Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Влияние экстракта из отжима калины Саржента и гребней винограда амурского на физиологические и структурные характеристики эритроцитов

КУШНЕРОВА ТАТЬЯНА ВИКТОРОВНА

ВЛИЯНИЕ ЭКСТРАКТА ИЗ ОТЖИМА КАЛИНЫ САРЖЕНТА И ГРЕБНЕЙ ВИНОГРАДА АМУРСКОГО НА ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И СТРУКТУРНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЭРИТРОЦИТОВ

14 00 25 — фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Владивосток - 2007

003160183

Работа выполнена в лаборатории фармакологии Института биологии моря имени А В Жирмунского Дальневосточного отделения Российской академии наук

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор

Хотимченко Юрий Степанович

Официальные оппоненты доктор медицинский наук, профессор

Кропотов Александр Валентинович доктор медицинских наук Антонюк Марина Владимировна

Ведущая организация Государственное образовательное учреждение

высшего профессионального образования «Амурская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится «» ноября 2007 г в '/О часов на заседании Диссертационного совета К 208 007 02 при ГОУ ВПО «Владивостокский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу 690002, г Владивосток, пр Острякова, 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Владивостокский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу 690002, г Владивосток, пр Острякова, 2

Автореферат разослан « ¿Р» октября 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета

Шмыкова И И

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Важнейшими аспектами биологического действия растительных полифенольных соединений являются антиокислительные свойства (Хавинсон и др, 2003, Костюк, Потапович, 2004, Меныцикова и др, 2006, Rice-Evans, Miller, 1996, de Groot, Rauen, 1998,), способность выступать ловушками свободных радикалов различного типа (Packer et al, 1999) и взаимодействие с мембранами, что приводит к изменению их структурных характеристик (Александрова, 2005, Arora et al, 2000, Hulbert, 2003) Использование эритроцитов как модели для изучения мембранопротекторных свойств растительных препаратов, не имеет такого широкого распространения в модельных экспериментах, как, например, гепатоцитов, микросомальных мембран, эпителиальных клеток кишечника, эндотелиоцитов, тромбоцитов, нейтрофилов и других клеток (Заводник и др , 2006, Стрелкова и др , 2007, Shimoi et al, 1994, 1996, Kuo et al, 1998, Kaneko et al, 1999, Van Acker et al, 2000) Между тем, их изучение представляет интерес для расширения представлений о механизмах мембранозащитного действия растительных полифенолов и разработки на их основе лекарственных препаратов и биологически активных добавок с мембранопротекторными свойствами, а также для проверки этих свойств при проведении клинических испытаний

На сегодняшний день лекарственные средства биофлавоноидной природы являются препаратами-лидерами в терапии заболеваний печени

В работе приняты следующие сокращения АРА — антирадикальная активность, Г-SH - восстановленный глутатион, ГХС - гиперхолемстеринемия, КОПЦ - комплекс олигомерных проантоцианидинов, ЛФХ - лизофосфатидилхолин, ЛФЭ -лихофосфатидилэтаноламин, МДА — малоновый диальдегид, ПОЛ - перекисное окисление липидов, СОД - супероксиддисмутаза, СДЭ - средний диаметр эритроцита, СЖК - свободные жирные кислоты, СМ - сфингомиелин, СОЭр - средний объем эритроцита, ОРЭ - осмотическая резистентность эритроцитов, ОФЛ - общие фосфолипиды, ТАГ - триацилглицерин, ФИ - фосфатидилинозит, ФК - фосфатидная

кислота, ФЛ - фосфолипиды, ФС - фосфатидилсерин, ФХ - фосфатидилхолин, ФЭ -фосфатидилэтаноламин, ХС - холестерин, ЭЖК - эфиры жирных кислот, ЭХС - эфиры холестерина

Наиболее изучены препараты, содержащие в качестве основного действующего вещества группу полифенольных флавоноидных соединений -силимарин, выделенных из экстрактов плодов расторопши пятнистой (Silybum тагшпит G) Действие силимарина обусловлено стабилизацией клеточных мембран и включением в них фосфолипидов (Новиков, Климкина, 2005) Однако препараты, содержащие силимарин, зарубежного производства, поэтому очевидна актуальность и необходимость поиска и изучения новых источников сырья, в частности отходов от переработки растительных, дикорастущих видов Дальневосточной тайги и разработки новых эффективных отечественных мембранопротекторов В частности, на Дальнем Востоке интенсивно изучается препарат «Максар», полученный из маакии Амурской (Maakia amurensis Rupr ) (Федореев и др , 2004), экстракты из отходов от переработки (отжим, включающий гребни, кожицу, косточки) калины Саржента (Viburnum Sargentn Koehne), гребней винограда Амурского (Vitis amurensis), гребней лимонника Китайского (Schizandra chmensis) (Кушнерова, Спрыгин, Фоменко, 1995-2006) в плане восстановления функции печени в условиях экспериментальных токсических гепатитов у животных Системного исследования мембранозашитных свойств экстракта из отжима калины, включая выделение из него биологически активной субстанции в виде комплекса олигомертных проантоцианидинов (КОПЦ), а также экстракта из гребней винограда до сих пор не проводилось

Цель работы — изучить влияние экстрактов из отжима калины и гребней винограда, а также комплекса олигомерных проантоцианидинов из экстракта отжима калины в условиях воздействия мембраноповреждающих факторов

Задачи

1 Изучить физиологические характеристики, систему показателей «перекисное окисление липидов-антиоксидантная защита» и липидный состав мембран эритроцитов крыс при действии мембраноповреждающих

факторов (стресс-вертикальная фиксация за дорзальную шейную складку, интоксикация этиловым спиртом, гиперхолестериновый рацион)

2 Сравнить мембранопротекторные свойства экстракта из отжима калины и элеутерококка в условиях экспериментальной модели стресса

3 Сравнить мембранопротекторные эффекты экстракта из отжима калины и легалона, комплекса олигомерных проантоцианидинов и пикногенола в условиях экспериментальной модели интоксикации этиловым спиртом животных

4 Оценить мембранопротекторные свойства экстракта из гребней винограда в условиях экспериментальной модели гиперхолестеринового рациона

Научная новизна. Впервые выполнено системное исследование мембранопротекторных свойств водно-спиртовых экстрактов из отжима калины, гребней винограда и комплекса олигомерных проантоцианидинов, выделенного из экстракта отжима калины

Получено экспериментальное подтверждение наличия у экстрактов из отжима калины, гребней винограда и комплекса олигомерных проантоцианидинов мембранозащитных свойств

При сопоставлении эффектов экстракта из отжима калины и известного стресс-протектора экстракта элеутерококка в условиях экспериментальной модели стресс-вертикальной фиксации крыс за дорзальную шейную складку у первого обнаружены более выраженные мембранозащитные свойства по способности увеличивать в мембране эритроцитов эфиры жирных кислот и снижать лизофосфатидилхолин и фосфатидную кислоту, что предполагает более активное влияние на биосинтез фосфолипидов

Установлено, что в период депривации после интоксикации этиловым спиртом экстракт из отжима калины превосходит полифенольный препарат легалон по способности нормализовать размерные характеристики эритроцитов, повышать концентрацию восстановленного глутатиона,

снижать холестерин и сфингомиелин, что обеспечивало увеличение порога осмотической устойчивости эритроцитов к гемолизирующему агенту

Впервые обнаружено, что комплекс олигомерных проантоцианидинов и препарат пикногенол в равной степени обеспечивали восстановление мембран эритроцитов крыс после токсического действия этилового спирта

Получены новые данные о том, что в условиях гиперхолестеринового рациона экстракт из гребней винограда усиливает этерификацию холестерина, чем снижает микровязкость липидной составляющей мембран эритроцитов и восстанавливает их осмотическую устойчивость

Практическая значимость работы. Исследование расширяет недостаточно разработанные в науке представления о мембранопротекторных свойствах растительных полифенолов и, в частности, олигомерных проантоцианидинов Материал о мембранозащитном действии экстрактов из отжима калины, гребней винограда и комплекса олигомерных проантоцианидинов в отношении изменений показателей системы «перекисное окисление липидов-антиоксидантная защита», физиологических и структурных характеристик эритроцитов при действии повреждающих факторов может быть использован при разработке медико-биологической документации на применение этих средств в качестве биологически активной добавки как в нативном виде, так и в составе продуктов питания Экстракт из отжима калины используется при производстве функционального пищевого продукта - мармелада «Биолад-кадина» (ТУ 9128-152-02067936-2006) Положения, выносимые на защиту

1 Экстракт из отжима калины по способности препятствовать стресс-индуцированным отклонениям показателей физиологических и структурных характеристик мембран эритроцитов сопоставим со стресс-протекторным препаратом экстрактом элеутерококка

2 Экстракт из отжима калины в период депривации после интоксикации животных этиловым спиртом по способности восстанавливать липидный состав и физиологические характеристики эритроцитов сопоставим с

известным полифенольным препаратом легалон, а комплекс олигомерных проантоцианидинов сопоставим с известным препаратом пикногенол 3 Экстракт из гребней винограда обладает выраженным гипохолестеринемическим и мембранопротекторным эффектом в условиях гиперхолестеринового рациона

Апробация работы. Основные результаты работы представлены, доложены и обсуждены на Всероссийской научной молодежной конференции «Биологически активные добавки и здоровое питание» (Улан-Уде, 2001), П-й и Ш-й Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины» (Владивосток, 2001, 2002), 9-й Пущинской школы конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2005), Третьем съезде общества биотехнологов России им Ю А Овчинникова (Москва, 2005), III Международном Тихоокеанском конгрессе по традиционной медицине (Владивосток, Сеул 2006) Работа выполнена при поддержке гранта «Старт» № 7371 Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах, входящих в список ВАК

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 133 страницах и содержит введение, обзор литературы, характеристику материала и методов исследования, описание результатов собственных исследований, обсуждение результатов и выводы Список литературы включает 278 работ, в том числе 126 отечественных и 152 зарубежных авторов Текст иллюстрирован 19 рисунками и 9 таблицами

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные животные. В экспериментах использовано 140 крыс-самцов линии Вистар Крыс получали из питомника РАМН «Столбовая» (г Чехов Московской области)

Острый стресс моделировали вертикальной фиксацией животных за дорзальную шейную складку на 22 часа (Добряков, 1996)

Интоксикация этанолом. Животным в течение 7 дней внутрибрюшинно вводили 33%-ный этанол в дозе 7,5 мл/кг 2 раза в сутки (ва^ов et а1, 1972)

Экспериментальную гиперхолестерннемню (ГХС) вызывали введением в рацион животных повышенного содержания насыщенных жиров (растительное сало 25% от веса рациона), включающих 2,5% холестерина (Мещерская и др 1966) в течение 6 недель

По завершении каждого эксперимента животных выводили из него методом декапитации под легким эфирным наркозом Кровь для исследований собирали из шейной вены животных в пробирку с 1% раствором гепарина из расчета 0,02 мл раствора на 1 мл крови

Выделение эритроцитов. Гепаринизированную кровь центрифугировали 10 мин при 3000 g Плазму удаляли, а эритроциты отмывали 0,9% раствором ИаС1, хорошо перемешивая, осаждали центрифугированием, супернатант удаляли (Новгородцева и др , 2003)

Физиологические характеристики эритроцитов. В мазках крови, окрашенных азур-эозиновой смесью, с помощью окуляр-микрометра определяли диаметр эритроцитов (мкм) Средний объем эритроцита (СОЭр) вычисляли по формуле СОЭр = ё3 х 0,2 (мкм3), где <1 - средний диаметр эритроцита (Гольдберг и др, 1973) Осмотическую резистентность эритроцитов (ОРЭ) определяли по методу Б Эндрю (1972)

Биохимические методы. Состояние антиоксидантной системы оценивали по величине антирадикальной активности крови (ЯоиасЬ е1 а1, 1997), активности супероксиддисмутазы (КФ 115 11) (Рао1ейу е1 а1, 1986), уровня восстановленного глутатиона (Новгородцева и др , 2003), малонового диальдегида (Гончаренко, Латинова, 1985) Эритроциты выделяли по методу МСУсатенко и Г И Берлин (1979) Экстракция липидов из эритроцитов

(Folch et al, 1957), определение общих фосфолипидов (Vaskovsky et al, 1975), приготовление систем растворителей для микротонкослойной хроматографии и реактивов для идентификации фосфолипидов (Кейтс, 1975, Wagner et al, 1961, Rouser et al, 1967, Vaskovsky et al, 1975), микротонкослойная хроматография фосфолипидов (Svetachev, Vaskovsky, 1972), определение количественного содержания фракций фосфолипидов (Vaskovsky et al, 1975), хроматографическое разделение и количественное определение фракций нейтральных липидов (Amenta, 1964)

Экстракт из отжима калины Саржента (Viburnum Sargentn Koehne) (ось соцветия, косточки и кожица ягод после отделения сока) Запатентован как гепатопротектор (патент № 2177330, свидетельство на товарный знак «Калифен» RU № 228327 и En № 225516) и как экстракт калины, обладающий антирадикальной активностью (патент № 2220614 приоритет от 20 09 2001 г)

Экстракт из гребней винограда Амурского (Vitis amurensis) (патент № 1473139, свидетельство на товарный знак «Диприм» № 236689,)

Комплекс олигомерных проантоцианидинов (КОИЦ) был выделен из экстракта отжима калины и запатентован как биологически активная добавка к пище (варианты) (патент № 2199249)

Растительные экстракты имеют сложный состав различных классов веществ, в котором по количеству преобладают лейкоантоцианы, катехины и их полимерные формы, флавонолы, органические кислоты, свободные аминокислоты, сахара и ряд других органических соединений Основные представители флавоноидов составляли 60% от сухого веса экстрактов, которые и определяют их биологическую активность

Предварительно освобожденные от спирта экстракты (путем упаривания в вакууме) животным вводили в виде водных растворов внутрижелудочно (по 0,4 мл/кг) в дозе, соответствующей 100 мг общих полифенолов на кг массы тела животного (Венгеровский и др , 1999) Выбор дозы для КОПЦ (100 мг/кг) в экспериментах на животных осуществляли,

основываясь на литературных данных (Kropacova, et al,, 1998; Ray et al., 2001)- В качестве препаратов с равнения использовали «Легален» (MADAUS AG, Германия), комплекс олигомерных проантоцианидшюв «Пикногенол» (Stryka Botanicals, Switzerland), выделенный из коры морской сосны (Pinus maritime), аптечный экстракт элеутерококка..

Статистические методы. Экспериментальные данные обработаны методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента. Для расчетов применяли программу «STATISTICA for Windows, release 5.1».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Влияние экстракта из отжима калины на физиологические и стру1стурныс характеристики эритроцитов крыс при стрессе

Влияние стресса сопровождалось достоверным увеличением СДЭ на 26% (Р<0,001), СОЭр в 2 раза (Р<0,001) и ХС на 10%(Р<0,05) (рис. 1).

□ Стресс ИИ Стрссс+эксттракгг :>'< .i;im i а Стресс-Ьэлеут1:рококк

1Z0 -| к 100 "

1 2ii~ fl *'

8 ц _ J 1—^ т

a

-80

СДЭ СОЭр ХС ОФЛ ХС/ОЛ СОД Г-SH АРА МДА

РисЛ Влияние экстракта из отжима калины и элеутерококка на физиологические характеристики эритроцитов крыс и показатели системы ПОЛ-АОЗ при стрессе * - Р < 0,05; ** - Р < 0,0); *** - Р < 0,001.

Известно, что в результате встраивания холестерина в мембрану эритроцитов увеличиваются их размеры и изменяется форма происходит превращение двояковогнутых дисков в сфероциты и эхиноциты (Лопухин и др , 1983, Lindl et al, 1998) Снизилось количество общих фосфолипидов, что привело к увеличению коэффициента холестерин/фосфолипиды Такие изменения в структуре мембран эритроцитов обусловили снижение осмотической устойчивости эритроцитов к гемолизирующему агенту, что определяет повышение проницаемости мембран Также влияние стресса сопровождалось увеличением активности СОД на 46% (Р<0,001) и снижением уровня Г-SH на 23% (Р<0,001), что связано с высокой концентрацией супероксиданионов и расходованием резервов глутатиона То есть, при стрессе происходит рассогласование процессов антиоксидантной и антирадикальной защиты, которое обусловливает активацию перекисного окисления липидов, подтверждением чего является увеличение уровня МДА на 15% (Р<0,05)

При введении животным экстракта из отжима калины и препарата сравнения известного стресс-протектора экстракта элеутерококка нормализовало многие исследованные параметры Восстановились и даже расширились границы устойчивости к гемолизирующему агенту. Однако экстракт элеутерококка показал меньшую эффективность в процессах восстановления сохранялись повышенными размерные характеристики эритроцитов, что обусловлено увеличенным коэффициентом ХС/ФЛ.

Тот факт, что АРА при введении как экстракта из калины, так и элеутерококка оставался пониженным относительно контроля (на 28% и 33%, соответственно), говорит об истощении антирадикальной защиты при использованной модели стресса, но эти величины были гораздо выше, чем таковые при чистом стрессе

При исследовании липидной составляющей мембран эритроцитов обращает внимание повышенный уровень ТАГ на 14% (Р<0,01), СЖК на 13% (Р<0,01) и пониженный ЭХС на 22% (Р<0,001) (Рис 2)

□ Стресс □ Стресе+экстраюг калины ЭСтресс+экстрэкт элеутерококка

ТАГ сжк ЭЖК эхе ФХ ЛФХ СМ ФЭ ЛФЭ ФС ФИ ФК хс

Рис.2. Влияние экстракта из отжима калины и элеутерококка на ляпидцьтй состав мембран эритроцитов крыс при стрессе * - Р < 0,05; ** - Р < 0,01; *** -Р< 0,001

Считается, что компенсаторным ответом на ítoвреждающее действие стресса являете» увеличение содержания ХС в мембране, обеспечивающее поддержание упорядоченности ее структуры и сохранение целостности.

Снижение ЭХС при стрессе связано с угнетением лсп^тин-х&д-ест-ернн-ацилтрансферазы (ЛХАТ), фермента, участвующего в катаболизме липопротеинов (Никифорова, 1981; Carrasco et al., 1998). То есть, изменении в соотношении неэтерифицированного холестерина и его эте риф и цир осанной формы обусловлены нарушением в соотношении линопротеинов (известный в литературе факт повышения ДНОНП и ЛЩШ при стрессе), что отражается на липидной сосгдаадэщей мембран эритроцитов. В ф ос фол и пи дном спектре отмечалось достоверное равнозначное снижение основных структурных компонентов мембран ФХ и ФЭ на 8% &<0,01), и увеличение их лизоформ rra l3-t5% (Р<0,05), что свидетельствует об активации фосфолипазы А2 и увеличении проницаемости мембран (Kabarowsky et ai,, 2002).

Однако компенсаторной реакцией на повышение проницаемости мембран эритроцитов явилось повышение количества СМ на 30% (Р<0,001) Разбалансировка в соотношении метаболически активных фракций фосфолипидов (ФИ и ФК) в среднем на 18% (Р<0,01) в мембране эритроцитов, обусловливает угнетение активности мембраносвязанных ферментов, таких как глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа и №+-К+-АТФаза (Меерсон, 1986)

Известно (Хныченко, Сапронов, 2003), что стресс-вертикальная фиксация крыс сопровождается глубокими структурно-функциональными нарушениями в виде снижения жидкостных свойств мембран эритроцитов, увеличения микровязкости липидного бислоя, повышения его насыщенности и жесткости То есть, возникает необходимость защиты мембран эритроцитов от повреждающего действия стресса Введение экстракта из калины и элеутерококка нормализовало показатели липидного состава мембран эритроцитов Однако следует отметить, что при введении экстракта калины уровень ЭЖК был выше контроля на 29% (Р<0,001), а ФК был ниже на 10% (Р<0,05), что может считаться позитивным моментом и являться одним из механизмов репаративного действия экстракта, так как эти два компонента являются основой для синтеза всех фосфолипидов По остальным показателям экстракт из отжима калины проявлял свойства сходные с таковыми у элеутерококка Например, равнозначное снижение холестерина на 10% Данный феномен объясняется тем, что молекулы полифенолов активируют фермент 7а-холестерингидроксилазу, участвующего в окислении ХС в желчные кислоты, а также ЛХАТ, который обусловливает выведение холестерина из мембран и поступление в гепатоцит возросшего потока холестерина в этерифицированной форме в составе липопротеинов высокой плотности (Гаскина и др, 1989) То есть, растительные полифенолы имеют выраженные гипохолестеринемические свойства

2. Влияние экстракта из отжима калины на физиологические и структурные характеристики эритроцитов крыс при алкогольной

интоксикации

Алкогольная интоксикация животных в течение 7 дней сопровождалась увеличением размерных характеристик эритроцитов (СДЭ на 16% и СОЭр на 67%, Р<(),001}, повышением в них ХС па 13% (Р<0,05), снижением общих фосфоляпидов на 13% (Р<0,001) и ростом коэффициента ХС/ФЛ (рис. 3),

СОД Г-SH АРА МДА СДЭ СОЭр ХС ФЛ ХС/ФЛ

Рис.З. Влияние растительных подифенольных комплексов на показатели системы ПОЛ-АОЗ в крови крыс, на физиологические и структурные характеристики эритроцитов крыс при интоксикации этанолом и в период депривации * - Р < 0,05 ; ** - Р < 0,01; *** - Р < 0,001

То есть подтверждается известный в литературе факт о развитии макрощпша при алкогольной интоксикации (Сторожок и др., 2001; Lieber, 2005). Анализ компонентов системы «перекисное окисление липидон-антиоксидантная защита» показал, что алкогольная интоксикация сопровождалась увеличением активности СОД на 48% (Р<0,001), а также снижением АРА и Г-SH, в среднем, на 14% (Р<0,001). Такое соотношение

компонентов системы антиокеидантной защиты предполагает ее напряжение и тенденцию к истощению. Веш'шнаМДА к крови крыс после интоксикации этанолом была на 39% (Р<0,001) выше, чем таковая б контроле, что свидетельствует об активации перекисного окисления липидов мембран эритроцитов.

Факт увеличения количества ЭЖК на 11% (Р<0,05) обусловлен усилением реакции этарификации СЖК с этанолом, что определяет его разжижающий эффект на мембраны (рис. 4).

□ Этанол СЦДепривяцця 5 Лепр и п лция кст | >ат кнл и н ы

В Депривяция' легалои 0 Д е п |>м на ц к и+ КО П Ц Ш Д СП р НВ ¡1ЦНЯ+ П ПК 1 ЮГ«|Ш

Рис.4. Влияние растительных полифенольных комплексов на липидный состав эритроцитов крыс при интоксикации этанолом и в период депривации * - V < 0.05; ** -Р <0,05; *** -Р <0,005

Отмечался дисбаланс в содержании фосфолипщщых фракций: снижалось содержание основных структурных фосфолипидов мембран: ФХ и ФЭ на 12% и б% (Р<0,01), соответственно, при этом, уровень ЛФХ увеличивался на 62% (Р<0,01), а ЛФЭ на 7% {?<(?,О)). В то же время возрастал уровень СМ на 31% (Р<0,001), который является стабилизатором мембран. Алкогольная интоксикация сопровождалась увеличением количества ФС на 28% (Р<0,001) и снижением количества ФИ на 9%

(Р<0,001), необходимых для функционирования мембраносвязанных ферментов

Изменения в соотношении фосфолипидных фракций в мембране эритроцитов косвенно предполагает повышение вязкости и жесткости мембран, снижению их лабильности (Шевченко и др , 2002)

В период отмены этанола (депривация) в течение 7 дней полного восстановления физиологических характеристик, показателей антиоксидантной защиты, липидной составляющей мембран эритроцитов не наблюдалось, что определяет продолжение стрессовой реакции после воздействия токсического агента (в частности, этанола) Сохранялся макроцитоз, который может быть обусловлен стойкостью патологических сдвигов в соотношении групп липопротеинов плазмы крови, влияющих на состав липидов в мембране эритроцитов Количество ТАГ и СЖК осталось на уровне величин, зарегистрированных при введении этанола Несколько снизилось содержание ЭЖК, что обусловлено отсутствием этанола Еще выше стал уровень ЛФХ (на 69%, Р<0,001) и ЛФЭ (на 11%, Р<0,01), что говорит о сохраняющейся высокой активности фосфолипаз На 27% уменьшилось количество ФК (Р<0,001) Следовательно, в организме в период депривации сохраняются радикальные реакции и оксидативное поражение мембран

Введение экстракта из отжима калины, легалона, КОПЦ и пикногенола в период депривации способствовало нормализации практически всех изученных физиологических и структурных характеристик эритроцитов При сопоставлении эффектов экстракта из калины и легалона в период депривации показало, что при введении легалона оставалась повышенными СОЭр, активность СОД, уровень МДА и сниженной концентрация ФЛ, Г-БН и АРА То есть, в течение 7 дней после прекращения алкогольной интоксиации экстракт из калины был более эффективен, чем легалон в плане нормализации антиоксидантной и антирадикальной защиты По остальным параметрам экстракт калины полностью соответствует эффекту легалона

При введении КОПЦ и пикногенола наблюдалась нормализация практически всех исследуемых параметров эритроцитов То есть, КОПЦ и пикногенол в равной степени обеспечивали восстановление мембран после токсического действия этилового спирта

Полученные результаты указывают на мембранопротекторный эффект как экстракта из отжима калины, так и легалона, а также КОПЦ и пикногенола

3. Влияние экстракта из гребней винограда на физиологические и структурные характеристики эритроцитов крыс при гиперхолестериновом рационе

Гиперхолестериновый рацион является одной из распространенных экспериментальных моделей формирования гиперхолестеринемии, при которой происходит встраивание холестерина из липопротеинов в мембрану эритроцитов, что сопровождается увеличением их размеров (Левачев, 1986) В наших исследованиях это подтвердилось СДЭ вырос на 37% (Р<0,001) и СОЭр в 2,6 раза (Р<0,001), что определяет развитие макроцитоза (рис 5)

Начало гемолиза происходило позже, чем в контроле (в контроле при данной концентрации НаС1 он уже заканчивался), а интервал концентраций между началом и завершением гемолиза был всего 0,05%, тогда как в контроле - 0,1% Это свидетельствует о том, что проницаемость мембран эритроцитов при ГХС была ниже, чем таковая в контроле и при стрессе за счет большего количества холестерина в мембране, являющегося ее стабилизатором Так как холестерин снижает эластичность мембраны, то при гиперхолестериновом рационе эритроцит имеет меньшие возможности к растяжению, чем в других экспериментальных моделях, что и обусловило более быстрое завершение гемолиза

|дГХС Ш ГХС+ЭКСУраст из грейнсП винограда |

Ш- ■ Д!^

1 . «А*- . ТТТШ -

ШШ 1 1 | ■ 1 1*1 4 1ШШ1 '

СДЭ СОЭр начало окончание ФЛ ХС/ФЛ ХС гемолиза гемолиза

Рис. 5. Влияние экстракта ж гребней винограда на физиологические и структурные характеристики эритроцитов крыс при гиперхо лестеринемии (ГХС) * - Р < 0,05; *** - Р < 0,001.

Анализ липидной составляющей мембран эритроцитов (рис. б) показал увеличение ТАГ, СЖК, ХС; что обусловлено рационом, богатым насыщенными жирами и холестерином.

Снижение основного структурного компонента мембран - ФХ, компенсируется увеличением СМ. То есть, мембрана при таком соотношении липидных фракций обладает жесткостью, низкой эластичностью и лабильностью. Кроме того, снижение количества ФИ и ФК определяет нарушение активности Иа^-К'-АТФазы (Бурлакова, 1977). Следовательно, данная экспериментальная модель вызывает более глубокие нарушения структуры мембран.

Введение экстракта из гребней винограда ока:«;,то позитивный эффект на исследованные параметры. Снизился уровень холестерина в мембране, восстановился уровень общих фосфолинидов, что обусловило снижение коэффициента ХС/ФЛ. Значительно снизился объем эритроцитов, хотя и оставался еще достоверно повышенным.

РГХС ШГХС+эксгцакт из гребней ииногцида |

ЯК п

1М та ли — — ТТЛ

ш ■ 1 _ •ЦТ" ' ш ' ии^ 1 и- 1 [_ри ■ у 1

ТАГ сжк ЭЖК ЭХС ФХ ЛФХ СМ ФЭ ЛФЭ ФС Щ ФК хс

Рис.б. Влияние экстракта из 1ребией винограда на липидный состав эритроцитов крыс ори гиперхолестеринемии (ГХС) * - Р < 0,05; ** - р < 0,01;

***_р< о,001

Границы Осмотической устойчивости расширились до 0,1%, что говорит об увеличении эластичности мембраны эритроцита. То есть, полученные результаты еще раз подтверждает выше сказанное о том, что растительные полифенолы активируют реакцию ЛХАТ, при которой холестерин преобразуется в эфирную форму и его избыток выходит яз мембран. Это снижает мякровязкость липидной составляющей мембран эритроцитов и восстанавливает их осмотическую устойчивость.

Одним из важнейших механизмов действия полифенольньгх комплексен является угнетение процессов ПОЛ, благодаря их способности улавливать свободные оксигенные ы пероксисилы-ше радикалы ек а!.,

1994). Однако, при сравнении выраженности антиоксидантного действия легалона (но содержанию МДА и АРА) с таковыми у экстракта из отжима калины и КОПЦ, проявляются определенные преимущества у двух последних. Известно, что в состав легалона входит активная группа изомерных флавоноидных содинений (силибинин, силикристин, силндианин), не образующих ол иго мерных форм. Как проантоцианидипы.

так и полифенолы легалона способны к образованию феноксил-радикала, взаимодействие которого с другими свободными радикалами приводит к обрыву цепи свободнорадикального процесса Однако проантоцианидины образуют феноксил-радикал, имеющий более высокую стабильность, чем образующийся из мономерных флавоноидов (Вогб е! а1, 2000) По видимому, проантоцианидины, будучи полимерными веществами, демонстрируют антирадикальные свойства в большей степени, чем мономеры легалона Данный феномен объясняется тем, что молекулы полифенолов, встраиваясь в наружний монослой мембран, способны упорядочивать жирнокислотные хвосты фосфолипидов и снижать возможность атаки радикалами (Афанасьева и др , 2007, Кгорасоуа е! а1., 1998)

Также меньшая эффективность легалона связана с очень низкой биодоступностью компонентов, входящих в его состав из-за ограниченной их растворимости в водной фазе (Бсойоуа е1 а1, 2001, Кип е1 а1, 2003) и, следовательно, низкой абсорбции в желудочно-кишечном тракте

ВЫВОДЫ

1 Экстракты из отжима калины, гребней винограда и комплекс олигомерных проантоцианидинов, выделенный из экстракта отжима калины, проявляют мембранопротекторные свойства в условиях воздействия мембраноповреждающих факторов у животных

2 Экстракт из отжима калины и комплекс олигомерных проантоцианидинов нормализуют показатели системы «перекисное окисление липидов-антиоксидантная защита» за счет собственной антирадикальной и антиоксидантной активности, регулируют реакции этерификации холестерина и нормализуют соотношение фосфолипидных фракций, что обусловливает восстановление размерных характеристики эритроцитов (средний диаметр и средний объем эритроцитов), повышение их эластических свойств и расширение границ осмотической устойчивости

3 Экстракт из отжима калины в условиях стресс-вертикальной фиксации животных превосходит экстракт элеутерококка по способности увеличивать в мембране эритроцитов эфиры жирных кислот и снижать лизофосфатидилхолин и фосфатидную кислоту

4 Экстракт из отжима калины в период депривации после интоксикации этиловым спиртом превосходит полифенольный препарат легалон по способности нормализовать размерные характеристики эритроцитов, повышать концентрацию восстановленного глутатиона, снижать холестерин и сфингомиелин, что обеспечивает увеличение порога осмотической устойчивости эритроцитов к гемолизирующему агенту Комплекс олигомерных проантоцианидинов и пикногенол в равной степени обеспечивают восстановление мембран эритроцитов крыс после токсического действия этилового спирта

5 Экстракт из гребней винограда обладает мембранопротекторным эффектом в условиях гиперхолестеринового рациона, усиливает этерификацию холестерина и выведение его из мембран, нормализует соотношение липидных компонентов и восстанавливает осмотическую устойчивость

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Кушнерова Т В Гребни винограда Амурского - источник природных антиоксидантов // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины сб тез докл II Тихоокеанской науч -практ конф студентов и молодых ученых медиков с междунар участием - Владивосток, 2001 -С 9

2 Кушнерова Т В Эффективность использования пищевой добавки «Диприм» при восстановлении структурной организации мембран эритроцитов // Биологически активные добавки и здоровое питание сб материалов Всероссийской науч молодежной конф с междунар участием -Улан-Уде, 2001 -С 73-74

3 Кушнерова Т В Эффективность использования природных биологически активных веществ при стрессе // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины сб тез докл II Тихоокеанской науч -практ конф студентов и молодых ученых медиков с междунар участием - Владивосток, 2002 - С 5

4 Кушнерова Т В , Лесникова Л H Влияние этилового спирта на липидный состав мембран эритроцитов и его коррекция растительными комплексами полифенолов //Биология - наука XXI века сб тез 9-й междунар Пущинской школы-конф молодых ученых — Пущино, 2005 — С 152

5 Кушнерова ТВ Профилактика нарушений липидного состава мембран эритроцитов комплексом растительных полифенолов из калины // Третий Съезд общества биотехнологов России им Ю А Овчинникова сб материалов - Москва, 2005 - С 58-59

6 Кушнерова Т В , Хотимченко Ю С Влияние стресса на структуру мембран эритроцитов и коррекция природными полифенолами // Третий междунар Тихоокеанский конгресс по традиционной медицине сб материалов - Владивосток, Сеул, 2006 - С 158-159

7 Кушнерова Т В Применение экстракта из винограда Vitis Amurensis при экспериментальной гиперхолестеринемии // Бюлл физиологии и патологии дыхания 2007 Вып 25 С 47-50

8 Фоменко С Е , Кушнерова H Ф , Спрыгин В Г , Кушнерова Т В Обоснование применения проантоцианидинов в комплексной терапии хронического алкоголизма // Наркология 2007 № 7 С 46-51

Татьяна Викторовна Кушнерова

ВЛИЯНИЕ ЭКСТРАКТА ИЗ ОТЖИМА КАЛИНЫ САРЖЕНТА И ГРЕБНЕЙ ВИНОГРАДА АМУРСКОГО НА ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И СТРУКТУРНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЭРИТРОЦИТОВ

Автореферат

Подписано к печати 27 09 2007 Уел печ л 1,0 Уч-изд л 1,0

Формат 60x84/16 Тираж 100 Заказ №71

Отпечатано в ОНТИ Тихоокеанского океанологического института ДВО РАН Владивосток, Балтийская, 43

Актуальность проблемы. Важнейшими аспектами биологического действия растительных полифенольных соединений являются антиокислительные свойства (Хавинсон и др., 2003; Костюк, Потапович, 2004; Меныцикова и др., 2006; Salja et al., 1995; Rice-Evans, Miller, 1996; de Groot, Rauen, 1998; Vasiljeva et al., 1998), способность выступать ловушками свободных радикалов различного типа (van Acker et al., 1998; Packer et al., 1999) и взаимодействие с мембранами, что приводит к изменению их структурных характеристик (Александрова, 2005; Huh et al., 1996; Arora et al., 2000; Hulbert, 2003). Использование эритроцитов как модели для изучения мембранопротекторных свойств растительных препаратов, не имеет такого широкого распространения в модельных экспериментах, как, например, гепатоцитов, микросомальных мембран, эпителиальных клеток кишечника, эндотелиоцитов, тромбоцитов, нейтрофилов и других клеток (Заводник и др., 2006; Стрелкова и др., 2007; Shimoi et al., 1994, 1996; Kuo et al., 1998; Kaneko et al., 1999; Van Acker et al., 2000). Между тем, их изучение представляет интерес для расширения представлений о механизмах мембранозащитного действия растительных полифенолов и разработки на их основе лекарственных препаратов и биологически активных добавок с мембранопротекторными свойствами, а также для проверки этих свойств при проведении клинических испытаний.

На сегодняшний день лекарственные средства биофлавоноидной природы являются препаратами-лидерами в терапии заболеваний печени. Наиболее изучены препараты, содержащие в качестве основного действующего вещества группу полифенольных флавоноидных соединений -Silimarin, выделенных из экстрактов плодов расторопши пятнистой (Silybum marianum G.). Действие силимарина обусловлено стабилизацией клеточных мембран и включением в них фосфолипидов (Новиков, Климкина, 2005). Однако препараты, содержащие силимарин, зарубежного производства, поэтому очевидна актуальность и необходимость поиска и изучения новых источников сырья, в частности отходов от переработки растительных, дикорастущих видов Дальневосточной тайги и разработки новых эффективных отечественных мембранопротекторов. В частности, на Дальнем Востоке интенсивно изучается препарат «Максар», полученный из маакии Амурской (Maakia amitrensis Rupr.) (Федореев и др., 2004), экстракты из отходов от переработки (отжим, включающий гребни, кожицу, косточки) калины Саржента (Viburnum Sargenta Koehne), гребней винограда Амурского (Vitis amnrensis), гребней лимонника Китайского (Schizandra chinensis) (Кушнерова, Спрыгин, Фоменко, 1995-2006) в плане восстановления функции печени в условиях экспериментальных токсических гепатитов у животных. Системного исследования мембранозащитных свойств экстракта из отжима калины, включая выделение из него биологически активной субстанции в виде комплекса олигомертных проантоцианидинов (КОПЦ), а также экстракта из гребней винограда до сих пор не проводилось.

Как известно, действие на организм повреждающих факторов (физический и химический стресс) сопровождается нарушением физиологических свойств и существенным сдвигом в липидной составляющей мембран эритроцитов (Молотов-Лучанский и др., 2005; Лесникова, 2006; Кашапова и др., 2007; Lindi et al., 1998; Thompson, 1999). Также показано, что экстракты из отжима калины и гребней винограда, комплексы олигомерных проантоцианидинов способствуют стабилизации мембран лизосом и гепатоцитов в условиях интоксикации четыреххлористым углеродом и этиловым спиртом (Спрыгин и др., 2002, 2004; 2006; Фоменко и др., 2003). Эти данные подтверждают перспективность исследования экстракта из отжима калины, гребней винограда и комплекса олигомерных проантоцианидинов как мембранопротекторных средств.

В настоящем исследовании анализируется действие мембраноповреждающих факторов (стресс-вертикальная фиксация крыс за дорзальную шейную складку, интоксикация этиловым спиртом и гиперхолестериновый рацион) на физиологические характеристики, систему показателей «перекисное окисление липидов-антиоксидантная защита» и липидную составляющую мембран эритроцитов, а также демонстрируется возможность коррекции наблюдаемых отклонений с помощью водно-спиртового экстракта из отжима калины и гребней винограда, а также комплекса олигомерных проантоцианидинов, выделенного из экстракта отжима калины.

Цель работы — изучить влияние экстрактов из отжима калины и гребней винограда, а также комплекса олигомерных проантоцианидинов из экстракта отжима калины в условиях воздействия мембраноповреждающих факторов.

Задачи:

1. Изучить физиологические характеристики, систему показателей «перекисное окисление липидов-антиоксидантная защита» и липидный состав мембран эритроцитов крыс при действии мембраноповреждающих факторов (стресс-вертикальная фиксация за дорзальную шейную складку, интоксикация этиловым спиртом, гиперхолестериновый рацион).

2. Сравнить мембранопротекторные свойства экстракта из отжима калины и элеутерококка в условиях экспериментальной модели стресса.

3. Сравнить мембранопротекторные эффекты экстракта из отжима калины и легалона, комплекса олигомерных проантоцианидинов и пикногенола в условиях экспериментальной модели интоксикации этиловым спиртом.

4. Оценить мембранопротекторные свойства экстракта из гребней винограда в условиях экспериментальной модели гиперхолестеринового рациона.

Научная новизна. Впервые выполнено системное исследование мембранопротекторных свойств водно-спиртовых экстрактов из отжима калины, гребней винограда и комплекса олигомерных проантоцианидинов, выделенного из экстракта отжима калины.

Получено экспериментальное подтверждение наличия у экстрактов из отжима калины, гребней винограда и комплекса олигомерных проантоцианидинов мембранозащитных свойств.

При сопоставлении эффектов экстракта из отжима калины и известного стресс-протектора экстракта элеутерококка в условиях экспериментальной модели стресс-вертикальной фиксации крыс за дорзальную шейную складку у первого обнаружены более выраженные мембранозащитные свойства по способности увеличивать в мембране эритроцитов эфиры жирных кислот и снижать лизофосфатидилхолин и фосфатидную кислоту, что предполагает более активное влияние на биосинтез фосфолипидов.

Установлено, что в период депривации после интоксикации этиловым спиртом экстракт из отжима калины превосходит эталонный полифенольный препарат легалон по способности нормализовать размерные характеристики эритроцитов, повышать концентрацию восстановленного глутатиона, снижать холестерин и сфингомиелин, что обеспечивало увеличение порога осмотической устойчивости эритроцитов к гемолизирующему агенту.

Впервые обнаружено, что комплекс олигомерных проантоцианидинов и эталонный препарат пикногенол в равной степени обеспечивали восстановление мембран эритроцитов крыс после токсического действия этилового спирта.

Получены новые данные о том, что в условиях гиперхолестеринового рациона экстракт из гребней винограда усиливает этерификацию холестерина, чем снижает микровязкость липидной составляющей мембран эритроцитов и восстанавливает их осмотическую устойчивость.

Практическая значимость работы. Исследование расширяет недостаточно разработанные в науке представления о мембранопротексторных свойствах растительных полифенолов и, в частности, олигомерных проантоцианидинов. Материал о мембранозащитном действии экстрактов из отжима калины, гребней винограда и комплекса олигомерных проантоцианидинов в отношении изменений показателей системы «перекисное окисление липидов-антиоксидантная защита», физиологических и структурных характеристик эритроцитов при действии повреждающих факторов может быть использован при разработке медико-биологической документации на применение этих средств в качестве биологически активной добавки как в нативном виде, так и в составе продуктов питания. Экстракт из отжима калины используется при производстве функционального пищевого продукта - мармелада «Биолад-калина» (ТУ 9128-152-02067936-2006).

Положения, выносимые на защиту:

1. Экстракт из отжима калины по способности препятствовать стресс-индуцированным отклонениям показателей физиологических и структурных характеристик мембран эритроцитов сопоставим со стресс-протекторным препаратом экстрактом элеутерококка.

2. Экстракт из отжима калины в период депривации после интоксикации животных этиловым спиртом по способности восстанавливать липидный состав и физиологические характеристики эритроцитов сопоставим с известным полифенольным препаратом легалон, а комплекс олигомерных проантоцианидинов сопоставим с известным препаратом пикногенол.

3. Экстракт из гребней винограда обладает выраженным гипохолестеринемическим и мембранопротекторным эффектом в условиях гиперхолестеринового рациона.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены, доложены и обсуждены на Всероссийской научной молодежной конференции «Биологически активные добавки и здоровое питание» (Улан-Уде, 2001), Н-й и Ш-й Тихоокеанских научно-практических конференциях студентов и молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины» (Владивосток, 2001, 2002), 9-й Пущинской школы конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2005), Третьем съезде общества биотехнологов России им.

Ю.А.Овчинникова (Москва, 2005), III Международном Тихоокеанском конгрессе по традиционной медицине (Владивосток, Сеул 2006).

Работа выполнена при поддержке гранта «Старт» № 7371.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах.

ВЫВОДЫ

1. Экстракты из отжима калины, гребней винограда и комплекс олигомерных проантоцианидинов, выделенный из экстракта отжима калины, проявляют мембранопротекторные свойства в условиях воздействия мембраноповреждающих факторов как у животных, так и у человека.

2. Экстракт из отжима калины и комплекс олигомерных проантоцианидинов нормализуют показатели системы «перекисное окисление липидов-антиоксидантная защита» за счет собственной антирадикальной и антиоксидантной активности, регулируют реакции этерификации холестерина и нормализуют соотношение фосфолипидных фракций, что обусловливает восстановление размерных характеристик эритроцитов (средний диаметр и средний объем эритроцитов), повышение их эластических свойств и расширение границ осмотической устойчивости.

3. Экстракт из отжима калины в условиях стресс-вертикальной фиксации животных превосходит экстракт элеутерококка по способности увеличивать в мембране эритроцитов эфиры жирных кислот и снижать лизофосфатидилхолин и фосфатидную кислоту, что предполагает более активное влияние на биосинтез фосфолипидов.

4. Экстракт из отжима калины в период депривации после интоксикации этиловым спиртом превосходит полифенольный препарат легалон по способности нормализовать размерные характеристики эритроцитов, повышать концентрацию восстановленного глутатиона, снижать холестерин и сфингомиелин, что обеспечивало увеличение порога осмотической устойчивости эритроцитов к гемолизирующему агенту. Комплекс олигомерных проантоцианидинов и пикногенол в равной степени обеспечивают восстановление мембран эритроцитов крыс после токсического действия этилового спирта.

5. Экстракт из гребней винограда обладает мембранопротекторным эффектом в условиях гиперхолестеринового рациона, усиливая этерификацию холестерина и выведение его из мембран, чем нормализует соотношение липидных компонентов и восстанавливает осмотическую устойчивость.

Заключение

Анализ работ, посвященных химической характеристике полифенольных соединений, обзор известных растительных препаратов, а также изучение механизмов их антиоксидантного и антирадикального действия позволяет сделать вывод о том, что универсальная активность флавоноидов определяется универсальностью синдрома пероксидации в генезе практически всех патологий. В обсужденных работах показано, что флавоноиды активны в отношении различных активных форм кислорода, перекисей липидов, пероксил-радикалов, гидроксил-радикалов, радикалов оксида азота, синглетного кислорода, супероксиданион-радикала. Одним из существенных факторов проявления ими антиоксидантной активности считается наличие сопряжения между кольцами С и В. Антирадикальная активность флавоноидов рассматривается как комбинация реакций между свободными радикалами, ионами металлов и фенольными гидроксильными группами. В реакции инактивации свободных радикалов флавоноиды являются донорами водорода. Перспективность использования флавоноидов растительного происхождения определяется их выраженным гепатозащитным эффектом. Однако изучению возможности применения полифенольных комплексов из дикоросов Уссурийской тайги в качестве мембранопротекторов посвящены единичные работы. Это и определило направление, которое будет отражено в данном диссертационном исследовании.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования

Объектом экспериментальных исследований явились белые крысы линии Вистар, выведенные в питомнике лабораторных животных РАМН «Столбовая» (г. Чехов, Московская обл.). Для воспроизведения экспериментальных моделей использованы половозрелые самцы средней массой 175±5,5 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария при естественном освещении и постоянной температуре 20-22°С согласно нормам содержания лабораторных животных (Западнюк и др., 1974) и с соблюдением всех правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Международные рекомендации Европейской конвенции по защите позвоночных животных. Страсбург, 1986). Крыс ежедневно осматривали, фиксировали изменения весоростовых параметров. За время экспериментальных исследований не было случаев падежа крыс. По завершении каждого эксперимента животных выводили из него с использованием эфирного наркоза и проводили взятие крови из шейной вены.

Материалы исследований

Экстракт из отжима калины Саржента (ось соцветия, косточки и кожица ягод после отделения сока) (Viburnum Sargenta Koehne). Запатентован как гепатопротектор (патент № 2177330 от 18.08.2000 г.) и как экстракт калины, обладающий антирадикальной активностью (патент № 2220614 приоритет от 20.09.2001 г.). Экстракт имеет товарный знак

Калифен» (свидетельство на товарный знак RU № 228327 и En № 225516 от 09.10.2000 г). Количество общих полифенолов составляло 32,8 г/л.

Экстракт из гребней винограда Амурского (Vitis amurensis) (патент № 1473139 приоритет от 15.12.1998 г). Экстракт имеет товарный знак «Диприм» (свидетельство № 236689, приоритет от 24.05.2001). Количество общих полифенолов составляло 32,4 г/л.

Экстракты были приготовлены методом реперколяции на 40%-ном этиловом спирте (1:1). Выход экстракта составлял 1 л из 1 кг сухого сырья. Химический состав экстракта из гребней винограда был исследован Л.А.Муджири (1987). Химический состав экстракта из отжима калины был исследован В.Г.Спрыгиным и Н.Ф.Кушнеровой (2002, 2004). Экстракты представляют собой жидкости темно-коричневого цвета со специфическим запахом и сладковато-кисловато-терпким вкусом. Имеют сложный композиционный состав различных классов веществ, в котором по количеству преобладают лейкоантоцианы, катехины и их полимерные формы, флавонолы, органические кислоты (фумаровая, аскорбиновая, глицериновая, оксалатная, галактуроновая и др.), свободные аминокислоты (гистилин, аргинин, аспарагиновая кислота, треонин, серин, глутаминовая кислота, глицин, цистеин, метионин, изолейцин, тирозин и др.), сахара (сахароза, рафиноза) и ряд других органических соединений. Основные представители флавоноидов составляли 60% от сухого веса экстрактов, которые и определяют их биологическую активность.

Экстракты обладают низкой токсичностью — ЛД50 составляет 36,5 мл/кг (Спрыгин и др., 2002) и безопасностью при длительных введениях (Кушнерова, Спрыгин, 2001).

Комплекс олигомерных проантоцианидинов (КОПЦ) был выделен из экстракта отжима калины и запатентован как биологически активная добавка к пище (варианты) (патент № 2199249 от 20.09.01 г.).

Использованные в работе экстракты и КОПЦ были любезно предоставлены лабораторией биохимии Тихоокеанского океанологического института им. В.И. Ильичева ДВО РАН.

Предварительно освобожденные от спирта экстракты (путем упаривания в вакууме) животным вводили в виде водных растворов внутрижелудочно (по 0,4 мл/кг) в дозе, соответствующей 100 мг общих полифенолов на кг массы тела животного. Доза в 100 мг/кг соответствует известной терапевтической дозе для полифенольных гепатопротекторов (Венгеровский и др., 1999).

Выбор дозы для КОПЦ (100 мг/кг) в экспериментах на животных осуществляли, основываясь на литературных данных (Kropacova, et al., 1998; Ray etal., 2001).

В качестве препаратов сравнения использовали «Легалон» (MADAUS AG, Германия), содержащий в качестве активного начала комплекс флавоноидов из экстракта плодов расторопши пятнистой (Silybum marianum), комплекс олигомерных проантоцианидинов «Пикногенол» (Stryka Botanicals, Switzerland), выделенный из коры морской сосны (Pinus maritima), аптечный экстракт элеутерококка.

Биологическим материалом для исследования явились эритроциты крови животных.

Получение биоматериала

Кровь для исследований собирали из шейной вены животных в пробирку с 1% раствором гепарина. Гепарин готовили из расчета 0,02 мл раствора на 1 мл крови. Пробы брали утром натощак.

Выделение эритроцитов. Гепаринизированную кровь центрифугировали 10 мин при 3000 g. Плазму удаляли, а эритроциты отмывали 0,9% раствором NaCl, хорошо перемешивая, осаждали центрифугированием, супернатант удаляли (Новгородцева и др., 2003).

Повреждающие факторы. Острый стресс. Острый стресс моделировали вертикальной фиксацией животных за дорзальную шейную складку на 22 часа (Добряков, 1978).

Интоксикация этанолом. Животным в течение 7 дней внутрибрюшинно вводили 33%-ный этанол в дозе 7,5 мл/кг 2 раза в сутки. Использована схема эксперимента, разработанная А. Оа]ёоБ е! а1. (1972).

Экспериментальная гиперхолестеринемия. Экспериментальную гиперхолестеринемию вызывали в течение 6 недель введением в рацион животных повышенного содержания насыщенных жиров (растительное сало 25% от веса рациона), включающих 2,5% холестерина (Мещерская и др. 1966).

Физиологические характеристики эритроцитов. В мазках крови, окрашенных азур-эозиновой смесью, с помощью окуляр-микрометра определяли диаметр эритроцитов (мкм). Средний объем эритроцита (СОЭ) вычисляли по формуле: СОЭ = с!3 х 0,2 (мкм3), где с! - средний диаметр эритроцита (Гольдберг и др., 1973). Осмотическую резистентность эритроцитов измеряли по методу-, предложенному Б.Л. Эндрю (1972).

Биохимические методы характеристики системы «перекисное окисление липидов - антиоксидантная защита». Состояние антиоксидантной системы оценивали по величине антирадикальной активности крови (ЯоиасЬ е! а1., 1997), активности супероксиддисмутазы (КФ 1.15.1.1) (Рао1еИу е! а1., 1986), уровня восстановленного глутатиона (Новгородцева и др., 2003), малонового диальдегида (Гончаренко, Латинова, 1985).

Биохимические методы определения липидов. Экстракты общих липидов из эритроцитов готовили по методу I. Ро1сЬ е! а1. (1957). В полученных экстрактах с помощью хроматографических методов определяли количественное содержание фракций фосфолипидов и нейтральных липидов.

Измерение концентрации липидов в хлороформных растворах проводили методом З.У.Рапёе с соавторами (1963) в модификации Э.Я.

Костецкого и Н.Ф. Кушнеровой (1978). Аликвоту липидного экстракта упаривали досуха, добавляли 2 мл бихроматного реагента, приготовленного растворением 2,3 г бихромата калия в 14 мл дистиллированной воды и последующим доведением полученного раствора до объема в 1л концентрированной серной кислотой. Пробы нагревали на кипящей водяной бане в течение 15 минут. После охлаждения в каждую пробу добавляли по 4,5 мл дистиллированной воды и после тщательного перемешивания замеряли оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 440 нм. Количество общих липидов расчитывали по калибровочной кривой, построенной по высушенной до постоянного веса аликвоте липидного экстракта.

Определение общих фосфолипидов в экстрактах проводили по методу В.Е. Васьковского и соавт. (Vaskovsky et al., 1975). К упаренной досуха аликвоте липидного экстракта добавляли 0,2 мл 72-%-ной хлорной кислоты и сжигали в алюминиевом блоке при температуре 180-200°С в течение 20 мин. Остаток пробы охлаждали, добавляли 4,8 мл реактива Б. После перемешивания и последующего нагревания на кипящей водяной бане в течение 15 мин. пробу вновь охлаждали и затем измеряли ее оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 815 нм. В качестве стандарта для построения калибровочной кривой брали раствор однозамещенного фосфата калия. Пересчет липидного фосфора в соответствующее количество фосфолипидов производили с помощью универсального коэффициента пересчета, равного 25 (Покровский, 1969). Окончательный результат выражали в % от общих липидов.

Микротонкослойную хроматографию липидов осуществляли по методу В.И. Светашева и В.Е. Васьковского (Svetachev, Vaskovsky, 1972). В качестве сорбента использовали отечественный селикагель марки «КСК». Суспензию селикагеля получали путем осаждения частиц в определенном интервале времени. Осадки силикагеля, полученные в промежутке времени от 40 до 120 минут седиментации, собирали и хранили в банке с притертой пробкой под слоем воды. Хроматографическое распределение липидов проводили на стеклянных пластинках (6x6 см). Количество силикагеля, необходимого для нанесения на пластинку, определяли взвешиванием высушенной при 120°С суспензии. Силикагель тщательно взбалтывали, добавляли тонко растертый гипс - 10% к весу сухого силикагеля. Полученную смесь окончательно перемешивали на магнитной мешалке. Затем при постоянном перемешивании пипеткой отбирали 1 мл готовой смеси (200-220 мг сорбента) и осторожно наносили тонким слоем на предварительно обезжиренную и просушенную пластинку. Сорбент равномерно распределяли по всей поверхности пластинки и оставляли на воздухе до полного высыхания. Непосредственно перед применением пластинки активировали в сушильном шкафу при 120°С в течение 15 минут.

Хроматографическое распределение нейтральных липидов проводили методом одномерной тонкослойной хроматографии на силикагеле в системе растворителей гексан : серный эфир : уксусная кислота в соотношении 90:10:1 об./об. Идентификацию пятен липидов проводили с помощью очищенных препаратов отечественного производства. Количественное определение фракций нейтральных липидов выполняли по методу 1.8.Атеп1а (1964). После хроматографирования стандарты и пробы обнаруживали парами иода. Идентифицированные фракции (триглицериды, холестерин, свободные жирные кислоты, эфйры холестерина и эфиры жирных кислот) с пластинок специальным шпателем переносили в пробирки, добавляли в них по 2 мл бихроматного реактива и нагревали на кипящей водяной бане 15 минут. В охлажденные пробы добавляли по 4 мл дистиллированной воды, перемешивали и центрифугировали при 3000 об./мин в течение 10 минут. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре при длине волны 440 нм. Результаты выражали в % от суммы всех фракций.

Для разделения фосфолипидных фракций использовали метод двумерной хроматографии. Использовали системы растворителей, предложенные в. Кошег с соавторами (1967): в первом направлении хлороформ : метанол : аммиак (28%-ный) (65:25:5 или 65:35:5 об/об), во втором — хлороформ : ацетон : метанол : ледяная уксусная кислота : вода (30:40:10:10:5 или 50:20:10:10:5 об/об).

Для идентификации фосфолипидных фракций применяли очищенные препараты и специфические свидетели. Для обнаружения холинсодержащих фосфолипидов (фосфатидилхолина, лизофосфатадилхолина, сфингомиелина) использовали реактив Драгендорфа, приготовленный по методу H. Wagner et al. (1961); липиды проявлялись в виде оранжевых пятен на желтом фоне. Для обнаружения фосфолипидов, содержащих аминогруппу фосфатидилэтаноламин, лизофосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин), пластинки опрыскивали 5%-ным раствором нингидрина в ацетоне (Rouser et al., 1967) с последующим нагреванием в течение 2-3 минут над парами воды. Фосфолипиды, содержащие гидроксильную группу (фосфатидилинозит), обнаруживали с помощью периодатного реактива Шиффа (Кейтс, 1975); пятна липидов имели розово-сиреневый цвет.

Для проявления всех фосфолипидных фракций применяли молибдатный реактив, приготовленный по методу В.Е. Васьковского с соавторами (Vaskovsky et al., 1975) и реагент на основе малахитового зеленого (Vaskovsky, Latishev, 1975). При этом, липиды проявлялись в виде синих и зеленых пятен на белом фоне.

Для количественного определения отдельных фракций фосфолипидов, пластинку опрыскивали 10%-ным раствором серной кислоты в метаноле с последующим нагреванием ее при 180°С в течение 1-2 минут. Зоны, содержащие липиды, микрошпателем осторожно переносили в жаростойкие пробирки (80x100 мм) и добавляли в них по 0,07 мл 57%-ной хлорной кислоты. Для контрольных проб отбирали силикагель в зонах, не содержащих липиды. Пробирки с пробами помещали в алюминиевый блок. После 40-минутного сжигания в охлажденные пробирки добавляли по 0,43 мл реактива Б, приготовленного из реактива А, тщательно перемешивали и нагревали на кипящей водяной бане 15 минут. Для осаждения силикагеля охлажденные пробы 10 минут центрифугировали при 2000 об/мин. Измерение оптической плотности проводили на спектрофотометре при длине волны 815 нм. Результаты выражали в % от суммы всех фракций.

Реактивы для анализа фосфолипидов (А, Б и реагент на основе малахитового зеленого) готовили описанным ниже способом.

Реактив А (исходный реактив): 10 г молибденовокислого натрия растворяли в 60 мл 4Н соляной кислоты, нагревали на кипящей водяной бане в течение 20 минут, охлаждали, добавляли 14 мл концентрированной серной кислоты. Полученный объем раствора доводили дистиллированной водой до 100 мл. Реактив устойчив при комнатной температуре в посуде из темного стекла в течение нескольких месяцев.

Реактив Б: к 5,5 мл реактива А добавляли 26 мл 1Н серной кислоты и доводили объем раствора до 100 мл дистиллированной водой.

Реагент на основе малахитового зеленого: 5 г молибдата натрия растворяли в 100 мл 2Н солянрй кислоты и смешивали с раствором 1 г малахитового зеленого в 100 мл 2Н соляной кислоты. Объем раствора доводили до 500 мл дистиллированной водой, выдерживали 2-3 часа при комнатной температуре, фильтровали через бумажный фильтр. Пластинку после хроматографирования опрыскивали 57%-ной хлорной кислотой и нагревали на электроплитке (под тягой) до прекращения выделения паров кислоты. Охлажденную пластинку опрыскивали готовым реагентом. Фосфорсодержащие липиды окрашивались ярко-зеленым цветом.

В экспериментальных исследованиях было использовано 140 экспериментальных животных (крыс). Выполнено 420 физиологических исследований и 2680 биохимических исследований.

Экспериментальные данные обрабатывали методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента. Для проведения расчетов применяли программу «STATISTICA for Windows, release 5.1».