного мозга у мышей линии HZB в про-дессе развития аутоиммунного заболевания. // Тез.докл. I съезда лммунологов России. - Новосибирск. - 1992. - С. 347.

1. Матросова В.Ю., Орловская И.А., Козлов В.А. Продукция костномозговых факторов, регулирующих пролифератинную активность юлипотентной стволовой кроветворной клетки у мышей, в различных экспериментальных моделях //Иммунология. - 1995. - N 2. - С. >4-27.