Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Влияние дистантного прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина на выживаемость ишемизированных тка-ней и неоваскулогенез (экспериментальное исследование)

На правах рукописи

Колесник Инга Михайловна

ВЛИЯНИЕ ДИСТАНТНОГО ПРЕКОНДИЦИОНИРОВАНИЯ И РЕКОМБИНАНТНОГО

ЭРИТРОПОЭТИНА НА ВЫЖИВАЕМОСТЬ ИШЕМИЗИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ И НЕОВАСКУЛОГЕНЕЗ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14,03.06 - фармакология, клиническая фармакология 14.01.17 - хирургия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Курск-2010

1 В ДЕН 2010

004618532

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Покровский Михаил Владимирович доктор медицинских наук, профессор Лазаренко Виктор Анатольевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Резников Константин Михайлович доктор медицинских наук, профессор Горпинич Александр Борисович

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Защита состоится « » 2010 г. в °° часов на за-

седании диссертационного совета Д 208.039.03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО КГМУ Росздрава.

Автореферат разослан « /3 » 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Профилактика и коррекция последствий локальной ишемии, развивающейся при различных хирургических вмешательствах, является актуальной проблемой современной медицины. В связи с этим высок интерес к изучению ишемического прекондиционирования, суть которого состоит в том, что кратковременные подпороговые периоды ишемии активируют эндогенные защитные механизмы, снижающие степень повреждения клеток в результате последующего продленного ишемического эпизода. Феномен был открыт и описан С.Е. Murry и соавт. в 1986 г., которые впервые продемонстрировали, что четыре пятиминутных эпизода коронароокклюзии, перемежающиеся пятиминутными периодами реперфузии перед сорокаминутной ко-ронароокклюзией, уменьшали размер инфаркта миокарда почти в 2 раза.

Исследования последних лет показали, что одного эпизода преходящей ишемии достаточно, чтобы вызвать прекондиционирование. Защитные свойства проявляются уже через 5 минут реперфузии. Тогда наступает первая защитная фаза. Продолжительность её - 1-2 часа. Затем эффект исчезает и возобновляется в промежуток времени от 24 до 96 часов. Это вторая защитная фаза (Бо-керия Л.А., 2007; Dirnagl U„ Becker К., Meisel А., 2009).

В 1993 году было открыто дистантное ишемическое прекондиционирование - феномен, при котором кратковременные эпизоды ишемии одного органа (почки, брыжейки, нижней конечности) повышают толерантность других органов к тяжелым ишемическим повреждениям (McClanahan Т., 1993; Prziclenk К., 1993; Botker Н.Е., Kharbanda R., Schmidt M.R. et al., 2010). Открытие подтвердило предположение о том, что эффект прекондиционирования реализуется не локально, а представляет систему многоуровневого иерархического дублирования, включающую нейрогенный компонент, гуморальный и внутриклеточный (Hausenloy D.J., Yellon D.M., 2008). Последнее привело к необходимости поиска гуморального агента, выделяющегося в ответ на ишемию и способного при экзогенном введении инициировать процесс без ишемии. С клинической точки зрения прекондиционирование фармакологическими средствами выглядит предпочтительнее, так как технологически проще и лишено потенциальной опасности ишемических эпизодов для патологически измененных тканей (Sommer С., 2008). Еще больший интерес для клинического применения представляет возможность дозировать введение фармакологических средств, что делает управляемым временной интервал периода толерантности к ишемии.

Наиболее перспективным для изучения, с нашей точки зрения, является эритропоэтин. Это гликопротеиновый гормон, синтез которого стимулирует гипоксия (Захаров Ю.М., 2007; Fantacci M., Bianciardi P., Caretti A., 2006). Период полувыведения эритропоэтина значительно выше, чем у других гумораль-

ных агентов прекондиционирования (аденозин, брадикинин, опиоиды), следовательно, временной интервал периода толерантности к ишемии, инициируемый им, должен быть существенно шире. Кроме того, открытие рецепторов ' эритропоэтина на мезангиальных клетках и в миокарде, фибробластах мышечной и нервной ткани позволило изучать неэритропоэтические функции гормона ' (Бакшеев В.И., Коломоец Н.М., 2007; Melli G., Jack С., Lambrinos G.L. et al., 2006; Taoufik E., Petit E., Divoux D. et al., 2008). Некоторыми авторами доказано, что применение эритропоэтина в малых дозах не оказывает влияния на показатели периферической крови, в то время как неэритропоэтические функции его сохраняются (Ferrario M. et al., 2007).

Наиболее изучены эффекты прекондиционирования на сердце и головной мозг. Однако предполагаемый механизм реализации феномена указывает на возможность его универсального использования в хирургии для защиты органов и тканей в условиях нарушения кровообращения и, возможно, стимуляции неоваскулогенеза.

Цель исследования: установить влияние дистантного ишемического прекондиционирования и фармакологического прекондиционирования реком-бинантным эритропоэтином на выживаемость изолированного кожного лоскута на питающей ножке и неоваскулогенез в ишемизированной скелетной мышце крыс.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние дистантного ишемического прекондиционирования на выживаемость изолированного кожного лоскута на питающей ножке и неоваскулогенез в ишемизированной мышце голени крыс.

2. Изучить влияние рекомбинантного эритропоэтина в субэритростиму-лирующей дозе на выживаемость изолированного кожного лоскута на питающей ножке и неоваскулогенез в ишемизированной мышце голени крыс.

3. Оценить сочетанное влияние дистантного ишемического прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина на выживаемость изолированного кожного лоскута на питающей ножке и неоваскулогенез в ишемизированной мышце голени крыс.

4. Определить роль АТФ-зависимых калиевых каналов в механизме реализации цитопротекторного эффекта дистантного ишемического прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина.

5. Определить роль эндотелиальной NO-синтазы в механизме реализации цитопротекторного и неоваскулогенного эффектов рекомбинантного эритропоэтина.

Научная новизна исследования. В работе впервые предложены эффективные способы улучшения выживаемости ишемизированных тканей и стиму-

ляции неоваскулогенеза в ишемизированной скелетной мышце с помощью дистантного ишемического прекондиционирования и фармакологического прекон-диционирования рекомбинантным эритропоэтином в субэритростимулирую-щей дозе.

Впервые показано, что влияние рекомбинантного эритропоэтина на выживаемость ишемизированных тканей и неоваскулогенез аналогично влиянию дистантного ишемического прекондиционирования.

АТФ-зависимые калиевые каналы являются эффекторяым звеном в механизме реализации цитопротекторного действия дистантного ишемического прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина.

Эндотелиальная NO-синтаза задействована в механизме реализации цитопротекторного эффекта рекомбинантного эритропоэтина, блокада её не влияет на возможность стимуляции им неоваскулогенеза.

Научная новизна подтверждается получением патента на полезную модель РФ № 97615 от 20.09.2010 г. «Устройство для дистантного прекондиционирования»; положительного решения о выдаче патента РФ на изобретение по заявке № 2009140096/14(056915) «Способ коррекции эндотелиальной дисфункции рекомбинантным эритропоэтином при L-NAME индуцированном дефиците оксида азота» от 03.08.2010 г.

Практическая значимость. В работе экспериментально обоснована эффективность применения дистантного ишемического прекондиционирования для профилактики и коррекции ишемических повреждений тканей, развивающихся при различных хирургических вмешательствах, а также возможность инициации процесса прекондиционирования рекомбинантным эритропоэтином.

Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные клинические испытания дистантного ишемического прекондиционирования и фармакологического прекондиционирования рекомбинантным эритропоэтином в су-бэритростимулирующей дозе, для профилактики и коррекции ишемических повреждений тканей.

Экспериментально обоснованная возможность применения рекомбинантного эритропоэтина для фармакологического прекондиционирования позволяет проводить экспериментальное изучение временного параметра инициируемого им периода толерантности к ишемии и возможностей управления им.

Внедрение в практику. Материалы диссертации используются в учебном процессе и научно-исследовательской работе ряда кафедр ГОУ ВПО КГМУ Росздрава, ГОУ ВПО РГМУ им. Н.И. Пирогова Росздрава, ГОУ ВПО БелГУ, ГОУ ВПО ВГМА им. H.H. Бурденко.

Связь с планом НИР. Диссертация выполнена в соответствии с планом НИР ГОУ ВПО КГМУ Росздрава. Номер государственной регистрации темы -01.2.01056141.

Апробация работы.

Материалы работы были представлены на межвузовской научной конференции, посвященной памяти профессора Владислава Васильевича Пичугина и 75-летию КГМУ «Актуальные вопросы фармакологии и фармации» (Курск, 2009), 75-й юбилейной итоговой Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых «Молодежная наука и современность» (Курск, 2010), Всероссийской научно-практической конференции «Биомедицинская инженерия и биотехнология» (Курск, 2010), Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2010).

Апробация диссертации проведена на расширенном научно-практическом заседании кафедр фармакологии, хирургических болезней ФПО; хирургических болезней № 1; хирургических болезней № 2; общей хирургии; оперативной хирургии и топографической анатомии; онкологии; травматологии, ортопедии и военно-полевой хирургии; клинической фармакологии; инфекционных болезней и эпидемиологии; внутренних болезней ФПО; акушерства и гинекологии ФПО; акушерства и гинекологии; патофизиологии; микробиологии, вирусологии и иммунологии; анатомии; биоорганической химии; общей химии; кафедры мобилизационной подготовки, здравоохранения и медицины катастроф; НИИ экологической медицины ГОУ ВПО КГМУ Росздрава (Курск, 2010).

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 5 из них - в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.

Положения, выносимые на защиту:

1. Дистантное ишемическое прекондиционирование и рекомбинантный эритропоэтин увеличивают выживаемость изолированного кожного лоскута на питающей ножке.

2. Дистантное ишемическое прекондиционирование и рекомбинантный эритропоэтин стимулируют неоваскулогенез в ишемизированной мышце голени крыс.

3. Блокада АТФ-зависимых калиевых каналов глибенкламидом полностью нивелирует цитопротекторный эффект дистантного ишемического пре-кондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина на модели изолированного кожного лоскута на питающей ножке.

4. Блокада эндотелиальной NO-сшггазы нивелирует цитопротекторный эффект рекомбинантного эритропоэтина, не оказывая влияния на возможность стимуляции им неоваскулогенеза.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 225 источников, из которых 72 отечественных и 153 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста, содержит 3 таблицы и 43 рисунка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проведены на 310 крысах линии Wistar массой 250-300 г. Для исследования взяты крысы без внешних признаков заболевания, прошедшие карантинный режим вивария Курского государственного медицинского университета. В ходе эксперимента животные содержались в условиях стандартной экспериментальной биологически чистой комнаты, температура воздуха составляла 22-24°С, освещение - 12 ч/12 ч светлый/темный цикл, все крысы получали гранулированный корм и фильтрованную водопроводную воДУ

Все исследования проводили в одно и то же время суток во второй половине дня с соблюдением принципов, изложенных в «Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1986). Наркотизацию осуществляли виутрибрюшинным введением водного раствора хлоралгидрата в дозе 300 мг/кг веса; выведение животных из эксперимента - его передозировкой. Животных распределяли по группам путем стратифицированной рандомизации со стратификацией по массе тела, а также по проводимым операциям и манипуляциям. Каждая группа формировалась не менее чем из десяти крыс.

Влияние дистантного ишемического прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина на выживаемость ишемизированных тканей исследовали на модели изолированного кожного лоскута на питающей ножке. Создание модели производили на вторые сутки эксперимента. Отступив 1 см от мечевидного отростка по белой линии живота, предварительно наметив по трафарету размер, выкраивали кожный лоскут: 1 см - основание, 4 см - длина, (сохранив питающий сосуд) изолировали в полиэтиленовый пакет, края кожи ушивали непрерывным швом (Шолохов В.М., 1984; Черноморцева Е.С., 2002). Площадь выжившей ткани лоскута оценивали на пятые сутки после его моделирования планиметрически (Автандилов Г.Г., 1994). В дальнейшем рассчиты-

пали показатель выживаемости (отношение площади выжившей ткани к изначальной площади лоскута *100%).

Влияние дистантного ишемического прекондиционирования и рекомби-нантного эритропоэтина на неоваскулогенез исследовали на модели ишемии мышц голени, которую воспроизводили оперативным удалением участка магистральных сосудов, включающего бедренную, подколенную, переднюю и заднюю большеберцовые артерии правой задней конечности (Артюшкова Е.Б., 2008; Takeshita А., 1998; Sugano С. et al„ 2004). При оценке состояния микро-циркуляторного русла в ишемизированной мышце учитывали уровень микро-ииркуляции в ней и данные морфологического исследования1. Уровень микроциркуляции в мышцах голени определяли при помощи оборудования производства компании Biopac systems: полиграфа МР100 с модулем лазерной доппле-ровской флоуметрии LDF100C и инвазивного игольчатого датчика TSD144. Регистрация и обработка результатов лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) производилась с помощью программы AcqKnowledge версии 3.8.1., значения микроциркуляции выражались в перфузионных единицах (ПЕ).

Роль АТФ-зависимых калиевых каналов в реализации цитопротекторного эффекта дистантного ишемического прекондиционирования и рекомбинантно-го эритропоэтина исследовали на модели изолированного кожного лоскута на питающей ножке. Блокаду АТФ-зависимых калиевых каналов осуществляли внутрибрюшинным введением глибенкламида в дозе 5 мг/кг веса (растворитель диметилсульфоксид) за 30 минут до проведения дистантного ишемического прекондиционирования и/или введения рекомбинантного эритропоэтина (Са-мойленкова Н.С., Гаврилова СЛ., Дубина А.И. и др., 2007; Miyra Т., Liu Y. et al„ 2001; Negrjni J.A. et al„ 2002).

Для определения роли эндотелиальной NO-синтазы в реализации цитопротекторного и неоваскулогенного эффектов рекомбинантного эритропоэтина моделировали блокаду эндотелиальной NO-синтазы ежедневным внутрибрюшинным введением с первых суток эксперимента Ы-нитро-Ь-аргинин метилового эфира (L-NAME) в дозе 25 мг/кг/сут. (Покровский М.В. с соавт., 2006).

Дистантное ишемическое прекондиционирование (ДИП) проводили 10-минутным пережатием левой бедренной артерии, с последующей 30-минутной реперфузией непосредственно перед моделированием патологии, на третьи и пятые сутки эксперимента. Пережатие бедренной артерии осуществляли наложением жгута на верхнюю треть левого бедра (Охшап Т., 1997). Контролем правильности наложения жгута служило отсутствие пульса на атрериях голени.

1 Морфологические исследования проведены на кафедре общей патологии медицинского института Орловского государственного университета под руководством д.м.н. профессора B.C. Барсукова.

Рекомбинантный эритропоэтии (ЕРО) («Эпокрин» эпоэтин альфа; ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых препаратов» Федерального медикобиологического агентства г. Санкт-Петербург, Россия) вводили подкожно в субэритростимулирующей дозе 50 ME/кг на первые (за 12 часов до моделирования патологии), третьи и пятые сутки эксперимента (Германн Б.Ф., Герман X., 2004). На б-е, 10-е, 22-е и 29-е сутки от начала введения препарата отклонений от нормы показателей количества эритроцитов, уровня гемоглобина и гематокрита у экспериментальных животных нами зарегистрировано не было.

Статистическая обработка результатов исследования. Статистический анализ полученных данных осуществляли в программе Microsoft Excel версии 10.0 при помощи средств пакета анализа. «Описательная статистика» применялась для нахождения среднего значения (М) показателей и ошибки среднего (m). «Двухвыборочный t-тест с различными дисперсиями» использовался для сравнения соответствующих показателей в различных группах животных и определения достоверности различий между ними. Статистически значимыми считали различия при значениях двустороннего р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изучение влияния дистантного ишемического прекондициониро-вания и рекомбинантного эритропоэтина на выживаемость изолированного кожного лоскута на питающей ножке.

При моделировании кожного лоскута на питающей ножке выживает часть его длины, превосходящая ширину основания не более чем в 2 раза. Мы заведомо моделировали лоскут, длина которого в 4 раза превосходила ширину основания.

На пятые сутки в контрольной группе площадь выжившей ткани составила 1,59±0,03 ем2, показатель выживаемости - 40% от изначальной площади (4 см2), что соответствует результатам, полученным другими исследователями, применявшими данную модель (Шолохов В.М., 1984; Черноморцева Е.С., 2002).

Все изучаемые методы коррекции способствовали достоверному увеличению площади выжившей ткани по сравнению с контрольной группой. Проведение дистантного ишемического прекондиционирования - до значения 2,3б±0,09 см2 (р=0,00001); введение рекомбинантного эритропоэтина - до 2,51±0,05 см2 (р<0,05); сочетанное воздействие изучаемых методов - до 2,64±0,16 см2 (р=0,00018). Следовательно, показатель выживаемости увеличился в 1,5; 1,6 и 1,7 раза соответственно.

Достоверных отличий между показателями в названных опытных группах нами выявлено не было (р=0,17685 при сравнении показателей в группах ДИП и ЕРО; р=0,15894 и р=0,45228 при сравнении их с группой сочетанного воздействия соответственно). Таким образом, дистантное ишемическое прекондицио-нирование способствует увеличению выживаемости изолированного кожного лоскута на питающей ножке. Рекомбинантный эритропоэтин в этой модели оказывает аналогичное действие (рис. 1).

40%

Рис. 1. Эксперимент по изучению влияния дистантного ишемического прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина на выживаемость изолированного кожного лоскута на питающей ножке.

Примечание. ДИП - дистантное ишемическое прекондиционирование, ЕРО - рекомбинантный эритропоэтин подкожно в субэритростимулирующей дозе 50 МЕ/кг; мИКЛ - моделирование изолированного кожного лоскута на питающей ножке (на 2-е сутки эксперимента); показатель выживаемости кожного лоскута оценивали на пятые сутки после его моделирования (6-е сутки эксперимента), обозначен процент выжившей ткани.

Цитопротекторный эффект дистантного ишемического прекондиционирования в данной модели мы обусловливаем запуском каскадных реакций, ведущих к снижению уровня энергопотребления прекондиционированных тканей и активации молекулярных механизмов цитопротекции. Отсутствие достоверных отличий между показателями в опытных группах не опровергло наших предположений о способности эритропоэтина инициировать процесс прекондиционирования и привело к необходимости исследования других эффектов.

Прекондиционирование индуцирует экспрессию генных программ, вовлечённых не только в цитопротекцию, но и в восстановительные механизмы,

основным из которых является ангиогенез. В связи с этим в дальнейшем исследовании нами изучено влияние дистантного ишемического прекондициониро-вания и рекомбинантного эритропоэтина на неоваскулогенез.

2. Комплексная оценка влияния дистантного ишемического прекон-диционирования и рекомбинантного эритропоэтина на неоваскулогенез в ишемизированной мышце голени крысы с использованием результатов лазерной доиплеровской флоуметрии и морфологического исследования.

Среднее значение уровня микроциркуляции в интактной мышце голени крыс составляет 526±34 ПЕ. Результат не имеет значимых отличий от результатов, полученных другими авторами, применявшими данную модель (Артюшко-ва Е.Б., 2008). При гистологическом исследовании мышц голени интактных крыс миоциты образуют плотные пучки, в толще которых проходят полнокровные венулы и артериолы, содержащие единичные эритроциты. Просветы сосудов широкие, эндотелиальные клетки без патологических изменений.

После моделирования ишемии мышц голени уровень микроциркуляции в них резко снижается, восстановление его начинается лишь после 14 суток, однако до 90 суток остается достоверно ниже значения, зарегистрированного в группе интактных животных (рис. 2).

600 500 400 300 200 100 о

Рис. 2. Динамика уровня микроциркуляции на разных сроках после моделирования ишемии мышц голени крыс контрольной серии в перфузионных единицах.

Примечание. * - р<0,05 при сравнении с показателями в группе интактных животных.

Учитывая результаты, полученные при анализе возможности компенсаторного восстановления регионарного кровообращения в применяемой нами модели, а также литературные данные, как наиболее информативные расценены 28-е сутки, 21-е рассматривались как промежуточные.

На 21-е сутки ишемизированная мышца макроскопически выглядела набухшей, в ней имелись крупные участки серовато-коричневатого цвета. Данные участки гистологически представляли собой крупные очаги организующегося некроза с резорбцией некротических волокон и разрастанием грануляционной ткани. На 28-е сутки цвет мышцы нормапизовывался, но она выглядела несколько гипотрофичной. При гистологическом исследовании участки резорби-руемого некроза были значительно мельче, а в микроциркуляторном русле отмечались полнокровие и новообразование единичных капилляров. Вблизи участков некроза встречались пучки атрофированных мышечных волокон.

В группе ложнооперированных животных среднее значение уровня микроциркуляции в мышцах правой голени составляет на 21-е сутки 527±10 ПЕ, на 28-е сутки - 532±33 ПЕ. На всех сроках результаты лазерной допплеровской флоуметрии не имеют достоверных отличий от показателей в группе интактных животных 526±34 ПЕ (р=0,19; р=0,43 соответственно), при гистологическом исследовании отличий от строения интактных мышц также не выявлено, поэтому при последующем изложении для удобства мы будем называть их интактными.

При оценке уровня микроциркуляции в опытных группах было выявлено, что проведение дистантного ишемического прекондиционирования и введение рекомбинантного эритропоэтина способствуют эффективному и равнозначному повышению уровня регионарного кровотока в ишемизированной мышце голени крыс (рис. 3). Показатели ЛДФ в этих группах достоверно выше таковых в контрольной группе на соответствующем сроке (ДИП: 21-е сутки - р<0,05, 28-е сутки - р<0,05; ЕРО: 21-е сутки - р=0,00065, 28-е сутки - р<0,05). Достоверных отличий между показателями в названных группах выявлено не было (21-е сутки - р=0,7; 28-е сутки - р=0,08). Сочетанное применение дистантного ишемического прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина привело к увеличению показателей ЛДФ до значений, достоверно отличающихся от таковых в контрольной группе на соответствующем сроке (21-е сутки - р=0,00003; 28-е сутки - р<0,05) и не имеющих достоверных отличий от показателей в группе с применением ДИП (21-е сутки - р=0,53; 28-е сутки - р=0,50) и ЕРО (21-е сутки - р=0,62; 28-е сутки - р=0,34) (рис. 3). Уровень микроциркуляции во всех опытных группах на 21-е сутки приближается к показателям в группе интактных животных, а на 28-е сутки значительно выше (рис. 3).

Рис. 3. Изучение влияния дистантного ишемического прекондициониро-вания и рекомбинантного эритропоэтина на неоваскулогенез. Динамика уровня микроциркуляции в ишемизированной мышце голени крыс в перфузионных единицах.

Примечание. * - р<0,05 при сравнении с контрольной группой; здесь и везде далее: ДИП - дистантное ишемическое прекондиционирование перед моделированием патологии, на третьи и пятые сутки эксперимента; ЕРО - реком-бинантвый эритропоэтин подкожно в дозе 50 МЕ/кг на первые (за 12 часов до моделирования патологии), третьи и пятые сутки эксперимента.

То есть можно говорить о том, что компенсаторное восстановление регионарного кровообращения в ишемизированных мышцах животных опытных групп произошло до 28-х суток эксперимента. В контрольной серии восстановление исходного значения наблюдается значительно позже (в срок до 3 месяцев).

При макроскопической оценке мышцы ишемизированной голени крыс после проведения дистантного ишемического прекондиционирования на 21-е и 28-е сутки ишемии не отличались по цвету и виду от интактных. При гистологическом исследовании некротические изменения в них не обнаруживались. Однако в некоторых участках встречались мелкие очаги атрофирующихся мио-цитов с пролиферацией клеток перимизия.

При большом увеличении в ишемизированных мышцах голени отмечалось усиленное новообразование капилляров, более выраженное на 28-е сутки ишемии (рис. 4, 5).

Рис. 4. Морфологическое исследование ишемизированных мышц голени крыс. Животное из группы с применением дистантного ишемического прекон-диционирования, 21-е сутки ишемии. Новообразующийся капилляр с пролифе-рирующим эндотелием в ишемизированной мышце. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. х 280.

Рис. 5. Морфологическое исследование ишемизированных мышц голени крыс. Животное из группы с применением дистантного ишемического прекон-диционирования, 28-е сутки ишемии. Новообразовавшийся и функционирующий полнокровный капилляр в ишемизированной мышце. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. х 280.

Гистологическое исследование ишемизированных мышц других опытных групп не выявило достоверных отличий в динамике морфологических изменений по сравнению с данной группой.

Следовательно, в модели ишемии мышц голени дистантное ишемическое прекондиционирование и рекомбинантный эритропоэтин оказывают равноценное стимулирующее влияние на неоваскулогенез.

Для подтверждения возможности применения рекомбинантного эритро-поэтина для фармакологического прекондиционирования нами проведено исследование роли основных звеньев механизма прекондиционирования в реализации цитопротекторного и неоваскулогенного эффектов рекомбинантного эри-тропоэтина.

3. Определение роли АТФ-зависимых калиевых каналов в механизме реализации цитопротекторного эффекта дистантного ишемического прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина.

Наиболее вероятным эффекториым звеном цитопротекции в феномене ишемического прекондиционирования являются АТФ-зависимые калиевые каналы (Бокерия Л.А., 2007; Pain Т., Yang Х-М., Critz С. et а)., 2000; Javadov S., Clarke S., Das M., 2003). Реализацию их защитного потенциала связывают с гиперполяризацией мембраны вследствие их открытия, активацией системы оксида азота и другими механизмами (Gross G., Fryer R., 2000). Эти каналы обнаружены в клетках многих органов, в том числе сосудистой сети. Первоначально их активность была выявлена на уровне сарколеммальной мембраны, а позднее на митохондриальном уровне. Поскольку большинство исследователей склонны считать, что все их изоформы способны принимать участие в реализации защитного эффекта прекондиционирования, в эксперименте мы применяли неселективный блокатор АТФ-зависимых калиевых каналов глибенкламид.

Исследование проводили на модели изолированного кожного лоскута на питающей ножке. Введение препарата животным контрольной группы (без лечения) не повлияло на выживаемость лоскута (р>0,05). Введение его перед проведением дистантного ишемического прекондиционирования способствовало уменьшению площади выжившей ткани изолированного кожного лоскута на питающей ножке до значения 1,62±0,02 см2, не имеющего достоверных отличий от показателя в контрольной группе (1,59±0,03 см2) (р=0,43145), аналогичный результат получен при введении глибенкламида животным перед применением рекомбинантного эритропоэтина - 1,60±0,06 см2 (р=1,0) (рис. 6). Блокада АТФ-зависимых калиевых каналов глибенкламидом полностью нивелировала цитопротекторный эффект как дистантного ишемического прекондиционирования, так и рекомбинантного эритропоэтина. Результат говорит о том, что основным эффекторным звеном в механизме реализации цитопротекторного действия и в том и в другом случае являются АТФ-зависимые калиевые каналы.

Рис. 6. Определение роли АТФ-зависимых калиевых каналов в реализации цитопротекторного эффекта дистантного ишемического прекондициониро-вания и рекомбинантного эритропоэтина. Показатели выживаемости изолированного кожного лоскута на питающей ножке на 5-е сутки после его моделирования.

Примечание. * - р<0,05 при сравнении с контрольной группой; Глиб -глибенкламид в дозе 5 мг/кг веса (растворитель диметилсульфоксид) за 30 ми- [ нут до прекондиционирования и/или введения ЕРО.

4. Исследование роли эндотелиальной NO-синтазы в механизме цитопротекторного и неоваскулогснного эффектов рекомбинантного эритропо-эгина.

В развитии ишемического прекондиционирования имеют значение две различные изоформы NO-синтаз (NOS): кальцийзависимая эндотелиальная (eNOS), участвующая в ранних фазах ИПК, и кальцийнезависимая индуцибель- | пая (iNOS), генерирующая оксид азота поздней защиты (Downey J.M., 2007).

Авторы «гипотезы оксида азота» считают, что именно повышенная активность iNOS, регистрируемая через 24-72 ч после инициируемого ишемиче- ! ского эпизода, является ответственной за реализацию эффектов отсроченной фазы ИПК (Bolli R., 1998).

Исследование роли эндотелиальной NO-синтазы в реализации цитопротекторного эффекта рекомбинантного эритропоэтина проводили на модели изолированного кожного лоскута на питающей ножке.

Введение Ь-ЫАМЕ животным контрольной группы привело к достоверному уменьшению площади выжившей ткани лоскута (0,92±0,05 см2) по сравнению с результатом в контрольной группе (1,59±0,03 см2) (р<0,05). Данный факт еще раз доказывает немаловажную позитивную роль оксида азота в реализации естественных механизмов защиты от ишемии. Блокада эндотелиальной ]М0-синтазы у животных, которым вводился рекомбинантный эритропоэтин способствовала уменьшению показателя выживаемости изолированного кожного лоскута на питающей ножке, зарегистрированного нами ранее, до значения (1,б8±0,0б см2), не имеющего достоверных отличий от показателя в контрольной группе (1,59±0,03 см2) (р=0,19249). Результат, полученный в данной экспериментальной группе, свидетельствует о существенной роли эндотелиальной ЫО-синтазы в реализации цитопротекторного эффекта рекомбинантного эри-тропоэтина. Однако можно отметить, что в группе животных, которым на фоне блокады эндотелиальной ЫО-синтазы вводился рекомбинантный эритропоэтин, показатель выживаемости достоверно выше, чем в группе животных, которым блокада эндотелиальной КЮ-синтазы моделировалась без лечения (р<0,05) (рис. 7).

70% т"

60% -И

50% 40% 30% г 20% )

10% 0%

Рис. 7. Исследование роли эндотелиальной ЫО-синтазы в реализации цитопротекторного эффекта рекомбинантного эритропоэтина. Показатели выживаемости изолированного кожного лоскута на питающей ножке на 5-е сутки после его моделирования.

Примечание. * - р<0,05 при сравнении с контрольной группой; здесь и везде далее: Ь-КАМЕ - Ы-нитро-Ь-аргинина метиловый эфир ежедневно внут-рибрюшинно, в дозе 25 мг/кг/сут.

Такой результат можно объяснить тем, что активация АТФ-зависимых калиевых каналов осуществляется не только нитритэргической системой, но в некоторой степени протеинкиназами. В литературе есть сведения о возможности активации протеинкиназ эритропоэтином (Chong Z.Z., Kang J.Q., Maiese К., 2002; Shi Y., Rafiee P., Su J. et al., 2004). Нельзя исключать возможность прямого влияния эритропоэтина на АТФ-зависимые калиевые каналы.

Исследование роли эндотелиальной NO-синтазы в реализации неоваску-логенного эффекта рекомбинантного эритропоэтина проводили на модели ишемии мышц голени крыс. Результаты ЛДФ представлены на рис. 8.

Рис. 8. Исследование роли эндотелиальной N0 синтазы в реализации не-оваскулогенного эффекта рекомбинантного эритропоэтина. Динамика уровня микроциркуляции в ишемизированной мышце голени крыс в перфузионных единицах.

Примечание. * - р<0,05 при сравнении с контрольной группой.

На 21-е сутки в группе, где животным моделиройали блокаду эндотелиальной >Ю-синтазы, уровень микроциркуляции в ишемизированной мышце составил 351±24 ПЕ, на 28-е - 427±13 ПЕ. В данной группе мы не получили ожидаемого достоверного снижения уровня микроциркуляции в сравнении с показателями в контрольной группе на соответствующих сроках (21-е сутки -р=0,45; 28-е сутки - р=0,15), что очевидно связано с вовлечением в механизм самовосстановления ишемизированной мышцы не эндотелиальной, а индуци-бельной МО-синтазы, синтез которой программируется в ответ на ишемию.

При проведении ЛДФ на 21-е сутки в группе животных, которым осуществляли введение рекомбинантного эритропоэтина на фоне блокады эндотели-альной NO-синтазы, уровень микроциркуляции в ишемизированной мышце -357±13 ПЕ, на 28-е сутки - 682±43 ПЕ. Введение L-NAME не отменило неоан-гиогенного эффекта рекомбинантного эритропоэтина, наблюдаемого нами ранее. Полученный результат свидетельствует о незадействованпости в механизме стимуляции пеоваскулогенеза рекомбинантным эритропоэтином эндотели-альной NO-синтазы. Наиболее вероятна здесь роль индуцибельной NO-синтазы. Причиной небольшого снижения уровня микроциркуляции, очевидно, является то, что в данной модели имеет место и процесс цитопротекции, который нивелируется при блокаде эндотелиальной NO-синтазы.

Наше предположение подтвердилось при анализе результатов гистологического исследования. При введении рекомбинантного эритропоэтина на фоне блокады эндотелиальной NO-синтазы у 3 крыс из 10 в мышце были выявлены небольшие участки некроза с интенсивными репаративными процессами. У остальных животных на 21-е сутки и у всех животных на 28-е сутки ишемии очагов некроза не обнаружено, отмечается активный капиллярогенез.

Таким образом, в ходе проведенного исследования было выявлено, что дистантное ишемическое прекондиционирование и рекомбинантный эритропо-этин в субэритростимулирующей дозе обладают в равной степени выраженными и цитопротекторным эффектом на модели изолированного кожного лоскута на питающей ножке, и способностью стимулировать неоваскулогенез в ишемизированной мышце голени крыс. АТФ-зависимые калиевые каналы являются эффекторным механизмом в реализации цитопротекторного действия как дистантного ишемического прекондиционирования, так и рекомбинантного эритропоэтина. Оксид азота играет важную роль в реализации цитопротекторного и »еоваскулогенного эффектов рекомбинантного эритропоэтина. И в том и другом случае синтез его осуществляется за счет активации индуцибельной NO-синтазы, однако в механизме цитопротекции большое значение имеет эн-дотелиальная NO-синтаза, выполняющая, по всей вероятности, триггерную роль. В процессе стимуляции неоваскулогенеза эндотелиальная NO-синтаза не задействована. Неогенез сосудов запускается во вторую фазу прекондиционирования, обусловленную фенотипическим репрограммингом (Bernaudin M., Tang Y., Reilly M., Petit E., 2002; Stenzel-Poore M.P., Stevens S.L., Xiong Z. et al„ 2003; Tang Y., Pacary E., Freret T. et al., 2006). Последний происходит в результате влияния протеинкиназ на ядро клетки. Доказанная способность эритропоэтина активировать протеинкиназы (Chong Z.Z., Kang J.Q., Maiese К., 2002; Shi Y., Rafiee P., Su J. et al., 2004) позволяет предположить их триггерную роль в процессе стимуляции пеоваскулогенеза рекомбинантным эритропоэтином.

Фрагмент механизма ишемичеекого прекондиционирования и гипотетическая роль эритропоэтина в нем представлены на рис. 9.

Кратковременный ишемический эпизод

Рис. 9. Фрагмент механизма ишемичеекого прекондиционирования и гипотетическая роль эритропоэтина в нем.

Примечание. ЕРО - эритропоэтин; К+АТФ каналы - АТФ-зависимые калиевые каналы; eNOS - эндотелиальная NO-синтаза; ¡NOS - индуцибельная NO-синтаза; L-NAME - N-нитро-Ь-аргинина метиловый эфир; N0 - оксид азота; РФК - реактивные формы кислорода; ЦОГ-2 - циклооксигеназа-2.

Из этого следует, что рекомбинантный эритропоэтин в субэритростиму-лирующей дозе можно рекомендовать как препарат для фармакологического прекондиционирования.

Результаты, полученные в проведенных нами экспериментальных исследованиях, позволяют проводить дальнейшее изучение возможности применения дистантного ишемичеекого прекондиционирования и фармакологического прекондиционирования рекомбинантным эритропоэтином в субэритростиму-лирующей дозе для профилактики и коррекции ишемических повреждений тканей в хирургии.

ВЫВОДЫ

1. Дистантное ишемическое прекондиционирование, осуществляемое 10-минутным пережатием бедренной артерии с последующей 30-минутной ре-

перфузией непосредственно перед моделированием патологии, на третьи и пятые сутки эксперимента, увеличивает выживаемость изолированного кожного лоскута на питающей ножке в 1,5 раза и стимулирует неоваскулогенез в ише-мизированной мышце голени контрлатеральной конечности крыс, увеличивая показатель микроциркуляции на 28-е сутки ишемии в 2 раза.

2. Рекомбинантный эритропоэтин, вводимый подкожно в субэритрости-мулирующей дозе 50 МЕ/кг на первые (за 12 часов до моделирования патологии), третьи и пятые сутки эксперимента, увеличивает выживаемость изолированного кожного лоскута на питающей ножке в 1,6 раза и стимулирует неоваскулогенез в ишемизированной мышце голени крыс, увеличивая показатель микроциркуляции на 28-е сутки ишемии в 2 раза.

3. Сочетанное применение дистантного прекондиционирования и реком-бинантного эритропоэтина увеличивает выживаемость изолированного кожного лоскута на питающей ножке в 1,7 раза и стимулирует неоваскулогенез в ишемизированной мышце голени крыс, увеличивая показатель микроциркуляции на 28-е сутки ишемии в 2 раза.

4. АТФ-зависимые калиевые каналы являются эффекторным звеном в механизме цитопротекторного действия как дистантного ишемического прекондиционирования, так и рекомбинантного эритропоэтина на модели изолированного кожного лоскута на питающей ножке.

5. Блокада эндотелиальной КО-синтазы нивелирует цитопротекторный эффект рекомбинантного эритропоэтина на модели изолированного кожного лоскута на питающей ножке, не оказывая влияния на возможность стимуляции им неоваскулогенеза в ишемизированной мышце голени крыс.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Экспериментально обоснованные данные о возможности применения дистантного ишемического прекондиционирования и фармакологического прекондиционирования рекомбинантным эритропоэтином в субэритростимули-рующей дозе для оптимизации выживаемости ишемизированных тканей и стимуляции неоваскулогенеза могут использоваться в учебном процессе на кафедрах фармакологии и хирургии медицинских вузов.

2. Провести доклинические исследования рекомбинантного эритропоэтина в субэритростимулирующей дозе 50 МЕ/кг на первые, третьи и пятые сутки эксперимента как препарата для фармакологического прекондиционирования с последующей рекомендацией клинических испытаний у больных хирургического профиля.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние дистантного прекондиционирования на выживаемость ишемизнрованных тканей / И.М. Колесник, М.В. Покровский, В.А. Лаза-реико и др. // Вестник экспериментальной и клинической хирургии. -2010. - Т. 3, № 3. - С. 214-217.

2. Влияние рекомбинантного эритропоэтина на эндотелиальную дисфункцию / И.М. Колесник, М.В. Покровский М.В. Корокин и др. // Межвузовская научная конференция, посвященная памяти профессора Владислава Васильевича Пичугина и 75-летию КГМУ «Актуальные вопросы фармакологии и фармации» (25 декабря 2009 г., г. Курск). - Курск: КГМУ, 2009. - С. 207-208.

3. Дистантное и фармакологическое прекондиционированне - новые возможности стимуляции иеоваскулогенеза / И.М. Колесник, М.В. Покровский, О.С. Гудырев и др. // Кубанский научный медицинский вестник. -2010.-№6.-С. 56-58.

4. Колесник, И.М. Экспериментальное исследование некоторых негемо-поэтических свойств рекомбинантного эритропоэтина / И.М. Колесник // III Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Биотехнология и биомедицинская инженерия» (7-8 июня 2010 г., г. Курск). -Курск, 2010.-С. 198-200.

5. Колесник, И.М. Эндотелиопротективные свойства рекомбинантного эритропоэтина / И.М. Колесник // III Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Биотехнология и биомедицинская инженерия» (7-8 июня 2010 г., г. Курск). - Курск, 2010. - С. 200-203.

6. Колесник, И.М. Фармакологическое прекондиционированне эри-тропоэтином - новые возможности оптимизации выживаемости ишемизнрованных тканей / И.М. Колесник, М.В. Покровский, В.А. Лазаренко // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». - 2010. -№3.-С. 32-36.

7. Оценка неоангиогенного эффекта L-аргинина и его сочетания с плазмидами гена VEGF при экспериментальной ишемии конечности / Д.В. Пашков, М.В, Покровский, И.М. Колесник и др. // Кубанский научный медицинский вестник. - 2009. - № 5. - С. 102-106.

8. Фармакологическая коррекция L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота рекомбинантным эритропоэтином / Л.В. Корокина, И.М. Колесник, М.В, Покровский и др. // Кубанский научный медицинский вестник. - 2009. - № 9. - С. 66-69.

9. Эндотелиопротективные эффекты рекомбинантного эритропоэтина / И.М. Колесник, Л.В. Корокина, А.Е. Королев и др. // XVII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» (12-16 апреля 2010 г., г. Москва). -М„ 2010.-С. 644.

Лицензия ЛР № 020862 от 30.04.99 г. Сдано в набор 12.11.2010 г. Подписано в печать 15.11.2010 г. Формат 30х42'/8. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 131 "А" Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.

Актуальность исследования

Профилактика и коррекция последствий локальной ишемии, развивающейся при различных хирургических вмешательствах, является актуальной проблемой современной медицины. В связи с этим, высок интерес к изучению ишемического прекондиционирования, суть которого состоит в том, что короткие подпороговые периоды ишемии активируют эндогенные защитные механизмы, снижающие степень повреждения клеток в результате последующего продленного ишемического эпизода. Феномен был открыт и описан С.Е. Murry и соавт. в 1986 г., которые впервые продемонстрировали, что четыре коротких эпизода коронароокклюзии, перемежающиеся пятиминутными периодами реперфузии перед сорокаминутной коронароокклюзией, уменьшали размер инфаркта миокарда почти в 2 раза [173].

Исследования последних лет показали, что одного эпизода преходящей ишемии достаточно, чтобы вызвать прекондиционирование [107, 132, 198, 199]. Защитные свойства проявляются уже через 5 минут реперфузии. Тогда , наступает первая защитная фаза. Продолжительность её — 1-2 часа. Затем эффект исчезает и возобновляется в промежуток времени от 24 до 96 часов. Это вторая защитная фаза [9, 96, 108].

В 1993 году было открыто дистантное ишемическое прекондиционирование, суть которого состоит в том, что кратковременные эпизоды ишемии одного органа (почки, брыжейки, нижней конечности) повышают устойчивость других органов к тяжелым ишемическим повреждениям [86, 194]. Открытие подтвердило предположение о том, что эффект прекондиционирования реализуется не локально, а представляет систему многоуровневого иерархического дублирования, включающую нейрогенный компонент, гуморальный и внутриклеточный [102, 138, 197].

Последнее привело к необходимости поиска гуморального агента, выделяющегося в ответ на ишемию и способного' при экзогенном введении инициировать процесс без ишемии. С клинической точки зрения прекондиционирование фармакологическими средствами выглядит предпочтительнее, так как технологически проще и лишено потенциальной опасности ишемических эпизодов для патологически измененных тканей [206]. Еще больший интерес для клинического применения представляет возможность дозировать введение фармакологических средств, что делает управляемым временной интервал периода толерантности к ишемии.

Наиболее перспективным для изучения с нашей точки зрения является эритропоэтин. Это гликопротеиновый гормон, главным фактором, регулирующим его продукцию, является гипоксия, [114, 127, 128]. Период полувыведения эритропоэтина значительно выше, чем у других гуморальных агентов прекондиционирования (аденозин, брадикинин, опиоиды), следовательно, временной интервал периода толерантности к ишемии, инициируемый им, должен быть существенно шире. Кроме того, открытие рецепторов эритропоэтина на мезангиальных клетках и в миокарде, фибробластах мышечной ткани и нейронах позволило изучать неэритропоэтические функции гормона [25, 123, 125, 126].

Наиболее изучены эффекты прекондиционирования на сердце и головной мозг. Однако предполагаемый механизм реализации феномена указывает на возможность его универсального использования в хирургии для защиты органов и тканей в условиях нарушения кровообращения и, возможно, стимуляции неоваскулогенеза.

Цель исследования:

Установить влияние дистантного ишемического прекондиционирования и фармакологического прекондиционирования рекомбинантным эритропоэтином на выживаемость изолированного кожного лоскута на питающей ножке и неоваскулогенез в ишемизированной скелетной мышце крыс.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние дистантного ишемического прекондиционирования на выживаемость изолированного кожного лоскута на питающей ножке и неоваскулогенез в ишемизированной мышце голени крыс;

2. Изучить влияние рекомбинантного эритропоэтина в субэритростимулирующей дозе на выживаемость изолированного кожного лоскута на питающей ножке и неоваскулогенез в ишемизированной мышце голени крыс;

3. Оценить сочетанное влияние дистантного ишемического прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина в субэритростимулирующей дозе на выживаемость изолированного кожного лоскута на питающей ножке и неоваскулогенез в ишемизированной мышце голени крыс;

4. Определить роль АТФ зависимых калиевых каналов в механизме реализации цитопротекторного эффекта дистантного ишемического прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина; ,

5. Определить роль эндотелиальной N0 синтазы в механизме реализации цитопротекторного и неоваскулогенного эффектов рекомбинантного эритропоэтина.

Научная новизна исследования

В работе впервые предложены эффективные способы улучшения выживаемости ишемизированных тканей и стимуляции неоваскулогенеза в ишемизированной скелетной мышце с помощью дистантного ишемического прекондиционирования и фармакологического прекондиционирования рекомбинантным эритропоэтином в субэритростимулирующей дозе.

Впервые показано, что влияние рекомбинантного эритропоэтина на выживаемость ишемизированных тканей и неоваскулогенез аналогично влиянию дистантного ишемического прекондиционирования.

АТФ зависимые калиевые каналы являются эффекторным звеном в механизме реализации цитопротекторного действия дистантного ишемического прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина.

Эндотелиальная N0 синтаза задействована в механизме реализации цитопротекторного эффекта рекомбинантного эритропоэтина, блокада ее не влияет на возможность стимуляции им неоваскулогенеза.

Научная новизна подтверждается получением патента на полезную модель РФ № 97615 от 20.09.2010 г. «Устройство для дистантного прекондиционирования»; положительного решения о выдаче патента РФ на изобретение по заявке №2009140096/14(056915) «Способ коррекции эндотелиальной дисфункции рекомбинантным эритропоэтином при Ь-ЫАМЕ индуцированном дефиците оксида азота» от 03.08.2010 г.

Практическая значимость

В работе экспериментально обоснована эффективность применения дистантного ишемического прекондиционирования для профилактики и коррекции ишемических повреждений тканей, развивающихся при различных хирургических вмешательствах, а также возможность инициации процесса прекондиционирования рекомбинантным эритропоэтином.

Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные клинические испытания дистантного прекондиционирования и фармакологического прекондиционирования рекомбинантным эритропоэтином в субэритростимулирующей дозе для профилактики и коррекции ишемических повреждений тканей.

Экспериментально обоснованная возможность применения рекомбинантного эритропоэтина для фармакологического прекондиционирования позволяет проводить экспериментальное изучение временного параметра инициируемого им периода толерантности к ишемии и возможностей управления им.

Внедрение результатов научного исследования

Результаты диссертационного исследования используются в учебном процессе и научно-исследовательской работе ряда кафедр Курского государственного медицинского университета, Российского государственного медицинского университета им. Н.И. Пирогова, Белгородского государственного университета, Воронежской государственной медицинской академии им. H.H. Бурденко.

Апробация работы

Материалы работы были представлены на межвузовской научной конференции, посвященной памяти профессора Владислава Васильевича Пичугина и 75-летию КГМУ «Актуальные вопросы фармакологии и фармации» (Курск 2009), 75 юбилейной итоговой Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых «Молодежная наука и современность» (Курск, 2010), Всероссийской научно-практической конференции «Биомедицинская инженерия и биотехнология» (Курск, 2010), Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2010).

Апробация диссертации проведена на расширенном научно-практическом заседании кафедр фармакологии; хирургических болезней ФПО; хирургических болезней №1; хирургических болезней №2; общей хирургии; оперативной хирургии и топографической анатомии; онкологии; травматологии, ортопедии и военно-полевой хирургии; клинической фармакологии; инфекционных болезней и эпидемиологии; внутренних болезней ФПО; акушерства и гинекологии ФПО; акушерства и гинекологии; патофизиологии; микробиологии, вирусологии и иммунологии; анатомии; биоорганической химии; общей химии; кафедры мобилизационной подготовки, здравоохранения и медицины катастроф; НИИ Экологической медицины ГОУ ВПО КГМУ Росздрава (Курск, 2010).

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 5 из них - в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.

Положения, выносимые на защиту:

1. Дистантное ишемическое прекондиционирование и рекомбинантный эритропоэтин увеличивают выживаемость изолированного кожного лоскута на питающей ножке;

2. Дистантное ишемическое прекондиционирование и рекомбинантный эритропоэтин стимулируют неоваскулогенез в ишемизированной мышце голени крыс;

3. Блокада АТФ зависимых калиевых каналов глибенкламидом полностью нивелирует цитопротекторный эффект дистантного ишемического прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина на модели изолированного кожного лоскута на питающей ножке;

4. Блокада эндотелиальной N0 синтазы нивелирует цитопротекторный эффект рекомбинантного эритропоэтина, не оказывая влияния на возможность стимуляции им неоваскулогенеза.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего

выводы

1. Дистантное ишемическое прекондиционирование, осуществляемое 10 минутным пережатием бедренной артерии с последующей 30 минутной реперфузией'непосредственно перед моделированием патологии, на третьи и пятые сутки эксперимента увеличивает выживаемость изолированного кожного лоскута на питающей ножке в 1,5 раз и стимулирует неоваскулогенез в ишемизированной мышце голени контрлатеральной конечности крыс, увеличивая показатель микроциркуляции на 28 сутки ишемии в 2 раза.

2. Рекомбинантный эритропоэтин, вводимый подкожно в субэритростимулирующей дозе 50 МЕ/кг на первые (за 12 часов до моделирования патологии), третьи и пятые сутки эксперимента, увеличивает выживаемость изолированного кожного лоскута на питающей ножке в 1,6 раз и стимулирует неоваскулогенез в ишемизированной мышце голени крыс, увеличивая показатель микроциркуляции на 28 сутки ишемии в 2 раза.

3. Сочетанное применение дистантного прекондиционировния и рекомбинантного эритропоэтина увеличивает выживаемость изолированного кожного лоскута на- питающей ножке в 1,7 раза и стимулирует неоваскулогенез в ишемизированной мышце голени крыс, увеличивая показатель микроциркуляции на 28 сутки ишемии в 2 раза.

4. АТФ зависимые калиевые каналы являются эффекторным звеном в механизме цитопротекторного действия как дистантного ишемического прекондиционирования, так и рекомбинантного эритропоэтина на модели изолированного кожного лоскута на питающей ножке.

5. Блокада эндотелиальной N0 синтазы нивелирует цитопротекторный эффект рекомбинантного эритропоэтина на модели изолированного кожного лоскута на питающей ножке, не оказывая влияния на возможность стимуляции им неоваскулогенеза в ишемизированной мышце голени крыс.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Экспериментально обоснованные данные о возможности применения дистантного ишемического прекондиционирования и фармакологического прекондиционирования рекомбинантным эритропоэтином в субэритростимулирующей дозе для оптимизации выживаемости ишемизированных тканей и стимуляции неоваскулогенеза могут использоваться в учебном процессе на кафедрах фармакологии и хирургии медицинских вузов.

2. Провести доклинические исследования рекомбинантного эритропоэтина в субэритростимулирующей дозе 50 МЕ/кг на первые, третьи и пятые сутки эксперимента как препарата для фармакологического прекондиционирования с последующей рекомендацией клинических испытаний у больных хирургического профиля.