Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Фитохимическое изучение и стандартизация лекарственных средств и биологически активных добавок из продуктов переработки винограда культурного (Vitis vinifera L.)
- Ученая степень
- кандидата фармацевтических наук
- ВАК РФ
- 15.00.02
Автореферат диссертации по фармакологии на тему Фитохимическое изучение и стандартизация лекарственных средств и биологически активных добавок из продуктов переработки винограда культурного (Vitis vinifera L.)
На правах рукописи
ерёмина анастасия викторовна
фотохимическое изучение и стандартизация лекарственных средств и биологически активных добавок из продуктов переработки винограда
культурного (уггге ушшена ь.).
1S.00.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия.
автореферат
диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук
Москва - 2005
Работа выполнена в ГОУ ВПО Московской медицинской академии имени И М. Сеченова Министерства Здравоохранения и Социального развития РФ
Научный руководитель:
доктор фармацевтических наук, Решетняк Владимир Юрьевич
профессор
Официальные оппоненты:
доктор фармацевтических наук, Белобородое Владимир Леонидович
профессор
доктор фармацевтических наук Сокольская Татьяна Александровна
Ведущая организация:
Институт государственного контроля лекарственных средств ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства Здравоохранения и Социального развитая РФ
Защита состоится «10» мая 2005 г. в «14» часов на заседании диссертационного совета Д 006.070.01 при Всероссийском НИИ лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН по адресу: 117216, г. Москва, ул. Грина, 7.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВНИИ лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН по адресу 117216, г. Москва, ул. Грина, 7.
Автореферат разослан «_»_ 2005 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Д 006.070.01
М.В. Кирцова
fciOG ^Ч
4G>S4
агдьъ^'д
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. В настоящее время на Российском фармацевтическом рынке представлено большое количество лекарственных препаратов и биологически активных добавок (БАД) из лекарственных растений, не включенных в Государственную Фармакопею, но обладающих выраженной биологической активностью и полезными для здоровья человека эффектами. Ярким примером являются препараты на основе экстрактов Винограда культурного (Vitis vinifera £.,сем. Vitaceae).
Большая популярность препаратов винограда обусловлена их высокой фармакологической активностью и выраженными клиническими эффектами. История их появления связана с изучением полезных свойств красного виноградного вина и явлением, получившим название «французский парадокс», суть которого заключается в существенном снижении уровня сердечно-сосудистой заболеваемости в популяции на фоне традиционного высокого потребления продуктов виноделия. Экстракты винограда содержат комплекс полифенольных соединений, обладающих очень мощным антиоксидантным действием, по силе превышающем аскорбиновую кислоту в 20 раз и а-токоферол в 50 раз, благодаря чему эти соединения названы самыми важными биологически активными добавками десятилетия.
Экстракты получают из разных частей Винограда культурного. Так на основе семян за рубежом созданы лекарственные препараты и биологически активные добавки, известные под различными торговыми названиям и представленные на российском рынке - «Пикногенол», «Эндотелон», «Grape seed», «Французский парадокс» и др. Основное фармакологическое действие этих препаратов - лечение и профилактика сердечно-сосудистых заболеваний.
У нас в стране начало изучения биологически активных соединений винограда связано с изучением водно-спиртового экстракта гребней винограда под названием Каприм, разработанного около 30 лет назад в Тихоакеанском океанологическом институте АН СССР под руководством И.И. Брехмана.
Основное действие Каприма
организма
токсическому действию алкоголя и сильные антиоксидантные свойства, на его основе до настоящего времени производится ряд БАД: «Корда-Парафарм», «Биомиллениум», «Нестарин» и др.
В качестве лекарственного растительного сырья для получения экстрактов винограда отечественные производители используют, как правило, гребни плодов винограда, однако в 2002 году появилась БАД «Иммортель», сырьём для получения которой, служат свежие плоды винограда. Помимо экстрактов винограда отечественные производители БАД начали выпускать «Экстракты красного виноградного вина» (Парафарм, Эвалар).
Отходом винодельческой промышленности помимо гребней является жом плодов винограда, который по содержанию полифенольных соединений превосходит гребни винограда и может стать перспективным сырьевым источником для получения обогащенных антиоксидантными веществами экстрактов.
Полифенольные соединения винограда представлены несколькими классами органических соединений, однако при стандартизации БАД на основе экстрактов винограда российские производители, как правило, не учитывают разнообразие структуры полифенольных соединений и присутствие взаимосвязи между биологической активностью и определяемой группой БАВ, что не соответствует требованиям, предъявляемым к современному фармакогностическому анализу.
Стандартизация экстрактов винограда представляет собой очень сложный и трудоёмкий процесс, требующий применения современных физико-химических методов анализа. Внедрение простых и легко воспроизводимых методик качественного и количественного анализа фармакологически значимых полифенольных соединений винограда является актуальной проблемой.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы является совершенствование методов стандартизации различных экстрактов винограда, а также лекарственных средств (ЛС) и биологически активных добавок (БАД), произведённых на их
основе, и изучение потенциальной возможности применения жома плодов винограда в качестве сырьевого источника для получения экстрактов с вйраженной биологической активностью.
В соответствии с указанной целью было предусмотрено решение следующих задач:
1. Подобрать оптимальные технологические условия для получения экстрактов из жома плодов винограда.
3. Изучить биологическую активность полученных экстрактов жома плодов винограда при помощи ферментных биотест-систем in vitro.
4. Провести скрининговый анализ полифенольных соединений винограда в сухих экстрактах жома плодов и гребней винограда с помощью химических и физико-химических методов анализа с целью выявления ведущей группы биологически активных веществ для каждого вида экстракта.
5. Обосновать основные показатели, характеризующие качественный состав и количественное содержание полифенольных соединений в сухих экстрактах гребней и жома плодов винограда.
6. Провести количественное определение полифенольных соединений в некоторых JIC и БАД на основе экстрактов винограда отечественного и зарубежного производства.
Научная новизна
Впервые изучен полифенольный состав и биологическая активность высушенных водно-спиртовых экстрактов из жома плодов сортовой смеси Винограда культурного (Ркацители и Молдова), произрастающего на территории РФ. Показано, что изучаемые экстракты обладают выраженной антиоксидантной активностью, поэтому жом плодов винограда является перспективным сырьевым источником, альтернативой семян винограда.
Проведён скрининговый химический и физико-химический анализ полифенольных соединений в промышленных образцах сухого экстракта гребней винограда и в изучаемых образцах экстрактов из жома плодов винограда, по результатам которого выявлены ведущие группы биологически
активных веществ для последующей стандартизации этих экстрактов. Установлено наличие взаимосвязи между биологической активностью и содержанием отдельных групп полифенольных соединений.
На основании проведённых исследований обоснована необходимость комплексного подхода к стандартизации ЛС и БАД на основе различных экстрактов винограда, виноградного вина и сока по показателям качественный и количественный анализ БАВ.
Разработаны высокоспецифичные методики качественного анализа проантоцианидинов, позволяющие идентифицировать эти соединения в различных экстрактах винограда и виноградного вина, а также ЛС и БАД, произведённых на их основе.
Разработаны методики количественного анализа проантоцианидинов и суммы полифенольных соединений в различных экстрактах винограда и виноградного вина, а также ЛС и БАД, произведённых на их основе, обеспечивающие повышение требований к контролю качества данных добавок.
Положения, выносимые на защиту
На защиту выносятся результаты изучения полифенольного состава и биологической активности экстрактов из сортовой смеси жома плодов винограда (Ркацители и Молдова), а также промышленных образцов экстракта гребней винограда; результаты исследований по разработке комплексного подхода к качественному и количественному анализу биологически значимых полифенольных соединений винограда в различных экстрактах, ЛС и БАД.
Практическая значимость работы и внедрение в практику
Результаты исследований легли в основу разработки разделов «подлинность» и «количественное определение» биологически активных веществ нормативной документации (ТУ 9176-051-46865780-04) новой БАД «Экстракт красного вина - Парафарм».
На основе результатов проведённого исследования, при перерегистрации БАД «Корда-Парафарм» внесены изменения в разделы «подлинность» и
«количественное определение» биологически активных веществ нормативной документации (ТУ 9176-050-46865780-04), регламентирующей её качество.
Методики количественного анализа полифенольных соединений винограда апробированы в ОАО «Красногорсклексредства».
Апробация работы Основные положения диссертационной работы доложены на: XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, апрель 2004 г.);11 научной конференции «Биотехнология - охране окружающей среды». Школа для специалистов: «Биокорректоры — нелекарственные оздоровительные продукты. Фундаментальные и прикладные аспекты» (г. Москва, 25-26 мая 2004 г., МГУ им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет); Конгрессе детских кардиологов (г. Москва, 26 мая 2004 г.); Научно-практическом семинаре «Новые технологии биологической медицины (фундаментальные и клинические аспекты проблемы)» (г. Москва, 11 июня 2004 г., РАСХ).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ.
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в рамках отраслевой научно-исследовательской программы ММА им. И.М. Сеченова «Разработка и совершенствование технологии подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием» (шифр 16, утвержденный МЗ РФ); в соответствии с комплексной темой кафедры общей химии стоматологического факультета ММА им. И.М. Сеченова: «Новые знания и подходы в оценке качества и сертификации биологически активных соединений синтетического и природного происхождения, лекарственных препаратов, изделий медицинской техники (технологические аспекты)» (№ государственной регистрации 01.200.118796).
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 155 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, глав экспериментальных исследований, выводов, списка литературы и приложений. В работе 30 рисуноков, 30 таблиц. Список
цитируемой литературы включает в себя 152 источника, из них 82 иностранных.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования.
В работе использовали следующие промышленные образцы растительного сырья: жом плодов винограда образец № 1 (сортовая смесь Ркацители и Молдова, урожай 2002 г, август), жом плодов винограда образец № 2 (сортовая смесь Ркацители и Молдова, урожай 2002 г, сентябрь). Промышленные образцы экстрактов, применяемые в производстве БАД «Корда-Парафарм»: сухой экстракт гребней винограда серия 011002, сухой экстракт гребней винограда серия 021002. А также экстракт красного виноградного вина - субстанция, применяемая для производства новой БАД «Экстракт красного вина - Парафарм».
В исследовании применяли JIC «Antistax» капе. № 50 (Pharmaton, Швеция) и БАД: «Нестарин» табл. № 20 (ООО «Здоровое отечество», г. Химки); «Корда-Парафарм» капе. № 10 (ЗАО «Парафарм» г. Москва); «Экстракт красного вина» капе. № 30 (ЗАО «Эвалар», г. Бийск); «Иммортель» 200 мл (ЗАО "Завод экологических технологий и экопитания ДИОД"); «Grape seed» капе. № 30 (Nature's Plus, США). .
Для проведения физико-химических исследований использовано следующее оборудование.
Высокоэффективный жидкостной хроматограф фирмы "Gilston" (Франция) с компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы «Мультихром» для "Windows" (версия 5). Насос для ВЭЖХ модель Pompa 305 "Zelson", позволяющий поддерживать расход элюента 0,110 мл/мин с возможностью работы при давлении до 400 бар.
Спектрофотометрический детектор для ВЭЖХ модели 151 UF-VIS "Gilston" с проточной кварцевой кюветой (длина оптического пути 10 мм), относительной погрешностью измерения не более ±5%, с программируемой сменой длин волн, позволяющей проводить измерения в диапазоне длин волн от 190 до 600 нм.
Инжектор ввода пробы типа «Реодайн 7125» с рабочим объёмом петли 5 - 10 мкл. Аналитическая хроматографическая колонка металлическая PLATINUM EPS С-18, длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, с обращённофазовым сорбентом Nucleosil 100 С18 с зернением 5 мкм.
Саморегистрирующий спектрофотометр фирмы Gelios (США) с проточной кварцевой кюветой (длина оптического пути 10 мм), уровнем относительной погрешности измерения не более ±5%, позволяющий проводить измерения в диапазоне длин волн от 190 до 900 нм.
Регистрирующий спектрофотометр Specord М 40 UV-VIS (Германия) с проточной кварцевой кюветой (10 мм), со спектральным диапазоном 185-900 нм. Источник излучения для УФ области спектра - дейтериевая лампа D2E; галогеновая лампа 6 В, 20 Вт для видимой области спектра. Приёмник: фотоумножитель. Уровень относительной погрешности измерения не более ±5%.
При проведении ТСХ-анализа были использованы хроматографические пластаны "KISELGEL 60 F 254" (Merck, Германия). Для идентификации полифенольных соединений в сухих экстрактах жома плодов и гребней винограда использовали систему растворителей: н-бутанол - уксусная кислота - вода в соотношении 40:12:28 [Запромётов М.Н., 1974], а для качественного анализа проантоцианидинов: толуол - ацетон - муравьиная кислота в соотношении 6:6:1 частей по объёму [Lea A.G., 1979; Carando S., 1999].
В работе использовались реактивы, растворители, стандартные образцы, отвечающие требованиям соответствующей нормативной документации.
Для выявления потенциальной адаптогенной, антиоксидантной, антимикробной и иммуномодулирующей активности исследуемых сухих экстрактов жома плодов и гребней винограда применяли глутатионредуктазную, катал аз ную и НАДФН-оксидазную ферментные биотест-системы in vitro, разработанные в ВИЛАР и запатентованные в РФ (патенты № 2181890, № 218191, № 218192 приоритет от 06.06.2001).
Глутатионредуктаза и каталаза - коммерческие препараты высокой степени очистки. Источником НАДФН-оксидазы служили перитонеальные макрофаги крыс.
Статистическую обработку полученных в ходе исследования данных производили с использованием t-критерия Стьюдента.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В соответствии с задачами исследования методом перколяции 20, 40 и 60% этанолом нами были получены лабораторные образцы экстрактов жома плодов винограда. На стадии высушивания водно-спиртовых извлечений для максимального сохранения термолабильных полифенолов был использован метод лиофильной сушки при температуре 37°С на установке ТГ-15 (Германия). Качество экстрактов соответствовало требованиям ОФС «Экстракты» ГФ XI.
Полученные экстракты были протестированы на наличие биологической активности с помощью ферментных биотест-систем. В качестве контрольного образца был использован экстракт гребней винограда, являющийся действующей основой БАД Корда-Парафарм. Результаты изучения влияния сухих экстрактов жома плодов (ЭЖПВ) и гребней винограда (ЭГВ) на скорость глутатионредуктазной (ГР) и каталазной (КАТ) реакций in vitro представлены в таблице 1. Результаты тестов показали способность всех изучаемых экстрактов повышать скорости глутатионредуктазной и каталазной реакций, что свидетельствует о наличии у них антиоксидантной активности. Таким образом, было показано, что жом плодов винограда можно использовать в качестве потенциального сырьевого источника для получения экстрактов с антиоксидантной активностью.
Количественная оценка способности экстрактов жома плодов винограда повышать скорости указанных реакций, показала максимальную антиоксидантную активность для ЭЖПВ, полученного с помощью 60% этанола. Кроме того, для данного экстракта было показано наличие умеренной иммуномодулирующей активности. На основании результатов по
определению биологической активности была выбрана оптимальная концентрация экстрагента для получения экстрактов жома плодов винограда с максимальной антиоксидантной активностью. Эта концентрация этанола составила 60%.
В таблице 2 представлены результаты тестирования сухого экстракта жома плодов винограда, полученного экстракцией 60% этанолом, с помощью НАДФН-оксидазной биотест-системы in vitro, позволяющей выявлять вещества с иммуномодулирующими свойствами. Ранее было установлено, что иммуномодуляторы активируют НАДФН-оксидазу in vitro.
Из табл. 2 видно, что экстракт жома плодов винограда, полученный экстракцией 60% этанолом, при добавлении к гомогенатам «спокойных» макрофагов крыс немного, но достоверно активируют НАДФН-оксидазу. Активирующий эффект зависит от концентрации, для изучаемых сухих экстрактов винограда установлена прямая зависимость активирующего эффекта от концентрации.
Результаты скринингового химического и физико-химического анализа полифенольных соединений в анализируемых экстрактах винограда
С помощью общепринятых фармакопейных методик, применяемых для идентификации различных БАВ полифенольной структуры, в сухих экстрактах жома плодов винограда были обнаружены антоцианы и конденсированные дубильные вещества, в сухих экстрактах гребней винограда - флавоноиды и конденсированные дубильные вещества.
Результаты спектрофотометрического анализа в УФ-области показали, что спектры поглощения водно-спиртовых растворов сухих экстрактов жома плодов и гребней винограда не идентичны: спектры поглощения растворов сухих экстрактов жома плодов винограда в 60% этаноле имеют максимум при длине волны 280 нм, а сухих экстрактов гребней винограда в 60% этаноле при длине волны 271,5 нм. Анализ полученных спектров позволяет сделать вывод о том, что в спектрах поглощения анализируемых экстрактов нет максимума поглощения в интервале длин волн 300-370 нм, характерного для спектров поглощения флавоноидов: рутина, кверцетина и др. Наличие максимумов поглощения в анализируемых экстрактах в интервале длин волн 270-290 нм характерно для катехинов, коричной и галловой кислот.
Влияние сухих экстрактов винограда на скорость глутатионредукташой (ГР) и каталазной (КАТ) реакций in vitro
Вариант опыта Скорость ГР мкмоль/мин на мг белка Относительное повышение скорости^%) Скорость КАТ мкмоль/мин на мг белка Относительное повышение скорости,(%)
Контроль (без добавок экстрактов) 9,22±0,10 100,011,08 19,1611,05 100,011,52
ЭЖПВ (20% спирт): 5 мкг/мл 10 мкг/мл 15 мкг/мл 9,21 ±0,41 9,43±0,39 10,4910,27 99,914,45 100,214,14 113,812,57 22,0710,97 28,7410,74 30,9911,09 35,514,39 46,213,35 49,913,52
ЭЖПВ (40% спирт): 5 мкг/мл 10 мкг/мл 15 мкг/мл 9,16±0,45 9,2610,33 10,0910,55 99,4±4,91 100,413,56 109,515,45 26,4910,53 30,4510,99 30,6311,03 42,612,00 49,013,25 49,313,36
ЭЖПВ (60% спирт): 5 мкг/мл 10 мкг/мл 15 мкг/мл 9,2210,39 9,2410,48 10,8110,63 100,014,23 102,315,19 117,315,82 23,5810,99 29,0111,01 32,9710,88 37,0+4,20 46,713,48 53,012,67
ЭГВ: 5 мкг/мл 10 мкг/мл 15 мкг/мл 9,4310,47 9,6010,43 10,57Ю,19 102,314,98 104,114,48 114,611,80 23,9610,96 24,6910,57 25,6810,89 34,612,18 35,711,28 37,1+1,95
Таблица 2
Влияние экстрактов жома плодов винограда на скорость НАДФН-оксидазной реакции in vitro
Препарат, концентрация Скорость НАДФН-оксидазной реакции нмоль/мин х тыс. кл.
ЭЖПВ 3,3 мкг/мл 20,7±0,98
ЭЖПВ 6,6 мкг/мл 23,1±0,65
ЭЖПВ 9,9 мкг/мл 30,0± 1,09
Подбор условий хроматографического разделения методом ВЭЖХ включал в себя выбор сорбента, типа детектора и условий детектирования, оптимального состава подвижной фазы и скорости подачи элюента. Результаты исследования показали, что при использовании колонки Platinum EPS С-18 (4,6x250 мм) оптимальное разделение полифенольных соединений наблюдается в подвижной фазе состава: метанол-вода-фосфорная кислота конц. в соотношении 40:60:5. Со скоростью потока 0,5 мл/мин при использовании УФ-детектора при длине волны 254 нм.
Результаты качественного анализа полифенольных соединений, проведённого с помощью метода ВЭЖХ представлены в табл. 3 и 4, соответственно.
На основе проведенных исследований методом ВЭЖХ можно сделать следующие выводы: идентифицированные полифенольные соединения в сухих ЭЖПВ и ЭГВ представлены в основном галловой кислотой. В сухих экстрактах винограда методом внутренней нормализации определено, что галловая кислота составляет ~ от 60 до 70% от площади всех обнаруженных на хроматограмме пиков, т.е. составляет основную часть, перешедших в экстракты фенольных соединений.
Кофейная кислота в общем количестве выделенных веществ составляет от 0,34 % (экстракт гребней винограда) до 8,03 % в образце №2 экстракта жома плодов винограда.
Флавоноиды в образцах сухих экстрактов жома плодов винограда практически отсутствуют, лишь в образце № 2 зафиксирован апигенин в количестве 0,01%. В образце № 3 (сухой экстракт гребней винограда) флавоноиды представлены следующим образом: лютеолин-7-гликозид 23,23%; гиперозид 2,97%; рутин 1,23%; гесперидин 0,66% от суммы всех регистрируемых на хроматограмме органических соединений.
Количество неидентифицированных веществ колеблется от 10 до 13 и примерно одинаково во всех образцах. Анализ времени удерживания неидентифицированых соединений показал, что с достаточной степенью достоверности можно определить наличие трёх одинаковых веществ в образцах №1,2 (сухие экстракты жома плодов винограда) и одного вещества в образцах №1 и №3 (сухой экстракт гребней винограда). По составу остальных соединений не представляется возможным сделать достоверные выводы при отсутствии PCO.
Поскольку галловая кислота является доминантным соединением среди идентифицированных полифенольных соединений в анализируемых экстрактах, то представлялось целесообразным оценить её количественное содержание. Количественное определение галловой кислоты проводили методом абсолютной калибровки.
Результаты количественного определения галловой кислоты в сухих экстрактах жома плодов и гребней винограда представлены в таблицах 5 и 6.
Согласно результатам проведенных исследований в образцах сухих экстрактах винограда галловая кислота содержится в пределах 8 %. Её содержание практически одинаково во всех трёх экстрактах. Следовательно, возможна стандартизация сухих экстрактов жома плодов и гребней винограда по показателю количественного содержания её в готовом препарате с использованием метода ВЭЖХ.
Дороговизна и трудоёмкость ВЭЖХ-анализа составляют главную сложность для использования этого метода в «рутинном» анализе, поэтому нами был осуществлён качественный анализ наиболее значимых соединений, идентифицированных методом ВЭЖХ, с помощью хроматографии в тонких слоях сорбента. Более низкая по сравнению с ВЭЖХ чувствительность данного метода позволила идентифицировать в экстрактах жома плодов винограда (образцы №1 и № 2) только галловую кислоту, а в экстракте гребней винограда галловую кислоту и лютеолин-7гликозид.
Результаты идентификации полифенольных веществ в сухих экстрактах жома плодов винограда (ЭЖПВ) и гребней винограда (ЭГВ) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
НАИМЕНОВАНИЕ PCO ВРЕМЯ УДЕРЖИВАНИЯ PCO МИН КОМПОНЕНТЫ ИССЛЕДУЕМОГО ОБРАЗЦА ИДЕНТИФИЦИРОВАНО
ЭЖПВ образец №1 ЭЖПВ образец №2 ЭГВ образец №3 ЭЖПВ образец №1 ЭЖПВ образец №2 ЭГВ образец №3
Алигенин 92,58 - + + Апигенин Апигенин
Гиперозид 26,94 - - + Гиперозид
Геспередин 33,25 - - + Геспередин
Галловая кислота 6,202 + + + Галловая кислота Галловая кислота Галловая кислота
Кверцетин 70,12 - - -
Кофейная кислота 9,205 + + + Кофейная кислота Кофейная кислота Кофейная кислота
Люггеолин 85,06 - - -
Лютеолин-7-гликозид 23,73 - - + Лютеолин-7-гликозид
Рутин 28,13 - - + Рутин
Катехин 72,54 + + + Катехин Катехин Катехин
PCO 10 веществ 13 веществ 10 веществ не идентифицир овано не вденгифиц ировано не идентифици ровано
Таблица 4
Результаты качественного анализа полифенольных веществ в сухих экстрактах винограда методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Образец № Сумма площадей всех пиков на хроматограмме, % Соотношение основных компонентов в образце, % Идентифицировано флавоноидов, % Идентифицировано других фенольнЫх соединений, %
ЭЖПВ образец №1 100 Галловая кислота 61,08 Кофейная кислота 4,76 Катехин 0,17 Неидентифицированное Вещество 33,79 Катехин 0,37 Галловая кислота 61,08 Кофейная кислота 4,76
ЭЖПВ образец №2 100 Галловая кислота 69,68 Кофейная кислота 8,03 Катехин 0,11 Неидентифицированное Вещество 19,98 Неидентифицированное Вещество 1,99 Апигенин 0,01 Катехин 0,11 Галловая кислота 69,58 Кофейная кислота 8,03
эгв образец №3 100 Галловая кислота 67,27 Кофейная кислота 0,34 Лютеолин-7-гликозид 23,23 Гиперозид 2,97 Рутин 1,23 Геснеридин 0,66 Катехин 0,22 Неидентифицированное Вещество 1,57 Неидентифицированное Вещество 1,58 Лютеолин-7-гликозид 23,23 Гиперозвд 2,97 Рутин 1,23 Гесперидин 0,66 Катехин 0,22 Галловая кислота 67,27 Кофейная кислота 0,34
Результаты количественного определения галловой кислоты в сухих экстрактах винограда методом ВЭЖХ.
ЭЖПВ (образец №1) ЭЖПВ (образец №2) ЭГВ (образец №3)
Масса, Найдено Масса, Найдено Масса, Найдено
г галловой Г галловой г галловой
кислоты, кислоты, кислоты,
% % %
0,1564 8,41 0,1167 8,41 0,0998 8,51
0,0782 8,69 0,1054 8,68 0,0876 8,77
0,0892 8,17 0,1203 8,16 0,1205 8,25
0,0785 8,63 0,1328 8,68 0,1024 8,75
0,1579 8,43 0,1171 8,22 0,1032 8,30
X 8,47 X 8,43 X 8,52
Таблица 6
Метрологические характеристики результатов количественного определения галловой кислоты в сухих экстрактах винограда методом ВЭЖХ
Наименование п f Р% T(P,f) Х% S2 S Sx АХ Е%
ЭЖПВ (образец №1) 5 4 95 2,78 8,47 0,0423 0,2056 0,019 0,25 2,95
ЭЖПВ (образец №2) 5 4 95 2,78 8,43 0,0606 0,2460 0,1100 0,30 3,56
ЭГВ (образец №3) 5 4 95 2,78 8,52 0,0518 0,2433 0,1088 0,30 3,52
Стандартизация полифенольных соединений в сухих экстрактах жома плодов и гребней винограда
Для идентификации проантоцианидинов предложены варианты методик, основанные на реакции кислотного гидролиза соединений, сочетающегося с их окислением, а также на реакции взаимодействия проантоцианидинов с ванилиновым альдегидом. Последняя реакция позволяет также определять
катехины. Условия проведения реакции гидролитического разложения проантоцианидинов неодинаковы для сухих экстрактов жома плодов и гребней винограда. Для последнего требуется более длительное нагревание -в течение 45 мин, в отличие от 5 мин, достаточных для появления специфичной малиновой окраски цианидина у раствора ЭЖПВ.
Качественный анализ индивидуальных проантоцианидинов был проведён методом ТСХ в системе растворителей: толуол - ацетон -муравьиная кислота в соотношении 6:6:1 частей по объёму, в качестве веществ сравнения использовали PCO (+)-катехин и ацетоновое извлечение из жома плодов винограда (сортовая смесь Ркацители и Молдова). В экстрактах жома плодов винограда обнаружены тримеры проантоцианидинов, связанные с галловой кислотой (ВГВ4) и один из низкомолекулярных проантоцианидинов ВГВ4 с Rf 0,48. В сухом экстракте гребней винограда идентифицированы два из низкомолекулярных проантоцианидинов Bi-B4 (Rf 0,48 и 0,50) и тримеры проантоцианидинов, связанные с галловой кислотой с Rf 0,36.
Помимо идентификации проантоцианидинов и катехинов в экстрактах гребней винограда определяли наличие суммы флавоноидов по реакции с алюминия хлоридом.
Для количественной оценки суммы проантоцианидинов применяли метод Porter L.J., суммарное количество полифенольных соединений в пересчёте на галловую кислоту определяли по методу Folin-Ciocalteu. Результаты анализа представлены на рис 1.
Результаты количественного определения суммы проантоцианидинов и полифенолов в экстрактах жома плодов и гребней винограда
1- 20% сп. ЭЖПВ, образец 1,2- 20% сп. ЭЖПВ, образец И, 3 - 40% сп. ЭЖПВ, образец I; 4 - 40% сп. ЭЖПВ, образец II; 5- 60% сп. ЭЖПВ, образец I; 6 - 60% сп. ЭЖПВ, образец II; 7- ЭГВ серия 1; 8 - ЭГВ, серия 2.
Результаты количественного анализа проантоцианидинов в сухих экстрактах жома плодов винограда, полученных с помощью 20%, 40% и 60% этанола, позволяют сделать вывод о том, что содержание этих соединений составляет в среднем 24-30%. Относительная ошибка среднего результата для данной методики составила от 2,70 до 5,20%. При этом максимальное количество проантоцианидинов обнаружено в ЭЖПВ, полученном экстракцией 60% этанолом.
Результаты количественного анализа проантоцианидинов методом кислотного гидролиза в среде бутанола показали низкое содержание этих соединений в сухом экстракте гребней винограда (не более 1,5%). Содержание суммы полифенольных соединений в различных экстрактах жома плодов винограда в отличие от экстрактов гребней винограда существенно ниже, чем содержание в них суммы проантоцианидинов. Это объясняется тем, что метод РоПп-Сюсакеи позволяет определять полифенольные соединения, находящиеся в свободном виде, а кислотный гидролиз с последующим
определением антоцианов по методу Porter позволяет определять антиоксиданты в связанном, т.е. в форме проантоцианидинов, виде.
Низкое содержание проантоцианидинов в экстракте гребней винограда свидетельствует об отсутствии олигомерных и полимерных форм этих соединений в данном экстракте, следовательно, антиоксиданты ЭГВ представлены, преимущественно, свободными полифенолами.
Результаты определения суммы проантоцианидинов и суммы свободных полифенольных соединений свидетельствуют о том, что максимальное количество и тех и других соединений содержится в экстракте жома плодов винограда, полученном с помощью 60% этанола, что и объясняет его более высокую биологическую активность по сравнению с ЭЖПВ, полученными экстракцией 20% и 40% этанолом.
При ориентировочном фитохимическом анализе в сухом экстракте гребней винограда (с помощью реакции с алюминия хлоридом) были идентифицированы флавоноиды, поэтому было решено провести количественный анализ флавоноидов в сухом экстракте гребней винограда.
Количественный анализ флавоноидов в сухих экстрактах гребней винограда показал, что их содержание превышает содержание проантоцианидинов и составляет 2,59±0,08% и 2,44+0,09%, соответственно, для двух серий экстрактов. Относительная ошибка среднего результата составила для данной методики от 3,09 до 3,46%.
Таким образом, в ЭГВ количественное содержание флавоноидов превышает содержание проантоцианидинов приблизительно в 2 раза, что позволяет сделать вывод о преобладании флавоноидов, следовательно, стандартизовать ЭГВ необходимо по сумме флавоноидов, а не проантоцианидинов. Данные выводы согласуются с фармакологической активностью ЭГВ, обладающего выраженными антиоксидантными, адаптогенными и дезинтоксикационными свойствами, при этом влияние ЭГВ на сердечно-сосудистую систему, реализующееся, прежде всего, за счёт проантоцианидинов, не выражено.
Количественный анализ полифенольных соединений в некоторых ЛП и Б АД иа основе экстрактах винограда
Результаты количественного определения суммы проантоцианидинов в пересчёте на цианидин и суммы полифенолов, в пересчёте на галловую кислоту в ЛП и шести БАД представлено на рис. 2.
Рисунок 2
Результаты количественного определения суммы проантоцианидинов и полифенолов в изучаемых ЛС и БАД
□ суммы проантоцианидинов ■ сумма полифенолов
Результаты определения суммы проантоцианидинов по методу Porter показывают, что их содержание в анализируемых добавках колеблется в широких пределах. Максимальное количество проантоцианидинов обнаружено в БАД «Grape seed», оно составляет 57,87±1,82%. Далее следует БАД «Иммортель», действующей основой которой является концентрированный сок из плодов красного винограда, содержание проантоцианидинов в ней составляет 16,70±0,35%. БАД на основе экстрактов красного виноградного вина содержат умеренное количество проантоцианидинов, которое для «Экстракта красного вина» (Эвалар) составляет 7,41 ±0,26%, а для «Экстракта красного вина-Парафарм» -8,45±0,24%.
Биологически активные добавки на основе экстрактов из гребней и листьев винограда по результатам проведённого анализа содержат небольшое количество проантоцианидинов, которое для двух БАД - «Корда-Парафарм», «Нестарин» и ЛП «Antistax» в среднем не превышает 1,5%. Относительная ошибка среднего результата для использованной методики составила от 2,10 до 5,52%.
Результаты количественного анализа проантоцианидинов в различных БАД схожи с результатами анализа этих соединений в сухих экстрактах гребней винограда, согласно которым проантоцианидины не являются ведущей группой биологически активных веществ для данных экстрактов. Кроме того, было показано, что препарат «Antistax», содержащий в качестве действующей основы экстракт листьев винограда, также характеризуется низким содержанием проантоцианидинов, поэтому для ЛС и БАД на основе экстрактов из гребней и листьев винограда был проведён количественный анализ суммы флавоноидов.
Результаты количественного определения флавоноидов в БАД «Корда-Парафарм», «Нестарин» и ЛП «Antistax» показали, что содержание суммы флавоноидов в пересчёте на рутин составляет для первой добавки 2,28±0,07%; для второй - 1,94±0,06%, а для третьей - 3,7810,07%, что во всех случаях превышает содержание суммы проантоцианидинов.
Анализ показаний к применению ЛС и БАД на основе экстрактов из гребней и листьев винограда свидетельствует о том, что их основными фармакологическими эффектами являются укрепление сосудистых стенок вен и капилляров (Р-витаминная активность), адаптогенное, общеукрепляющее и антиоксидантное действие, что связано, прежде всего, с присутствием в них флавоноидов. Таким образом, результаты проведённого анализа и данные по биологической активности показывают необходимость стандартизации биологически активных добавок на основе экстрактов из гребней и листьев винограда по показателю количественное содержание суммы флавоноидов, а не проантоцианидинов.
В отличие от препаратов на основе экстрактов листьев и гребней винограда, препараты, содержащие экстракты семян, жома плодов винограда, красного виноградного вина или сока содержат большое количество проантоцианидинов и назначаются, главным образом, для профилактики и комплексного лечения сердечно-сосудистых заболеваний, поэтому их необходимо стандартизовать по показателю количественное содержание проантоцианидинов по методу Porter, который позволяет определять проантоцианидины в форме олигомеров и полимеров.
Результаты по определению суммы полифенольных соединений в пересчёте на галловую кислоту по методу Folin-Ciocalteu (FC) показывают, что содержание суммы полифенолов в изучаемых БАД колеблется значительно меньше, чем содержание проантоцианидинов. Максимальное количество анализируемых соединений, так же как и проантоцианидинов, содержится в БАД «Grape seed». Для данной добавки оно составляет 25,58+1,14%.
Аналогично результатам анализа экстрактов из жома плодов винограда, содержание суммы проантоцианидинов, определённое по методу Porter, для БАД «Grape seed» превышает содержание суммы полифенольных соединений, определённое по методу FC. Это объясняется специфичностью метода Porter, который позволяет определять сумму проантоцианидинов опосредованно через количество выделившегося цианидина в процессе гидролиза олиго- и полимерных форм соединений, в отличие от анализа суммы полифенолов по методу Folin-Ciocalteu, который, как отмечалось ранее, позволяет определять полифенольные соединения, находящиеся в свободном состоянии. Следовательно, в экстрактах на основе семян и гребней винограда содержатся преимущественно олигомерные и полимерные формы проантоцианидинов.
Для БАД «Иммортель» содержание суммы полифенольных соединений составляет 22,85+0,57% и превышает содержание суммы проантоцианидинов. Высокое значение этого показателя связано с тем, что в состав препарата
введена аскорбиновая кислота, являющаяся активным восстановителем с полифенольной структурой.
Для остальных изучаемых Б АД содержание суммы полифенольных соединений составляет от 9,00 до 12,69% и превышает содержание проантоцианидинов, что свидетельствует о том, что проантоцианидины представлены в данных БАД низкомолекулярными фракциями, менее активными с фармакологической точки зрения по сравнению с олигомерными и полимерными фракциями. Относительная ошибка среднего результата для метода Фолина-Чикальтео составила от 2,49 до 5,80%.
ВЫВОДЫ
1. Подобраны оптимальные технологические условия получения экстрактов жома плодов винограда; с помощью ферментных биотест-систем in vitro показано наличие максимальной антиоксидантной активности у экстракта, полученного с помощью 60% этанола.
2. Проведён скрининговый анализ полифенольных соединений в экстрактах жома плодов винограда и экстракте гребней винограда с помощью специфических химических реакций, ТСХ, УФ-спектрофотометрии и ВЭЖХ.
3. Подобраны оптимальные условия для ВЭЖХ-анализа, что позволило идентифицировать в экстракте гребней винограда галловую кислоту, кофейную кислоту, флавоноиды (апигенин, катехин, кверцетин, рутин, гесперидин); в экстрактах жома плодов винограда галловую кислоту, кофейную кислоту и катехин. Установлено, что галловая кислота является доминантным соединением для всех изучаемых экстрактов.
4. Предложены и обоснованы методики качественного и количественного анализа полифенольных соединений в анализируемых экстрактах жома плодов и гребней винограда, доступные для реализации в производственных условиях.
5. Проведён количественный анализ суммы флавоноидов, проантоцианидинов и свободных полифенолов в JIC и БАД,
производимых на основе экстрактов из различных частей Винограда культурного.
1 6. Выявлены ведущие группы БАВ для различных экстрактов винограда, что позволило разработать комплексный подход, согласно которому стандартизацию экстрактов жома плодов, семян винограда, сухих экстрактов вина, экстрактов из свежих виноградных плодов и, соответственно, ЛС и БАД на их основе необходимо проводить по двум показателям: содержание суммы проантоцианидинов, в пересчёте на цианидин и содержание суммы полифенольных соединений в пересчёте на галловую кислоту', экстракты гребней и листьев винограда, а также ЛС и БАД на их основе по показателям' содержание суммы флавоноидов в пересчёте на рутин и содержание суммы полифенольных соединений в пересчёте на галловую кислоту.
7. Полученные данные могут быть использованы для стандартизации и повышения контроля качества ЛС и БАД, содержащие экстракты винограда. На основании результатов проведённого исследования внесены изменения в соответствующие разделы нормативной документации, регламентирующей качество БАД «Корда-Парафарм» и «Экстракт красного вина - Парафарм».
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Ерёмина A.B., Попков В.А., Дегтярёва Е.А., Решетняк В.Ю. Биологически активные вещества винограда: классификация, фармакологические эффекты, лекарственные препараты и БАД на их основе // Натуротералия и гомеопатия. - 2003. - № 4. - С. 27-30.
2. Ерёмина A.B., Решетняк В.Ю., Везиришвили М.О. Определение полифенольного состава сухого экстракта гребней винограда методом ВЭЖХ // Химико-фармацевтический журнал. - 2004. - Т. 38, № 3. - С. 2628.
3. Ерёмина A.B., Решетняк В.Ю., Везиришвили М.О. Комплексный подход к стандартизации экстракта красного вина // Труды международного биотехнологического центра МГУ им. М.В. Ломоносова «Биотехнология -охране окружающей среды». - М: Спорт и культура. - 2004. - С. 202-207.
4. Ерёмина A.B., Решетняк В.Ю., Везиришвили М.О. Новый подход к стандартизации комплекса полифенолов гребней винограда (Kill В) // Труды международного биотехнологического центра МГУ им. М.В. Ломоносова «Биотехнология - охране окружающей среды». - М: Спорт и культура. - 2004. - С. 206.
5. Ерёмина A.B., Решетняк В.Ю., Везиришвили М.О. Количественный анализ проантоцианидинов в сухом экстракте вина // Труды международного биотехнологического центра МГУ им. М.В. Ломоносова «Биотехнология -охране окружающей среды». - М: Спорт и культура. - 2004. - С. 207.
6. Ерёмина A.B., Решетняк В.Ю., Поткин A.B., Жданова О.И. Перспективы применения фитокомплекса Иммортель в детской кардиологии // Тезисы Всероссийского Конгресса «Детская Кардиология 2004». - Москва, 2004. -С.351-352.
7. Ерёмина A.B., Везиришвили М.О., Решетняк В.Ю. Стандартизация полифенольных соединений сухого экстракта гребней винограда // XI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». - М: Медицина. -2004.-С. 785.
Аннотация
к диссертационной работе Ерёминой Анастасии Викторовны на тему: «Фитохимическое изучение и стандартизация лекарственных средств и биологически активных добавок из продуктов переработки Винограда культурного (Vitis vimfera L.)»
В ходе исследования был впервые изучен полифенольный состав и
биологическая активность высушенных водно-спиртовых экстрактов из жома плодов сортовой смеси Винограда культурного (Ркацители и Молдова), произрастающего на территории РФ. Показано, что изучаемые экстракты обладают выраженной антиоксидантной активностью, поэтому жом плодов винограда является перспективным сырьевым источником.
Проведён скрининговый химический и физико-химический анализ полифенольных соединений в различных экстрактах винограда, по результатам которого выявлены ведущие группы биологически активных веществ для последующей стандартизации этих экстрактов.
На основании проведённых исследований разработан комплексный подход к стандартизации различных экстрактов винограда и виноградного вина. Предложены высокоспецифичные методики качественного и количественного анализа проантоцианидинов и других полифенольных соединений в различных экстрактах винограда и виноградного вина, а также ЛП и Б АД, произведённых на их основе, обеспечивающие повышение требований к их контролю качества.
"Phytochemical study and standardization of some drugs and food additives based on different extracts from grape (Vitis vinifera L.)"
In the process of experiments polypbenolic composition and biological activity of
grape by-products extracts (kinds "Молдова", "Ркацители" (Russia) have been studied for the first time. It has been shown that these extracts have very strong antioxidant activity and can be perspective source of biological active substances
Chemical and physiochemical analysis of polypbenolic substances were conducted in various grape extracts thereby main groups of biological active substances were detected for later standardization these extracts.
Comprehensive method standardization of various grape and wine extracts have been developed. Specific techniques of qualitative and quantitative analysis of proanthocyanidins and another polyphenols substances of various grape extracts were developed for improve die quality of some drugs and food additives consist of it
H-6 29 9
РНБ Русский фонд
2006-4 4654
Заказ № 743 Тираж: 100 экз
ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавской пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 (095) 318-40-68 www autoreferat ru
Оглавление диссертации Еремина, Анастасия Викторовна :: 2005 :: Москва
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Химический состав жома плодов винограда.
1.1.1 Характеристика липофильного комплекса жома плодов винограда.
1.1.2 Характеристика полифенольного комплекса жома плодов винограда.
1.2 Химический анализ полифенолов винограда.
1.2.1 Катехины.
1.2.2 Проантоцианидины.
1.2.3.Феноловые кислоты.
1.3 Механизмы фармакологического действия флавоноидов.
1.4 Применение ЛП и БАД на основе экстрактов винограда в медицинской практике.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
ГЛАВА 2 Изучение возможности применения жома плодов винограда в качестве источника экстрактов с выраженной биологической активностью
2.1 Получение образцов сухого экстракта жома плодов винограда.
2.2 Изучение биологической активности экстрактов жома плодов и гребней винограда с помощью ферментных биотест-систем.
ГЛАВА 3 Скрининговый анализ полифенольных соединений в сухих экстрактах жома плодов и гребней винограда
3.1 Предварительный качественный анализ полифенольных соединений в анализируемых экстрактах.
3.2 Спектрофотометрический анализ экстрактов жома плодов и гребней винограда в УФ-области спектра.
3.3 ВЭЖХ-анализ полифенольных соединений в анализируемых экстрактах.
3.4 Хроматографический анализ полифенольных соединений в экстрактах жома плодов и гребней винограда в тонких слоях сорбента.
ГЛАВА 4 Разработка комплексного подхода к качественному и количественному анализу полифенольных соединений в сухих экстрактах жома плодов и гребней винограда
4.1 Качественный анализ полифенолов в анализируемых экстрактах.
4.2 Количественный анализ полифенолов в анализируемых экстрактах
ГЛАВА 5 Оценка полифенольного состава некоторых биологически активных добавок отечественного и зарубежного производства
ВЫВОДЫ.
Введение диссертации по теме "Фармацевтическая химия и фармакогнозия", Еремина, Анастасия Викторовна, автореферат
Актуальность темы.
В настоящее время на Российском фармацевтическом рынке появляется большое количество лекарственных препаратов и биологически активных добавок (БАД) из лекарственных растений, не включенных в Государственную Фармакопею, но обладающих выраженной биологической активностью и полезными для здоровья человека эффектами. Ярким примером являются препараты на основе экстрактов Винограда культурного (Vitis vinifera L.,сем. Vitaceae).
Большая популярность препаратов винограда обусловлена их высокой фармакологической активностью и выраженными клиническими эффектами. История появления этих препаратов связана с изучением полезных свойств красного виноградного вина и явлением, получившим название «французский парадокс». Суть которого заключается в существенном снижении уровня сердечно-сосудистой заболеваемости в популяции на фоне традиционного потребления продуктов виноделия. Экстракты винограда содержат комплекс полифенольных соединений, обладающих очень мощным антиоксидантным действием, по силе превышающем аскорбиновую кислоту в 20 раз и а-токоферол в 50 раз, благодаря чему эти соединения названы самыми важными биологически активными добавками десятилетия [76].
Экстракты винограда получают из разных частей Винограда культурного. Так на основе семян винограда за рубежом созданы лекарственные препараты и биологически активные препараты, известные под различными торговыми названиям и представленные на российском рынке - «Эндоте-лон», «Пикногенол», «Grape seed», «Французский парадокс» и др. Основное фармакологическое действие этих препаратов — лечение и профилактика сердечно-сосудистых заболеваний.
У нас в стране начало изучения биологически активных соединений винограда связано с изучением водно-спиртового экстракта гребней винограда под названием «Каприм», разработанного около 30 лет назад в Тихоакеанском океанологическом институте АН СССР под руководством И.И. Брех-мана. Первые промышленные партии производились из отходов винограда, выращенного в Кахетии, отсюда и произошло название «Каприм» (Кахетия — Приморье).
Основное действие Каприма — повышение сопротивляемости организма токсическому действию алкоголя и сильные антиоксидантные свойства. На его основе до настоящего времени производится ряд БАД: «Корда-Парафарм», «Биомиллениум», «Нестарин» и др.
В качестве лекарственного растительного сырья для экстрактов винограда до недавнего времени отечественные производители использовали, как правило, гребни винограда. Недавно на российском рынке парафармацевти-ческих товаров появилась БАД «Иммортель», сырьём для получения которой служит сок плодов винограда. Помимо экстрактов винограда отечественные производители БАД начали выпускать «Экстракты красного виноградного вина» (Парафарм, Эвалар).
Отходом винодельческой промышленности помимо гребней является жом плодов винограда, который может стать перспективным сырьевым источником для получения обогащенных антиоксидантными веществами экстрактов.
Полифенольные соединения винограда представлены различными классами органических соединений, поэтому стандартизация препаратов на основе экстрактов винограда по показателям качественный состав и количественное содержание действующих веществ представляет собой очень сложный и трудоёмкий процесс, требующий применения современных физико-химических методов анализа. Разработка простых и легко воспроизводимых методик качественного и количественного анализа полифенольных соединений в сухих экстрактах винограда является актуальной.
Цель исследования и задачи исследования
Целью настоящей работы является совершенствование стандартизации различных экстрактов винограда, а также ЛП и БАД на их основе и изучение потенциальной возможности применения жома плодов винограда в качестве сырьевого источника для получения экстрактов с выраженной биологической активностью.
В соответствии с указанной целью было предусмотрено решение следующих задач:
1. Подобрать оптимальные технологические условия для получения экстрактов из жома плодов винограда.
2. Изучить биологическую активность полученных экстрактов жома плодов винограда при помощи ферментных биотест-систем in vitro.
3. Провести скрининговый анализ полифенольных соединений винограда в сухих экстрактах жома плодов и гребней винограда с помощью химических и физико-химических методов анализа с целью выявления л < ведущей группы биологически активных веществ для каждого вида экстракта.
4. Обосновать основные показатели, характеризующие качественный состав и количественное содержание фармакологически значимых полифенольных соединений в сухих экстрактах гребней и жома плодов винограда.
5. Провести анализ количественного содержания полифенольных соединений в некоторых БАД на основе экстрактов винограда отечественного и зарубежного производства с помощью разработанных нами методик.
Научная новизна
Впервые изучен полифенольный состав водно-спиртовых экстрактов из жома плодов сортовой смеси Винограда культурного (Ркацители и Молдова), произрастающего на территории РФ. Показано, что изучаемые экстракты обладают выраженной антиоксидантной активностью.
Проведён скрининговый химический и физико-химический анализ поли-фенольных соединений в промышленных образцах сухого экстракта гребней винограда и в изучаемых образцах экстрактов жома плодов винограда, по результатам которого выявлены ведущие группы биологически активных веществ для последующей стандартизации этих экстрактов. Показано наличие взаимосвязи между биологической активностью и содержанием определённых групп полифенольных соединений в различных экстрактах винограда.
На основании проведённых исследований разработан комплексный подход к стандартизации ЛП и БАД на основе различных экстрактов винограда и виноградного вина по показателям «подлинность» и «количественное определение».
Разработаны высокоспецифичные методики качественного анализа проан-тоцианидинов, позволяющие идентифицировать эти соединения в различных экстрактах винограда и виноградного вина, а также ЛП и БАД на их основе.
Разработаны методики количественного анализа проантоцианидинов и суммы полифенольных соединений в различных экстрактах винограда и виноградного вина, а также ЛП и БАД на их основе, обеспечивающие повышение требований к контролю их качества.
Положения, выносимые на защиту
На защиту выносятся результаты по изучению полифенольного состава и биологической активности экстрактов из сортовой смеси жома плодов винограда (Ркацители и Молдова), а также промышленных образцов экстракта гребней винограда; результаты исследований по разработке и обоснованию применения комплексного подхода к качественному и количественному анализу биологически значимых полифенольных соединений винограда в различных экстрактах, ЛП и БАД.
Практическая значимость работы и внедрение в практику
На основе результатов проведённого исследования, при перерегистрации БАД «Корда-Парафарм» внесены изменения в разделы «подлинность» и «количественное определение» биологически активных соединений ТУ 9176050-46865780-04, регламентирующих её качество.
Результаты исследований легли в основу разработки разделов «подлинность» и «количественное определение» биологически активных соединений нормативной документации (ТУ 9176-051-46865780-04) для БАД «Экстракт красного вина — Парафарм».
Методики количественного анализа полифенольных соединений винограда апробированы в ОАО «Красногорсклексредства».
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы доложены на: XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, апрель 2004 г.); II научной конференции «Биотехнология — охране окружающей среды». Школа для специалистов: «Биокорректоры — нелекарственные оздоровительные продукты. Фундаментальные и прикладные аспекты» (г. Москва, 25-26 мая 2004 г., МГУ им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет); Конгрессе детских кардиологов (26 мая 2004 г); Научно-практическом семинаре «Новые технологии биологической медицины (фундаментальные и клинические аспекты проблемы)» (г. Москва, 11 июня РАСХ).
Заключение диссертационного исследования на тему "Фитохимическое изучение и стандартизация лекарственных средств и биологически активных добавок из продуктов переработки винограда культурного (Vitis vinifera L.)"
Общие выводы
1. Подобраны оптимальные технологические условия получения экстрактов жома плодов винограда; с помощью ферментных биотест-систем in vitro показано наличие максимальной антиоксидантной активности у экстракта, полученного с помощью 60% этанола.
2. Проведён скрининговый анализ полифенольных соединений в экстрактах жома плодов винограда и экстракте гребней винограда с помощью специфических химических реакций, ТСХ, УФ-спектрофотометрии и ВЭЖХ.
3. Подобраны оптимальные условия для ВЭЖХ-анализа, что позволило идентифицировать в экстракте гребней винограда галловую кислоту, кофейную кислоту, флавоноиды (апигенин, катехин, кверцетин, рутин, гесперидин); в экстрактах жома плодов винограда галловую кислоту, кофейную кислоту и катехин. Установлено, что галловая кислота является доминантным соединением для всех изучаемых экстрактов.
4. Предложены и обоснованы методики качественного и количественного анализа полифенольных соединений в анализируемых экстрактах жома плодов и гребней винограда, доступные для реализации в производственных условиях.
5. Проведён количественный анализ суммы флавоноидов, проантоцианидинов и свободных полифенолов в JIC и БАД, производимых на основе экстрактов из различных частей Винограда культурного.
6. Выявлены ведущие группы БАВ для различных экстрактов винограда, что позволило разработать комплексный подход, согласно которому стандартизацию экстрактов жома плодов, семян винограда, сухих экстрактов вина, экстрактов из свежих виноградных плодов и, соответственно, ЛС и БАД на их ос нове не обходимо пр оводить по двум показателям: содержание суммы проантоцианидинов, в пересчёте на цианидин и содержание суммы полифенольных соединений в пересчёте на галловую кислоту; экстракты гребней и листьев винограда, а также ЛС и БАД на их основе по показателям: содержание суммы флавоноидов в пересчёте на рутин и содержание суммы полифенольных соединений в пересчёте на галловую кислоту.
7. Полученные данные могут быть использованы для стандартизации и повышения контроля качества ЛС и БАД, содержащие экстракты винограда. На основании результатов проведённого исследования внесены изменения в соответствующие разделы нормативной документации, регламентирующей качество БАД «Корда-Парафарм» и «Экстракт красного вина - Парафарм».
Список использованной литературы по фармакологии, диссертация 2005 года, Еремина, Анастасия Викторовна
1. Андреев В.В., Сухомлина О.А. Перспективы промышленного производства и применения естественных пищевых красителей. -Кишинёв: Молд. НИИНТИ. 1971. - 46 с.
2. Антипенко Е.М., Кузнецов В.П., Полимерные адсорбенты аффинного типа в исследовании физиологически активных веществ VI. Перспективы ЖКХ дубильных веществ (обзор) // Химико-фармацевтический журнал. 1995. - 29, № 9.- С. 53-60.
3. Бандюкова В.А. Фенолокислоты растений, их эфиры и гликозиды // Химия природных соединений. — 1983. №3. - С. 263-273.
4. Барабой В. А. Закономерности и механизмы биологического действия некоторых растительных фенольных соединений: Автореферат дисс. доктора мед. наук. Москва, 1971. - 36 с.
5. Барабой В.А. Биологическое действие растительных фенольных соединений. Киев: Наукова думка, 1976. — 260 с.
6. Барабой В.А. Растительные фенолы и здоровье человека. М.: Наука, 1984. -160 с.
7. Бауер К.Х. Анализ органических соединений. -М.: Изд. ИЛ, 1953. -470 с.
8. Бездетко Г.Н., Хасина Э.И., Дардымов И.В. Адаптогенное действие каприма // Валеология: Диагностика, средства и практика обеспечения здоровья. Вып. 2, Владивосток: Дальнаука. 1995, С. 178 197.
9. Беленко E.JI. Абсолютное содержание и экстрагируемость липидов виноградной ягоды // Физиология растений. — 1984. — том 31, № 1. — С. 162-167.
10. Биохимия фенольных соединений. / Под. ред. Д. Харборна. М.: Мир. -1968.-451 с.
11. Блажей А., Шутый JL, Фенольные соединения растительного происхождения. М.: Мир, 1977. - 239 с.
12. Богачёв В.Ю. Системное лечение хронической венозной недостаточности нижних конечностей // CONSILIUM-PROVISORUM. -2002.-том 2, №2.-С. 21-26.
13. И.Брехман И.И. Что противопоставить вредному действию алкоголя. Владивосток: Дальпресс, 1994.- 70 с.
14. Виноградные семена: Характеристики и состав масла (перевод) / A.M.Gattuso et al. // J. Soc. Italiano de Scienze del Alimentaziona. 1983. -том 12, № 11.-С. 47-54.
15. Влияние влагосодержания и размера частиц на экстрагируемость масла из семян винограда при помощи надкритического СОг (перевод) / Snyder
16. J.M. et al. // J. American Oil Chem. Soc. 1984. - том 61, № 11. - С. 18511856.
17. Выделение и анализ природных биологически активных веществ. Под ред. Е.Е. Сироткиной. Томск. - 1987. - С. 138-157.
18. Георгиев В.И., Дурнев А.Д., Середенин С.Д. // Бюл. эксперим. биол. и мед. Вып. 9,1994, С. 270-273.
19. Гледин В.М. Разделение дубильных веществ смешанной группы на пирогалловые и пирокатехиновые танниды // Аптечное дело. 1958. -№3.-С. 70.
20. Городецкий Ф.Ф., Барабой В.А. Противолучевые свойства галлатов. Киев. 1963.- 126 с.
21. Государственная фармакопея СССР Х1-е изд. Вып. 2. — М.: Медицина.- 1990.-392 с.
22. Дремова Н.Б., Литвинова Т.М. лекарственные средства для лечения рака молочной железы // «В мире лекарств».- 2000.- № 4 www.medi.ru.
23. Египетское виноградное масло. Экстракция, константы, жирные кислоты и неомыляемые вещества (перевод) / Zeany В.A. et al. // Crasas у Aceites. 1982.- том 33, №3.- С. 158-161.
24. Егоров И.А., Родопуло А.К. Исследование эфирных масел в некоторых сортах винограда // Виноделие и виноградарство СССР. 1978. - № 14. С. 36-38.
25. Жеребин Ю.Л., Колесник A.A. Токоферолы виноградной ягоды // Химия природных соединений. 1983. - № 2. - С. 247-248.
26. Жеребин Ю.Л., Колесник A.A. Триацилглицериды виноградной ягоды // Химия природных соединений. 1983. - № 4. — С. 525-526.
27. Жеребин Ю.Л., Колесник A.A. Каротиноиды виноградной ягоды // Химия природных соединений. 1984. - № 1. - С. 111-113.
28. Жеребин Ю.Л., Колесник A.A. Фосфолипиды виноградной ягоды // Химия природных соединений. 1984. - № 2. - С. 165-168.
29. Зозуля Ю.Л., Барабой В.А., Сутковой Д.А. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная защита мозга при патологии головного мозга. М: Знание. 2000. - 344 с.
30. Кения М.В., Лукаш А.И., Гуськов Е.П. Роль низкомолекулярных антиоксидантов при окислительном стрессе // Успехи современной биологии. 1993. - Том 13, вып.4 - С. 456-470.
31. Кириенко А.И., Григорян P.A., Богачев В.Ю. Фармакотерапия хронической венозной недостаточности нижних конечностей // CONSILIUM-MEDICUM. 2000,- № 4 www.consilium-medicum.com.
32. Теселкин Ю.О., Бабенкова И.В. Антиоксидантная активность сыворотки крови // Вестник РАМН. 1999. -№2. - С. 15-22.
33. Клышев Л.К., Бандюкова В.А„ Алюкина Л.С. Флавоноиды растений. -Алма-Ата: Наука Каз.ССР. 1978. - 220 с.
34. Косман М.В. Идентификация фенольных соединений растительного происхождения методом обращённо-фазовой высокоэффективной хроматографии: Дисс. канд. фарм. наук. — Москва, 1997. 148 с.
35. Кушнерова Н.Ф., Фоменко С.Е., Гордейчук Т.Н. и др. Влияние Каприма на состояние этанолокисляющей системы // Валеология: Диагностика, средства и практика обеспечения здоровья. — Владивосток: Дальнаука, 1995.-вып. 2.-С. 162-168.
36. Кушнерова Н.Ф., Фоменко С.Е., Гордейчук Т.Н. Антиоксидантный эффект пищевой добавки Коррда-К при алкогольной интоксикации // V Международная конференция «Биоантиоксидант». Тез. докл. Москва. — 1998.-С. 312-313.
37. Литвинова Л.Б., Федорченко Т.Б. Влияние растительных масел на женскую репродуктивную систему // Экспер. и клин, фармакология. — 1984. -57, №4. -С. 49-59.
38. Масло семян винограда и возможность его использования (перевод) / Malik F., Sohmidt S. et al II Vinphrad. 1985. - том 23, № 9. - С. 207-208.
39. Мееров Я.С., Кошевой Е.П., Масликов В.А. Анализ возможностей получения и использования виноградных семян масложировойпромышленностью Северного Кавказа // Труды НИИ Пищ. Промышленности. 1969. - том 5. - 58 с.
40. Миронова А.Н., Козлова В.Л., Волкова З.Д. Химический состав и биологические свойства масла из семян винограда // Вопросы питания. -1990.-№5.-С. 35-37.
41. Нестерова О.В. Фармакогностическое изучение видов пищевого растительного сырья с целью получения биологически активных веществ липидной природы: Дисс. докт. фарм. наук. — Москва, 1997.
42. Подколзин A.A., Мегреладзе А.Г., Донцов В.И. Система антиоксидантной защиты организма и старение // Профилактика старения. 2000. - № 3. - С. 5-26.
43. Пономарёв В.Д. Экстрагирование лекарственного растительного сырья. М.: Медицина. 1976. - 125с.
44. Родопуло А.К. Ароматообразующие вещества винограда и виноградного сока // Виноделие и виноградарство СССР. 1987. - № 4. - С. 53-55.
45. Сапронова H.H., Сорокина A.A. Формулы биологически активных соединений: Учеб. пособие. М., 2000. - 56 с.
46. Спрыгин В.Г., Кушнерова Н.Ф. и соавт. Стресс протективное действие диприма// Экспер. и клинич. фармакология. - 2002. - № 4 www.folium.ru.
47. Спрыгин В.Г., Кушнерова Н.Ф. Метод оценки и стандартизации олигомерных проантоцианидиновых, полученных из различных видов растительного сырья // Химико-фармацевтический журнал. 2002. - 36, №3. - С. 31-35.
48. Спрыгин В.Г., Кушнерова Н.Ф. Калина новый нетрадиционный источник олигомерных проантоцианидинов// Химико-фармацевтический журнал. - 2004. - 38, №2. - С. 41-45.
49. Танчев С.С. Антоцианы в плодах и овощах. М.: Пищевая промышленность, 1980. — 249 с.
50. Фармакогнозия: Учебник. Д.А. Муравьёва. 3-е изд., перераб. и доп. - \ М.: Медицина, - 1991. - 560 с.
51. Холмгрин Е., Литвак В. О пользе вина для здоровья человека // Виноград и вино России. 1998. - № 6. - С. 34-35.
52. Хроматография. Практическое приложение метода. Под ред. Э Хофтман. В 2-х ч. М.: Мир, 1986. - 336 с.
53. Шмидт О. Биологические методы анализа растений. М.: Изд. ИЛ. 1960. - 542 с.
54. Acker S.A., Tromp M.N., Haenen G. R. et al. Flavonoids as scaveringers of nitric oxide radical //Biochem. Biophys. Reserch Commun. 1995. - 85. -P.755-759.
55. Ames B.N., Shigenaga M.K., Hagen T.M. Oxidants, anthioxidants and the degenerative diseases of aging // Proc. Natl.Acad.Sci. — 1993. vol. 90. - P. 7915-7922.
56. Amic D., Davidovic D., Beslo D. Structure-radical scavenging activity relationships of flavonoids // Croatica Chemica Acta. 2003. - 76, №1. - C. 55-61.
57. Arai Y., Watanabe S. Kimira M et al. Dietary intakes of flavonols, flavones and isoflavones by Japanese woman and the correlation between quercetin intake and plasma LDL cholesterol consentration // J. Nutrition. 2000. -130, P. 2243-2250.
58. Ascorbic acid and proanthocyanidin composition for topical application to human skin: Заявка 323095 США, МКИ A 61 К 6/00, A 61 К 31/34A 61 К31/355. Sheldon Lerner, San Diego, Calif. № 5470874; Заявл. 14.10.94; Опубл. 28.11.05.
59. Bagchi D., Bagchi M., Stohs S. et al. Free radicals and grape seed proanthocyanidins extract: importance in human health and disease prevention //Toxicology. 2000. - 148, № 2-3. - P. 187-197.
60. Bate-Smith E.C. Tannins of Herbaceous Leguminosae // Phytochemistry. -1973. 12, №7. - C. 1809-1812.
61. Bate-Smith E.C. Haemanalysis of tannins: The concept of relative astringency // Phytochemistry. 1973.- 12, №4. - P. 907-912.
62. Bate-Smith E.C. Phytochemistry of proanthocyanidins // Phytochemistry. — 1975.- 14.-C. 1107-1113.
63. Boukharta M., Girardin M., Metche M. Procyanidols oligomeres des sarments de vigne, cepage Carignan // Vitis. -1994. 33,№ 1. - P. 5-10.
64. Bourzeix M., Weyland D., Heredia N. Etude des catechines et des procyanidols de la grappe de raisin du vin et d'autees derives de la vigne // Bull. O.I.V. 1986. - 59, № 669-670. - P. 1171 - 1254.
65. Carando S., Tessedre P-L. et al. Levels of flavan-3-ols in French wines // J. Agric. Food Chem. 1999. - 47. - P. 4161-4166.
66. Carando S., Tessedre P-L., Cabanis J.C. Estimation de Г apport en catechines et procyanidins relative a une consommation moderee et reguliere de vins en France // Bulletin O.I.V. 1999. - 72. - P. 73-86.
67. Constant J. Alcohol, ishemic heart disease and the French paradox // Clin. Cardiol. 1997. - 2, № 5. - P. 420-424.
68. Cos P., Ging L., Colomme M. et al. Structure, activity, relationship and classification of Flavonoids as inhibitors of xanthine oxidase and superoxide scavengers // J. Nat. Prod. 1998. - 61. - P. 71-76.
69. Dunnick J.K., Hailey J.R. Toxicity and carcinogenicity studies of quercetin and naturals components of food // Fundam. Appl. Toxicol. 1992. - 19. - P. 423-431.
70. Escribano M.T., Guerra M.T. et al. Proanthocyanidin composition in skin and seed from grapes // Polyphenols. 1994. - 23. - C. 223-226.
71. Formica J.V., Regelson W. Review of the biology of quercetine and related bioflavonoids // Food Chem. Toxicol. 1995. - 33. - 1061-1080.
72. Fotsis T., Repper M., Aktas E. et al. Flavonoids, dietary-derived inhibitors of cell proliferation and in vitro angiogenesis // Cancer Res. — 1997. 57. - P. 2916-2921.
73. Hair-growing agent comprised of proanthocyanidins: Заявка 08/765634 США, МКИ A 61 К 7/06, A 61 К 35/78. Tomoya Takahashi, Yoshinori Kobayashi, Michio Kawamura et al., Tokio. № 6126940; Заявл. 30.06.95; Опубл. 03.10.2000.
74. Hammerstone J.F., Lazarus S.A., Mitchell A.E. et al. Identification of procyanidins in cocoa (Theobroma cacao) and chocolate using HighPerformance Liquid Chromatography/Mass Spectrometry // J. Agric. Food Chem. 1999. - 47. - P. 490-496.
75. Hertog M.G., Kromhout D., Aravanis C. et al. Flavonoids intake and long-term risk of coronary heart disease and cancer in seven countries study // Arch. Inter. Med. 1995. - 155. - P. 381-386.
76. Hmamouchi M. et al. Quantitative and qualitative analysis for cluster proanthocyanidins of four grape varieties issuing from Morocco // Bull. O.I.V.- 1994. v. 67, № 765/766. - P. 901-915.
77. Hradzina G. Anthocyanins. The flavonoids: advances in research // Ed. J. B. Harborn. London. New-York. 1982. - P. 135-188.
78. Kallay M., Kerenyi Z. Occurrence and identification of procyanidins in Hungarian grapes and wines //Hungarian Agricaltural Research. 1999. - 8, №4. -P. 17-20.
79. Kallithraka S., Garcia-Viguerra C., Bakker J., Bridle P. Extraction techniques and HPLC analysis of phenolic compounds from grape seeds // Polyphenols. — 1994. № 23-27. -P.226-228.
80. Kantz K., Singleton V. Isolation and determination of polymeric Polyphenols using Sephadex LH-20 and analysis of grape tissue extracts // Am. J. Enol. Vitic. 1990. -41, № 3. - P. 223-228.
81. Kaul T.N., Middleton E.J., Ogra P.L. Antiviral effects of flavonoids on human viruses // J. Med. Virol. 1985. - 15. - P. 71-79.
82. Kerry N.L., Abbey M. Red wine and fractionated phenolic compounds prepared from red wine inhibit low density lipoprotein oxidation in vitro //Atherosclerosis. 1997. - 135. - P.93-102.
83. Kiraly-Veghely Z., Tyihak E. et al. Identification and measurement of Resveratrol and formaldehyde in parts of white and blue grape berries // Acta biologica Hungarica. 1998. - 49, № 2-4. - C. 281-289.
84. Knekt P., Jarvinen R., Seppanen R. et al. Dietary Flavonoids and the risk of lung canser and other malignant neoplasms //Am. J. Epidemiol. 1997. - 146. -P. 223-230.
85. Kopp P. Resveratrol a phytoestrogen found in red wine // Eur. J. Endocrinol.- 1998. 138, № 6. - P. 619-620.
86. Korkina L.G., Afanas'ev I.B. Antioxidant and chelating properties of flavonoids//Adv. Pharmacol. 1997.-38.-P. 151-163.
87. Lamuela-Raventos R.M., Waterhouse A. L. A direct HPLC separation of wine phenolics // Am. J. Enol. Vitic. 1994. - 45,№ 1. - P. 1-4.
88. Lang F., Wilhelm E. Quantitative determination of proanthocyanidins in Ginkgo biloba special extracts // Pharmazie. 1996. - 51, №10. - C. 734-737.
89. Lardos A., Kreuter M.H., Examine the red vine leaf and its therapeutic potential in the field of vascular diseases // Ingredient research. 2002 e. grindlay@virgin.net.
90. Lea A.G. Reversed phase gradient HPLC of proanthocyanidins and their oxidation products in cider, wines, optimized by snyder's procedure // J. Chromatography. - 1980. - 194. - P. 62-68.
91. Lea A.G., Bridle P., Timberlake C.F. et al. The procyanidins of white grapes and wines // Am. J. Enol. Vitic. 1979. - 30. - P. 289-230.
92. Lee C.Y., Oszmianski J. Isolation and HPLC-determination of phenolic compounds in red grapes // Am. J. Enol. Vitic. 1990. - 41, № 1. - P. 87-89.
93. Lee C.Y., Jaworski A.W. Identification of some phenolics in white grapes // Am. J. Enol. Vitic. 1990. - 41, № 3. - P. 204-206.
94. Lipoprotein lowering agent, cholesterol lowering agent and medicaments comprising these agents respectively: Заявка 95118644 Япония, МКИ A 61 К 35/78. Kondo Kazuo, Itakira Hiroshige, Koda Hirofumi. Заявл. 27.11.95; Опубл. 29.05.96.
95. Madhavi D.L., Deshpande S.S., Salunkhe D.K. Food Antioxidants: Technological, Toxicological and Health Perspectives. New York: Marcel Dakker, 1996.-479 p.
96. Method for extraction of proanthocyanidins from plant material: Заявка 08/919805 США, МКИ С 07 D 311/62, С 07 D 15/00. Karim Nafisi-Movaghar, Tomas Т. Svanoe, William A. Seroy et al.; Concord Calif., № 5912363; Заявл. 29.09.97; Опубл. 15.06.99.
97. Middleton E.Jr. Flavonoids in the living system. New York: Plenum Press, 1998.-179 p.
98. Moroney M.A., Alcaraz M.J., Forder R.A. et al. Selectivity of neutrophil 5-lipoxygenase and cyclo-oxygenase inhibition by an anti-inflammatory flavonoids glucoside and related aglycone flavonoids // J. Pharm. Pharmacol. 1998.-40.-P. 787-792.
99. Mulkay P., Tounilaux R., Jerimanis J. Proanthocyanidins of barley: separation and identification // J. Chromatography. 1981. - 208. - P. 419423.
100. Nagao A., Seki M.,Kobayashi H. Inhibition of xanthine oxidase by Flavonoids // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1999. - 63. - P. 1787-1790.
101. Nigdikar S.V. Consumption of red wine polyphenols redused the susceptibility of low-density lipoproteins to oxidation in vivo // Am. J. Clin. Nutr.- 1998.-68.-P. 258-265.
102. Pace-Asciak C.R. et al. The red wine phenolics trans-resveratrol and quercetin block human platelets aggregation and eicosanoid synthesis: Implication for protection against coronary heart disease // Clinica Chemica Acta. 1995. - 235. - P. 207-219.
103. Pataki Т., Bäk I et al. Grape seed proanthocyanidins improved cardic recovery during reperfusion after ischemia in isolated rat hearts // Amer. J. Clin. Nutr. 2002. - 75, № 5. - P. 894-899.
104. Peri C., Pompei C. An assay of different phenolic fractions in wines // Am. J. Enol. Vitic. 1971. - 22. - C. 55-58.
105. Porter L.J., Hurstich L.N., Chan B.G. The conversion procyanidins and prodelphinidins to cyanidins and delphinidins // Phytochemistry. 1986. - 1.- C. 223-230.
106. Pryor W.A. Cigarette smoke radicals and the role of the free radicals in chemical carcinogenicity // Environ Health Perspect. 1997. - 105. - P. 875882.
107. Renaud S., Longeril M. Wine, alcohol, platelets and the French paradox for coronary heart disease // Lancet. 1992. - 339, № 8808. - C. 1523-1526.
108. Renaud S. et al. Alcohol and mortality in middle aged men from eastern France // Epidemiology. - 1998. -9. - P. 184-188.
109. Ricardo Da Silva J.M., Rosec J-P., Bourzeix. M., Heredia N. Separation and quantitative determination of grape and wine procyanidins by HPRFLC // Sci. Food Agric. 1990. - 53. - P. 85-92.
110. Ricardo Da Silva J.M., Belchior A.P., Spranger M.I., Bourzeix. M. Oligomeric procyanidins of three grapevine varieties and wines from Portugal // Sciences des aliments. 1992. - 12. - P. 223-237.
111. Robak J., Gryglewsky R. Bioactivity of flavonoids // Pol. J. Pharmacol. — 1996.-48.-P. 554-564.
112. Romer J., Lund L. Grapes/wine containing phytoestrogen // Nature Medicine. 1997.- 3. - P. 1195-1196.
113. Saito V., Hosoyama H., Agira T. et al. Antiulcer activiti of grape seed extract and procyanidins // J. Agric. Food Chem. 1998. - 46. - C. 14601464.
114. Shoskes D.A. Effects of bioflavonoids quercetin and curcumin on ischemic renal injurity: a new class of renoprotective agents // Transplantation. 1998. -66.-P/ 147-152.
115. Shutenko Z., Henry Y., Pinard E. et al. Influence of the antioxidant quercetin in vivo on the level of nitric oxide concentration in ischemia-reperfusion injurity: an experimental study // Br. J. Surgery. 1998. - 85. - 1080-1085.
116. Singleton V.L., Rossi J.A. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents // Am. J. Enol. Vitic. 1969.- 19.-P. 144-158.
117. Singleton V.L., Orthofer R., Lamuela-Raventos R.M. Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent // Oxidants and Antioxidants, 1999. №3. - P. 152-178.
118. Siemann E., Creasy L. Consentration of the phytoalexin resveratrol in wine // Am. J. Enol. Vitic. 1992. -34. - P. 49-52.
119. Soleas G.J., Diamandis E.P., Goldberg D.M. Wine as a biological fluid: history, production and role in disease prevention // J. Clin. Lab. Anal. 1997. - 11, № 5. - C. 287-313.
120. Soleas G.J., Goldberg D.M., Grass L., Levesque M., Diamandis P. Do wine Polyphenols modulate p53 gene expression in human cancer cell lines? // Clinical Biochemistry.- 2001. 34. - P. 415-420.
121. Souquet J-M., Labarte B. et al. Phenolic composition of grape stems // J. Agric. Food Chem. 2000. - 48. - P. 1076-1080.
122. Sun B., Leandro C., Ricardo da Silva J.M., Spranger I. Separation of grape and wine proanthocyanidins according to their degree of polymerization // J. Agric. Food Chem. 1998. - 46. - P. 1390-1396.
123. Sun B., Ricardo-da-Silva J.M., Spranger I. Critical factors of vanillin assay for catechins and proanthocyanidins // J. Agric. Food Chem. 1998. - 46. - P. 4267-4274.
124. Swain T., Hillis W. The phenolics constituents of Prunus Pomestica L. — The quantitative analysis of phenolics constituents // J. Sci. Food Agric. -1959. 10, №1. - C. 63-68.
125. Tzeng S.H., Ko W.S., Ko F.N. et al. Inhibition of platelets aggregation by some flavonoids // Thromb. Res. 1991. - 64. - P. 91-100.
126. Takashi T., Gen-ichiro N., Takashi S. et al. // Chem. Pharm. Bull. 1990. -38, №8.-p. 2151-2156.
127. Thorngate J.H., Singleton V.L. Localization of procyanidins in grape seeds // Am. J. Enol. Vitic. 1994. - 45, № 2. - P. 259-262.
128. Vlietinck A.J., De Bruyne I., Apers S. et al. Plant derived leading compound for chemotherapy of human immunodeficiency virus (HIV) infection //Planta Med. // 1998. - 64. - P. 97-109.
129. Wang J-N., Hano Y., Nomura T., Chen Y-J. Procyanidins from seeds of Vitis amurensis II Photochemistry. 2000. - 53. - P. 1097-1102.
130. Zhu B.T., Ezell E.T., Liehr J.G. Catechol-O-methyl trasnsferase catalysis rapid O-methylation of mutagenic Flavonoids. Metabolic inactivation as a possible reason for their lack of carcinogenicity in vivo // J. Biol. Chem. — 2001.-269.-P. 292-299.