Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Влияние экстракта маакии амурской на реологические свойства крови, гемостаз и функциональную активность эндотелия при экспериментальной овариоэктомии

003465242

На правах рукописи

Шульгау Зарина Токтамысовна

ВЛИЯНИЕ ЭКСТРАКТА МААКИИ АМУРСКОЙ НА РЕОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КРОВИ, ГЕМОСТАЗ И ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ЭНДОТЕЛИЯ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ОВАРИОЭКТОМИИ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

пГ-" '

и

Томск-2009

003465242

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и учреждении Российской академии медицинских наук научно-исследовательском институте фармакологии Сибирского отделения РАМН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, Плотникова

профессор Татьяна Макаровна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Суслов

Николай Иннокентьевич

Степовая Елена Алексеевна

Ведущее учреждение: ГОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится " ¿г^шу?-/ 2009 г. в " У " часов на заседании диссертационного совета Д. бо 1.031.01 при НИИ фармакологии СО РАМН (634028, Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ фармакологии СО РАМН

Автореферат разослан " Уё " 'Л-са/ьу-ц 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук ^ Амосова Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. По статистике средняя продолжительность жизни женщин неуклонно растет и более 1/3 своей жизни женщина находится в периоде пери- и постменопаузы, т.е. в условиях возрастных изменений гомеостаза, сопровождающихся глубокой перестройкой гормонального профиля и психофизиологических реакций на эти изменения. По прогнозам ВОЗ к 2015 году 46% женщин окажется в возрасте старше 45 лет. Проблема сохранения здоровья женщин 45-65 лет актуальна и для России в XXI веке, где данная возрастная группа составляет почти одну пятую часть населения (29,6 млн) [Сметник В.П., Шестакова И.Г., 2003; Аюсер JI.B. и соавт., 2004]. В связи с этим более пристального внимания заслуживает вопрос адекватного лечения климактерических проблем, возникающих более чем у 70% женщин в указанный период жизни [Евтушенко И.Д. и соавт., 2006; Сметник В.П., 2007; Тихомиров A.JL, 2007].

У женщин на фоне эстрогенного дефицита, вызванного естественной или хирургической менопаузой, помимо вегетативных и психоэмоциональных симптомов, снижающих качество жизни, отмечен значительный рост сердечно-сосудистых заболеваний [Сметник В.П., Шестакова И.Г, 2003; Караченцев А.Н. и соавт., 2004; Евтушенко И.Д. и соавт., 2006; Ольбинская Л.И. и соавт., 2006; Тихомиров A.JL, 2007; Макацария А.Д. и соавт., 2007; Сметник В.П., Ильина JI.M., 2007], важным звеном патогенеза которых являются нарушения реологических свойств крови, гемостатический дисбаланс, эндоте-лиальная дисфункция [Мелкозерова О.А., 2002; Manson J.E. et al., 2003; Гель-цер Б.И., Котельников В.Н., 2003; Vaya A. et al., 2004; Silvestri A. et al., 2005; Rosano G.M. et al., 2006; Абусуева З.А. и соавт., 2006]. Гормональная заместительная терапия уменьшает проявления климактерического синдрома, но, в силу наличия серьезных побочных эффектов, не рекомендуется для длительного применения с целью уменьшения риска возникновения сердечнососудистых заболеваний [Writing Group, 2002; Manson J.E. et al., 2003; Грацианский A.H., 2004; Караченцев А.Н. и соавт., 2004; Farquhar С.М. et al., 2006; Rossouw J.E. et al., 2007; Зайдиева Я.З., 2008].

Естественная и послеоперационная эстрогенная недостаточность протекают на фоне ярко выраженного оксидантного стресса [Antunes F., Cadenas Е., 2001; Караченцев А.Н., Кузнецова И.В., 2004]. В этих же клинических ситуациях наблюдаются гемореологические расстройства, приводящие к формированию синдрома повышенной вязкости крови, причем в процесс самым непосредственным образом вовлекаются эритроциты - возрастает их агрегация и снижается деформируемость [Безрукова О.Д. и соавт., 1986; Мелкозерова О.А., 2002; Vaya A. et al., 2004]. Следовательно, существуют основания считать активацию перекисного окисления липидов фактором, участвующим

в повреждении клеточного звена реологии крови. Сведения о возможности предотвращать негативное влияние липидной пероксидации на реологические функции эритроцитов с помощью антиоксидантов [Mo J. et al., 1993; Giakoumaki A. et al., 2001] побудили нас к поиску перспективных гемореоло-гическйх препаратов при гипоэстрогенемии среди природных антиоксидантов - экстрактов изофлавоноидсодержащих растений, поскольку изофлаво-ноиды относятся к фитоэстрогенам [Bingham M. et al., 1998; Santti R. et al., 1998; Никитин А.И., 2000; Тутельян В. A. и соавт., 2003; Балан В.Е, 2007].

Фитоэстрогены, являясь избирательными модуляторами эстрогеновых рецепторов [Никитин А.И., 2000; Тутельян В.А. и соавт., 2003; Евтушенко И.Д. и соавт., 2006], могут быть реальной альтернативой заместительной гормональной терапии (ЗГТ) в условиях эстрогенной недостаточности. Несмотря на высокую потребность, фитоэстрогенные препараты на фармацевтическом рынке представлены весьма скромно. Разработаны фитоэстрогенные препараты из экстракта растения Cimicifuga racemosa [Borrelli F. et al., 2003; Сметник В.П., 2006; Балан В.Е., 2007]. Отечественных лекарственных препаратов, обладающих фитоэстрогенной активностью нет. Объектом исследования выбран полифенольный комплекс из древесины эндемичного приморского растения семейства бобовые маакии амурской (Maackia amuren-sis Rupr. et. Maxim.), который был зарегистрирован в 2004 г. в Российской Федерации в качестве фармакологической субстанции (Р №003309/01) для изготовления лекарственного препарата «Максар® таблетки, покрытые оболочкой, 60 мг» (Р №003294/01). Максар разрешен для клинического применения в качестве гепатопротектора. Высокое содержание изофлавоноидов в экстракте древесины маакии амурской явилось основанием для изучения его эффектов в условиях гипоэстрогенемии.

Цель исследования. Изучить влияние экстракта маакии амурской в сравнении с действием этинилэстрадиола на реологические свойства крови, гемостаз и функциональную активность эндотелия в условиях экспериментальной овариоэктомии.

Задачи исследования:

1. На модели гипервязкости крови in vitro выявить наиболее эффективный экстракт маакии амурской по его влиянию на вязкость крови и агрегацию тромбоцитов.

2. Оценить влияние экстракта маакии амурской в сравнении с действием этинилэстрадиола на реологические свойства крови и эффективность доставки кислорода тканям у крыс при экспериментальной овариоэктомии.

3. Исследовать влияние экстракта маакии амурской в сравнении с действием этинилэстрадиола на перекисное окисление липидов и фосфолипидный состав мембран эритроцитов у крыс после овариоэктомии.

4. Изучить влияние экстракта маакии амурской на эндотелийзависимые эффекты у овариоэктомированных крыс в сравнении с терапией этинилэст-радиолом.

5. Оценить влияние экстракта маакии амурской и этинилэстрадиола на гемостаз крыс с экспериментальной гипоэстрогенемией.

Научная новизна. В условиях экспериментальной гипоэстрогенемии впервые выявлена способность экстракта маакии амурской ослаблять выраженность синдрома повышенной вязкости крови и улучшать эффективность доставки кислорода тканям. Получены приоритетные данные о способности экстракта маакии амурской улучшать реологические свойства эритроцитов и уменьшать агрегацию тромбоцитов. Впервые показано, что у крыс после ова-риоэктомии экстракт маакии амурской эффективнее, чем этинилэстрадиол снижает процессы липидной пероксидации в мембранах эритроцитов и предупреждает их окислительную модификацию. Новыми являются данные о наличии у экстракта маакии амурской эндотелийпротективной активности, выявленной в условиях экспериментальной овариоэктомии. Установлено, что экстракт маакии амурской, в отличие от этинилэстрадиола, уменьшает активность свертывающей системы крови при экспериментальной гипоэстрогенемии.

Научно-практическая значимость. В результате проведенного исследования получены новые данные фундаментального характера о механизмах формирования синдрома повышенной вязкости крови при овариоэктомии и способах их коррекции с помощью эстрогенов и фитоэстрогенов - изофлаво-ноидов экстракта маакии амурской. Установлены принципиальные различия в действии гормональной терапии и фитоэстрогенов на реологические свойства крови, гемостаз и эндотелий сосудов в условиях экспериментальной гипоэстрогенемии. Материалы доклинических исследований специфической активности экстракта маакии амурской вошли в комплект документов для представления в Министерство здравоохранения и социального развития Российской Федерации с целью получения разрешения на клинические исследования препарата по новому показанию в качестве противоклимактери-ческого средства.

Апробация работы.

Материалы диссертации представлены на VI международной конференции «Микроциркуляция и гемореология» (Ярославль, 2007); II международной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений» (Алматы, 2007); конференции НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН «Создание новых лекарственных препаратов» (Томск, 2007); IV Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008); IX конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2008); XII международ-

ной научной конференции «Здоровье семьи - XXI век» (Израиль, 2008); V Всероссийской конференции-школе «Химия и технология растительных веществ» (Уфа, 2008); симпозиуме «Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств» (Москва, 2008).

Публикаияи; По теме диссертации опубликовано 12 работ, из них 3 - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура работы: Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста. Состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Библиографический указатель включает 244 источников, из них 111 - отечественных и 133 - иностранных. Диссертация иллюстрирована 8 рисунками и 18 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проведены на 205 крысах-самках линии Вистар массой 300-350 г. Животные получены из научно-исследовательской лаборатории экспериментально-биомедицинского моделирования НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН г. Томск (сертификат имеется).

Животные находились в стандартных условиях вивария на обычном пищевом рационе и свободном доступе к воде и пище. Контрольные и опытные животные находились в аналогичных условиях и имели одинаковую исходную среднюю массу, контролируемую ежедневным взвешиванием для коррекции вводимой дозы экстрактов. Опыты выполняли, соблюдая "Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных", утвержденные Министерством Здравоохранения Российской Федерации.

В работе использовали экстракты из ядровой древесины дальневосточного растения семейства.бобовые маакии амурской (Maackia amurensis). На этапе скрининга исследовали несколько экстрактов. Суммарный экстракт из древесины маакии амурской (экстракт 1) представляет собой сумму изофла-воноидов, мономерных и димерных стильбенов. Содержание полифенолов в экстракте 1 по данным ВЭЖХ составляет 21,6%: стильбены - 8,9%, изофла-воноиды - 12,7%. Экстракт 2 - это сумма идентифицированных по данным ВЭЖХ изофлавоноидов, составляющих 68,9% от общей массы. Экстракт 3 представляет собой сумму стильбенов, составляющих 55% от общей массы.

Для проведения заместительной гормональной терапии использовали препарат микрофоллин (Gedeon Richter, Венгрия) - таблетки, содержащие 50 мкг этинилэстрадиола.

Изучение гемореологических и антитромбоцитарных эффектов исследуемых экстрактов осуществляли в условиях ex vivo и in vivo. Синдром повышенной вязкости крови (СПВК) для выполнения экспериментов в условиях ex vivo воспроизводили инкубацией крови при температуре 20,0±0,4 °С в

течение 60 мин, а в условиях in vivo - овариоэктомией половозрелых крыс-самок.

В опытах ex vivo исследуемые экстракты вводили внутрижелудочно ежедневно в дозах 200 мг/кг, 40 мг/кг и 35 мг/кг соответственно. Дозы экстрактов 2 и 3 подбирались таким образом, чтобы вводимое количество изо-флавоноидов и стильбенов соответствовало их содержанию в экстракте 1. Контрольным животным вводили эквиобъемное количество 1%-ной крахмальной слизи. Через 2 часа после последнего введения забирали кровь для исследования. После забора крови у опытных и контрольных животных в одних образцах регистрировали все исследуемые показатели, а другие пробы крови инкубировали при температуре 20,0±0,4 °С в течение 60 мин и затем производили измерение исследуемых показателей. Инкубация крови в течение 1 часа в этих условиях сопровождалась формированием СПВК [Плотников М.Б. и соавт., 1996].

Для воспроизведения СПВК у самок крыс in vivo использовали модель гормональной недостаточности, поскольку известно, что гипоэстрогенемия сопровождается повышением вязкости крови [Безрукова О.Д. и соавт., 1986; Armstrong В.К. et al., 1999; Мелкозерова О.А., 2002; Тутельян В.А. и соавт., 2003; Vaya A. et al., 2004]. Удаление яичников осуществляли согласно общепринятой методике [Киршенблат Я.Д., 1969]. Крысы, у которых проводили лапаротомию и ушивали рану, составили группу ложнооперированных животных. Через семь дней после овариоэктомии животным начинали вводить исследуемые препараты: суммарный экстракт маакии амурской в дозе 200 мг/кг и этинилэстрадиол в дозе 25 мкг/кг ежедневно внутрижелудочно в течение 14 дней. Контрольным животным аналогично вводили эквиобъемное количество 1 % крахмальной слизи. Через 2 часа после последнего введения забирали кровь для исследования.

Стадию эстрального цикла у животных оценивали по изменению клеточного состава в мазках влагалищной жидкости [Хэм А., Кормак Д., 1983; Гольдштейн Д.В. и соавт., 2004].

Для исследования фармакологической активности препаратов забор проб цельной крови осуществляли из общей сонной артерии крыс. Кровь стабилизировали 3,8% цитратом натрия в соотношении 9:1.

Для оценки вязкости крови и плазмы на различных скоростях сдвига применяли ротационный гемовискозиметр АКР-2. Агрегацию эритроцитов исследовали силлектометрическим методом [Плотников М.Б. и соавт., 1995]. Гематокрит определяли методом центрифугирования в стеклянных капиллярах на центрифуге МГЦ-8. Исследование деформируемости эритроцитов осуществляли методом лазерной дифрактометрии [Белкин А.В. и соавт., 1991]. Концентрацию фибриногена в плазме оценивали методом тромбообра-

зования Клауса на коагулометре KG-4 (Согтау, Польша) с использованием набора реагентов для определения концентрации фибриногена «Фибриноген-тест». Определение активированного парциального (частичного) тромбопла-стинового времени проводили с помощью наборов «Al И В (АЧТВ)-тест». Протромбиновое время свертывания оценивали с помощью набора «Техпла-стин-тест». Все вышеуказанные наборы произведены фирмой «Технология-стандарт» (Россия). Индекс эффективности транспорта кислорода в ткани рассчитывали как отношение гематокрита к вязкости крови при различных скоростях сдвига [Stoltz J.E., Donner M., 1991].

Агрегацию тромбоцитов в стандартизованной богатой тромбоцитами плазме (БТП) определяли нефелометрическим методом G.Bom [Born G.V.R., 1962; Баркаган З.С., Момот А.П., 1998]. Оценку антиагрегантной активности сосудистой стенки осуществляли методом в модификации В.А. Люсова и М.П. Савенкова [Люсов В.А., Савенков М.П., 1988]. Коэффициент эндотели-альной дисфункции (КЭД) оценивали как отношение реакции артериального давления на внутривенное введение натрия нитропруссида (НП, 30 мкг/кг), вызывающего эндотелийнезависимую вазодилятацию, к соответствующей реакции на введение ацетилхолина (АХ, 5 мкг/кг), вызывающего эндотелий-зависимую вазодилятацию. [Галаган М.Е. и соавт., 1991; Тюренков И.Н., Воронков A.B., 2008]. Фотометрическое определение в крови ближайшего стабильного метаболита окиси азота (N0) - нитрита (NO2) проводили по реакции Грисса [Каргаок В. Б. и соавт., 2000]. Модель внутрисосудистого тромбоза воспроизводили путем аппликации 10% раствора FeClj на левую общую сонную артерию наркотизированных животных (уретан 1 г/кг внутрибрю-шинно) [Максименко A.B., Тшценко Е.Г., 1999]. Измерение кровотока проводили с помощью электромагнитного расходомера MKMF-1: до, во время 10-минутной аппликации 10% раствора FeCb и в течение 75 мин после отмывки сосуда. Отмечали время полной остановки кровотока в стенозирован-ном сосуде и уровень снижения кровотока в течение эксперимента.

Содержание прогестерона и эстрадиола в исследуемых пробах сыворотки определяли иммуноферментным методом с помощью наборов Прогестерон ИФА («Хема-Медика», Россия) и EIAlgen Estradiol (Adaltis Italia S.p.A., Италия) на приборе «Пикон».

Тени эритроцитов для изучения липидного состава мембран получали по методу J.T. Dodge et. al. [Dodge J.T. et al., 1963]. Липидный экстракт мембран эритроцитов получали методом J. Folch [Folch J. et al., 1957]. Уровень общих липидов в мембранах эритроцитов оценивали по цветной реакции с фосфор-но-ванилиновым реактивом [Колб В.Г, Камышников B.C., 1982]. Общее содержание фосфолипидов определяли по реакции с ферротиоцианатом аммония [Пентюк A.A. и соавт., 1987]. Содержание отдельных фракций фосфоли-

пидов оценивали после разделения их методом одномерной восходящей хроматографии на пластинках «Silufol UV 254» [Финдлей Дж., Эванс У., 1990]. Основные классы фосфолипидов определяли в системе растворителей, которая состояла из смеси хлороформ/метанол/вода в соотношении 32:12,5:2. Пятна визуализировали нагреванием пластин в течение 15-20 минут при 80°С после предварительного опрыскивания 5% раствором фосфорно-молибденовой кислоты в 96% этиловом спирте.

Процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) в мембранах эритроцитов оценивали по содержанию в них диеновых коньюгатов (ДК) и малонового диальдегида (МДА) [Владимиров Ю.А., 1998]. Антиокислительную активность мембран оценивали по кинетике накопления МДА в суспензии теней эритроцитов при индукции ПОЛ раствором Fe2S04-7H20 в концентрации 10"6 М. Количество белка в суспензии теней эритроцитов определяли микро-биуретовым методом [Колб В.Г., Камышников B.C., 1982].

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием пакета программ «Statistica 6,0». Полученные результаты представлены в виде «среднее значение ± стандартная ошибка среднего значения». Нормальность распределения показателей оценивали с использованием критерия Sha-piro-Wilkvs W-test. Межгрупповые отличия оценивали непараметрическим критерием Mann-Whitney U-test. Для попарно связанных групп использовали непараметрический критерий Вилкоксона.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для первичной оценки гемореологической активности суммарного экстракта маакии амурской, а также его отдельных фракций, содержащих изо-флавоноиды или димерные стильбены, была использована модель гипервязкости крови in vitro [Плотников М.Б. и соавт., 1999]. В группе контрольных животных инкубирование крови в течение 60 минут при температуре 20±0,4 °С приводило к достоверному повышению вязкости крови в диапазоне скоростей сдвига от 3 с до 300 с"1 на 9—18%, что свидетельствовало о формировании СПВК. У крыс, получавших в течение 5 дней суммарный экстракт маакии амурской в дозе 200 мг/кг, инкубирование крови также приводило к повышению ее вязкости во всем исследуемом диапазоне скоростей сдвига на 411%, но при этом значения были ниже по сравнению с контролем на 6-15%. Таким образом, вязкость крови после инкубации увеличилась практически во всем исследуемом диапазоне скоростей сдвига, но достоверно менее выражено, чем в образцах крови крыс, не получавших суммарный экстракт маакии амурской. У крыс, получавших изофлавоноидный экстракт маакии амурской в дозе 40 мг/кг, инкубирование крови приводило к повышению вязкости крови на 9-26% во всем диапазоне скоростей сдвига, однако возрастание этого показателя было меньшим по отношению к контролю на скоростях сдвига 7-

300 с"1 на 6-10%. На самых низких скоростях сдвига достоверных различий вязкости крови в пробах крови до и после инкубации не наблюдалось. У крыс, получавших экстракт маакии амурской, содержащий димерные стиль-бены в дозе 35 мг/кг, инкубирование крови приводило к повышению ее вязкости во всем диапазоне скоростей сдвига на 6-9%, при этом значения вязкости крови были ниже по сравнению с соответствующими значениями в контроле в диапазоне скоростей сдвига от 3 до 10 с'1 на 10-14%. На высоких скоростях сдвига достоверных различий между показателями вязкости крови в контрольной и опытной группах не выявлено.

При изучении антиагрегантной активности экстрактов маакии амурской в опытах ex vivo установлено, что в контрольной группе амплитуда АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов в плазме крови составила 35%. Суммарный экстракт маакии амурской при его ежедневном введении крысам в течение 5 дней снижал АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов на 23% по сравнению с контролем. Изофлавоноидный экстракт маакии амурской при аналогичной схеме лечения уменьшал амплитуду агрегации тромбоцитов на 28% по сравнению с контролем. При введении экстракта, содержащего димерные стильбены, амплитуда агрегации тромбоцитов была на 26% ниже, чем в контроле. Следовательно, все вышеперечисленные экстракты маакии амурской продемонстрировали выраженный и практически равнозначный антиагрегантный эффект в отношении тромбоцитов.

Таким образом, эксперименты ex vivo позволили установить, что суммарный экстракт маакии амурской в отличие от других экстрактов ограничивал рост вязкости крови, вызванный ее инкубацией, в широком диапазоне скоростей сдвига, а также оказывал выраженное антитромбоцитарное действие. Кроме того, суммарный экстракт маакии амурской является официально зарегистрированной субстанцией для изготовления лекарственных средств. В связи с этим, для дальнейшего углубленного исследования нами был выбран суммарный экстракт маакии амурской, именуемый далее экстракт маакии амурской (ЭМА).

Дальнейшее углубленное исследование экстракта маакии амурской проводили у крыс при экспериментальной овариоэктомии. Забор крови у ложно-оперированных самок осуществляли в фазу эструса. Уровень эстрогенов в крови этих животных составил 42,5±3,1 пг/мл. Овариоэктомия приводила к исчезновению половых циклов у самок крыс, в мазках влагалищной жидкости наблюдали сплошь лейкоциты и эпителиальные клетки. К окончанию эксперимента у животных этой группы отмечено значимое снижение эстрогенов до 17,6±1,5 пг/мл, то есть на 59% по сравнению с ложнооперирован-ными животными.

Рис 1. Влияние экстракта маакии амурской (200 мг/кг внутрижелудочно, 14 дней) и этинилэстрадиола (25 мкг/кг внутрижелудочно, 14 дней) на вязкость крови при различных скоростях сдвига у крыс после овариоэктомии + - р<0,05 по сравнению со значениями у ложнооперированных животных * - р<0,05 по сравнению со значениями у животных контрольной группы

Наряду со снижением уровня половых гормонов у овариоэктомирован-ных крыс наблюдалось формирование СПВК, который характеризовался значительными сдвигами макро- и микрореологических показателей: возрастал гематокрит (на 7%), повышалось содержание фибриногена в плазме крови (на 38%) (табл. 1). Наблюдались также значительные сдвиги показателей клеточной реологии: повышение агрегационных свойств эритроцитов, что проявилось снижением полупериода их агрегации в 1,7 раза по сравнению с величиной этого показателя у ложнооперированных животных и уменьшение индекса деформируемости эритроцитов (ИДЭ) при скоростях сдвига (360890 с"1) на 13-25% соответственно (табл. 1). Изменения основных реологических показателей приводили к статистически значимому повышению вязкости крови во всем исследуемом диапазоне скоростей сдвига на 5-25% (рис. 1). При этом индекс эффективности транспорта кислорода тканям при низких скоростях сдвига (5-50 с"1) достоверно снижался на 5-7% (табл. 2). Таким образом, прирост гематокрита у животных после овариоэктомии не обеспечивал увеличение доставки кислорода в ткани из-за выраженного повышения вязкости крови, возникающего как вследствие гемоконцентрации, так и нарушения реологических свойств эритроцитов. Следовательно, овариоэктомия

Таблица 1

шшшца 1

Влияние экстракта маакИи амурской (ЭМА, 200 мг/кг в течение 14 дней) и этинилэстрадиола (25 мкг/кг в течение 14 дней) на гемореологические показатели у крыс: вязкость плазмы (ВП, мПа-с), гематокрит (Ш, %), уровень фибриногена в плазме крови (ФГ, г/л), полупериод агрегации эритроцитов (Т1/2) с), индекс деформируемости эритроцитов при разных скоиостях сдвига СИЛЭ. отн. ед.) V гоне после оваоиоэктомии

Группа ВП № ФГ Ти ВДЭ

90 с1 180 с 1 360 с1 890 с1

Ложноопериро-ванные (п=8) 1,39±0,03 43+1 2,4±0,4 21 ±2 0,161 ±0,009 0,201 ±0,009 0,262±0,013 0,310±0,011

Контроль(п=9) 1,41±0,01 46±1* 3,3±0,2* 14 ±2* 0,158±0,010 0,188±0,009 0,222±0,007* 0,282±0,007*

ЭМА (п=8) 1,38±0,01 45±1 2,5±0,3+ 19 ± Г 0,165±0,015 0,208±0,012 0,263±0,011+ 0,316±0,009+

Этинилэстрадиол (п=9) 1,40±0,02 42±1+ 2,5±0,3+ 19 ± 1+ 0,184±0,011 0,214±0,009+ 0,265±0,009+ 0,324±0,010+

Примечание (здесь и в таблицах 2,3,4 и 5): * - р<0,05 по сравнению со значениями у ложнооперированных животных;+ - р<0,05 по сравнению со значениями у животных контрольной группы.

Таблица 2

Влияние экстракта маакии амурской (ЭМА, 200 мг/кг в течение 14 дней) и этинилэстрадиола (25 мкг/кг в течение 14 дней) на индекс эффективности доставки кислорода тканям (отн. ед.) при различных скоростях сдвига у крыс после оваоиоэктомии__

Группы животных 5 с1 50 с1 100 с1 300 с1

Ложнооперированные (п=8) 6,0±0,1 9,1 ±0,2 9,7±0,2 10,2±0,2

Контроль(овариоэктомия) (п=9) 5,6±0,1* 8,7±0,1* 9,4±0,1 10,1±0,1

Овариоэктомия + ЭМА (п=8) 6,1±0,Г 9,2±0,1+ 9,8±0,1+ 10,4+0,1+

Овариоэктомия + этинилэстрадиол (п=9) 5,7±0,1* 8,6±0,1* 9,1±0,1* 9,8+0,1*

у крыс вызывала гипоэстрогенное состояние, сопровождающееся нарушением гемореологического статуса с формированием СПВК и снижением эффективности доставки кислорода тканям.

Курсовое введение ЭМА крысам после овариоэктомии не восстановило уровень эстрадиола в крови, значение которого составило 20,4±1,7 пг/мл, что соответствовало этому показателю у овариоэктомированных животных. При этом ЭМА уменьшал вязкость крови во всем диапазоне скоростей сдвига на 4—13 % по сравнению со значениями у крыс, не получавших лечения (рис. 1). При оценке вклада изменений отдельных гемореологических параметров в способность ЭМА уменьшать вязкость крови было установлено, что исследуемый экстракт вызывал значимое повышение деформируемости эритроцитов при высоких скоростях сдвига (360-890 с"1) на 12-19% (табл. 1), повышение полупериода агрегации эритроцитов на 26% (табл. 1), но при этом не оказывал влияния на макрореологические показатели — вязкость плазмы, ге-матокрит и уровень фибриногена в крови. Эффективность доставки кислорода в ткани под действием ЭМА достоверно увеличивалась на 3-9% в сравнении с группой контроля на всех исследованных скоростях сдвига (табл. 2). Можно утверждать, что данный эффект обеспечен способностью ЭМА уменьшать вязкость крови, поскольку достоверных изменений уровня гема-токрита препарат не вызывал (табл. 1).

Курсовое введение этинилэстрадиола крысам группы сравнения восстанавливало уровень эстрадиола до значений у ложнооперированных животных (43,5±0,4 пг/мл). При этом лечение этинилэстрадиолом, как и применение ЭМА, практически устраняло СПВК (рис. 1), но в отличие от действия ЭМА, эффект гормонального препарата был обусловлен влиянием как на макрореологические показатели - уменьшение гематокрита и фибриногена в крови, так и клеточные параметры реологии крови - улучшение деформируемости и ослабление агрегации эритроцитов (табл. 1). При этом индекс эффективности доставки кислорода в ткани под действием этинилэстрадиола не изменялся и не отличался от показателей в контроле (табл. 2).

Следовательно, уменьшения повышенной вязкости крови при овариоэктомии можно достичь как курсовым применением этинилэстрадиола, так и ЭМА, но при этом эффект ЭМА, в отличие от этинилэстрадиола, не связан с изменением уровня половых гормонов в крови и обусловлен преимущественным влиянием экстракта на функциональное состояние эритроцитов.

Основными патогенетическими факторами, участвующими в повреждении мембран клеток, в том числе и эритроцитов, являются активация свобод-норадикальных процессов и нарушение их липидного состава [Новицкий В.В. и соавт., 2004]. Дефицит женских половых гормонов является одной из причин окислительного стресса, формирующегося у женщин на фоне естест-

венной или хирургической менопаузы [Antones F., Cadenas Е., 2001] и может вызывать нарушения реологических свойств крови [Vaya A. et al., 2001], причем наиболее уязвимым является клеточное звено - эритроциты [Mo J. et al., 1993; Baskurt O.K., Meiselman H.J., 1999; Chang T.W., Chen-Po H.,1999; Wata-nabe H. et al., 1990; Bolokadze N. et al., 2003]. В связи с этим было исследовано влияние ЭМА и этинилэстрадиола на ПОЛ и липидный состав мембран эритроцитов у крыс в условиях экспериментальной овариоэктомии.

К 21-м суткам после проведения овариоэктомии у самок крыс количество ДК в мембранах эритроцитов повышалось на 62% по сравнению со значениями у ложнооперированных животных. Наблюдалось значительное повышение исходного содержания МДА (в 2 раза) и при индукции ПОЛ сульфатом железа (на 50%) по сравнению с показателями у ложнооперированных животных (табл. 3). Следовательно, овариоэкгомия у крыс, как и эстрогенная недостаточность у женщин, провоцирует усиление процессов ПОЛ [Antones F., Cadenas Е., 2001]. Этинилэстрадиол, при его курсовом применении у крыс после овариоэктомии, вызывал некоторое ограничение роста продуктов ПОЛ, что проявилось достоверным уменьшением на 18% содержания ДК в мембранах эритроцитов по сравнению со значением у контрольных животных. При этом не отмечено изменения уровня МДА как до, так и после стимуляции железом ПОЛ в эритроцитарных мембранах. Механизм антиокси-дантного действия эстрадиола связан с тем, что он, воздействуя на эстроге-новые рецепторы, стимулирует экспрессию генов супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы [Antones F., Cadenas Е., 2001]. У овариоэктомирован-ных крыс, получавших ЭМА, активность процессов ПОЛ в мембранах эритроцитов была значительно ниже, чем у контрольных животных. Наблюдалось достоверное уменьшение содержания ДК на 30% и МДА после индукции ПОЛ - на 32% по сравнению с контролем. В результате курсового применения ЭМА показатели ПОЛ в мембранах эритроцитов крыс оказались близки значениям в группе ложнооперированных животных. Следовательно, ЭМА проявил более выраженное, чем этинилэстрадиол, антиоксидантное действие в условиях активации ПОЛ, вызванной овариоэктомией у крыс. Возможно, это связано с тем, что механизм антиоксидантного действия изофлавоноидов маакии амурской шире, чем только воздействие на эстрогеновые рецепторы и помимо способности изофлавоноидов, в частности, генистеина, входящего в состав ЭМА, имитировать механизм антиоксидантного действия эстрадиола [Park D. et al., 2005], включает в себя прямую антирадикальную и антиокси-дантную активность [Федореев С.А. и соавт., 2004].

Овариоэктомия у крыс существенным образом не повлияла на содержание белка в мембранах эритроцитов, но при этом показатели абсолютного содержания общих липидов и коэффициента отношения липидов к белку

Таблица 3

Влияние экстракта маакии амурской (ЭМА, 200 мг/кг в течение 14 дней) и этинилэстрадиола (25 мкг/кг в течение 14 дней) на содержание диеновых конъюгатов (ДК, ОПгзг/мг липидов) и малонового диальдегида (МДА, нмоль/мг липидов) в мембранах эритроцитов у крыс после овариоэктомии___

Группы животных ДК МДА до индукции Fe2+ МДА после индукции Fe2+

Ложнооперированные (п=8) 0,118±0,021 8,1±1,7 23,9±2,9

Контроль (п=11) 0,191±0,016* 16,7±3,2* 35,8±3,7*

ЭМА (п=9) 0,134±0,014+ 11,7±1,9 24,5±2,9+

Этинилэстрадиол (п=8) 0,157±0,014+ 11,4±3,3 28,1±4,4

и

Таблица 4

Влияние экстракта маакии амурской (ЭМА, 200 мг/кг в течение 14 дней) и этинилэстрадиола (25 мкг/кг в течение 14 дней) на содержание белка и липидов в мембранах эритроцитов у крыс после овариоэктомии

Группы животных Белок, мг/мл суспензии теней эритроцитов Общие липиды, мг/мл суспензии теней эритроцитов Коэффициент отношения липидов к белку Общие фосфолипиды, мг/мл суспензии теней эритроцитов

Ложнооперированные (п=8) 4,бЗ±0,05 7,34±0,62 1,57±0,14 2,08±0,27

Контроль (п=11) 4,50±0,05 5,25 ±0,23* 1,18±0,05* 2,01 ±0,11

ЭМА (п=9) 4,52±0,14 6,61±0,66+ 1,49±0,16+ 2,07±0,09

Этинилэстрадиол (п=8) 4,77±0,Г 6,33±0,39+ 1,48±0,20+ 1,97±0,08

оказались сниженными соответственно на 29% и 25% (табл. 4). ЭМА при его курсовом применении препятствовал снижению данных показателей, сохраняя соотношение липидов и белков на уровне, близком к значению у ложно-оперированных крыс: абсолютное количество общих липидов увеличилось на 25% по сравнению с контролем, а отношение общих липидов к белку было достоверно выше, чем в контроле на 26% и не отличалось от этого показателя у ложнооперированных животных (табл. 4).

В группе овариоэктомированных крыс, получавших этинилэстрадиол, уровень белка и абсолютное количество общих липидов по сравнению со значениями у крыс контрольной группы увеличивались соответственно на 6% и 21%. При этом восстанавливалось отношение общих липидов к белку до показателей у ложнооперированных животных. Следовательно, терапия этинилэстрадиолом, как и курсовое применение ЭМА способствовали поддержанию нормального соотношения липидов и белков в мембранах эритроцитов крыс после овариоэктомии, хотя уровень общих липидов в этой группе крыс снижался в большей степени, чем у животных, получавших ЭМА, но при этом достоверно повышался уровень белка в суспензии теней эритроцитов (табл. 4).

Удаление яичников у крыс не оказало существенного влияния на абсолютное содержание общих фосфолипидов в мембранах эритроцитов (рис. 2). Однако усиление ПОЛ, отмеченное нами при овариоэктомии, не влияя существенным образом на общее количество фосфолипидов, вероятно, способно «разрыхлять» мембрану эритроцитов, обеспечивая доступность фосфолипидов для фосфолипаз, катализирующих переход фосфолипидов в ли-зоформы [Геннис Р., 1997]. В группе контроля среди фосфолипидов наблюдалось уменьшение содержания фосфатидилсерина и фосфатидилэтанола-мина на 9,5% и 10,5% соответственно по сравнению с ложнооперированны-ми животными. На фоне снижения содержания фосфолипидов, входящих преимущественно во внутренний слой липидного бислоя эритроцитарных мембран у животных после овариоэктомии происходило накопление в мембранах эритроцитов фракции лизофосфолипидов. Рост фракции лизофосфо-липидов у овариоэктомированных крыс составил 24% по сравнению с уровнем у ложнооперированных животных (рис. 2).

Курсовое применение ЭМА и этинилэстрадиола в условиях овариоэктомии у крыс, существенно не влияя на содержание общих фосфолипидов в мембранах эритроцитов (рис. 2), вызывало достоверное уменьшение соответственно на 30% и 37% лизофосфолипидов по сравнению со значениями у животных контрольной группы. Курсовое введение овариоэктомированным крысам ЭМА и этинилэстрадиола достоверно повышало соответственно на

Рис 2. Влияние экстракта маакии амурской (200 мг/кг внутрижелудочно, 14 дней) и этинилэстрадиола (25 мкг/кг внутрижелудочно, 14 дней) на содержание в мембранах эритроцитов фосфатидилэтаноламина (ФЭА), фосфатидил-серина (ФС), фосфатидилхолина (ФХ), сфингомиелина (СМ) и лизофосфо-липидов (ЛФЛ) у крыс после овариоэктомии

9% и 10% содержание фракции фосфатидилхолина в мембранах эритроцитов по сравнению с контрольными животными. Кроме того, введение препаратов ограничивало снижение фракции фосфатидилсерина в мембранах эритроцитов у крыс после овариоэктомии: ЭМА повышал уровень фосфатидилсерина на 15%, а этинилэстрадиол - на 13% по сравнению со значениями у контрольных животных (рис. 2).

Таким образом, ЭМА при его курсовом применении, как и проведение терапии этинилэстрадиолом, ограничивают активацию процессов ПОЛ и снижение общего содержания липидов, способствуют восстановлению нормального соотношения липидов и белка, а также препятствуют возрастанию уровня лизофосфолипидов в мембранах эритроцитов у крыс после овариоэктомии. Эти эффекты могут способствовать улучшению вязкоэластических свойств эритроцитов и, следовательно, нормализации показателей клеточной реологии крови при недостаточности половых гормонов.

Помимо нарушения реологических свойств крови и, как следствие, микроциркуляции, важным звеном патогенеза сердечно-сосудистых заболеваний

у женщин в постменопаузальном периоде, является, обусловленная гипоэст-рогенемией, дисфункция эндотелия. Дисфункция эндотелия проявляется уменьшением эндотелийзависимой вазодилятации, нарушением антиадгезивных свойств сосудистой стенки, что приводит к формированию протром-ботических состояний и способствует развитию сердечно-сосудистых заболеваний [Та<Ме1 Б. е1 а1., 1996].

Оценку влияния ЭМА в сравнении с этинилэстрадиолом на функциональное состояние эндотелия сосудов после овариоэктомии у крыс осуществляли в двух сериях экспериментов по способности препаратов влиять на эндотелийзависимые процессы: вазодилятацию и агрегацию тромбоцитов. Было установлено, что амплитуда необратимой агрегации тромбоцитов в БТП крыс-доноров без предварительной инкубации с сегментом сосуда составила 50±2%. Инкубация донорской БТП с сегментами брюшной аорты ложнооперированных и контрольных животных, снижала амплитуду агрегации тромбоцитов до 31±2% и 37±2%, соответственно (табл. 5). Следовательно, овариоэктомия уменьшала антиагрегантные свойства сосудистой стенки на 19% по сравнению с показателем у ложнооперированных крыс. Амплитуда агрегации тромбоцитов овариоэктомированных животных, получавших лечение ЭМА и этинилэстрадиолом составила 30+2% и 31±2% и была достоверно ниже на 19% и 16%, по сравнению со значениями у крыс после овариоэктомии без лечения (табл. 5). Следовательно, ЭМА и этинилэстрадиол при их курсовом введении восстанавливали антиагрегантную активность сосудистой стенки у крыс после овариоэктомии практически до нормы.

Таблица 5

Влияние экстракта маакии амурской (ЭМА, 200 мг/кг в течение 14 дней) и этйнилэстрадиола (25 мкг/кг в течение 14 дней) на антитромбоцитарную активность сосудистой стенки у крыс после овариоэктомии_

Группы животных Исходная агрегация тромбоцитов донорской плазмы, % Агрегация тромбоцитов донорской плазмы после инкубации с сегментами сосудов крыс, %

Ложнооперированные (п=5) 50+2 31±1

Овариоэктомия Контроль (п=5) 37±2*

ЭМА (п=5) 30±2+

Этинилэстрадиол (п=5) 31±2+

Примечание (здесь и в таблицах 6 и 7): * — р<0,05 по сравнению со значениями у ложнооперированных животных; + - р<0,05 по сравнению со значениями у животных контрольной группы.

В серии опытов по изучению вазодилятационной активности эндотелия у крыс контрольной и опытных групп оценивали реакцию артериального давления на введение ацетилхолина и натрия нитропруссида, вызывающих соответсвенно эндотелийзависимое и эндотелийнезависимое расширение сосудов. Коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД) у животных после овариоэктомии был на 66% выше, чем у ложнооперированных крыс (табл. 6). Следовательно, эстрогенная недостаточность, вызванная овариоэктомией у крыс, способствует развитию дисфункции эндотелия артерий. Полученные данные совпадают с результатами клинических исследований об ухудшении функции эндотелия у женщин в постменопаузальном периоде, когда показателем эндотелиальной дисфункции служило резкое снижение эндотелийза-висимой вазодилятации на ацетилхолин [Тюренков И.Н., Воронков A.B., 2008]. Проведение терапии этинилэстрадиолом уменьшало КЭД на 28% по сравнению с овариоэктомированными крысами без лечения, что подтверждают клинические данные об эндотелийпротективной активности эстрогенов [Taddei S. et al., 1996]. КЭД в группе животных, получавших ЭМА, снижался еще более существенно - на 38% по сравнению со значением у контрольной группы, что свидетельствует об устранении дисфункции эндотелия, поскольку величина этого показателя практически достигала соответствующего значения у ложнооперированных крыс (табл. 6).

Следовательно, ЭМА, как и этинилэстрадиол, обладают эндотелийпротективной активностью при овариоэктомии у крыс, что проявилось способностью препаратов восстанавливать эндотелийзависимую вазодилятацию и антиагрегантные свойства сосудистой стенки в этих условиях.

Таблица 6

Влияние экстракта маакии амурской (ЭМА, 200 мг/кг в течение 14 дней) и этинилэстрадиола (25 мкг/кг в течение 14 дней) на коэффициент эндотели-альной дисфункции (КЭД, отн. ед.) у крыс после овариоэктомии_

Группы животных КЭД

Ложнооперированные (п=5) 2,06±0,09

Овариоэктомия (контроль) (п=6) 3,42±0,34*

Овариоэктомия+ЭМА (п=5) 2,11±0,24+

Овариоэктомия+этинилэстрадиол (п=5) 2,46±0,35+

Результатом формирования эндотелиальной дисфункции при различных патологических состояниях являются изменения продукции синтезируемых эндотелиальными клетками биологически активных соединений, среди которых наибольшее значение, с точки зрения рассматриваемой проблемы, имеет окись азота - N0 [Марков Х.М., 2005]. Снижение отмеченной нами

эндотелийзависимой вазодилатации у крыс после овариоэктомии может быть следствием уменьшения продукции и высвобождения окиси азота (N0) в условиях гипоэстрогенемии [Тюренков И.Н., Воронков A.B., 2008]. В связи с этим для оценки степени эндотелиальной дисфункции помимо косвенных показателей (антиагрегантная и сосудорасширяющая активность эндотелия) было изучено влияние овариоэктомии и исследуемых препаратов на уровень в крови стабильных метаболитов окиси азота - нитритов. В крови ложноопе-рированных животных уровень нитритов составил 0,62±0,10 мкг/мл. У ова-риоэктомированных животных этот показатель уменьшался на 53%, то есть эстрогенная недостаточность приводила к значительному снижению нитритов в плазме крови. Введение этинилэстрадиола крысам после овариоэктомии восстанавливало уровень нитритов до показателей у ложнооперирован-ных животных, а курсовое применение ЭМА увеличивало этот показатель на 62% по сравнению с крысами, не получавшими лечение (табл. 7).

Таблица 7

Влияние экстракта маакии амурской (ЭМА, 200 мг/кг в течение 14 дней) и этинилэстрадиола (25 мкг/кг в течение 14 дней) на уровень нитритов (мкг/мл) в сыворотке крови у крыс после овариоэктомии_

Группы животных Нитриты

Ложнооперированные (п=5) 0,62±0Д0

Овариоэктомия (контроль) (п=5) 0,29±0,06*

Овариоэктомия+ЭМА (п=5) 0,47±0,05+

Овариоэктомия+этинилэстрадиол (п=5) 0,61±0,13+

Таким образом, результаты проведенных нами экспериментов свидетельствуют о том, что ЭМА, как и этинилэстрадиол, оказывают существенный терапевтический эффект, направленный на восстановление N0-продуцирующей активности эндотелия у крыс после овариоэктомии, о чем свидетельствует возрастание концентрации нитритов в крови животных после курсового лечения исследуемыми препаратами.

Известно, что одним из основных побочных эффектов ЗГТ являются нарушения в системе гемостаза, что приводит к развитию гиперкоагуляцион-ного синдрома и повышению риска возникновения тромбозов. В связи с этим представляло интерес изучить влияние ЭМА в сравнении с этинилэст-радиолом на гемостазиологические свойства крови у крыс после овариоэктомии.

У животных после овариоэктомии инициация образования тромба аппликацией раствора хлорида железа на сонную артерию приводила к полной остановке кровотока через 60 минут. Тромб сохранялся в просвете сосуда и

через сутки после начала эксперимента. Предварительное лечение овариоэк-томированных крыс ЭМА предупреждало формирование тромба, тогда как этинилэстрадиол, напротив, проявил отчетливое протромбогенное действие в этих условиях (табл. 8).

Таблица 8

Влияние экстракта маакии амурской (ЭМА, 200 мг/кг в течение 14 дней) и этинилэстрадиола (25 мкг/кг в течение 14 дней) на показатели внутрисосу-дистого тромбообразования, вызванного аппликацией на сонную артерию

Группы животных Кровоток в сонной артерии, мл/мин Масса тромба через сутки, мг

Исходное значение 75-я мин опыта

Контроль (овариоэкто-мия) (п=6) 4,5±0,6 0,1 ±0,2* 0,50±0,07

Овариоэкгомия+ЭМА (п=6) 4,9±0,4 5,3±0,7+ 0

Овариоэктомия + этинилэстрадиол (п=5) 4,5±0,8 0,2±0,7* 0,64±0,01

Примечание: * - р<0,05 по сравнению с исходными значениями;+ - р<0,05 по сравнению со значениями у животных контрольной группы.

Полученные данные побудили нас исследовать влияние ЭМА и этинилэстрадиола на состояние сосудисто-тромбоцитарного и коагуляционного звеньев гемостаза. При изучении влияния препаратов на сосудисто-тромбоцитарное звено гемостаза было установлено, что ЭМА снижал амплитуду агрегации тромбоцитов на 28% по сравнению со значениями у крыс, не получавших лечения, а при лечении этинилэстрадиолом отмечена тенденция к повышению этого показателя.

При изучении коагуляционного гемостаза было установлено, что ова-риоэктомия существенно не изменяла АЧТВ и ПВ, достоверно увеличивала уровень фибриногена в крови. В этих условиях этинилэстрадиол уменьшал лишь уровень фибриногена, тогда как ЭМА, судя по всем исследуемым параметрам, существенно снижал коагуляционную активность крови (табл. 9). Полученные данные согласуются с литературными сведениями о наклонности к тромбозам при длительном применении гормонов, причем, изменения, вызываемые этинилэстрадиолом, выше в тромбоцитах, чем в коагуляцион-ном звене [Шаповалов В.И., 2000]. ЭМА как сильный антиоксидант, уменьшая активность ПОЛ в клетках, снижал выраженность АДФ-

индуцированной агрегации тромбоцитов и степень агрегации эритроцитов. Данные эффекты ЭМА могли внести свой вклад в антитромбогенную активность препарата. Кроме того, известно, что изофлавоноиды, в частности, ге-нистеин, могут ингибировать активность тромбина, способствующего ферментативному превращению фибриногена в фибрин [Тутельян В.А., 2003; Gottstein N., 2003; Rimbach G., 2008]. Возможно, с этим связана выявленная нами способность ЭМА уменьшать коагуляционную активность крови.

Таблица 9

Влияние экстракта маакии амурской (ЭМА, 200 мг/кг в течение 14 дней) и этинилэстрадиола (25 мкг/кг в течение 14 дней) на содержание фибриногена в плазме крови (г/л), активированное частичное тромбопластиновое время

Группы животных Фибриноген АЧТВ ПВ

Ложнооперированные (п=7) 2,4±0,4 18,3+1,0 13,4+1,0

Контроль (овариоэктомия) (п=6) 3,3±0,2* 16,1±1,3 14,3+0,5

Овариоэктомия + ЭМА (п=10) 2,5±0,3+ 28,3±5,5+ 19,1+1,3+

Овариоэктомия + этинилэстрадиол (п=9) 2,5±0,3+ 17,3±1,1 14,6±1,1

Примечание: * - р<0,05 по сравнению со значениями у ложнооперированных животных; + - р<0,05 по сравнению со значениями у животных контрольной группы.

Таким образом, экстракт маакии амурской при гипоэстрогенемии, вызванной удалением яичников у крыс, устраняет СПВК преимущественно за счет влияния на клеточные гемореологические параметры. Ослабление агрегации эритроцитов и повышение их деформационных свойств при курсовом применении экстракта маакии амурской связано с ограничением процессов липидной пероксидации, снижением уровня лизофосфолипидов и восстановлением отношения общих липидов к белку в эритроцитарных мембранах. Экстракт маакии амурской ослабляет эндотелиальную дисфункцию при гипоэстрогенемии, восстанавливая его сосудорасширяющую и антиагрегант-ную активность. В отличие от этинилэстрадиола экстракт маакии амурской повышает эффективность доставки кислорода тканям, не обладает прокоагу-лянтным действием, что позволяет рекомендовать препарат для клинических исследований в качестве альтернативы ЗГТ в профилактике и лечении сердечно-сосудистых осложнений климактерического синдрома у женщин.

ВЫВОДЫ

1. На модели гипервязкости крови in vitro наибольшую гемореологическую активность проявляет суммарный экстракт маакии амурской, содержащий в своем составе изофлавоноиды и стильбены.

2. Экстракт маакии амурской при экспериментальной овариоэктомии уменьшает выраженность синдрома повышенной вязкости крови преимущественно за счет влияния на клеточные параметры реологии крови, увеличивает эффективность доставки кислорода тканям. Этинилэстрадиол в этих условиях уменьшает повышенную вязкость крови как за счет улучшения реологических свойств эритроцитов, так и в результате снижения гематокрита, но при этом не повышает индекс эффективности доставки кислорода тканям.

3. Экстракт маакии амурской в условиях экспериментальной гипоэстрогене-мии более эффективно, чем этинилэстрадиол, ограничивает активацию процессов перекисного окисления липидов в мембранах эритроцитов. Экстракт маакии амурской и этинилэстрадиол уменьшают уровень лизофосфолипи-дов, восстанавливают нормальное соотношение липидов и белка в эритроци-тарных мембранах.

4. Экстракт маакии амурской обладает эндотелийпротективной активностью у овариоэктомированных крыс, при этом не уступает этинилэстрадиолу в способности восстанавливать эндотелийзависимую вазодилятацию и потенцировать антиагрегантную активность сосудистой стенки.

5. Экстракт маакии амурской, в отличие от этинилэстрадиола, обладает ан-титромбоцитарным действием, уменьшает коагуляционные свойства крови и препятствует формированию тромба в сосуде при его инициации раствором хлорида железа у крыс после овариоэктомии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шульгау З.Т., Плотникова Т.М., Алиев О.И., Плотникова А.М. Влияние экстрактов маакии амурской на вязкость крови и агрегацию тромбоцитов // Микроциркуляция и гемореология: Тез. VI междунар. конф. Ярославль, 2007.-С. 22.

2. Плотникова Т.М., Шульгау З.Т., Алиев О.И., Плотникова А.М., Федорееев С.А. Влияние полифенолов маакии амурской на реологические свойства крови при овариоэктомии у крыс // Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений: Матер. П Междунар. конф. - Алматы, 2007. -С. 139.

3. Плотникова Т.М., Шульгау З.Т., Плотникова A.M., Алиев О.И., Федореев С.А., Кулеш Н.И. Сравнительная эффективность влияния этинилэстрадиола и экстракта маакии амурской на реологические свйоства крови и гемо-

стаз у овариоэктомированных крыс // Создание новых лекарственных препаратов: Матер, конф. - Томск, 2007. - С. 37-39.

4. Плотникова A.M., Шульгау З.Т. Эндотелийпротекторные эффекты экстракта маакии амурской и гормональной заместительной терапии этинилэстра-диолом при овариоэктомии у крыс // Науки о человеке: Материалы IX конгресса молодых ученых и специалистов. - Томск, 2008. - С. 118-119.

5. Плотникова Т.М., Шульгау З.Т., Плотникова A.M., Федореев С.А., Имбс Т.Н., Мищенко Н.П., Веселова М.В., Кулеш Н.И., Уткина Н.К. Разработка нового фитоэстрогенного препарата на основе полифенольного комплекса из маакии амурской // Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств: Материалы симпозиума. - Москва, 2008. - С. 160-161.

6. Плотникова A.M., Шульгау З.Т., Плотникова Т.М., Алиев О.И., Федореев С.А. Антитромбогенная и антитромбоцитарная активность экстракта маакии амурской при овариоэктомии у крыс // XII международная научная конференция: «Здоровье семьи - XXI век». - Израиль, 2008. - С-131-132.

7. Плотникова Т.М., Шульгау З.Т., Плотникова A.M. Антиоксидантное действие экстракта маакии амурской на эритроциты при овариоэктомии у крыс // V Всероссийская конференция-школа: Химия и технология растительных веществ. - Уфа, 2008. - С. 236.

8. Плотникова A.M., Шульгау З.Т., Алиев О.И., Плотникова Т.М. Синдром повышенной вязкости крови у крыс после овариоэктомии // IV Сибирский физиологический съезд. - Барнаул, 2008.-Т.1, - С. 226.

9. Плотникова A.M., Шульгау З.Т., Плотникова Т.М., Алиев О.И., Боровская Т.Г. Синдром повышенной вязкости крови при овариоэктомии у крыс // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2008. - Т. 140, № 7 - С. 101-104.

10. Плотникова Т.М., Шульгау З.Т., Плотникова A.M., Федореев С.А., Кулеш Н.И., Мищенко Н.П. Влияние экстракта маакии амурской на липидный спектр и перекисное окисление липидов в мембранах эритроцитов при овариоэктомии у крыс // Эксперим. и клиническая фармакология. - 2008. - Т. 71,№ 6-С. 28-30.

П.Плотникова A.M., Шульгау З.Т., Плотникова Т.М., Алиев О.И., Кулеш Н.И., Мищенко Н.П., Федореев С.А. Антитромбогенная и антитромбоцитарная активность экстракта из древесины маакии амурской // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2009. - Т. 147, № 2 - С. 164-167.

12.Плотникова A.M., Плотникова Т.М., Шульгау З.Т., Федореев С.А., Кулеш Н.И., Мищенко Н.П., Василевская H.A., Имбс Т.И., Глебко Л.И. Средство, обладающее гемореологической и антитромбоцитарной активностью: Пат. РФ №2342944.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ БТП - богатая тромбоцитами плазма ВК - вязкость крови ВП - вязкость плазмы ДК - диеновые конъюгаты ЗГТ - заместительная гормональная терапия ИДЭ - индекс деформируемости эритроцитов КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции МДА - малоновый диальдегид ПОЛ - перекисное окисление липидов СПВК - синдром повышенной вязкости крови ЭМА - экстракт маакии амурской

Опкчатю в ООО «Графика» 634050. Россия, г. Тон», ул. Бслснш. 17 тел. (382-2) 52-65-15 Заказ № 938 от 13.03.2009 Тираж 100 экз.

Актуальность проблемы. По статистике средняя продолжительность жизни женщин неуклонно растет и более 1/3 своей жизни женщина находится в периоде пери- и постменопаузы, т.е. в условиях возрастных изменений гомеоста-за, сопровождающихся глубокой перестройкой гормонального профиля и психофизиологических реакций на эти изменения. По прогнозам ВОЗ к 2015 г. 46% женщин окажется в возрасте старше 45 лет. Проблема сохранения здоровья женщин 45-65 лет актуальна и для России в XXI веке, где данная возрастная группа составляет почти одну пятую часть населения (29,6 млн) [2, 94]. В связи с этим более пристального внимания заслуживает вопрос адекватного лечения климактерических проблем, возникающих более чем у 70% женщин в указанный период жизни [38, 91, 98].

У женщин на фоне эстрогенного дефицита, вызванного естественной или хирургической менопаузой, помимо вегетативных и психоэмоциональных симптомов, снижающих качество жизни, отмечен значительный рост сердечнососудистых заболеваний [38, 47, 59, 72, 93, 94, 98], важным звеном патогенеза которых являются нарушения реологических свойств крови, гемостатический дисбаланс, эндотелиальная дисфункция [1, 66, 27, 192, 212, 222, 233]. Гормональная заместительная терапия уменьшает проявления климактерического синдрома, но, в силу наличия серьезных побочных эффектов, не рекомендуется для длительного применения с целью уменьшения риска возникновения сердечно-сосудистых заболеваний [31, 32, 42, 46, 154, 192, 213, 240].

Естественная и послеоперационная эстрогенная недостаточность протекают на фоне ярко выраженного оксидантного стресса [46, 119]. В этих же клинических ситуациях наблюдаются гемореологические расстройства, приводящие к формированию синдрома повышенной вязкости крови, причем в процесс самым непосредственным образом вовлекаются эритроциты — возрастает их агрегация и снижается деформируемость [7, 66, 233]. Следовательно, существуют основания считать активацию перекисного окисления липидов фактором, участвующим в повреждении клеточного звена реологии крови. Сведения о возможности предотвращать негативное влияние липидной пероксидации на реологические функции эритроцитов с помощью антиоксидантов [162, 199] побудили нас к поиску перспективных гемореологических препаратов при гипоэст-рогенемии среди природных антиоксидантов - экстрактов изофлавоноидсодер-жащих растений, поскольку изофлавоноиды относятся к фитоэстрогенам [5, 69, 100, 101, 125,216].

Фитоэстрогены, являясь избирательными модуляторами эстрогеновых рецепторов [38, 52, 69, 101], могут быть реальной альтернативой ЗГТ в условиях эстрогенной недостаточности. Несмотря на высокую потребность, фитоэстро-генные препараты на фармацевтическом рынке представлены весьма скромно. Разработаны фитоэстрогенные препараты из экстракта растения Cimicifuga га-cemosa [5, 90, 128]. Отечественных лекарственных препаратов, обладающих фитоэстрогенной активностью нет. Объектом исследования выбран полифе-нольный комплекс из древесины эндемичного приморского растения семейства бобовые маакии амурской {Maackia amurensis Rupr. et. Maxim.), который был зарегистрирован в 2004 г. в Российской Федерации в качестве фармакологической субстанции (Р №003309/01) для изготовления лекарственного препарата «Максар® таблетки, покрытые оболочкой, 60 мг» (Р №003294/01). Максар разрешен для клинического применения в качестве гепатопротектора. Высокое содержание изофлавоноидов в экстракте древесины маакии амурской явилось основанием для изучения его эффектов в условиях гипоэстрогенемии.

Цель исследования. Изучить влияние экстракта маакии амурской в сравнении с действием этинилэстрадиола на реологические свойства крови, гемостаз и функциональную активность эндотелия в условиях экспериментальной оварио-эктомии.

Задачи исследования.

1. На модели гипервязкости крови in vitro выявить наиболее эффективный экстракт маакии амурской по его влиянию на вязкость крови и агрегацию тромбоцитов.

2. Оценить влияние экстракта маакии амурской в сравнении с действием этинилэстрадиола на реологические свойства крови и эффективность доставки кислорода тканям у крыс при экспериментальной овариоэктомии.

3. Исследовать влияние экстракта маакии амурской в сравнении с действием этинилэстрадиола на перекисное окисление липидов и фосфолипидный состав мембран эритроцитов у крыс после овариоэктомии.

4. Изучить влияние экстракта маакии амурской на эндотелийзависимые эффекты у овариоэктомированных крыс в сравнении с терапией этинилэстра-диолом.

5. Оценить влияние экстракта маакии амурской и этинилэстрадиола на гемостаз крыс с экспериментальной гипоэстрогенемией.

Научная новизна. В условиях экспериментальной гипоэстрогенемии впервые выявлена способность экстракта маакии амурской ослаблять выраженность синдрома повышенной вязкости крови и улучшать эффективность доставки кислорода тканям. Получены приоритетные данные о способности экстракта маакии амурской улучшать реологические свойства эритроцитов и уменьшать агрегацию тромбоцитов. Впервые показано, что у крыс после овариоэктомии экстракт маакии амурской эффективнее, чем этинилэстрадиол снижает процессы липидной пероксидации в мембранах эритроцитов и предупреждает их окислительную модификацию. Новыми являются данные о наличии у экстракта маакии амурской эндотелийпротективной активности, выявленной в условиях экспериментальной овариоэктомии. Установлено, что экстракт маакии амурской, в отличие от этинилэстрадиола, уменьшает активность свертывающей системы крови при экспериментальной гипоэстрогенемии.

Научно-практическая значимость. В результате проведенного исследования получены новые данные фундаментального характера о механизмах формирования синдрома повышенной вязкости крови при овариоэктомии и способах их коррекции с помощью эстрогенов и фитоэстрогенов — изофлавоноидов экстракта маакии амурской. Установлены принципиальные различия в действии гормональной терапии и фитоэстрогенов на реологические свойства крови, гемостаз и эндотелий сосудов в условиях экспериментальной гипоэстрогене-мии. Материалы доклинических исследований специфической активности экстракта маакии амурской вошли в комплект документов для представления в Министерство здравоохранения и социального развития Российской Федерации с целью получения разрешения на клинические исследования препарата по новому показанию в качестве противоклимактерического средства.

Публикации: По теме диссертации опубликовано 12 работ, из них 3 — в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура работы: Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста. Состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Библиографический указатель включает 244 источника, из них 111 отечественных и 133 зарубежных. Иллюстративный материал представлен 8 рисунками и 18 таблицами.

105 ВЫВОДЫ

1. На модели гипервязкости крови in vitro наибольшую гемореологическую активность проявляет суммарный экстракт маакии амурской, содержащий в своем составе изофлавоноиды и стильбены.

2. Экстракт маакии амурской при экспериментальной овариоэктомии уменьшает выраженность синдрома повышенной вязкости крови преимущественно за счет влияния на клеточные параметры реологии крови, увеличивает эффективность доставки кислорода тканям. Этинилэстрадиол в этих условиях уменьшает повышенную вязкость крови как за счет улучшения реологических свойств эритроцитов, так и в результате снижения гематокрита, но при этом не повышает индекс эффективности доставки кислорода тканям.

3. Экстракт маакии амурской в условиях экспериментальной гипоэстрогенемии более эффективно, чем этинилэстрадиол, ограничивает активацию процессов перекисного окисления липидов в мембранах эритроцитов. Экстракт маакии амурской и этинилэстрадиол уменьшают уровень лизофосфолипидов, восстанавливают нормальное соотношение липидов и белка в эритроцитарных мембранах.

4. Экстракт маакии амурской обладает эндотелийпротективной активностью у овариоэктомированных крыс, при этом не уступает этинилэстрадиолу в способности восстанавливать эндотелийзависимую вазодилятацию и потенцировать антиагрегантную активность сосудистой стенки.

5. Экстракт маакии амурской, в отличие от этинилэстрадиола, обладает анти-тромбоцитарным действием, уменьшает коагуляционные свойства крови и препятствует формированию тромба в сосуде при его инициации раствором хлорида железа у крыс после овариоэктомии.