Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Комплексная оценка качества гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови для клинического применения

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального

медико-биологического агентства»

04201458955 на правах рукописи

Кобзева Ирина Владимировна

КОМПЛЕКСНАЯ ОЦЕНКА КАЧЕСТВА КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПУПОВИННОЙ КРОВИ для КЛИНИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ

14.01.21 - гематология и переливание крови

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научные руководители:

Астрелина Татьяна Алексеевна - доктор медицинских наук Бубнова Людмила Николаевна - доктор медицинских наук, профессор

Санкт-Петербург 2014г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

Введение..........................................................................................4

Глава 1.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ............................................................12

1.1. Преимущества и недостатки пуповинной крови, как альтернативного источника гемопоэтических стволовых клеток............................................12

1.2. Создание банков пуповинной крови..................................................16

1.3. Сбор и обработка пуповинной крови................................................18

1.4. Тестирование концентратов пуповинной крови..................................22

1.5. Криоконсервирование и долгосрочное криохранение

клеток пуповинной крови.........................................................................26

1.5.1. Криопротекторы..........................................................................28

1.5.2. Этапы замораживания и долгосрочное криохранение гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови........................................................31

1.6. Размораживание криоконсервированных клеток пуповинной крови................................................................................................34

1.7. Клиническое применение криоконсервированных

гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови................................35

ГЛАВА И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..................................................40

2.1. Материал исследования.................................................................40

2.2. Методы исследования...................................................................45

2.3. Статистическая обработка результатов..............................................49

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.......................................51

3.1. Биологические характеристики гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови до и после длительного криохранения в автоматизированной

системе «BioArchive®».........................................................................51

3.1.1. Влияние криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®»

на качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови...............51

3.1.2. Влияние методов лейкоконцентрации на качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®»........................................................................55

3.1.3. Влияние величины гематокрита на качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови после криохранения в автоматизированной

системе «BioArchive®».........................................................................59

3.1.4 Влияние концентрации гемоконсерванта CPDA на качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®»............................................63

3.2. Влияние отечественного криопротектора ДМСО+реополиглюкин

на качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови..................67

3.3. Анализ иммуногенетических характеристик общественного регистра и эффективность подборов гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови в городе Москве....................................................................................71

3.3.1. Особенности общественного регистра гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови...........................................................................................71

3.3.2. Анализ применения криоконсервированных гемопоэтических

стволовых клеток пуповинной крови...............................................................83

3.4. Алгоритм взаимодействия Московского банка стволовых клеток с

клиническими центрами........................................................................89

ГЛАВА IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................................................92

ВЫВОДЫ.......................................................................................103

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ................................................105

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.................................................................106

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................108

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Эффективность первых аллогенных трансплантаций гемопоэтических " стволовых клеток (алло-ТГСК) пуповинной крови (ПК) у пациентов с различными -заболеваниями привела к широкомасштабному развитию клинических исследований в данной области (Gluckman Е., 2010; Wagner J.E., 2010; Broxmeyer, Н.Е., 2011).

Благодаря уникальным свойствам клеток ПК, относительной простоте и безопасности их заготовки, на сегодняшний день ПК стала одним из наиболее востребованных альтернативных источников гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) во многих странах мира (Gluckman Е., 2011; Ballen К., 2013). Ежегодно в мире проводится более 3000 алло-ТГСК ПК пациентам с различными заболеваниями (Rocha V., 2010).

С целью обеспечения систематической заготовки гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) ПК для длительного криохранения и использования их в клинической практике было создано 160 успешно функционирующих банков ПК, в которых на криохранении находится более 600 000 тестированных концентратов ПК (Welte К., 2010; Lauber S., 2010; URL:http://www.bmdw.org/). Современная система банков ПК позволяет в короткие сроки накопить большое количество тестированных концентратов ПК, создать общественный регистр и подобрать подходящего донора для большинства пациентов, нуждающихся в проведении алло-ТГСК (Navarrete С., 1998; Armitage S., 1999; Brown J., 2000; Davey S., 2004, Бубнова Л.Н., 2008).

Успех алло-ТГСК ПК во многом зависит от качества криоконсервированных ГСК ПК (Rubinstein Р. 2009; Wagner J.E., 2002; Gluckman Е., 2005; Абдулкадыров К.М., 2006).

Проведенные в различных странах исследования по оценке качества ГСК ПК в продемонстрировали достаточный процент сохранения ГСК во время криохранения (Broxmeyer Н.Е. 2003, 2011; Zinno F., 2011). Рядом зарубежных

авторов были показаны преимущества криохранения концентратов пуповинной крови в автоматизированном системе «BioArchive» и «mini-Bioarchive» (Rubinstein P., 2004; Miura J., 2008). В России аналогичные исследования единичны. В 2012 году были представлены данные по оценке сохранности CD45+, CD45+/CD34+ клеток, колониеобразующей способности ГСК ПК и длины теломер в зависимости от различных способов криоконсервирования (программное и неконтролируемое замораживание) и краткосрочного криохранения (Карпова Н.С, 2012). Также было проведено исследование по изучению влияния метода выделения ядросодержащих клеток (ЯСК) на ГСК ПК (сохранность и жизнеспособность CD45+, CD45+/CD34+ клеток) до и после криохранения в течение 7,0 ±0,42 месяцев (Хурцилава О.Г., 2012).

Одним из наиболее перспективных направлений является поиск! оптимального комбинированного криопротектора, способного сохранить' качество ГСК ПК для дальнейшего клинического применения (Cilloni D., 1999;1 Galmes А., 1999; Halle P., 2001; Bakken A.M., 2003). В России было проведено только одно исследование по оценке влияния стандартного комбинированного криопротектора ДМСО в сочетании с декстраном 40 (Pall, Великобритания) на качество ГСК ПК (Смолянинов А.Б., 2009).

Степень разработанности темы.

Вышеизложенные данные не охватывают весь комплекс критериев по оценке качества ГСК ПК, необходимый для более полной характеристики трансплантационного материала. Не завершены исследования, направленные на поиск новых оптимальных комбинированных криопротекторов с использованием отечественных реагентов, которые обеспечивали бы достаточное количество и функциональную сохранность ГСК ПК после криохранения. Востребовано постоянное получение новых данных о распределения частоты HLA - гаплотипов в регистре банков ПК для целенаправленного поиска совместимых образцов ГСК

ПК, что особенно актуально для многонациональной России. Все это обусловливает актуальность настоящего исследования.

Цель исследования

Оценить качество криоконсервированных гемопоэтических стволовых { клеток пуповинной крови, находящихся на длительном хранении в ' автоматизированной системе «BioArchive®», для клинического применения.

Задачи исследования

1. Изучить клеточный состав концентратов пуповинной крови и биологические характеристики гемопоэтических стволовых клеток (количество CD45+/CD34+ клеток, жизнеспособность CD45+ клеток, колониеобразующую активность) до и после длительного криохранения.

2. Определить влияние методов обработки, концентрации гемоконсерванта CPDA, величины гематокрита на качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови.

3. Исследовать влияние отечественного комбинированного криопротектора ДМСО+реополиглюкин, предложенного в Московском банке стволовых клеток, на качество криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови.

4. Проанализировать иммуногенетические характеристики общественного регистра и эффективность подбора гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови в г. Москве. 1

5. Разработать алгоритм взаимодействия Московского банка стволовых клеток с клиническими центрами, адаптированный к условиям организации здравоохранения в Российской Федерации, с учетом международных рекомендаций NETCORD-FACT (International Standards for Cord Blood Collection, Processing, Testing, Banking, Selection and Release).

Научная новизна работы

Впервые в России представлена комплексная оценка качества криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови (биологические и иммуногенетические характеристики), находящихся на длительном криохранении в автоматизированной системе «BioArchive®».

Изучение клеточного состава концентратов пуповинной крови и i биологических характеристик гемопоэтических стволовых клеток после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» показало, что общее количество ядросодержащих клеток незначительно снижается, преимущественно за счет фракции гранулоцитов, колониеобразующая активность гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови сохраняется на достаточно высоком уровне. Это позволяет использовать клеточный концентрат пуповинной крови в качестве альтернативного источника гемопоэтических стволовых клеток.

Выявлено, что на качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови во время криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» влияют метод выделения, величина гематокрита после лейкоконцентрации и концентрация гемоконсерванта CPDA в концентрате пуповинной крови перед криохранением.

Установлено, что отечественный комбинированный криопротектор ДМСО+реополиглюкин позволяет сохранять высокое качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови во время криохранения и может использоваться для длительного криохранения.

Впервые проанализирован характер распределения HLA-гаплотипов в общественном регистре гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови г. Москвы и показано, что характер распределения в целом соответствует таковому у славян Центральной и восточной Европы, а частота вероятности совместимости пары донор - реципиент по 3- генам HLA - системы (локусы А, В, DRB1) составляет 1:218.

Впервые разработан алгоритм взаимодействия Московского банка стволовых клеток с клиническими центрами, адаптированный к условиям организации здравоохранения в Российской Федерации с учетом международных рекомендаций NETCORD - FACT.

Теоретическая и практическая значимость

Криоконсервированные гемопоэтические стволовые клетки пуповинной крови после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» являются качественным материалом для применения в клинической практике.

В результате проведенного исследования установлены факторы, влияющий на клеточный состав концентратов пуповинной крови и биологические характеристики гемопоэтических стволовых клеток после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®», которые необходимо учитывать при использовании клеточных концентратов пуповинной крови в клинической практике: метод выделения ядросодержащих клеток, величину гематокрита после процесса лейкоконцентрации и концентрацию гемоконсерванта CPDA до криохранения.

Доказана возможность использования отечественного комбинированного криопротектора ДМСО+реополиглюкин при заготовке гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови для длительного криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®».

Иммуногенетические особенности общественного регистра гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови Московского банка стволовых клеток позволяют проводить целенаправленный поиск совместимых образцов гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови для пациентов из различных регионов России.

Предложенный алгоритм взаимодействия Московского банка стволовых клеток с клиническими центрами, адаптированный к условиям организации здравоохранения в Российской Федерации с учетом международных

рекомендаций NETCORD - FACT, позволит усовершенствовать работу в подобных учреждениях.

Методология и методы исследования

В работе использованы общенаучные (анализ проспективный и ретроспективный, обобщение данных), частные научные методы (лабораторные, клинические) и методы математической статистики.

На первом этапе исследования изучались клеточный состав пуповинной крови и биологические характеристики гемопоэтических стволовых клеток до и после длительного криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®». Выявлено влияние методов обработки пуповинной крови, содержания гемоконсерванта CPDA, величины гематокрита на качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови после криохранения. Далее установлена целесообразность использования отечественного комбинированного криопротектора ДМСО+реополиглюкин при заготовке концентратов пуповинной крови для длительного криохранения. Проведен анализ иммуногенетических характеристик общественного регистра гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови, включающий характер распределения HLA-гаплотипов и эффективность подбора совместимых образцов гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови в г. Москве. На заключительном этапе проведенной работы разработан алгоритм взаимодействия Московского банка стволовых клеток с клиническими центрами, адаптированный к условиям организации здравоохранения в Российской Федерации и с учетом международных рекомендаций NETCORD - FACT.

Положения, выносимые на защиту

1. Предложенный комплекс по оценке биологических характеристик криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови в автоматизированной системе «BioArchive®» всесторонне характеризует качество трансплантационного материала. Методы обработки пуповинной крови;

концентрация гемоконсерванта CPDA и величина гематокрита перед криохранением оказывают влияние на биологические характеристики криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови.

2. Комбинированный отечественный криопротектор ДМСО+реополиглюкин, предложенный в Московском банке стволовых клеток, является эффективным криоконсервирующим раствором и может использоваться для длительного криохранения гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови.

3. Алгоритм взаимодействия Московского банка стволовых клеток с клиническими центрами, адаптированный к условиям организации здравоохранения в Российской Федерации и разработанный с учетом международных рекомендаций NETCORD-FACT, усовершенствует работу общественных регистров гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови в подобных учреждениях.

\

Степень достоверности и апробация результатов диссертации *

Достоверность результатов исследования подтверждается объемом фактического материала и использованием современных методик статистической обработки. i

Апробация диссертации проведена 4 марта 2014 г. на расширенном заседании Проблемной комиссии №3 ФГБУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства».

Материалы диссертации доложены на: XV конгрессе педиатров России с международным участием «Актуальные проблемы педиатрии» (Москва, 2011г.), международном симпозиуме «ACUTE LEUKEMIAS XIII Biology and Treatment Strategies» (Мюнхен, 2011г.), 37 Международном симпозиуме Европейской группы ЕВМТ (Париж, 2011г.), на V международном симпозиуме «Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток у детей и взрослых памяти Раисы Горбачевой» (Санкт-Петербург, 2011г.), на V научно-практической

конференции «Современная гематология. Проблемы и решения» (Москва, 2011г.), на Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии» (Беларусь, 2011г.), на XXXIX сессии «Мультидисциплинарный подход к гастроэнтерологическим проблемам» (Москва, 2013г.), на VII Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2013г.), международной конференции 8th East-West «Immunogenetics conference» (Вена, 2014).

Внедрение результатов в практику

Результаты исследования были внедрены в практику работы Государств�