Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Фитоэстрогены как альтернатива заместительной гормональной терапии при гипоэстрогенемии (экспериментальное исследование)

На правах рукописи

АНИЩЕНКО АННА МАРКОВНА

ФИТОЭСТРОГЕНЫ КАК АЛЬТЕРНАТИВА ЗАМЕСТИТЕЛЬНОЙ ГОРМОНАЛЬНОЙ ТЕРАПИИ ПРИ ГИПОЭСТРОГЕНЕМИИ

(экспериментальное исследование)

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

2 7 НДР 2014

Томск-2014 005546517

005546517

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научный консультант:

доктор медицинских наук

Алиев Олег Ибрагимович

Официальные оппоненты:

Зверев Яков Федорович, доктор медицинских наук, профессор Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Алтайский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации,кафедра фармакологии, профессор кафедры

Тюренков Иван Николаевич, доктор медицинских наук, профессор, заслуженный работник высшей школы, Государственное бюджетное общеобразовательное учреждение высшего профессионального образования "Волгоградский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра фармакологии и биофармации факультета усовершенствования врачей, заведующий кафедрой

Ваизова Ольга Евгеньевна, доктор медицинский наук, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации кафедра фармакологии, профессор кафедры

Ведущее учреждение: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН

Защита состоится "23" мая 2014 г. в "9.30" часов на заседании диссертационного совета Д 001.031.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (634028, Томск, пр. Ленина, 3; адрес сайта: pharmso.ru)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Автореферат разослан " ^ " г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук

Амосова Евдокия Наумовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. За последние 30 лет доля населения в возрасте 60 лет и старше возросла с 11 до 15% и к настоящему времени 70% женщин переступают порог менопаузы, а 55% - достигают возраста 75 лет [Минеев В.Н., 2005]. По прогнозам ВОЗ к 2015 г. 46% женщин окажется в возрасте старше 45 лет. Современные женщины проживают треть своей жизни в периоды пери- и постменопаузы, сопровождающиеся существенным изменением гормонального статуса, связанным с прекращением функции яичников [Сметник В.П., 2007]. Проблема сохранения здоровья женщин 45-65 лет актуальна и для России в XXI веке, где данная возрастная группа составляет почти одну пятую часть населения (29,6 млн.) [Аккер JI.B. и др., 2004]. Климактерический период является физиологическим процессом возрастной инволюции организма, однако у большинства женщин возникает патологический симптомокомплекс - климактерический синдром, наличие которого существенно снижает качество жизни. При климактерическом синдроме кроме вегетативных и психоэмоциональных нарушений отмечен значительный рост сердечно-сосудистых заболеваний, в патогенезе которых важную роль играют нарушения реологических свойств крови, гемостаза, липидного обмена и эндотелиальная дисфункция [Тихомиров A.JL, 2007; Сметник В.П. и др., 2007; Okeke Т.С. et al„ 2013; Papadopoulou S.A. et al„ 2013]. В связи с этим не вызывает сомнения значимость адекватного лечения климактерических проблем, возникающих в постменопаузальный период более, чем у 70% женщин [Сметник В.П. и др., 2007; Тихомиров А.Л., 2007].

Патогенетическим методом коррекции климактерических нарушений является гормональная заместительная терапия (ГЗТ). В настоящее время ГЗТ назначают пациенткам для купирования менопаузальных симптомов, урогенитальных нарушений, для профилактики потери массы костной ткани, колоректального рака, развития метаболических и других расстройств, возникающих при климактерическом синдроме [Thielemann A. et al., 2010; Kapur P. et al., 2010]. Однако многими авторами установлено, что при длительном применении ГЗТ у женщин с эстрогенной недостаточностью повышается риск развития венозных тромбозов, ИБС, инсультов, а также рака молочной железы [Vickers M.R. et al., 2007; Canonico M. et al., 2009; Canonico M. et al., 2011]. Следовательно, эффективность ГЗТ при климактерическом синдроме сочетается с относительно высоким риском развития серьезных побочных эффектов. На успех применения гормональной терапии можно рассчитывать у пациенток с хирургической менопаузой и в ранние сроки естественной менопаузы, тогда как у пожилых женщин с преморбидными состояниями преобладают отрицательные эффекты ГЗТ [Rosano G.M. et al., 2006; Сметник В.П. и др., 2007]. Учитывая вышесказанное, предпринимаются попытки найти адекватную замену ГЗТ таким образом, чтобы сохранив позитивные эффекты гормональной терапии свести к минимуму ее серьезные побочные эффекты. С этих позиций несомненный интерес представляют фитопрепараты, обладающие4 эстрогеноподобной активностью. Развитие данного направления в настоящее

время может быть успешным в связи со значительным повышением качества фитопрепаратов, что обусловлено совершенствованием технологии их получения и стандартизации, возможностью выделения индивидуальных действующих веществ [Ледина A.B., Прилепская В.П., 2012]. Следовательно, перспективным направлением поиска альтернативных гормональной терапии методов коррекции климактерических расстройств представляется исследование фитоэстрогенных препаратов различных химических классов, в частности, изофлавоноидов и лигнанов. Фитоэстрогены структурно близки 17р-эстрадиолу, что позволяет им связываться с эстрогеновыми рецепторами и воспроизводить эффекты естественных гормонов [Zhang E.J. et al., 2007; Vitale D.C. et al., 2012]. Вместе с тем, изофлавоноиды и лигнаны, обладая большим аффинитетом к ß-эстрогеновым рецепторам, могут обладать определенной тканеспецифичностью [Djioque S. et al., 2010; Vitale D.C. et al., 2012], что позволяет надеяться на разделение нежелательных пролиферативных эффектов в системе репродукции и терапевтического воздействия на другие эстрогенчувствительные ткани и органы.

Кроме того, фитоэстрогены обладают выраженными антиоксидантными свойствами, способны ингибировать активность ряда ферментов, обеспечивая противоопухолевый эффект в отношении гормонозависимых новообразований [Ding W., Liu Y., 2011; Mestre-Alfaro A. et al., 2011].

Совокупность биологических эффектов фитоэстрогенов позволяет предположить, что эти вещества могут быть реальной альтернативой ГЗТ в условиях эстрогенной недостаточности. Несмотря на высокую потребность, фитоэстрогенные препараты на фармацевтическом рынке представлены весьма скромно. Отечественных лекарственных средств, обладающих фитоэстрогенной активностью, нет. Для профилактики и лечения климактерических расстройств разработаны лекарственные средства из корней и корневищ цимицифуги (Cimicifuga racemosa L.) (Bionorica AG, Германия). Эффективность препаратов цимицифуги в качестве негормональных антиклимактерических средств делает перспективным поиск фитоэстрогенных препаратов, относящихся к двум основным классам - изофлавонов и лигнанов.

Высокое содержание изофлавоноидов в экстрактах маакии амурской (ЭМА), люцерны посевной и клевера красного (ЭЛиК), а также лигнана -секоизоларицирезинола диглюкозида в экстракте семян льна (ЭСЛ), явилось основанием для изучения указанных экстрактов в качестве фитоэстрогенов при экспериментальной овариоэктомии.

Степень разработанности. В плане изучения альтернативных гормональной заместительной терапии методов коррекции климактерического синдрома особое внимание уделяется фитопрепаратам, обладающим эстрогеноподобным действием. Однако в качестве негормональных антиклимактерических средств используют только препараты из корней и корневищ цимицифуги и, в основном, для коррекции вазомоторных и психоэмоциональных нарушений. Фитопрепаратов для профилактики и лечения сердечно-сосудистых осложнений климактерического синдрома нет. Фитоэстрогены классов изофлавонов и лигнанов обладают структурным

сходством с 17р-эстрадиолом, выраженными антиоксидантными свойствами, противоопухолевым эффектом, но практически неисследованным остается их влияние на такие факторы, повышающие риск возникновения сердечнососудистых осложнений при гипоэстрогенемии, как эндотелиальная дисфункция, нарушения реологических свойств крови и системы гесостаза.

Цель исследования. Изыскание новых фитоэстрогенных средств классов изофлавонов и лигнанов, изучение их антиклимактерического действия и влияния на сердечно-сосудистые нарушения при экспериментальной овариоэктомии.

Задачи исследования.

1. Исследовать влияние экстрактов, содержащих изофлавоноиды (маакия амурская, люцерна посевная и клевер красный) и растительные лигнаны (экстракт семян льна) на психоэмоциональные и вазомоторные реакции у крыс с гипоэстрогенемией, вызванной овариоэктомией.

2. Изучить влияние экстрактов маакии амурской и семян льна на процессы остеопороза у крыс после овариоэктомии.

3. В исследованиях in vitro среди экстрактов маакии амурской различного полифенольного состава выявить наиболее эффективный по его влиянию на вязкость крови и агрегацию тромбоцитов.

4. Осуществить углубленное изучение гемореологической активности и влияния на эффективность доставки кислорода тканям экстрактов, содержащих изофлавоноиды (маакия амурская) и растительные лигнаны (экстракт семян льна) при экспериментальной овариоэктомии.

5. Оценить влияние экстрактов маакии амурской и семян льна на перекисное окисление липидов в мембранах эритроцитов у крыс после овариоэктомии.

6. Изучить действие экстрактов, содержащих изофлавоноиды (маакия амурская, люцерна посевная и клевер красный) и растительные лигнаны (экстракт семян льна) на эндотелиальную дисфункцию у овариоэктомированных крыс.

7. Оценить влияние экстрактов маакии амурской, люцерны посевной и клевера красного, семян льна на показатели сосудисто-тромбоцитарного и плазменного гемостаза у крыс после овариоэктомии.

Научная новизна.

Впервые установлено, что фитоэстрогены классов изофлавоноидов (экстракты маакии амурской, люцерны посевной и клевера красного) и лигнанов (экстракт семян льна) оказывают антиклимактерическое действие, устраняя экспериментальные эквиваленты ранних симптомов климактерического синдрома (тревогу, «приливы жара») и поздние метаболические расстройства (остеопороз) в условиях овариоэктомии.

При экспериментальной гипоэстрогенемии впервые выявлена способность экстрактов маакии амурской и семян льна ослаблять выраженность синдрома повышенной вязкости крови за счет улучшения реологических свойств эритроцитов, что обеспечивает повышение эффективности доставки кислорода тканям.

Впервые показано, что у крыс после овариоэктомии экстракты, содержащие изофлавоноиды (маакии амурской, люцерны посевной и клевера красного) и растительные лигнаны (экстракт семян льна) эффективно снижают процессы липидной пероксидации в мембранах эритроцитов и предупреждают их окислительную модификацию.

Новыми являются данные о наличии у фитоэстрогенов классов изофлавонов и лигнанов эндотелийпротективной активности, выявленной в условиях экспериментальной овариоэктомии. Установлено, что экстракты маакии амурской, люцерны посевной и клевера красного, семян льна уменьшают агрегацию тромбоцитов при экспериментальной гипоэстрогенемии.

Теоретическая и практическая значимость работы. Получены данные фундаментального характера о механизмах коррекции реологических свойств крови при экспериментальной овариоэктомии фитоэстрогенами различных классов. Установлены принципиальные различия влияния гормональной терапии и фитоэстрогенов на реологические свойства крови и гемостаз в условиях экспериментальной гипоэстрогенемии.

Получены приоритетные данные об антиклимактерическом действии экстракта маакии амурской и его влиянии на реологические свойства крови при экспериментальной овариоэктомии (патенты РФ № 2342944 от 10.01.2009 и №2398592 от 10.09.2010), об эндотелийпротекторной активности экстракта семян льна при овариоэктомии у крыс (патент РФ №2455018 от 10.07.2012).

Материалы доклинических исследований экстракта маакии амурской представлены в Министерство здравоохранения Российской Федерации с целью получения разрешения на клинические исследования препарата по новому показанию в качестве антиклимактерического средства.

Методология и методы исследования. Согласно поставленным задачам выбраны современные высоко информативные методические подходы, имеющиеся в научно-исследовательских лабораториях ФГБУ «НИИ фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» СО РАМН. В качестве объекта исследования использованы аутбредные самки крыс сток Вистар в условиях овариоэктомии. Основные методы исследования: физиологические (изучение двигательной активности, ориентировочно-исследовательского поведения, «приливов жара» и функциональной активности эндотелия), гистологический (изучение процессов остеопороза), иммуноферментные (исследование содержания эстрадиола в пробах сыворотки), гемореологические (оценка вязкости цельной крови, вязкости плазмы, гематокрита, спонтанной агрегации и деформируемости эритроцитов), гемостазиологические (определение агрегации тромбоцитов, активированного частичного тромбопластинового времени и протромбинового времени), биохимические методы (исследование липидного и фосфолипидного состава мембран эритроцитов, перекисного окисления липидов), статистический анализ результатов.

Положения, выносимые на защиту:

1. При экспериментальной овариоэктомии формируется специфический синдром повышенной вязкости крови, обусловленный изменением как макрореологических показателей (повышение гематокрита и фибриногена в

плазме крови), так и клеточных параметров (нарушение деформируемости и повышение агрегации эритроцитов).

2. Фитоэстрогены классов изофлавонов и лигнанов уменьшают вазомоторные нарушения («приливы жара») и снижают проявления экспериментальных тревоги и страха, существенно не влияя на двигательную активность крыс после овариоэктомии. Экстракт маакии амурской уменьшает также и эстрогензависимые процессы резорбции костной ткани при экспериментальной овариоэктомии.

3. Уменьшения повышенной вязкости крови у крыс после овариоэктомии можно достичь как курсовым применением этинилэстрадиола, так и фитоэстрогенов классов изофлавонов и лигнанов, но при этом фитоэстрогены, в отличие от этинилэстрадиола, не влияют на уровень половых гормонов в крови и обеспечивают восстановление индекса эффективности доставки кислорода тканям.

4. Фитоэстрогены, как и этинилэстрадиол, ограничивают выраженность основных факторов, повышающих риск сердечно-сосудистых нарушений при экспериментальной гипоэстрогенемии: уменьшают вязкость крови и эндотелиальную дисфункцию (восстанавливают антиагрегантные и вазодилятационные свойства эндотелия). При этом фитоэстрогены замедляют и даже предупреждают в отсроченном периоде образование внутрисосудистого тромба, а этинилэстрадиол оказывает протромбогенное действие.

Степень достоверности и апробация результатов. Высокая степень достоверности полученных результатов подтверждается достаточным объемом экспериментального материала, использованием современных методов и методических подходов, высокотехнологичного оборудования, а также адекватных критериев для статистической обработки результатов.

Основные положения диссертации представлены на VI международной конференции «Микроциркуляция и гемореология» (Ярославль, 2007); II международной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений» (Алматы, 2007); конференции НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН «Создание новых лекарственных препаратов» (Томск, 2007); IV Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008); IX Konqxxce молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2008); XII международной научной конференции «Здоровье семьи - XXI век» (Израиль, 2008); V Всероссийской конференции-школе «Химия и технология растительных веществ» (Уфа, 2008); симпозиуме «Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств» (Москва, 2008); IV Всероссийской конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (Москва, 2009); XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2009); VII Всероссийской научной конференции «Химия и медицина, 0рхимед-2009» с Молодежной научной школой (Уфа, 2009); VIII Всероссийской научной конференции «Химия и медицина, 0рхимед-2010» с Молодежной научной школой (Уфа, 2010); 2ndAnnual Russian Korean Conference «Curren tissues of natural products chemistry and biotechnology» (Novosibirsk, 2010); XVIII

Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2011); VIII международной конференции «Системное кровообращение, микроциркуляция и гемореология» (Ярославль, 2011); XII конгрессе молодых ученых с международным участием «Науки о человеке» (Томск, 2011); XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2012); 1Усъезде фармакологов России (Казань, 2012); конференции молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2012).

Исследования частично проведены при финансовой поддержке ФЦП «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу» в рамках госконтракта 16.N08.12.1006 по теме «Доклинические исследования лекарственного средства на основе секоизоларицирезинола для лечения климактерических расстройств и эстрогензависимых опухолей».

По теме диссертации опубликовано 38 печатных работ, из них 16 - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, по материалам исследования получено 3 патента РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 227 страницах машинописного текста. Состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Библиографический указатель включает 336 источников, из них 110 отечественных и 226 зарубежных. Иллюстративный материал представлен 15 рисунками и 59 таблицами. Автор принимал непосредственное участие в планировании работы и разработке дизайна исследования, постановке его цели и задач. Автором лично осуществлен анализ литературных данных, получение и интерпретация основных результатов исследования, их статистическая обработка и подготовка к печати статей и тезисов по теме диссертации.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В первой главе представлен анализ отечественной и зарубежной научной литературы по теме исследования. В первом разделе представлены современные представления о патогенезе климактерических нарушений и возможностях гормональной заместительной терапии, проанализированы ее достоинства и недостатки. Основной раздел обзора литературы посвящен анализу альтернативных методов коррекции климактерических расстройств, в частности, фитоэстрогенам классов изофлавонов и лигнанов, подробно охарактеризован спектр их фармакологической активности.

Вторая глава диссертации посвящена описанию материалов и методов исследования. Эксперименты проведены на 640 аутбредных самках крыс сток Вистар массой 250-300 г. Животные получены из отдела экспериментальных биологических моделей ФГБУ «НИИ фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» СО РАМН г. Томск. Животные находились в стандартных условиях вивария на обычном пищевом рационе и свободном доступе к воде и пище. Массу животных контролировали еженедельным взвешиванием для коррекции вводимой дозы препаратов. Условия содержания и манипуляции с животными

соответствовали стандартам, указанным в нормативных документах регламентирующих работу с лабораторными животными [ГОСТ 53434, 2010; ГОСТ Р ИСО 10993-2, 2009]. Дизайн исследования одобрен этическим комитетом ФГБУ «НИИ фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» СО РАМН.

В работе использовали экстракты из ядровой древесины дальневосточного растения семейства бобовых маакии амурской (Maackia amwensis Rupr. et. Maxim), предоставленные ФГБУ науки Тихоокеанский институт биоорганической химии имени Г.Б. Елякова ДВО РАН, г. Владивосток. На этапе скрининга исследовали несколько сухих экстрактов маакии амурской. Суммарный экстракт из древесины маакии амурской (экстракт 1) представляет собой сумму изофлавоноидов, мономерных и димерных стильбенов. Содержание полифенолов в экстракте 1 по данным ВЭЖХ составляет 21,6%: стильбены - 8,9%, изофлавоноиды - 12,7%. Экстракт 2 - это сумма идентифицированных по данным ВЭЖХ изофлавоноидов, составляющих 68,9% от общей массы. Экстракт 3 представляет собой сумму стильбенов, составляющих 55% от общей массы.

В исследовании использовали также субстанции, предоставленные ЗАО «Эвалар», г. Бийск: экстракт клевера красного (Trifolium rubens L.) сухой и экстракт люцерны посевной (Medicágo sativa L.) сухой. Субстанции смешивали в соотношении 1:1, содержание изофлавоноидов в смеси составило 11,2%.

В качестве препарата, содержащего лигнаны, использовали экстракт семян льна сухой (Semem Lim) («Alalife», Китай). Содержание секоизоларицирезинола диглюкозида в экстракте, по данным ВЭЖХ, составляло 42%.

Для проведения заместительной гормональной терапии использовали этинилэстрадиол («Микрофоллин®», Gedeon Richter, Венгрия) - таблетки, содержащие 50 мкг этинилэстрадиола.

В качестве фитопрепарата сравнения использовали сухой экстракт корневищ цимшшфуги (Cimicifuga racemosa L.), который выпускается в таблетках, содержащих 20 мг активного ингредиента («Климадинон®», Bionorica AG, Германия).

Изучение гемореологических и антитромбоцитарных эффектов исследуемых экстрактов осуществляли в условиях in vitro и in vivo. Состояние гипервязкости крови при выполнении экспериментов в условиях in vitro воспроизводили инкубацией крови при температуре 20,0±0,4 °С в течение 60 минут.

Для опытов in vitro исследуемые экстракты маакии амурской 1, 2 и 3 вводили внутрижелудочно ежедневно (в течение 5 дней) в дозах 200 мг/кг, 40 мг/кг и 35 от/кг соответственно в виде суспензии в 1% крахмальной слизи. Дозы экстрактов 2 и 3 подбирались таким образом, чтобы вводимое количество изофлавоноидов и стильбенов соответствовало их содержанию в экстракте 1. Композицию экстрактов люцерны посевной и клевера красного, экстракт семян льна вводили внутрижелудочно ежедневно (в течение 5 дней) в дозах 200 мг/кг и 40 мг/кг соответственно. Контрольным животным вводили эквиобъемное количество 1% крахмальной слизи. Через 2 часа после последнего введения

забирали кровь для исследования. После забора крови у опытных и контрольных животных в одних образцах регистрировали все исследуемые показатели, а другие пробы крови инкубировали при температуре 20,0±0,4 °С в течение 60 мин и затем производили измерение исследуемых показателей.

Для воспроизведения синдрома повышенной вязкости крови (СПВК) у самок крыс in vivo использовали модель билатеральной овариоэктомии. Удаление яичников осуществляли согласно общепринятой методике [Киршенблат Я.Д., 1969]. Крысы, у которых проводили лапаротомию и ушивали рану, составляли группу ложнооперированных животных. Стадию астрального цикла у животных оценивали по изменению клеточного состава в мазках влагалищной жидкости [Хэм А. и др., 1983; Гольдштейн Д.В. и др., 2004].

Через семь дней после овариоэктомии животным начинали вводить исследуемые препараты: этинилэстрадиол в дозе 25 мкг/кг, экстракт цимицифуги в дозе 100 мг/кг, суммарный экстракт маакии амурской в дозе 200 мг/кг, композицию экстрактов люцерны посевной и клевера красного в дозе 200 мг/кг и экстракт семян льна в дозе 40 мг/кг ежедневно внутрижелудочно в течение 14 дней. Контрольным животным по аналогичной схеме вводили эквиобъемное количество 1% крахмальной слизи. Для исследования системы гемостаза, гемореологической и эндотелийпротективной активности препаратов забор проб крови осуществляли из общей сонной артерии животных через 2 часа после последнего введения препаратов. Кровь стабилизировали 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 9:1.

При изучении влияния экстрактов маакии амурской и семян льна в вышеперечисленных дозах на процессы остеопороза длительность курса лечения овариоэктомированных животных составила 60 дней.

Для оценки гемореологического статуса животных определяли следующие параметры: вязкость цельной крови, вязкость плазмы, гематокрит, концентрацию фибриногена в плазме, спонтанную агрегацию и деформируемость эритроцитов. Значения вязкости крови и плазмы при различных скоростях сдвига определяли на ротационном гемовискозиметре АКР-2 [Добровольский H.A. и др., 1997]. Агрегацию эритроцитов исследовали силлектометрическим методом [Плотников М.Б. и др., 1995]. Исследование деформируемости эритроцитов осуществляли методом лазерной дифрактометрии [Белкин A.B. и др., 1991]. Гематокрит оценивали методом центрифугирования в стеклянных капиллярах при помощи центрифуги РС-6 и выражали в %. Индекс эффективности транспорта кислорода в ткани рассчитывали как отношение гематокрита к вязкости крови при различных скоростях сдвига [Stoltz J.E., Donner M., 1991]. Концентрацию фибриногена в плазме оценивали методом тромбообразования Клауса на коагулометре KG-4 (Cormay, Польша) с использованием набора реагентов для определения концентрации фибриногена «Фибриноген-тест». Определение активированного парциального (частичного) тромбопластинового времени проводили с помощью наборов «АПТВ (АЧТВ)-тест». Протромбиновое время свертывания

оценивали с помощью набора «Техпластин-тест». Все вышеуказанные наборы произведены фирмой «Технология-стандарт» (Россия).

Агрегацию тромбоцитов в стандартизованной богатой тромбоцитами плазме (БТП) определяли нефелометрическим методом G. Bom [Born G.V.R., 1962; Баркаган З.С., Момот А.П., 1998]. Оценку антиагрегантной активности эндотелия сосудов осуществляли методом в модификации В.А. Люсова и М.П. Савенкова [Люсов В.А., Савенков М.П., 1988]. Коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД) оценивали как отношение площади над кривой снижения артериального давления при внутривенном введении натрия нитропруссида (30 мкг/кг), вызывающего эндотелийнезависимую вазодилятацию, к величине этого показателя при введении ацетилхолина (5 мкг/кг), вызывающего эндотелийзависимую вазодилятацию [Галаган М.Е. и др., 1991; Тюренков И.Н., Воронков A.B., 2008]. Фотометрическое определение в крови ближайшего стабильного метаболита оксида азота (NO) - нитрита (N02) проводили по реакции Грисса [Карток В. Б. и др., 2000]. Модель внутрисосудистого тромбоза воспроизводили путем аппликации 10% раствора FeCl2 на левую общую сонную артерию наркотизированных животных (уретан 1 г/кг внугрибрюшинно) [Максименко A.B., Тищенко Е.Г., 1999]. Измерение кровотока с помощью электромагнитного расходомера MKMF-1 проводили непрерывно до, во время 15-минутной аппликации раствора 10% РеСЬ и в течение 75 мин после отмывки сосуда. Отмечали время полной остановки кровотока в стенозированном сосуде и уровень снижения кровотока в течение эксперимента.

Содержание эстрадиола в исследуемых пробах сыворотки крови определяли иммуноферментным методом с помощью набора EIAlgen Estradiol (Adaltis Italia S.p.A., Италия) на приборе «Пикон».

Тени эритроцитов для изучения липидного состава мембран получали по методу J.T. Dodge et. al. (1963). Липидный экстракт мембран эритроцитов получали методом J. Folch (1957). Уровень общих липидов в мембранах эритроцитов оценивали по цветной реакции с фосфорно-ванилиновым реактивом [Колб В.Г, Камышников B.C., 1982]. Общее содержание фосфолипидов определяли по реакции с ферротиоцианатом аммония [Пентюк A.A. и др., 1987]. Содержание отдельных фракций фосфолипидов оценивали после разделения их методом одномерной восходящей хроматографии на пластинках «Silufol UV 254» [Финдлей Дж., Эванс У., 1990]1.

Процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) в мембранах эритроцитов оценивали по содержанию в них диеновых коньюгатов (ДК), триеновых коньюгатов (ТК), оснований Шиффа (ОШ) и ТБК-активных продуктов. Содержания ДК в мембранах эритроцитов определяли при длине волны 232 нм на спектрофотометре «ffitachi-557». Содержание ТК определяли при длине волны 280 нм на спектрофотометре «Hitachi-557». Результаты измерений выражали в относительных единицах оптической плотности на 1 мг

1 Раздел работы по изучению липидного состава мембран эритроцитов выполнен совместно с аспирантом кафедры фармакологии СибГМУ З.Т. Шульгау на базе ЦНИЛ СибГМУ.

липидов [Косухин А .Б. Ахметова Б.С., 1987]. Содержание липидов оценивали гравиметрическим методом. Основания Шиффа определяли по методу А. Tappel (1978). Антиокислительную активность мембран оценивали по кинетике накопления ТБК-активных продуктов в суспензии теней эритроцитов при индукции ПОЛ раствором Fe2S04-7H20 в концентрации 10 М. Количество белка в суспензии теней эритроцитов определяли микробиуретовым методом [Колб В.Г., Камышников B.C., 1982].

Исследование влияния препаратов на «приливы жара» проводили в конце курсового введения исследуемых препаратов. В течение 3-х часов каждый час (с 900 до 12°°) с помощью прибора UT301A (Россия) фиксировали температуру у основания хвоста животного, поскольку в эксперименте эти изменения температуры являются эквивалентом «приливов жара» у женщин с климактерическим синдромом [Bowe J. et al., 2006].

Влияние препаратов на двигательную активность и ориентировочно-исследовательское поведение крыс изучали на экспериментальной установке «открытое поле» в соответствии с «Методическими рекомендациями по доклиническому изучению лекарственных средств с ноотропным типом действия» [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. М., 2013.].

Для изучения влияния исследуемых экстрактов на процессы остеопороза животных выводили из эксперимента передозировкой COi, выделяли бедренные кости, фиксировали в 10% нейтральном формалине. После фиксации кости подвергли декальцинации муравьиной кислотой, затем обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин. Из проксимального метафиза изготавливались срезы толщиной 7 мкм. Депарафинированые срезы окрашивали гематоксилином и эозином [Меркулов Г.А., 1969]. На микроскопе Axio lab. 1 Carl Zeiss с помощью видеокамеры AxioCam ERc 5s на гистологическом препарате каждого животного фотографировали 10 последовательных полей зрения в зоне проксимального метафиза. В программе Image G на полученных снимках измеряли площадь костных балок и вычисляли ее отношение к общей площади среза (10 снимков)2.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета статистических программ «Statistica 8.0». Данные представлены в виде М±т, где М - среднее значение, т - стандартная ошибка среднего значения. Для оценки достоверности межгрупповых различий использовали непараметрический критерий Mann-Whitney U test и метод х~ квадрата. Статистически значимыми различия считались при р<0,05.

2 Раздел работы по исследованию остеопороза выполнен совместно со старшим научным сотрудником отдела лекарственной токсикологии ФГБУ «НИИ фармакологии имени Е.Д. Гольдберга »СО РАМН, к.м.н. Т.И. Фоминой.

Третья глава (Результаты собственных исследований)

Антпклпмактерические эффекты экстрактов, содержащих изофлавоноиды и лигнаны

На первом этапе исследования было изучено влияние овариоэктомии и экстрактов маакии амурской, люцерны посевной и клевера красного, семян льна на гормональный статус крыс.

Забор крови у ложнооперированных самок осуществляли в фазу эструса. Уровень эстрадиола в крови этих животных составил 43,8±1,3 пг/мл. Овариоэктомия приводила к исчезновению половых циклов у самок крыс, в мазках влагалищной жидкости наблюдали сплошь лейкоциты и эпителиальные клетки. К окончанию эксперимента у животных этой группы отмечено значимое снижение эстрогенов до 17,6±1,5 пг/мл, то есть на 60% по сравнению со значениями у ложнооперированных животных (Таблица 1). В группе овариоэктомированных животных, получавших в течение 14 суток этинилэстрадиол, уровень эстрадиола в крови был значимо выше, чем в группе контроля (в 2,5 раза) и достигал значений этого гормона у ложнооперированных крыс (Таблица 1). В группе овариоэктомированных крыс, получавших в течение 14 суток препарат сравнения группы фитоэстрогенов — экстракт цимицифуги, содержание эстрадиола в крови было ниже уровня этого гормона у ложнооперированных животных на 53% (Таблица 1). Курсовое введение экстракта маакии амурской крысам после овариоэктомии не восстановило уровень эстрадиола в крови, значение которого составило 20,1±1,7 пг/мл, что было ниже на 54% по сравнению со значением у ложнооперированных животных и соответствовало этому показателю у овариоэктомированных крыс (Таблица 1).

Таблица 1 - Влияние этинилэстрадиола (ЭЭ), экстракта цимицифуги (ЭЦ), экстракта маакии амурской (ЭМА), композиции экстрактов люцерны посевной и клевера красного (ЭЛиК), экстракта семян льна (ЭСЛ) на уровень эстрадиола

Группы наблюдения (количество животных) Уровень эстрадиола, пг/мл

Ложнооперированные (п=10) 43,8±1,3

Контроль (овариоэктомия) (п=11) 17,6±1,5*

Овариоэктомия + ЭЭ (п=9) 43,5±0,4+

Овариоэктомия+ЭЦ (п=8) 20,5±0,4*

Овариоэктомия + ЭМА (п=8) 20,1±1,7*

Овариоэктомия + ЭЛиК (п=9) 19,8±3,1*

Овариоэктомия + ЭСЛ (п=8) 18,1±1,5*

Примечание - * - р<0,05 по сравнению со значениями у ложнооперированных животных; - р<0,05 по сравнению со значениями у животных контрольной группы.

В группе овариоэктомированных крыс, получавших в течение 14 дней композицию экстрактов люцерны посевной и клевера красного, уровень эстрадиола в крови был ниже (на 53%) по сравнению с показателем у ложнооперированных самок, что существенно не отличалось от содержания гормона в крови овариоэктомированных крыс (Таблица 1). В группе овариоэктомированных крыс, получавших в течение 14 суток экстракт семян льна, содержание эстрадиола в крови было ниже уровня этого гормона у ложнооперированных животных на 60%, что также не отличалось от значений у овариоэктомированных крыс (Таблица 1).

Следовательно, овариоэктомия приводила к исчезновению половых циклов у самок крыс и вызывала значительное снижение содержания эстрадиола в крови. Введение животным этинилэстрадиола в этих условиях повышало уровень эстрадиола, а применение фитоэстрогенов существенно не изменяло уровень гормона в крови.

Антиклимактерические эффекты исследуемых экстрактов изучали в условиях гипоэстрогенемии, вызванной овариоэктомией у крыс. Психоэмоциональные расстройства, как и вазомоторные нарушения, относятся к ранним симптомам климактерического синдрома, включают в себя изменение настроения (появление раздражительности, чувства тревоги, плаксивости), а также быструю утомляемость, нарушение сна, снижение когнитивных функций [Kravitz Н.М. et al., 2003; Meyer P.M. et al., 2003, Поворознюк B.B., Григорьева H.B., 2004]. Исследование психоэмоциональных нарушений, возникающих при экспериментальной овариоэктомии, позволило установить, что снижение уровня половых гормонов в крови приводило к формированию пассивного типа поведения крыс в тесте «открытое поле» с уменьшением ориентировочно-исследовательской активности и повышением тревожности. Тревожность у овариоэктомированных крыс регистрировали по поведенческим и соматическим реакциям. Изменение поведения животных выражалось уменьшением числа горизонтальных перемещений и вертикальных стоек в 2 раза и на 40% соответственно по сравнению с соответствующими значениями у ложнооперированных животных (Рисунок 1А). У овариоэктомированных животных изменялся и соматический компонент психоэмоциональных реакций - увеличилось в 3 раза число болюсов по сравнению с соответствующими показателями у ложнооперированных животных (Рисунок 1Б). Изменение эмоциональных и поведенческих реакций у животных после овариоэктомии, вероятно, связано с дезорганизацией работы лимбико-ретикулярного комплекса в результате нарушения синтеза нейромедиаторов: снижения дофаминергического тонуса, ухудшения функционирования

серотонинергической системы и активации адренергического комплекса [Сметник В.П., 2007; Тихомиров В.Н., 2007].

Референтные препараты (этинилэстрадиол и экстракт цимицифуги) не оказывали существенного влияния на ориентировочно-исследовательскую активность крыс: при их применении сохранялось выраженное снижение общего числа локомоторных актов, как горизонтальных перемещений, так и вертикальных стоек по сравнению с показателями у ложнооперированных

животных (Рисунок 1А). Вместе с тем, этинилэстрадиол достоверно уменьшал соматический компонент психоэмоциональных реакций в условиях стресса новизны, о чем свидетельствовало снижение количества болюсов в 4 раза по сравнению с контролем (Рисунок 1Б). Экстракт цимицифуги в этих условиях не снижал количество болюсов (Рисунок 1Б).

Исследуемые экстракты, содержащие как изофлавоноиды (экстракт маакии амурской, композиция экстрактов люцерны посевной и клевера красного), так и лигнаны (экстракт семян льна), в условиях овариоэктомии оказывали влияние на психоэмоциональные реакции подобно препарату сравнения этинилэстрадиолу и проявляли противотревожное действие, сходное с эффектами других фитоэстрогенов [Waif А.А. et al., 2005]. Так, экстракт маакии амурской, достоверно уменьшал соматический компонент психоэмоциональных реакций в условиях стресса новизны, о чем свидетельствовало уменьшение в 2 раза количества болюсов по сравнению с соответствующими показателями у овариоэктомированных животных и не вызывал существенного изменения двигательной активности крыс (Рисунок 1 А, 1Б). Композиция экстрактов люцерны посевной и клевера красного при курсовом введении в условиях овариоэктомии не оказывала существенного влияния на ориентировочно-исследовательскую активность крыс в тесте «открытое поле»: сохранялось снижение двигательной активности животных, прежде всего - вертикальных стоек на 45%, существенно не изменялось число горизонтальных перемещений и количество обследованных отверстий (норковый рефлекс) по сравнению с показателями у ложнооперированных крыс (Рисунок 1А). Вместе с тем, композиция экстрактов люцерны посевной и клевера красного уменьшала в 2 раза количество болюсов, по сравнению с соответствующими показателями у овариоэктомированных животных (Рисунок 1Б).

В условиях повышенного уровня тревожности и пассивного типа поведения, формирующегося у крыс после овариоэктомии, курсовое введение экстракта семян льна не оказывало существенного влияния на двигательную активность животных. В частности, сохранялось выраженное снижение общего числа локомоторных актов, в том числе - горизонтальных перемещений, вертикальных стоек, по сравнению с показателями у ложнооперированных крыс (Рисунок 1А). Оценка психоэмоциональных реакций овариоэктомированных крыс при курсовом введении экстракта семян льна позволила установить достоверное уменьшение в 2 раза количество болюсов, по сравнению со значениями у группы контроля (Рисунок 1Б), что характеризует уменьшение соматического компонента психоэмоциональных реакций животных. В опытах с применением селективных модуляторов эстрогеновых рецепторов, в частности, фитоэстрогена куместрола, доказано, что противотревожное действие опосредуется преимущественно р-эстрогеновыми рецепторами [Waif А.А. et al., 2005]. Следовательно, есть основания предполагать, что исследованные экстракты в условиях гипоэстрогенемии уменьшают экспериментальные тревогу и страх, активируя Р-эстрогеновые рецепторы гиппокампа.

□ ЛО а Контроль ИЭЭ ®ЭЦ ВЭМА ШЭЛиК 0ЭСЛ

Вертикальная Горшонтштьная Норковый рефлекс

активность активность

А

□ ЛО И Контроль ИЭЭ ШЭЦ ВЭМА ИЭЛиК ИЭСЛ

Время выхода нз первого Болюсы

квадрата

Б

Рисунок 1 - Влияние этинилэстрадиола (ЭЭ), экстракта цимицифуги (ЭЦ), экстракта маакии амурской (ЭМА), композиции экстрактов люцерны посевной и клевера красного (ЭЛиК), экстракта семян льна (ЭСЛ) на двигательную активность (А) и психоэмоциональные реакции (Б) у крыс после овариоэктомии. По оси абсцисс - показатели двигательных и психоэмоциональных реакций, по оси ординат - величина показателей, %; ЛО - ложнооперированные животные. Примечание - * - р<0,05 по сравнению со значениями у ложнооперированных животных; + - р<0,05 по сравнению со значениями у крыс после овариоэктомии.

Для оценки влияния исследуемых фитоэстрогенных средств на вазомоторные реакции при овариоэктомии измеряли температуру на коже основания хвоста. Изменения температуры, измеренной на коже основания хвоста крыс после овариоэктомии, в эксперименте являются эквивалентом

«приливов жара» у женщин с климактерическим синдромом [Bowe J. et al., 2006]. В наших исследованиях температура кожи основания хвоста у ложнооперированных крыс в период наблюдения с 900 до 1200 ч достоверно не изменялась (Рисунок 2).

У овариоэктомированных животных, в отличие от ложнооперированных, наблюдались существенные колебания температуры по отношению к исходному значению (Рисунок 2А, В и Г) или ее повышение в среднем на 2 °С (Рисунок 2Б). Данные температурные скачки или ее повышение оценивали как экспериментальные эквиваленты «приливов жара».

В этих условиях у крыс, получавших этинилэстрадиол, температура была постоянной на всем протяжении эксперимента - в период наблюдения с 900 до 1200 ч (Рисунок 2А).

Способность эстрогенов уменьшать «приливы» хорошо известна и описана в литературе [Сметник В.П., 2008; Thieleman A. et al., 2010]. Курсовое введение как препарата сравнения экстракта цимицифуги, так и исследуемых фитоэстрогенов (экстракта маакии амурской, композиции экстрактов люцерны посевной и клевера красного, экстракта семян льна) также препятствовало колебаниям или повышению температуры у основания хвоста овариэктомированных животных в течение всего времени исследования (Рисунок 2). Механизм нормализации вазомоторных реакций под действием экстракта цимицифуги связан со способностью препарата непосредственно, не связываясь с а и p-эстрогеновыми рецепторами [Балан В.Е., 2007], изменять нейромедиаторный обмен и снижать активность центра терморегуляции [Davis S.R., 2001]. Механизм же влияния фитоэстрогенов на центр терморегуляции связан с тем, что их метаболиты взаимодействуют с эстрогеновыми рецепторами подобно эстрогенам, отличаясь от последних большим сродством к р-эстрогеновым рецепторам [Djiogue S. et al., 2010], высокая плотность которых обнаружена в мозге, в том числе и в гипоталамусе [Dahlma-Wright К. et al., 2006]. Кроме того, фитоэстрогены способны уменьшать вазомоторные симптомы за счет снижения уровня лютеинизирующего и тиреотропного гормонов, роль которых в патогенезе «приливов» считается доказанной [Baber R.J. et al., 1999].

Одним из поздних метаболических нарушений, возникающих при климактерическом синдроме, является постменопаузальный остеопороз, характеризующийся прогрессирующей потерей массы костной ткани, что приводит к повышению риска переломов костей [Seeman Е., Delmas P.D., 2006; Сметник В.П., 2010]. В наших экспериментах в отсроченный период - через 68 дней после овариоэктомии, у крыс наблюдалось достоверное снижение относительной плотности костных балок метафиза бедренных костей в 1,5 раза, по сравнению с показателем у ложнооперированных животных, что является морфологическим маркером остеопороза (Таблица 2). Курсовое введение экстракта маакии амурской в течение 60 дней (начиная с 8-го дня после операции по удалению яичников) приводило к увеличению относительной плотности костных балок метафиза в 1,2 раза по сравнению со значениями у

Рисунок 2 - Влияние этинилэстрадиола (ЭЭ) (А), экстракта цимицифуги (ЭЦ) (А), экстракта маакии амурской (ЭМА) (Б), композиции экстрактов люцерны посевной и клевера красного (ЭЛиК) (В), экстракта семян льна (ЭСЛ) (Г) на температуру кожи у основания хвоста крыс после овариоэктомии. По оси абсцисс - суточное время, ч; по оси ординат - значения температуры кожи у основания хвоста крыс, °С; ЛО - ложнооперированные животные, К -контроль (овариоэктомия).

Примечание - * - р<0,05 по сравнению со значениями у ложнооперированных животных; + - р<0,05 по сравнению со значениями у крыс после овариоэктомии.

овариоэктомированных крыс без лечения (контроль) (Таблица 2). Остеопротективный эффект при гипоэстрогенемии хорошо доказан для таких изофлавоноидов как генистеин, дайдзеин [Mathey J. et al., 2006; Wang J. et al., 2008]. Вышеперечисленные изофлавоноиды входят в состав экстракта маакии амурской, обеспечивая, вероятно, его терапевтический эффект за счет стимуляции остеобластов и подавления активности остеокластов [Morabito N. et al., 2002, Ma D.F. et al., 2008]. Активация остеобластов осуществляется за счет прямого действия изофлавоноидов на ERg костной ткани [Okamoto F. et. al.,

2001; Е1-81шапу МА. е1 а1., 2010]. Применение экстракта семян льна в течение 60 дней, начиная с 8-го дня после овариоэктомии, не вызывало достоверных изменений относительной плотности костных балок метафиза бедренных костей крыс (Таблица 2).

Таблица 2 - Влияние экстракта маакии амурской (ЭМА) и экстракта семян льна (ЭСЛ) на относительную площадь костных балок метафиза бедренной кости у крыс после овариоэктомии (М±т)_

Группы наблюдения (количество животных) Относительная плотность костных балок (%)

Ложнооперированные (п=7) 54±1

Контроль (овариоэктомия) (п=8) 36±2*

Овариоэктомия + ЭМА (п=7) 43±1*+

Овариоэктомия + ЭСЛ (п=7) 36±1*

Примечание - * - р<0,05 по сравнению со значениями у ложнооперированных животных; - р<0,05 по сравнению со значениями у животных контрольной группы.

Следовательно, в условиях модели овариоэктомии экстракт маакии амурской, содержащий изофлавониоиды, предупреждает эстрогензависимые процессы резорбции костной ткани, тогда как экстракт семян льна, содержащий лигнаны, в этих условиях не оказывает остеопротективного действия.

Таким образом, экстракты маакии амурской, люцерны посевной и клевера красного, содержащие изофлавоноиды, а также экстракт семян льна, содержащий лигнаны, подобно препаратам сравнения этинилэстрадиолу и экстракту цимицифуги, обладают антиклимактерическими эффектами в условиях экспериментальной овариоэктомии, что проявилось уменьшением экспериментальных эквивалентов ранних постменопаузальных нарушений -вазомоторных и психоэмоциональных расстройств. Экстракт маакии амурской при гипоэстрогенемии, вызванной удалением яичников, уменьшал такое позднее метаболическое нарушение климактерического периода, как снижение плотности костной ткани.

Влияние фитоэстрогепных средств классов изофлавопов и лнгнанов на факторы, повышающие рпск сердечно-сосудистых нарушений прп экспериментальной овариоэктомии

Важной проблемой, возникающей у женщин в постклимактерическом периоде, является существенный рост сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) [Мартынов А.И. и др., 2005; Макацария А.Д. и др., 2007]. Недостаток эстрогенов у женщин в климактерическом периоде или после овариоэктомии в более молодом возрасте может сопровождаться появлением множественных факторов риска развития ССЗ [Подзолков В.И. и др., 2004; Wijeratne S.S., Cuppett S.L., 2007; Rimbach G. et al., 2008]. Вместе с тем, имеются убедительные доказательства того, что ГЗТ при климактерическом синдроме предотвращает

прогрессирование остеопороза, уменьшает неблагоприятные метаболические сдвиги, нейровегетативные расстройства, но неэффективна в отношении первичной и вторичной профилактики ССЗ [Canonico М., 2011]. В связи с этим представлялось весьма перспективным оценить влияние исследуемых фитоэстрогенных средств, являющихся селективными модуляторами эстрогеновых рецепторов [Cherdshewasart W. et al., 2007], на факторы, повышающие риск ССЗ при гипоэстрогенемии, такие как гемореологические и гемостазиологические нарушения, а также эндотелиальная дисфункция.

Для первичной оценки гемореологической активности суммарного экстракта маакии амурской, его отдельных фракций, содержащих изофлавоноиды или димерные стильбены, а также композиции экстрактов люцерны посевной и клевера красного, экстракта семян льна была использована модель гипервязкости крови in vitro. Инкубирование проб крови контрольных животных в течение 60 минут при температуре 20±0,4 "С приводило к достоверному повышению вязкости крови в диапазоне скоростей сдвига от 3 с"1 до 300 с на .9-18%. У крыс, получавших в течение 5 дней суммарный экстракт маакии амурской в дозе 200 мг/кг, вязкость крови до инкубации была ниже, чем в контроле, в диапазоне скоростей сдвига от 3 с' до 7 с'1 на 7-9% соответственно. Инкубирование крови крыс этой группы также приводило к повышению вязкости крови во всем исследуемом диапазоне скоростей сдвига на 4-11%, но при этом значения вязкости крови были ниже по сравнению с контролем в диапазоне скоростей сдвига от 3 до 100 с" на 6-15%. Таким образом, вязкость крови крыс, получавших суммарный экстракт маакии амурской, после инкубации увеличилась практически во всем исследуемом диапазоне скоростей сдвига, но достоверно менее выражено, чем в образцах крови крыс контрольной группы. У крыс, получавших изофлавоноидный экстракт маакии амурской в аналогичных условиях, отмечены более низкие исходные значения вязкости крови - на 6-7% в диапазоне скоростей сдвига 3-5 с"1. Инкубирование крови крыс, получавших изофлавоноидный экстракт, приводило к повышению вязкости крови на 9-26% во всем диапазоне скоростей сдвига, однако возрастание этого показателя было меньшим по отношению к контролю на скоростях сдвига 7-300 с"1 на 6-10%. На самых низких скоростях сдвига достоверных различий вязкости крови в пробах крови до и после инкубации не наблюдалось. У крыс, получавших экстракт маакии амурской, содержащий димерные стильбены, вязкость крови до инкубации была ниже, чем в контроле в диапазоне низких скоростей сдвига на 6-12%. Инкубирование проб крови крыс этой группы приводило к повышению вязкости крови во всем исследуемом диапазоне скоростей сдвига на 6-9%, при этом значения вязкости крови были ниже по сравнению с соответствующими значениями в контроле в диапазоне скоростей сдвига от 3 до 10 с"1 на 10-14%. На высоких скоростях сдвига достоверных различий между показателями вязкости крови в контрольной и опытной группах не выявлено.

Следовательно, наиболее эффективно препятствовал повышению вязкости крови при ее инкубации суммарный экстракт маакии амурской, в состав полифенольной фракции которого входили как изофлавоноиды, так и

стильбены. В связи с этим для углубленного исследования был выбран именно этот экстракт маакии амурской.

Инкубирование проб крови крыс, получавших в течение 5 дней композицию экстрактов люцерны посевной и клевера красного в дозе 200 мг/кг, приводило к повышению вязкости крови во всем исследуемом диапазоне скоростей сдвига на 5-9%, однако при этом значения вязкости крови были ниже по сравнению с соответствующими показателями в контроле на 9-17%. Инкубирование крови крыс, получавших в течение 5 дней экстракт семян льна в дозе 40 мг/кг, приводило к повышению вязкости крови во всем исследуемом диапазоне скоростей сдвига на 6-11%, однако значения были ниже по сравнению с контролем во всем исследованном диапазоне скоростей сдвига на 6-17%.

При изучении антиагрегантной активности экстрактов маакии амурской, композиции экстрактов люцерны посевной и клевера красного, экстракта семян льна в опытах in vitro установлено, что в контрольной группе амплитуда АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов в плазме крови составила 35±2%. Суммарный экстракт маакии амурской при его ежедневном введении крысам в течение 5 дней снижал АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов на 23% по сравнению с контролем. Изофлавоноидный экстракт маакии амурской при аналогичной схеме лечения уменьшал амплитуду агрегации тромбоцитов на 28% по сравнению с контролем. При введении экстракта, содержащего димерные стильбены, амплитуда агрегации тромбоцитов была на 26% ниже, чем в контроле. Следовательно, все вышеперечисленные экстракты маакии амурской продемонстрировали практически равнозначный антиагрегантный эффект в отношении тромбоцитов. При исследовании влияния экстрактов люцерны посевной и клевера красного на агрегацию тромбоцитов было установлено, что ежедневное введение крысам в течение 5 дней указанной композиции экстрактов существенно снижало АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов на 56% по сравнению с показателем в группе контроля. Ежедневное введение экстракта семян льна интактным животным в течение 5 дней не вызывало достоверных изменений АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов по сравнению с контролем. Следовательно, экстракт семян льна не изменял нормальный уровень агрегации тромбоцитов.

Таким образом, эксперименты in vitro позволили установить, что суммарный экстракт маакии амурской, композиция экстрактов люцерны посевной и клевера красного, а также экстракт семян льна ограничивали повышение вязкости крови, вызванный ее инкубацией в широком диапазоне скоростей сдвига. Кроме того, суммарный экстракт маакии и композиция экстрактов люцерны посевной и клевера красного оказывали выраженное антитромбоцитарное действие. Полученные результаты явились основанием для дальнейшего углубленного исследования влияния суммарного экстракта маакии амурской, комплекса экстрактов люцерны посевной и клевера красного, а также экстракта семян льна на реологию крови у крыс с экспериментальной гипоэстрогенемией.

Нарушения реологических свойств крови являются важным звеном патогенеза ССЗ в условиях естественной или хирургической менопаузы [Безрукова О.Д. и др., 1986; Vaya A. et al., 2004]. При гипоэстрогенемии у женщин были выявлены практически все изменения гемореологических показателей - увеличение гематокрита и уровня фибриногена, повышение вязкости крови и вязкости плазмы, усиление процессов агрегации эритроцитов и ухудшение их деформируемости [Безрукова О.Д. и др., 1986; Мелкозерова О.А., 2002; Vaya A. et al., 2004]. Эти изменения формируют т.н. «синдром повышенной вязкости крови» (СПВК), наличие которого существенно увеличивает риск возникновения ССЗ.

Комплексный анализ изменения гемореологического статуса у женщин в постменопаузе по сравнению с пременопаузальным периодом весьма затруднен, поскольку кроме гипоэстрогенемии на реологические свойства крови могут оказывать влияние возраст (наступление естественной менопаузы колеблется в пределах 10 лет), курение, индекс массы тела, наличие или отсутствие сопутствующих заболеваний [Pignon D. et al., 1994]. В связи с этим представляло интерес оценить изменения гемореологических параметров у крыс после овариоэктомии по сравнению с соответствующими показателями у ложнооперированных животных одинакового возраста и массы тела.

Овариоэктомия, снижая уровень эстрогенов в крови, вызывала изменения гемореологических параметров у самок крыс. Вязкость цельной крови у животных контрольной группы через 21 день после овариоэктомии увеличилась на 7-18% во всем диапазоне скоростей сдвига по сравнению с показателями у ложнооперированных крыс (Рисунок ЗА). Повышение вязкости крови после овариоэктомии было обусловлено изменением как микро- так и макрореологических показателей. Так, отмечено уменьшение деформируемости эритроцитов при высоких скоростях сдвига на 10-18% (Рисунок 4А) и достоверное усиление их агрегации на 35% (Рисунок 5). Кроме того, отмечено достоверное повышение гематокрита и уровня фибриногена в плазме крови на 7% и 38% соответственно (Рисунок 5). При этом индекс эффективности транспорта кислорода тканям при скоростях сдвига (5-50 с' ) достоверно снижался на 5-7% по сравнению со значениями у ложнооперированных крыс (Рисунок 6). Таким образом, прирост гематокрита у животных после овариоэктомии не обеспечивал увеличение доставки кислорода в ткани из-за выраженного повышения вязкости крови, возникающего как вследствие гемоконцентрации, так и нарушения реологических свойств эритроцитов.

Следовательно, овариоэктомия у крыс вызывала гипоэстрогенное состояние, сопровождающееся нарушением гемореологического статуса с формированием СПВК и снижением эффективности доставки кислорода тканям.

в г

Рисунок 3 - Влияние этинилэстрадиола (ЭЭ) (А), экстракта маакии амурской (ЭМА) (Б), композиции экстрактов люцерны посевной и клевера красного (ЭЛиК) (В), экстракта семян льна (ЭСЛ) (Г) на вязкость крови (мПа-с) при различных скоростях сдвига у крыс после овариоэктомии.

По оси абсцисс - значения скорости сдвига, с"1, по оси ординат - значения вязкости крови, мПа-с; ЛО - ложнооперированные животные, К - контроль (овариоэктомия).

Примечание - * - р<0,05 по сравнению со значениями у ложнооперированных животных; + - р<0,05 по сравнению со значениями у крыс после овариоэктомии.

Однотипность полученных изменений параметров, определяющих вязкость крови при экспериментальной овариоэктомии и у женщин при хирургической или естественной менопаузе, позволила использовать предложенную модель для исследования влияния фитоэстрогенов классов изофлавоноидов и лигнанов на гемореологические параметры при гипоэстрогенемии. Изучение этого аспекта действия препаратов с фитоэстрогенной активностью представляется весьма важным, поскольку поиск эффективных гемореологических средств является

В Г

Рисунок 4 - Влияние этинилэстрадиола (ЭЭ) (А), экстракта маакии амурской (ЭМА) (Б), композиции экстрактов люцерны посевной и клевера красного (ЭЛиК) (В), экстракта семян льна (ЭСЛ) (Г) на индекс деформируемости эритроцитов (усл.ед.) при различных скоростях сдвига у крыс после овариоэктомии.

По оси абсцисс - значения скорости сдвига, с"1, по оси ординат - значения ИДЭ, усл. ед.; ЛО - ложнооперированные животные, К - контроль (овариоэктомия).

Примечание - * - р<0,05 по сравнению со значениями у ложнооперированных животных; + - р<0,05 по сравнению со значениями у крыс после овариоэктомии.

неиспользованным резервом для профилактики и лечения сердечно-сосудистых осложнений климактерического синдрома.

У овариоэктомированных животных, получавших препарат сравнения этинилэстрадиол, вязкость крови снижалась при всех скоростях сдвига на 4-

□ ЛО И Контроль 0ЭЭ ВЭМА И ЭЛнК ШЭСЛ

160 120 80 40 0

ВП

Ж

РЬ

Т 1/2

Рисунок 5 - Влияние этинилэстрадиола (ЭЭ), экстракта маакии амурской (ЭМА), композиции экстрактов люцерны посевной и клевера красного (ЭЛиК), экстракта семян льна (ЭСЛ) на гемореологические показатели у крыс: вязкость плазмы (ВП), гематокрит (Ш), уровень фибриногена в плазме крови (РЬ) и полупериод агрегации эритроцитов (Ть-^) у крыс после овариоэктомии. По оси абсцисс - гемореологические показатели, по оси ординат - значения показателей, %; ЛО - ложнооперированные животные.

Примечание - * - р<0,05 по сравнению со значениями у ложнооперированных животных; + - р<0,05 по сравнению со значениями у крыс после овариоэктомии.

11% по сравнению со значениями у животных контрольной группы (Рисунок ЗА), а индекс деформируемости эритроцитов (ИДЭ) при всех исследованных скоростях сдвига был достоверно выше, чем в контроле на 14-19% (Рисунок 4А). Полученные данные свидетельствуют о практически полной нормализации эластичности мембран эритроцитов овариоэктомированных крыс под действием этинилэстрадиола. Повышение ИДЭ, вероятно, приводило к отмеченному выше ограничению роста вязкости крови на высоких скоростях сдвига, поскольку в этом диапазоне скоростей сдвига вязкость крови преимущественно зависит от деформируемости эритроцитов [Габриелян Э.С., Акопов С.Э., 1985].

Второй показатель, который характеризует состояние клеточной реологии - полупериод агрегации эритроцитов, при введении этинилэстрадиола овариоэктомированным крысам достоверно увеличивался на 35% соответственно, что свидетельствует о нормализации агрегационной активности эритроцитов (Таблица 5). Этот эффект, вероятно, обеспечивал отмеченное ограничение роста вязкости крови исследуемыми препаратами на низких скоростях сдвига (Рисунок 3), поскольку агрегация эритроцитов играет определяющую роль в величине вязкости крови в сосудах крупного и среднего диаметра — на участках кровеносного русла с низкими скоростями сдвига [ЛевтовВ.А. и др., 1982].

□ ЛО а Контроль НЭЭ Р ЭМА 0ЭСЛ

%

105 100

95 90

85

5 50 100

Рисунок 6 - Влияние этинилэстрадиола (ЭЭ), экстракта маакии амурской (ЭМА), экстракта семян льна (ЭСЛ) на индекс эффективности доставки кислорода тканям при различных скоростях сдвига у крыс после овариоэктомии.

По оси абсцисс - значения скорости сдвига, с" , по оси ординат - значения индекса эффективности доставки кислорода тканям относительно группы ложнооперированных животных, %; ЛО - ложнооперированные животные. Примечание - * - р<0,05 по сравнению со значениями у ложнооперированных животных; * - р<0,05 по сравнению со значениями у крыс после овариоэктомии.

Индекс эффективности доставки кислорода в ткани под действием этинилэстрадиола не изменялся и существенно не отличался от показателей в контроле, оставаясь достоверно ниже на 4-6% при всех исследованных скоростях сдвига в сравнении с показателями у ложнооперированных животных (Рисунок 6). Оценка влияния препаратов на макрореологические показатели, определяющие вязкость крови, позволила установить, что в условиях овариоэктомии этинилэстрадиол снижал гематокрит на 9% и уменьшал уровень фибриногена в плазме на 38% по сравнению с показателями у крыс контрольной группы (Рисунок 5). Снижение фибриногена при введении этинилэстрадиола статистически значимо не повлияло на вязкость плазмы, однако могло быть одной из причин отмеченного снижения агрегационной активности эритроцитов (Рисунок 5).

Курсовое введение экстракта маакии амурской при экспериментальной овариоэктомии у крыс вызывало изменение реологических свойств крови, снижая вязкость цельной крови при всех скоростях сдвига на 4—13% по сравнению с показателями в группе контроля (Рисунок ЗБ). Причем из всех параметров, определяющих вязкость крови, под действием курсового введения экстракта маакии амурской наиболее существенно изменялись показатели клеточной реологии. Так, ИДЭ при высоких скоростях сдвига (360 с"1 и 890 с"1) был выше контрольных значений соответственно на 19% и 12%, но существен-

но не отличался от значений в контрольной группе при скоростях сдвига 90 с"1 и 180 с"1 (Рисунок 4Б).

Повышение ИДЭ, вероятно, приводило к отмеченному выше снижению вязкости крови у овариоэктомированных крыс при высоких скоростях сдвига. Введение экстракта маакии амурской овариоэктомированным крысам оказывало влияние и на агрегационную активность эритроцитов: полупериод их агрегации увеличивался на 36%, что характеризует снижение повышенной при овариоэктомии агрегационной активности эритроцитов (Рисунок 5). Макрореологические параметры, определяющие вязкость крови, под действием экстракта маакии амурской изменялись в меньшей степени, в частности, отмечено лишь достоверное снижение уровня фибриногена в плазме крови на 35% по сравнению с контролем, при этом вязкость плазмы и гематокрит существенно не изменялись (Рисунок 5). Эффективность доставки кислорода в ткани под действием экстракта маакии амурской достоверно увеличивалась на 3-9% при всех исследованных скоростях сдвига в сравнении со значениями в группе контроля (Рисунок 6). Можно утверждать, что данный эффект обеспечен способностью препарата уменьшать вязкость крови, поскольку достоверных изменений гематокрита при применении экстракта маакии амурской не отмечено (Рисунок 5).

Курсовое введение композиции экстрактов люцерны посевной и клевера красного не оказывало существенного влияния на вязкость цельной крови у овариоэктомированных крыс - отмечена лишь тенденция к ее снижению при всех исследованных скоростях сдвига (Рисунок ЗВ). Вместе с тем, у крыс с овариоэктомией при курсовом введении композиции экстрактов люцерны посевной и клевера красного индекс деформируемости эритроцитов при скоростях сдвига 180 с"1, 360 с"1 и 890 с*1 был соответственно выше на 20%, 17% и 16% по сравнению со значениями у животных контрольной группы (Рисунок 4В). Композиция экстрактов люцерны посевной и клевера красного ограничивала также развитие гиперагрегации эритроцитов, отмеченное у овариоэктомированных крыс, о чем свидетельствует повышение полупериода агрегации эритроцитов на 20%. Время полуагрегации эритроцитов у крыс, получавших исследуемую композицию экстрактов, существенно не отличалось от значения у ложнооперированных животных (Рисунок 5). Композиция экстрактов люцерны посевной и клевера красного не оказывала существенного влияния на макрореологические параметры. Однако наблюдалось достоверное снижение уровня фибриногена в крови на 35% по сравнению с контролем (Рисунок 5). Вероятно, снижение этого показателя и обеспечило антиагрегантный эффект композиции экстрактов люцерны посевной и клевера красного в отношении эритроцитов.

Вязкость крови у овариоэктомированных животных под действием экстракта семян льна снижалась на всех скоростях сдвига на 4-10% по сравнению с соответствующими значениями у контрольных животных (Рисунок ЗГ). Анализ механизмов снижения вязкости крови под действием экстракта семян льна позволил установить, что основной вклад в уменьшение СПВК, вызванного овариоэктомией, вносят улучшение реологических

характеристик эритроцитов. Так, было показано, что в группе овариоэктомированных крыс, получавших экстракт семян льна, ИДЭ при всех исследованных скоростях сдвига был достоверно выше, чем в контроле, на 1929% (Рисунок 4Г), а полупериод агрегации эритроцитов на 30% больше, по сравнению со значением в группе животных, не получавших лечения (Рисунок 5). Введение экстракта семян льна овариоэктомированным крысам существенно не изменяло такие макрореологические показатели как вязкость плазмы, гематокрит и уровень фибриногена (Рисунок 5). В результате индекс эффективности доставки кислорода в ткани под действием экстракта семян льна при всех исследованных скоростях сдвига увеличивался на 3-9% по сравнению со значениями у овариоэктомированных животных (Рисунок 6).

Следовательно, препарат сравнения - этинилэстрадиол уменьшал повышенную вязкость крови у крыс после овариоэктомии как за счет влияния на клеточные показатели крови, так и за счет воздействия на макрореологические параметры, в частности, в результате снижения гематокрита. Исследуемые экстракты с фитоэстрогенной активностью также уменьшали выраженность СПВК, вызванного овариоэктомией, но преимущественно в результате воздействия на реологические свойства эритроцитов и не изменяли уровень эстрадиола в крови, в отличие от гормональной терапии. При этом экстракты маакии амурской и семян льна, в отличие от этинилэстрадиола, обеспечивали восстановление уровня эффективности доставки кислорода тканям, что является важным терапевтическим эффектом экстрактов с фитоэстрогенной активностью, обеспечивающим возможность ослаблять системную или региональную гипоксию в условиях гипоэстрогенемии.

Гипоэстрогенемия является одной из причин окислительного стресса, возникающего у женщин на фоне естественной или хирургической менопаузы [Evsen M.S. et al„ 2013] и может быть причиной нарушения реологии крови и, прежде всего, ее клеточного звена - эритроцитов [Arslan A. et al., 2011]. В связи с этим, в целях изучения механизмов терапевтического действия фитоэстрогенных средств на реологические свойства крови исследовали их влияние на процессы ПОЛ и липидный состав мембран эритроцитов крыс в условиях экспериментальной овариоэктомии. В мембранах эритроцитов контрольной группы животных уровень ДК превышал на 62%, а содержание ТБК-активных продуктов - в 2 раза соответствующие значения у ложнооперированных крыс. При индукции ПОЛ сульфатом железа содержание ТБК-активных продуктов у овариоэктомированных крыс повышалось на 33% по сравнению со значениями у ложнооперированных животных, что свидетельствует об активации окислительных процессов в мембранах эритроцитов (Таблица 3).

Этинилэстрадиол при его курсовом введении крысам после овариоэктомии вызывал некоторое ограничение процессов ПОЛ в мембранах эритроцитов, что проявилось достоверным уменьшением на 18% уровня ДК по сравнению со значением у контрольных животных (табл. 3). Основным механизмом антиоксидантного действия эстрадиола является его воздействие

на эстрогеновые рецепторы и, как следствие, экспрессию генов ферментов антиоксидантной защиты: супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы, каталазы [Robb E.L., Stuart J.A., 2011; Sivritas D. et al., 2011].

Таблица 3 - Влияние этинилэстрадиола (ЭЭ), экстракта маакии амурской (ЭМА), экстракта семян льна (ЭСЛ) на содержание в мембранах эритроцитов продуктов перекисного окисления липидов у крыс после овариоэктомии (М±т)

Группы наблюдения (количество животных) Диеновые конъюгаты, ОП232/МГ липидов ТБК-активные продукты, нмоль/мг липидов

ДО индукции Fe2+ после индукции Fe2+

Ложнооперированные (п=8) 0,118±0,021 8,1±1,7 23,9±2,9

Контроль (овариоэктомия) (п=11) 0,191±0,016* 16,7±3,2* 35,8±3,7*

Овариоэктомия+ЭЭ (п=8) 0,157±0,014+ 11,4±3,3 28,1 ±4,4

Овариоэктомия + ЭМА (п=9) 0,134±0,0Г 11,7±1,9 24,5±2,9+

Овариоэктомия + ЭСЛ (п=8) 0,139±0,001+ 7,9±1,0+ 21,1±2,2+

Примечание - * - р<0,05 по сравнению со значениями у ложнооперированных животных; + - р<0,05 по сравнению со значениями у крыс после овариоэктомии.

У овариоэктомировашшгх крыс, получавших экстракт маакии амурской, активность процессов ПОЛ в мембранах эритроцитов была значительно ниже, чем у контрольных животных. Наблюдалось достоверное уменьшение содержания ДК на 30% и ТБК-активных продуктов после индукции ПОЛ - на 32% по сравнению с контролем. В результате курсового применения экстракта маакии амурской показатели ПОЛ в мембранах эритроцитов крыс оказались близки значениям в группе ложнооперированных животных (Таблица 3).

При курсовом введении композиции экстрактов люцерны посевной и клевера красного овариоэктомированным крысам было отмечено достоверное уменьшение содержания в плазме крови ДК на 25%, ТК на 31% и оснований Шиффа - на 34% по отношению к соответствующим значениям в контрольной группе. Антиоксидантное действие изофлавоноидов является комплексным и заключается в их воздействии на эстрогенные рецепторы и способности имитировать механизм антиоксидантного действия эстрадиола преимущественно через ß-рецепторы эстрадиола [Robb E.L., Stuart J.A., 2011]. Основным же механизмом антиоксидантной активности изофлавоноидов является их способность, благодаря своей фенольной структуре, быть ловушкой свободных радикалов [Bacciottini L. et al., 2007].

Экстракт семян льна, так же, как и изофлавоноидные экстракты, при его курсовом применении ограничивал рост продуктов ПОЛ в мембранах эритроцитов овариоэктомированных крыс. Это проявилось достоверным уменьшением на 27% содержания ДК и снижением уровня ТБК-активных продуктов до и после индукции Ре"+ на 52% и 41% соответственно, по сравнению со значениями у контрольных животных (Таблица 3). Основной механизм антиоксидантного действия растительных лигнанов связывают с взаимодействием секоизоларицирезинола диглюкозида (8БО) со свободными радикалами [Стасевич О.В. и др., 2009] и повышением активности антиоксидантных ферментов: каталазы и супероксиддисмутазы [Ни Б. е1 а1., 2012].

Избыточное образование продуктов ПОЛ при любых патологических процессах и при пшоэстроегнемии, в частности, оказывает на эритроциты цитотоксическое действие за счет изменения структуры липидного бислоя их мембраны [Новицкий В.В. и др., 2002]. В свою очередь, липидный бислой способен выполнять свои функции лишь при наличии «поддерживающего» белкового матрикса. Сбалансированность липидных и белковых компонентов мембран эритроцитов в значительной степени обеспечивает им оптимальную для деформации форму двояковогнутого диска [Новицкий В.В. и др., 2004]. В связи с этим, для понимания механизмов полученных нами гемореологических эффектов исследуемых экстрактов с эстрогеноподобной активностью было изучение влияние наиболее перспективного на наш взгляд фитоэстрогена -экстракта маакии амурской на соотношение липиды/белки и липидный состав мембран эритроцитов при овариоэктомии.

Активация процессов ПОЛ в мембранах эритроцитов, индуцированная овариоэктомией, существенным образом не повлияла на содержание белка в мембранах эритроцитов, снижая при этом содержание общих липидов и, как следствие, коэффициента отношения липидов к белку, которые оказались сниженными соответственно на 29% и 25%, по сравнению со значениями у ложнооперированных животных (Таблица 4). В группе животных после овариоэктомии, получавших этинилэстрадиол, уровень белка и абсолютное количество общих липидов по сравнению со значениями у крыс контрольной группы увеличивались соответственно на 6% и 21%. При этом восстанавливалось отношение общих липидов к белку до показателей у ложнооперированных животных (Таблица 4). Экстракт маакии амурской при его курсовом применении препятствовал снижению данных показателей, сохраняя соотношение липидов и белков на уровне, близком к значению у ложнооперированных крыс: абсолютное количество общих липидов увеличилось на 26% по сравнению с контролем, а отношение общих липидов к белку было достоверно выше, чем в контроле на 26% и не отличалось от этого показателя у ложнооперированных животных (Таблица 4).

Таблица 4 - Влияние этинилэстрадиола (ЭЭ) и экстракта маакии амурской (ЭМА) на содержание белка и липидов в мембранах эритроцитов у крыс после овариоэктомии (М±т)___

Группы наблюдения (количество животных) Белок, мг/мл суспензии теней эритроцитов Общие липиды, мг/мл суспензии теней эритроцитов Коэффициент отношения липидов к белку Общие фосфолипиды, мг/мл суспензии теней эритроцитов

Ложнооперированные (п=8) 4,63±0,05 7,34±0,62 1,57±0,14 2,08±0,27

Контроль (овариоэктомия) (п=11) 4,50±0,05 5,25±0,23* 1,18±0,05* 2,01 ±0,11

Овариоэктомия+ЭЭ (п=8) 4,77±0,Г 6,33±0,39" 1,48±0,20+ 1,97±0,08

Овариоэктомия+ЭМА (п=9) 4,52±0,14 6,61 ±0,66" 1,49±0,16~ 2,07±0,09

Примечание - * - р<0,05 по сравнению со значениями у ложнооперированных животных; * - р<0,05 по сравнению со значениями у крыс после овариоэктомии.

Таблица 5 - Влияние этинилэстрадиола (ЭЭ) и экстракта маакии амурской (ЭМА) на относительное содержание в мембранах эритроцитов фосфатидилэтаноламина (ФЭА, %), фосфатидилсерина (ФС, %), фосфатидилхолина (ФХ, %), сфингомиелина (СМ, %) и лизофосфолипидов (ЛФЛ, %) у крыс после овариоэктомии (М±т)__

Группы наблюдения (количество животных) ФЭА ФС ФХ СМ ЛФЛ

Ложнооперированные (п=8) 18,1 ±0,4 21,0±0,3 30,9±0,2 21,8±0,4 8,0±0,4

Контроль (овариоэктомия) (п=11) 16,2±0,7* 19,0±0,4* 31,8±0,8 21,9±0,6 9,9±0,6*

Овариоэктомия + ЭЭ (п=8) 15,8±0,7* 21,4±0,6" 35,0±1,2*+ 21,7±1,3 6,2±0,8*+

Овариоэктомия + ЭМА (п=9) 16,1±0,7* 21,8±0,7* 34,7±1,0** 21,1±0,9 6,9±0,6*

Примечание - * - р<0,()5 по сравнению со значениями у ложнооперированных животных; " - р<0,05 по сравнению со значениями у крыс после овариоэктомии.

Следовательно, как курсовое применение экстракта маакии амурской, так и терапия этинилэстрадиолом способствовали поддержанию нормального соотношения липидов и белков в мембранах эритроцитов крыс после овариоэктомии, хотя уровень общих липидов в группе крыс, получавших этинилэстрадиол, снижался в большей степени, чем у животных, получавших экстракт маакии амурской, но при этом достоверно повышался уровень белка в суспензии теней эритроцитов (Таблица 4).

Удаление яичников у крыс не оказало существенного влияния на абсолютное содержание общих фосфолипидов в мембранах эритроцитов (Таблица 5). Однако активация ПОЛ, отмеченная при овариоэктомии, не влияя существенным образом на общее количество фосфолипидов, вероятно, способна «разрыхлять» мембрану эритроцитов, обеспечивая доступность фосфолипидов для фосфолипаз, катализирующих переход фосфолипидов в лизоформы [Геннис Р., 1997]. В группе контроля наблюдалось уменьшение содержания фосфатидилсерина и фосфатидилэтаноламина на 9,5% и 10,5% соответственно по сравнению с показателями у ложнооперированных животных (Таблица 5). На фоне снижения содержания фосфолипидов, входящих преимущественно во внутренний слой липидного бислоя эритроцитарных мембран, у животных после овариоэктомии происходило накопление в мембранах эритроцитов фракции лизофосфолипидов. Рост фракции лизофосфолипидов у овариоэктомированных крыс составил 24% по сравнению с уровнем у ложнооперированных животных (Таблица 5). Избыточное накопление лизофосфолипидов в мембране меняет упаковку липидов мембран [Грибанов Г.А., 1991], способствуя переходу липидного бислоя в монослой, образованию гидрофильных каналов и дезактивации мембраносвязанных ферментов с последующей везикуляцией и трансформацией мембраны эритроцита, что резко уменьшает деформационные свойства эритроцитов [Владимиров К).А., 1989; Зелинский Б.А., Паламарчук A.B., 1994]. Накопление лизофосфолипидов в наружном слое мембран может повысить и агрегационную активность эритроцитов [Othmane А. et al., 1990].

Курсовое применение экстракта маакии амурской, как и препарата сравнения этинилэстрадиола, в условиях овариоэктомии у крыс, существенно не влияя на содержание общих фосфолипидов в мембранах эритроцитов (Таблица 4), вызывало достоверное уменьшение соответственно на 30% и 37% лизофосфолипидов, по сравнению со значениями у животных контрольной группы (Таблица 5). Экстракт маакии амурской и этинилэстрадиол достоверно повышали на 9% и 10% соответственно содержание фракции фосфатидилхолина в мембранах эритроцитов по сравнению с контрольными животными. Кроме того, введение исследуемых препаратов ограничивало снижение фракции фосфатидилсерина в мембранах эритроцитов у крыс после овариоэктомии: экстракт маакии амурской повышал уровень фосфатидилсерина на 15%, а этинилэстрадиол - на 13% по сравнению со значениями у контрольных животных (Таблица 5).

Следовательно, экстракт маакии амурской, оказывая более выраженное по сравнению с этинилэстрадиолом антиоксидантное действие, препятствовал

окислительной модификации мембран эритроцитов, что проявилось нормализацией соотношения белков и липидов в их составе и достоверным снижением фракции лизофосфолипидов. Эти эффекты могут быть основой терапевтического действия экстракта маакии амурской в отношении реологических свойств эритроцитов при овариоэктомии.

Важным звеном сердечно-сосудистых осложнений климактерического синдрома у женщин является дисфункция эндотелия [Novella S., 2012]. Считают, что ранний критерий эндотелиальной дисфункции - это нарушение эндотелийзависимой вазодилятации, которая является первым шагом в развитии ССЗ [Davis V.L. et. al., 2008]. Для оценки функциональной активности эндотелия нами был использован комплексный подход, включающий исследование реакции сосудов на введение эндотелийзависимых и эндотелийнезависимых вазодилататоров, изучение антиагрегантной активности сосудистой стенки и определение уровня стабильных метаболитов N0 -нитритов.

В серии опытов по изучению вазодилятационной активности эндотелия у овариоэктомированных крыс оценивали реакцию артериального давления на введение ацетилхолина и нитропруссида натрия, вызывающих соответственно эндотелийзависимую и эндотелийнезависимую вазодилатацию. КЭД определяли как отношение реакции артериального давления на введение натрия нитропруссида к реакции на ацетилхолин [Галаган М.Е. и др., 1991; Тюренков И.Н., Воронков A.B., 2008]. Было установлено, что овариоэктомия у крыс существенно повышала КЭД на 66% по сравнению со значением у ложнооперированных крыс (Таблица 6), что свидетельствует о формировании выраженной эндотелиальной дисфункции в условиях гипоэстрогенемии.

Таблица 6 - Влияние этинилэстрадиола (ЭЭ), экстракта маакии амурской (ЭМА), композиции экстрактов люцерны посевной и клевера красного (ЭЛиК), экстракта семян льна (ЭСЛ) на коэффициент эндотелиальной дисфункции

Группы наблюдения (количество животных) КЭД

Ложнооперированные (п=5) 2,06±0,09

Контроль (овариоэктомия) (п=6) 3,42±0,34*

Овариоэктомия+ЭЭ (п=5) 2,46±0,35"

Овариоэктомия + ЭМА (п=5) 2,11±0,24+

Овариоэктомия + ЭлиК (п=5) 2,50±0,01+

Овариоэктомия + ЭСЛ (п=5) 2,48±0,17+

Примечание - * - р<0,05 по сравнению со значениями у ложнооперированных животных; р<0,05 по сравнению со значениями у крыс после овариоэктомии.

Эти данные совпадают с результатами клинических исследований об ухудшении сосудорасширяющей функции эндотелия у женщин в постменопаузальный период [Тас1сЫ Б. е! а1., 1996].

Курсовое введение этинилэстрадиола уменьшало КЭД на 28% по сравнению со значениями у овариоэктомированных крыс без лечения, что подтверждает клинические данные о наличие эндотелийпротективных свойств эстрогенов [Taddei S. et al., 1996]. КЭД в группе животных, получавших экстракт маакии амурской, комплекс экстрактов люцерны посевной и клевера красного, а также экстракт семян льна снижался на 38%, 27% и 27% соответственно по сравнению со значением у контрольной группы (Таблица 6). Следовательно, исследуемые препараты обладают способностью восстанавливать эндотелийзависимую вазодилятацию сосудов.

При изучении антиагрегантной активности сосудистой стенки амплитуду необратимой агрегации тромбоцитов в БТП крыс-доноров без предварительной инкубации с сегментом сосуда приняли за 100%. Инкубация донорской БТП с сегментами брюшной аорты ложнооперированных животных снижала амплитуду агрегации тромбоцитов на 40%, а с сегментами сосудов контрольных крыс только на 20% (Рисунок 7). Следовательно, овариоэктомия существенно уменьшала антиагрегантные свойства сосудистой стенки.

ВИАТ ПЛО я Контроль и ЭЭ ЕЭЭМА ■ ЭЛиК ИЭСЛ

Рисунок 7 - Уменьшение амплитуды агрегации тромбоцитов при инкубации БТП с сегментами сосудов ложнооперированных крыс (ЛО), животных после овариоэктомии (контроль), овариоэктомированных крыс получавших этинилэстрадиол (ЭЭ), экстракт маакии амурской (ЭМА), композицию экстрактов люцерны посевной и клевера красного (ЭЛиК), экстракт семян льна (ЭСЛ); ИАТ - исходная агрегация тромбоцитов без инкубации БТП с сегментами сосудов принята за 100%.

Примечание - * - р<0,05 по сравнению с исходной агрегацией тромбоцитов донорской плазмы; * - р<0,05 по сравнению со значениями у ложнооперированных животных; + - р<0,05 по сравнению со значениями у животных контрольной группы.

В этих условиях курсовое применение препарата сравнения этинилэстрадиола практически восстанавливало антиагрегантную активность сосудистой стенки, о чем свидетельствовало уменьшение амплитуды агрегации тромбоцитов до значений, полученных при инкубации БТП с сегментами сосудов ложнооперированных животных (Рисунок 7).

Применение исследуемых экстрактов, содержащих как изофлавоноиды (экстракт маакии амурской, комплекс экстрактов люцерны посевной и клевера красного), так и лигнаны (экстракт семян льна) оказывало аналогичное этинилэстрадиолу действие (Рисунок 7).

Следовательно, исследованные экстракты с фитоэетрогенной активностью оказывали эндотелийпротективное действие при экспериментальной овариоэктомии, о чем свидетельствуют полученные нами данные о способности препаратов сохранять важнейшие для состояния сердечно-сосудистой системы функции эндотелия - сосудорасширяющую и антиагрегантную.

Результатом формирования эндотелиальной дисфункции при различных патологических состояниях являются изменения продукции синтезируемых эндотелиальными клетками биологически активных соединений, среди которых наибольшее значение имеет оксид азота (NO) [Марков Х.М., 2005]. Снижение отмеченной нами эндотелийзависимой вазодилатации у крыс после овариоэктомии может быть следствием уменьшения продукции и высвобождения NO в условиях гипоэстрогенемии [Тюренков И.Н., Воронков A.B., 2008].

В связи с этим для оценки степени эндотелиальной дисфункции при овариоэктомии помимо косвенных показателей (антиагрегантная и сосудорасширяющая активность эндотелия) было изучено влияние экстракта маакии амурской в сравнении с этинилэстрадиолом на уровень в крови стабильных метаболитов оксида азота - нитритов. В крови у ложнооперированных животных уровень нитритов составил 0,62±0,10 мкг/мл. У овариоэктомированных животных этот показатель уменьшался на 53%, то есть эстрогенная недостаточность приводила к значительному снижению нитритов в плазме крови (Таблица 7).

Таблица 7 - Влияние экстракта маакии амурской (ЭМА) и этинилэстрадиола (ЭЭ) на уровень нитритов (мкг/мл) в сыворотке крови у крыс после овариоэктомии (М±т)____

Группы наблюдения (количество животных) Нитриты

Ложнооперированные (п=5) 0,62±0,10

Овариоэктомия (контроль) (п=5) 0,29±0,06*

Овариоэктомия+ЭЭ (п=5) 0,61±0,13+

Овариоэктомия+ЭМА (п=5) 0,47±0,05+

Примечание - * - р<0,05 по сравнению со значениями у ложнооперированных животных; + - р<0,05 по сравнению со значениями у крыс после овариоэктомии.

Введение этинилэстрадиола крысам после овариоэктомии восстанавливало уровень нитритов до показателей у ложнооперированных животных, а курсовое применение экстракта маакии амурской увеличивало этот показатель на 62% по сравнению со значениями у крыс, не получавших лечение (Таблица 7). Вероятно, восстановление Ж)-продуцирующей функции эндотелия и/или уменьшение его деградации на фоне терапии экстрактом маакии амурской и этинилэстрадиолом является одним из механизмов их описанных выше эффектов - улучшения эндотелийзависимой вазодилатации и повышения антиагрегантной активности эндотелия.

Таким образом, результаты проведенных экспериментов свидетельствуют о том, что экстракт маакии амурской оказывает существенный, но менее выраженный, чем этинилэстрадиол, терапевтический эффект, направленный на восстановление активности эндотелиальной Ж)-синтазы у крыс после овариоэктомии путем, что проявилось увеличением концентрации нитритов в крови животных после курсового лечения исследуемыми препаратами.

Повышенный риск тромбозов и тромбоэмболических осложнений является одним из серьезных осложнений ГЗТ [Макацария А.Д. и др., 2007; Вега1 V. е1 а1., 2002; Сапотсо М„ ЯсагаЫп Р.У., 2009]. Эти данные явились основанием для сравнительного изучения влияния этинилэстрадиола и фитоэстрогенов на гемостазиологические свойства крови у крыс после овариоэктомии.

У животных после овариоэктомии инициация образования тромба аппликацией раствора хлорида железа на сонную артерию приводила к полной остановке кровотока через 60 минут. На следующие сутки после воздействия тромб в сосудах сохранялся и его средняя масса составляла 0,50±0,07 мг (Таблица 8). Образование тромба может косвенно свидетельствовать об ослаблении антиагрегантных, антитромботических свойств эндотелия сосудов при овариоэктомии, то есть о формировании эндотелиальной дисфункции, при которой происходит нарушение баланса анти- и протромбогенных факторов в пользу последних.

Воспроизведение тромбоза после курсового применения этинилэстрадиола сопровождалось полным прекращением кровотока по сосуду в среднем к 5-й минуте эксперимента. В стенозированных сосудах формировались тромбы, масса которых через сутки в среднем составила 0,64 мг, что достоверно больше массы тромбов, формировавшихся в сосудах крыс контрольной группы (Таблица 8).

У животных, получавших изофлавоноидные экстракты (экстракт маакии амурской и композиция экстрактов люцерны посевной и клевера красного), инициация внутрисосудистого тромбоза, в отличие от крыс контрольной группы, не сопровождалась снижением кровотока по сосуду в первые 90 минут после воздействия. Кроме того, через сутки после аппликации на сосуд раствора хлорида железа у животных этих групп полностью отсутствовали тромбы в сонной артерии (Таблица 8).

У животных при курсовом введении экстракта семян льна, содержащего лигнаны, аппликация 10% раствора хлорида железа на сонную артерию, в отличие от группы контроля, приводила к снижению кровотока на 28% от

исходного значения к 90 минуте эксперимента. Через сутки в сонной артерии были обнаружены тромбы, средняя масса которых составила 0,30 мг, однако их масса была на 40% меньше, чем масса тромбов, сформировавшихся у животных контрольной группы (Таблица 8).

Таблица 8 - Влияние этинилэстрадиола (ЭЭ), экстракта маакии амурской (ЭМА), композиции экстрактов люцерны посевной и клевера красного (ЭЛиК), экстракта семян льна (ЭСЛ) на показатели внутрисосудистого тромбообразования, вызванного аппликацией на сонную артерию 10%

раствора хлорида железа (мг Группы наблюдения (количество животных) т> Кровоток в сонной артерии, мл/мин Масса тромба через сутки, мг

Исходное значение 75-я мин опыта

Контроль (овариоэктомия) (п=6) 4,5±0,6 0,1 ±0,2* 0,50±0,07

Овариоэктомия + ЭЭ (п=5) 4,5±0,8 0,2±0,7* 0,64+0,01+

Овариоэктомия + ЭМА (п=6) 4,9±0,4 5,3±0,7" -

Овариоэктомия + ЭЛиК (п=6) 3,7±0,9 3,3±0,6+ —

Овариоэктомия + ЭСЛ (п=7) 3,2±1,1 2,3±1,2+ 0,30±0,15+

Примечание - * - р<0,05 по сравнению со значениями у ложнооперированных животных; + - р<0,05 по сравнению со значениями у крыс после овариоэктомии.

Следовательно, исследованные экстракты способны замедлять (экстракт семян льна) и даже предупреждать в отсроченном периоде (экстракт маакии амурской и комплекс экстрактов люцерны посевной и клевера красного) образование внутрисосудистого тромба, вызванного аппликацией раствора хлорида железа на сосуд.

Полученные результаты побудили нас исследовать влияние фитоэстрогенов и этинилэстрадиола на показатели сосудисто-тромбоцитарного и плазменного звеньев гемостаза. Овариоэктомия приводила к достоверному увеличению амплитуды АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов на 13% (Рисунок 8), одной из причин которого, вероятно, является отмеченное ранее уменьшение продукции эндотелием сосудов оксида азота. Через 14 дней после овариоэктомии у крыс не зарегистрировано изменений таких показателей, характеризующих плазменное звено свертывающей системы крови, как АЧТВ (активированное частичное тромбопластиновое время) и ПВ (протромбиновое время) (Рисунок 8). Полученные результаты соответствуют клиническим данным, свидетельствующим о протромбогенном характере изменений в

системе гемостаза в условиях эстрогенного дефицита [Караченцев А.Н., Кузнецова И.В., 2004; СметникВ.П, 2007].

В группах овариоэктомированных крыс, получавших препарат сравнения этинилэстрадиол, амплитуда АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов значимо не отличалась от показателя контрольной группы (Рисунок 8). Показатели плазменного гемостаза при 14-дневном введении этинилэстрадиола существенно не изменялись (Рисунок 8). Полученные данные согласуются с

□ ЛО И Контроль ИЭЭ БЭМА ■ ЭЛпК 0 ЭСЛ

120 °

Агрегация тромбоцитов

АЧТВ

Рисунок 8 - Влияние этинилэстрадиола (ЭЭ), экстракта маакии амурской (ЭМА), композиции экстрактов люцерны посевной и клевера красного (ЭЛиК), экстракта семян льна (ЭСЛ) на агрегацию тромбоцитов, активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) и протромбиновое время (ПВ) у крыс после овариоэктомии.

По оси абсцисс - показатели активности свертывающей системы крови, по оси ординат - значения показателей, %; ЛО - ложнооперированные животные. Примечание - * - р<0,05 по сравнению со значениями у ложнооперированных животных; т - р<0,05 по сравнению со значениями у крыс после овариоэктомии.

литературными сведениями о протромбогенном эффекте гормонов при их длительном применении, причем отмечают, что изменения, вызываемые этинилэстрадиолом, выше в тромбоцитах, чем в плазменном звене гемостаза [Шаповалов В.П., 2000].

Курсовое введение экстрактов, содержащих изофлавоноиды (маакии амурской и композиция экстрактов люцерны посевной и клевера красного) овариоэктомированным крысам вызывало достоверное снижение амплитуды агрегации тромбоцитов на 26% и 21% по сравнению с показателем у овариоэктомированных крыс не получавших лечения (Рисунок 8). Антиагрегантный эффект данных экстрактов, возможно, связан с тем, что изофлавоноиды, входящие в их состав, в частности, генистеин, могут снижать

активацию тромбоцитов и ингибировать активность проагреганта тромбина [Gottstein N. et al., 2003; Rimbach G. et al., 2008]. Курсовое введение овариоэктомированным крысам экстракта семян льна вызывало достоверное снижение амплитуды агрегации тромбоцитов на 16% по сравнению с показателем у животных, не получавших лечения (Рисунок 8). Известно, что растительные лигнаны при длительном применении способны оказывать антиагрегантное действие за счет снижения в крови циркулирующих растворимых молекул адгезии [Barre D.E. et al., 2012].

Курсовое введение исследуемых фитоэстрогенов - экстракта маакии амурской, композиции экстрактов люцерны посевной и клевера красного, экстракта семян льна при экспериментальной овариоэктомии, не оказывало существенного влияния на исследуемые показатели коагуляционого звена гемостаза (АЧТВ, ПВ) (Рисунок 8).

Следовательно, отмеченная выше способность исследованных экстрактов классов изофлавонов и лигнанов уменьшать образование тромбов, вызванных апликацией раствора хлорида железа на сосуды овариоэктомированных крыс, вероятно, обусловлена их влиянием на клеточное звено системы гемостаза. Этинилэстрадиол в этих условиях не оказывал антиагрегантного действия в отношении тромбоцитов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Экстракты, содержащие как изофлавоноиды (экстракт маакии амурской, композиция экстрактов люцерны посевной и клевера красного), так и лигнаны (экстракт семян льна), проявляют фитоэстрогенные свойства: уменьшают выраженность психоэмоциональных и вазомоторных нарушений при экспериментальной овариоэктомии, а экстракт маакии амурской предотвращает резорбцию костной ткани. Экстракты маакии амурской, люцерны посевной, клевера красного и семян льна уменьшают влияние таких факторов, повышающих риск сердечно-сосудистых осложнений климактерического синдрома, как нарушение реологических свойств крови, эндотелиальная дисфункция и повышение агрегациошюй активности тромбоцитов. Все исследованные экстракты при гипоэстрогенемии, вызванной удалением яичников у крыс, ограничивают СПВК преимущественно за счет влияния на клеточные гемореологические параметры. Ослабление агрегации эритроцитов и повышение их деформационных свойств при курсовом применении исследованных экстрактов с фитоэстрогенными свойствами связано с ограничением процессов липидной пероксидации, а у экстракта маакии амурской - со снижением уровня лизофосфолипидов и восстановлением соотношения общих липидов к белку в эритроцитарных мембранах. Экстракты маакии амурской, люцерны посевной и клевера красного, семян льна ослабляют эндотелиальную дисфункцию при гипоэстрогенемии, восстанавливая сосудорасширяющую и антиагрегантную активность эндотелия. Экстракты исследованных растений с фитоэстрогенной активностью не уступают этинилэстрадиолу в восстановлении показателей реологии крови и эндотелиальной дисфункции, но, в отличие от гормональной терапии, способны

повышать эффективность доставки кислорода тканям и не обладают протромбогенным эффектом этинилэстрадиола. Полученные результаты являются основой для проведения клинических исследований, направленных на внедрение в медицинскую практику фитоэстрогенных средств на основе изофлавоноидов и растительных лигнанов в качестве альтернативы ГЗТ с целью профилактики и лечения сердечно-сосудистых осложнений климактерического синдрома у женщин.

ВЫВОДЫ

1. Экстракты, содержащие изофлавоноиды (маакии амурской, люцерны посевной и клевера красного) и растительные лигнаны (семян льна), как и этинилэстрадиол, устраняют экспериментальные эквиваленты ранних симптомов климактерического синдрома: нормализуют вазомоторные реакции и снижают проявления тревоги и страха в условиях экспериментальной овариоэктомии, не изменяя при этом, в отличие от гормональной терапии, уровень эстрадиола в крови.

2. Экстракт маакии амурской, содержащий изофлавоноиды, предупреждает развитие таких поздних метаболических нарушений как процессы остеопороза при экспериментальной овариоэктомии у крыс. Экстракт семян льна, содержащий лигнаны, в этих условиях не уменьшает интенсивность процессов резорбции костной ткани у овариоэктомированных животных.

3. В условиях модели гипервязкости крови in vitro наиболее эффективно предупреждает нарушения реологических свойств крови, а также уменьшают агрегацию тромбоцитов суммарный экстракт маакии амурской, содержащий в своем составе изофлавоноиды и димерные стильбены.

4. Экстракты маакии амурской и семян льна при экспериментальной овариоэктомии уменьшают выраженность синдрома повышенной вязкости крови преимущественно за счет улучшения реологических свойств эритроцитов, увеличивая при этом эффективность доставки кислорода тканям. Композиция экстрактов люцерны посевной и клевера красного уменьшает агрегационную активность эритроцитов, повышает их деформируемость только при высоких скоростях сдвига.

5. Экстракт маакии амурской и экстракт семян льна на фоне экспериментальной гипоэстрогенемии, вызванной удалением яичников, ограничивают активацию процессов перекисного окисления липидов в мембранах эритроцитов. Экстракт маакии амурской уменьшает уровень лизофосфолипидов, восстанавливает нормальное соотношение липидов и белка в эритроцитарных мембранах. Композиция экстрактов люцерны посевной и клевера красного также обладает выраженной антиоксидантной активностью, снижая в плазме крови овариэктомированных животных содержание как первичных, так и вторичных продуктов перекисного окисления липидов.

6. Экстракт маакии амурской, композиция экстрактов люцерны посевной и клевера красного и экстракт семян льна обладают эндотелийпротективной активностью, проявляющейся способностью препаратов восстанавливать

антиагрегантную активность сосудистой стенки и нормализовать эндотелийзависимую вазодилятацию у крыс после овариоэктомии. 7. Экстракт маакии амурской, композиция экстрактов люцерны посевной и клевера красного и экстракт семян льна обладают антиагрегантным действием и препятствуют формированию тромба в сосуде при его инициации раствором хлорида железа у крыс после овариоэктомии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шульгау, З.Т. Влияние экстрактов маакии амурской на вязкость крови и агрегацию тромбоцитов / З.Т. Шульгау, Т.М. Плотникова, О.И. Алиев, А.М. Плотникова (Анищенко) // Микроциркуляция и гемореология: Тезизы VI международной конференции. - Ярославль, 2007. - С. 22.

2. Плотникова, Т.М. Влияние полифенолов маакии амурской на реологические свойства крови при овариоэктомии у крыс / Т.М. Плотникова, З.Т. Шульгау, О.И. Алиев, A.M. Плотникова (Анищенко), С.А. Федорееев // Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений: Материалы II Международной конференции. - Алматы, 2007. - С. 139.

3. Плотникова, Т.М. Сравнительная эффективность влияния этинилэстрадиола и экстракта маакии амурской на реологические свойства крови и гемостаз у овариоэктомированных крыс / Т.М. Плотникова, З.Т. Шульгау, A.M. Плотникова (Анищенко), О.И. Алиев, С.А. Федореев, Н.И. Кулеш // Создание новых лекарственных препаратов: Материалы конференции. -Томск, 2007.-С. 37-39.

4. Плотникова (Анищенко), А.М. Эндотелийпротекторные эффекты экстракта маакии амурской и гормональной заместительной терапии этинилэстрадиолом при овариоэктомии у крыс / A.M. Плотникова (Анищенко), З.Т. Шульгау // Науки о человеке: Материалы IX конгресса молодых ученых и специалистов. - Томск, 2008. - С. 118-119.

5. Плотникова, Т.М. Разработка нового фитоэстрогенного препарата на основе полифенольного комплекса из маакии амурской / Т.М. Плотникова, З.Т. Шульгау, A.M. Плотникова (Анищенко), С.А. Федореев, Т.И. Имбс, Н.П. Мищенко, М.В. Веселова, Н.И. Кулеш, Н.К. Уткина // Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств: Материалы симпозиума. - М., 2008. - С. 160-161.

6. Плотникова (Анищенко), А.М. Антитромбогенная и антитромбоцитарная активность экстракта маакии амурской при овариоэктомии у крыс / A.M. Плотникова (Анищенко), З.Т. Шульгау, Т.М. Плотникова, О.И. Алиев, С.А. Федореев // XII международная научная конференция: «Здоровье семьи - XXI век». - Израиль, 2008. - С. 131-132.

7. Плотникова, Т.М. Антиоксидантное действие экстракта маакии амурской на эритроциты при овариоэктомии у крыс / Т.М. Плотникова, З.Т. Шульгау, A.M. Плотникова (Анищенко) // Химия и технология растительных веществ: V Всероссийская конференция-школа - Уфа, 2008. - С. 236.

8. Плотникова (Анпщенко), A.M. Синдром повышенной вязкости крови у крыс после овариоэктомии / A.M. Плотникова (Анпщенко), З.Т. Шульгау, О.И. Алиев, Т.М. Плотникова // IV Сибирский физиологический съезд. -Барнаул, 2008. - Т. - С. 226.

9. Плотникова (Анищенко), A.M. Синдром повышенной вязкости крови при овариоэктомии у крыс / A.M. Плотникова (Анищенко), З.Т. Шульгау, Т.М. Плотникова, О.И. Алиев, Т.Г. Боровская // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - № 7. - С. 101-104.

10. Plotnikova (Anishchenko), A.M. Hyperviscosity syndrome in ovariectomized rats / A.M. Plotnikova (Anishchenko), Z.T. Shulgau, T.M. Plotnikova, O.I. Aliev, T.G. Borovskaya // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. -2008.-Vol. 146,№ l.-P. 92-95.

11. Плотникова, Т.М. Влияние экстракта маакии амурской на липидный спектр и перекисное окисление липидов в мембранах эритроцитов при овариоэктомии у крыс / Т.М. Плотникова, З.Т. Шульгау, A.M. Плотникова (Анпщенко), С.А. Федореев, Н.И. Кулеш, Н.П. Мищенко // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2008. - Т. 71, № 6. -С. 28-30.

12. Плотникова (Анищенко), A.M. Сравнительное исследование влияния комплексного изофлавоноидного препарата и этинилэстрадиола на микрореологические показатели крови при овариоэктомии у крыс /

A.M. Плотникова (Анищенко), О.И. Алиев, Г.А. Чернышева,

B.И. Смольякова, A.C. Васильев, М.Б. Плотников, A.C. Прокопьев,

C.Г. Король // Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии: IV Всероссийская конференция. -М., 2009. - С. 390.

13. Плотникова, Т.М. Эндотелийпротективные эффекты этинилэстрадиола при экспериментальной овариоэктомии / Т.М. Плотникова, З.Т. Шульгау, A.M. Плотникова (Анпщенко) // XVI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». - Москва, 2009. - С. 717.

14. Плотников, М.Б. Исследование фармакологических свойств комплексного изофлавоноидного препарата / М.Б. Плотников, О.И. Алиев,

A.M. Плотникова (Анпщенко), Г.А. Чернышева, A.C. Васильев,

B.И. Смольякова, Г.Р. Барштейн, A.C. Прокопьев, С.Г. Король // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - Прил. № 2. - С. 49-52.

15. Плотникова (Анищенко), A.M. Антитромбогенная и антитромбоцитарная активность экстракта из древесины маакии амурской / A.M. Плотникова (Анищенко), З.Т. Шульгау, Т.М. Плотникова, О.И. Алиев, Н.И. Кулеш, Н.П. Мищенко, С.А. Федореев // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2009.-Т. 147,№2.-С. 164-167.

16. Анищенко, A.M. Эндотелийпротекторные эффекты комплексного изофлавоноидного препарата при овариоэктомии у крыс / A.M. Анищенко, О.И. Алиев, Г.А. Чернышева, A.C. Васильев, В.И. Смольякова, М.Б. Плотников, A.C. Прокопьев // «Гемореология и микроциркуляция (от функциональных механизмов в клинику)»: VII международная конференция. - Ярославль, 2009. - С. 4.

17. Plotnikova (Anishchenko), A.M. Antithrombogenic and antiplatelet activities of extract from Maackiaamyrensis wood. / A.M. Plotnikova (Anishchenko), Z.T. Shulgau, T.M. Plotnikova, O.I. Aliev , N.I. Kulesh, N.P. Mischenko, S.A. Fedoreyev // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2009. -Vol. 147,№2.-P. 204-207.

18. Анищенко, A.M. Влияние комплексного изофлавоноидного препарата на реологические показатели крови при овариоэктомии у крыс / A.M. Анищенко, О.И. Алиев, Г.А. Чернышева, В.И. Смольякова, А.С. Васильев, М.Б. Плотников, А.С. Прокопьев // Химия и медицина: VII Всероссийская научная конференция: с молодежной научной школой. - Уфа, 2009. - С. 109.

19.Анищенко, А.М. Антитромбогенная и антитромбоцитарная активность комплексного изофлавоноидного препарата / A.M. Анищенко, М.Б. Плотников, О.И. Алиев, Г.А. Чернышева, В.И. Смольякова, А.С. Васильев, А.С. Прокопьев, С.Г. Король // Бюллетень СО РАМН. - 2009.

- № 6 (140) - С. 43^6.

20. Анищенко, А.М. Влияние комплексного изофлавоноидного препарата на гемостаз крыс после овариоэктомии / A.M. Анищенко, О.И. Алиев, Г.А. Чернышева, В.И. Смольякова, А.С. Васильев, М.Б. Плотников, А.С. Прокопьев // Химия и медицина: VIII Всероссийская научная конференция с молодежной научной школой. - Уфа, 2010. - С. 108.

21. Анищенко, A.M. Влияние экстракта семян льна на гемореологические показатели в условиях модели гипервязкости крови in vitro / A.M. Анищенко, Н.В. Васильева, Т.М. Плотникова, О.И. Алиев // Химия и медицина: VIII Всероссийская научная конференция с молодежной научной школой. - Уфа, 2010. - С, 109.

22. Anischenko, A.M. Improving Effects of Seed Flax Extract on Hemorheological Abnormalities in Ovariectomized Rats / A.M. Anischenko, T.M. Plotnikova, N.V. Vasil'eva // Current issues of natural products chemistry and biotechnology: 2"d Annual Russian-Korean Conference. - Novosibirsk, 2010. - P. 48.

23. Анищенко, A.M. Гемореологические эффекты полифенолов из дальневосточного растения маакии амурской при овариоэктомии у крыс / A.M. Анищенко, З.Т. Шульгау, Т.М. Плотникова, О.И. Алиев, С.А. Федореев // Вопросы биологии, медицины и фармацевтической химии.

- 2010. - № 8.-С. 45-48.

24. Анищенко, A.M. Влияние лигнанов экстракта семян льна на тромбообразование и антиагрегантную активность эндотелия при экспериментальной овариоэктомии / A.M. Анищенко, Н.В. Васильева, Т.М. Плотникова // XVIII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». - 2011. - С. 414.

25. Плотникова, Т.М. Влияние этинилэстрадиола на вязкость крови и гемостаз при экспериментальной овариоэктомии / Т.М. Плотникова, A.M. Анищенко, Н.В. Васильева, О.И. Алиев И Системное кровообращение, микроциркуляция и гемореология (от ангиогенеза до центрального кровообращения): VIII международная конференция «Системное

кровообращение, микроциркуляция и гемореология». - Ярославль. - 2011 -С. 71.

26. Васильева, Н.В. Влияние экстракта семян льна на структурно-функциональный статус эритроцитов при экспериментальной овариоэктомиии / Н.В. Васильева, A.M. Анищенко // Науки о человеке: Материалы XII конгресса молодых ученых с международным участием. -Томск, 2011.-С. 77-79.

27. Анищенко, A.M. Влияние экстракта семян льна на реологические свойства крови при экспериментальной овариоэктомии/ A.M. Анищенко, Н.В. Васильева, Т.М. Плота икона, О.И. Алиев // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2011. - Т. 74, №7. - С. 19-21.

28. Плотникова, Т.М. Фитоэстогены - корректоры вазомоторных и психоэмоциональных реакций при экспериментальной овариоэктомии / Т.М. Плотникова, Н.В. Васильева, A.M. Анищенко // Бюллетень сибирской медицины. - 2011- Т. 10, № 5 - С. 82-85.

29. Анищенко, A.M. Эндотелийпротекторные эффекты экстракта семян льна при экспериментальной овариоэктомии / A.M. Анищенко, О.И. Алиев, Н.В. Васильева, Т.М. Плотникова // XIX Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». - 2012. - С. 349-350.

30. Плотникова, Т.М. Итоги разработки нового фитоэстрогенного препарата на основе полифенолов маакии амурской / Т.М. Плотникова, А.М. Анищенко, О.И. Алиев // Инновации в современной фармакологии: IV съезд фармакологов России. - Казань: Фолиум, 2012. - С. 151.

31. Анищенко, A.M. Гемореологические и антитромбогенные эффекты лигнанов семян льна при экспериментальной овариоэктомии / A.M. Анищенко, Н.В. Васильева // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии: Матер, конф. молодых ученых - Томск, 2012. - С. 37-39.

32. Анищенко, A.M. Гемореологические эффекты комплексного изофлавоноидного препарата у крыс после овариоэктомии / A.M. Анищенко // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2012. - Т 154, № 12. - С. 723-725.

33. Anishchenko, A.M. Hemoreological Effects of Complex Isoflavonoid Preparation in Ovariectomized Rats / A.M. Anishchenko // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2013. - Vol. 154, № 6. - P. 755-757.

34. Анищенко, A.M. Психоэмоциональные и вазомоторные реакции при экспериментальной овариоэктомии и их коррекция фитоэстрогенами / A.M. Анищенко, О.И. Алиев, Т.М. Плотникова // Сибирский вестник психиатрга и наркологии. - 2013. - № 3 (78). - С. 14-16.

35. Анищенко, A.M. Эндотелийпротективные свойства климадинона при экспериментальной овариоэктомии / A.M. Анищенко, Т.М. Плотникова // Бюллетень сибирской медицины. - 2013. - Т. 12, № 3. - С. 18-23.

36. Апищепко, A.M. Антитромбоцитарная и антитромбогенная активность фитоэстрогенов экстракта семян льна при экспериментальной овариоэктомии / A.M. Анищенко, О.И. Алиев, Т.М. Плотникова,

Н.В. Васильева // Сибирский медицинский журнал. - 2013. - Т. 28, № 2. -С. 96-99.

37. Анищенко, A.M. Влияние этинилэстрадиола на реологические свойства крови и гемостаз при экспериментальной овариоэктомии / A.M. Анищенко, О.И. Алиев, Т.М. Плотникова // Бюллетень СО РАМН. - 2013. - Т. 33, № 4. - С. 30-34.

38. Анищенко, A.M. Гемореологические эффекты климадинона и этинилэстрадиола при экспериментальной овариоэктомии / A.M. Анищенко, Т.М. Плотникова, О.И. Алиев // Тромбоз, гемостаз и реология. - 2013. - № 3 (55). - С. 64.

Патенты на изобретение

1. Пат. 2342944 Российская Федерация. Средство, обладающее гемореологической и антитромбоцитарной активностью / А. М. Плотникова, Т. М. Плотникова, 3. Т. Шульгау и др. ; заявители и патентообладатели ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН и ТИБОХ ДВО РАН. - опубл. 10.01.2009, Бюл. № 1.-7 с.

2. Пат. 2398592 Российская Федерация. Антиклимактерическое средство / Т.М. Плотникова, A.M. Плотникова, С.А. Федореев и др. ; заявители и патентообладатели ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН и ТИБОХ ДВО РАН. - опубл. 10.09.2010, Бюл. № 25. - 7 с.

3. Пат. 2398592 Российская Федерация. Средство, обладающее эндотелийпротекторной активностью / М.Б. Плотников, О.И. Алиев, A.M. Анищенко и др. ; заявители и патентообладатели НИИ фармакологии СО РАМН. - опубл. 10.07.2012, Бюл. № 19. - 5 с.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АДФ - аденозиндифосфат

АЧТВ - активированное частичное тромбопластиновое время

БТП - богатая тромбоцитами плазма

ВК - вязкость крови

ВП - вязкость плазмы

ДК - диеновые коныогаты

ГЗТ - гормональная заместительная терапия

ИБС - ишемическая болезнь сердца

ИДЭ - индекс деформируемости эритроцитов

КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции

ОШ - основания Шиффа

ПВ - протромбиновое время

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СМ - сфингомиелин

СПВК - синдром повышенной вязкости крови ССЗ - сердечно-сосудистые заболевания

ТБК - тиобарбитуровая кислота ТК - триеновые конъюгаты

Т ./, - полупериод агрегации эритроцитов и тромбоцитов ФС - фосфатидилсерин ФХ - фосфатидилхолин ФЭА - фосфатидилэтаноламин

ЭЛиК - экстракты люцерны посевной и клевера красного

ЭМА - экстракт маакии амурской

ЭСЛ - экстракт семян льна

ЭЦ - экстракт цимицифуги

ЭЭ - этинилэстрадиол

ЕК« -а рецептор эстрадиола

ЕГф - р рецептор эстрадиола

РЬ - фибриноген

Ш - гематокрит

8БО - секоизоларицирезинола диглюкозид

Тираж 110. Заказ 185. Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники

634050, г. Томск, пр. Ленина, 40 Тел. 533018.