Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Дистантное и фармакологическое прекондиционирование с использованием эритропоэтина и тадалафила при экспериментальной ишемии почек

На правах рукописи

ДОЛЖИКОВА Ирина Николаевна

ДИСТАНТНОЕ И ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ПРЕКОНДИЦИОНИРОВАНИЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭРИТРОПОЭТИНА И ТАДАЛАФИЛА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИШЕМИИ ПОЧЕК

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

4 ДПР 2013

Белгород - 2013

005051183

Работа выполнена в Федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» Министерства образования и науки Российской Федерации

Научный руководитель Покровский Михаил Владимирович,

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты: Артюшкова Елена Борисовна,

доктор биологических наук, ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, директор НИИ экологической медицины

Резников Константин Михайлович,

заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Воронежская государственная медицинская академия имени H.H. Бурденко» Министерства здравоохранения Российской Федерации, зав. кафедрой фармакологии

Ведущая организация Открытое акционерное общество

«Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ» (ОАО «ВНЦ БАВ»)

Защита диссертации состоится года в « часов на

заседании совета по защите диссертаций на соискание учёной степени кандидата наук, на соискание учёной степени доктора наук Д 212.015.13 при ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» по адресу: 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет».

Автореферат разослан «/У »¿/Lttf/Ut

Ученый секретарь

совета по защите диссертаций на соискание учёной степени кандидата наук, на соискание учёной степени доктора наук, доктор биологических наук

В.И. Кочкаров

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ишемические повреждения тканей и органов являются одним из основных патогенетических механизмов, первично или вторично лежащим в основе многих заболеваний и патологических процессов. Помимо этого, медико-биологические аспекты проблемы заключаются также в том, что сами лечебно-диагностические вмешательства могут быть связаны с временным выключением кровотока в органах. Это касается реконструктивной и трансплантационной хирургии, экономных удалений частей органов. К числу последних относятся почки, на которых также выполняются вмешательства, связанные с частичным или полным прекращением кровотока различной продолжительности.

При ишемии запускается сложный каскад биохимических изменений в клетках и тканях, заканчивающийся различной степенью гибели структур [Би-ленко М.В., 1989; Крыжановский Г.Н., 2001; Капелька В.И., 2005]. Поиски способов профилактики и коррекции ишемических повреждений, повышения резистентности биологических структур к ишемии привели к раскрытию целого ряда механизмов возможной клеточной и тканевой протекции. К их числу относится феномен прекондиционирования (ишемического прекондиционирования), имеющий уже 25-летнюю историю [Murry С. Е. и соавт., 1986]. Было установлено, что ишемия, создаваемая в других органах (дистантное ишемическое прекон-диционирование) в определенных временных режимах, оказывает протективное действие на миокард, подвергающийся длительному действию циркуляторной гипоксии. По мере расшифровки механизмов дистантного ишемического прекондиционирования (ДИП), закономерно возникло направление исследований, связанное с управлением ими посредством фармакологических агентов, влияющих на различные звенья создания ДИП. С практической точки зрения данный подход является наиболее перспективным, так как основан на контролируемых воздействиях, позволяет влиять на различные звенья прекондиционирования с учетом особенностей отдельных тканей и органов [Бокерия JI.A., Чичерин И.Н., 2007; Колесник И.М., 2010; Dirnagl U. at al., 2009]. Ведущее значение в механизмах дистантного и фармакологического прекондиционирования отводится системе метаболизма оксида азота (NO), а также факторам, влияющим на неоангиогенез [Покровский В.И., 2005; Bolli R., 2001; Jugdutt B.I., 2003; Kunz А., 2007]. Однако до настоящего времени нуждаются в исследовании изменения внутриорганных метаболических систем, ответственных за прекондиционирующие эффекты дистантной ишемии и фармакологических агентов.

Почки занимают особое место, так как целый ряд внутрипочечных гуморальных механизмов (компоненты ренин-ангиотензиновой системы, простаглан-дины, ион- и водно-зависимые механизмы) играет ведущую роль в регуляции локальной и системной гемодинамики и, в свою очередь, зависит от перфузии почечной паренхимы. Особый интерес представляет изучение связей системы эндо-телиальной NO-синтазы с эндотелиопротективными и проангиогенными факторами, к числу которых относится эндоглин (CD 105). Одним из ключевых факторов, участвующих в функционировании системы ренин-ангиотензин - простаг-ландины в почках, является циклооксигеназа второго типа (СОХ-2), активность

которой интегрально отражает состояние механизмов регуляции внутрипочечно-го и системного кровотока.

Анализ литературы свидетельствует, что в исследованиях отечественных авторов акценты в изучении явления прекондиционирования в профилактике ишемических-реперфузионных поражений внутренних органов пока смещены в область кардиологии. Работы, посвященные изучению механизмов ишемического и фармакологического прекондиционирования для обеспечения протекции почечных структур, единичные. При этом имеющиеся литературные данные свидетельствуют о перспективности исследований фармакологических свойств ингибитора фосфодиэстеразы-5 тадалафила и эритропоэтина как прекондиционирую-щих средств [Покровская Т.Г. и соавт., 2010]. В связи с указанными аспектами проблемы нами сформулированы цель и задачи исследования.

Цель исследования. Провести оценку и определить возможные механизмы протективных эффектов ингибитора фосфодиэстеразы-5 тадалафила, эритропоэтина, дистантного ишемического прекондиционирования и их комбинаций при ишемическом-реперфузионном повреждении почек в эксперименте.

Задачи исследования.

1. Изучить влияние дистантного ишемического прекондиционирования, фармакологического прекондиционирования тадалафилом и эритропоэтином и их комбинаций на структурные изменения почек после ишемии-реперфузии в различные сроки.

2. Исследовать влияние дистантного ишемического прекондиционирования, фармакологического прекондиционирования тадалафилом и эритропоэтином и их комбинаций на синтез эндотелиальной (eNOS) и индуцибельной (iNOS) NO-синтаз после ишемии-реперфузии в различные сроки.

3. Определить влияние дистантного ишемического прекондиционирования, фармакологического прекондиционирования тадалафилом и эритропоэтином и их комбинаций на цитопротекторный эндотелиальный фактор CD105 (эндоглин) после ишемии-реперфузии в различные сроки.

4. Изучить влияние дистантного ишемического прекондиционирования, фармакологического прекондиционирования тадалафилом и эритропоэтином и их комбинаций на синтез циклооксигеназы 2 типа (СОХ-2) в регуляторных структурах почек после ишемии-реперфузии в различные сроки.

Научная новизна исследования. В работе впервые проведено комплексное изучение локальной экспрессии ферментов метаболизма NO (эндотелиальной - eNOS, и индуцибельной - iNOS, синтаз), эндотелиальных маркеров (фактор VIII, VEGF, CD105) и циклооксигеназы второго типа (СОХ-2) при ишемии-реперфузии почек, взаимосвязей данных факторов с учетом характера структурных изменений паренхимы почек в раннем и отдаленном периодах после повреждения.

Впервые изучено изолированное и комбинированное влияние ДИП, ингибитора фосфодиэтеразы-5 тадалафила и эритропоэтина (ЭПО) на структурные изменения почек и экспрессию указанных тканевых факторов в аспекте эффектов дистантного и фармакологического прекондиционирования. Показано, что краткосрочная дистантная ишемия скелетных мышц, ингибитор фосфодиэстеразы-5

тадалафил и ЭПО обладают прекондиционирующим действием на почки как в изолированном виде, так и в различных комбинациях.

Установлены взаимосвязи систем метаболизма сМОЗ и ¡N08, СОХ-2 и эн-дотелиального фактора СБ 105 в реализации эффектов дистантного ишемическо-го и фармакологического прекондиционирования с применением тадалафила и эритропоэтина.

Впервые установлены отличия эффективности действия сочетаний фармакологического и дистантного прекондиционирования на различные звенья, участвующие в развитии противоишемической протекции структур почек, и связь с периодами после ишемического-реперфузионного повреждения. Выявлены краткосрочные и отдаленные эффекты дистантного и фармакологического прекондиционирования.

Научно-практическое значение. Полученные данные раскрывают новые прикладные аспекты применения прекондиционирующих факторов для профилактики и коррекции ишемических повреждений органов, в частности почек. Доказанная эффективность применения ингибитора фосфодиэстеразы-5 тадалафила и ЭПО в качестве самостоятельных агентов, а также в сочетании с ДИП дает основания для разработки практически применимых подходов к профилактике и коррекции ишемических повреждений почек, проведению клинически направленных исследований. Материалы диссертации внедрены в учебный процесс и научно-исследовательскую работу кафедры биохимии и фармакологии медицинского факультета и кафедры фармакологии и фармацевтических дисциплин института последипломного медицинского образования ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет».

Апробация работы

Материалы работы были представлены на IX Международной научно-практической телеконференции «Актуальные проблемы современной науки» (http://tele-conf.ru/sektsiya-7.-ргоЬ1ету1-тес1к8ту1-1-р8Шо^11/З.Ь1т1, Томск, 2012), IV съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012), X научно-практической конференции студентов, интернов, ординаторов, аспирантов и молодых ученых, посвященной 10-летию ИПМО НИУ «БелГУ» (Белгород, 2012), совместном заседании кафедр медицинского и фармацевтического факультетов ФГАОУ ВПО НИУ «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» (Белгород, 2012), I Международной конференции «Морфо-клинические аспекты безопасности жизнедеятельности» (Воронеж, 2012), итоговой научной конференции сотрудников КГМУ, Центрально-Черноземного научного центра РАМН и отделения РАЕН (Курск, 2013).

Личный вклад автора. Автором лично определены цель и задачи исследования, разработаны методические подходы для их решения, проведено экспериментальное исследование на лабораторных животных, выполнен сбор и анализ полученных данных. Автор лично принимал участие в выполнении экспериментов, иммуноморфологических исследований, проводил обработку и анализ полученных данных, подготовку основных публикаций, апробацию результатов исследования, выполнил написание и оформление рукописи.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 в журналах из перечня ВАК.

Положения, выносимые на защиту.

1. Ингибитор фосфодиэстеразы-5 тадалафил, рекомбинантный эритропо-этин, дистантное ишемическое прекондиционирование и их сочетания оказывают протективное действие на'структуры почек при ишемии-реперфузии в эксперименте, которое реализуется через NO-зависимые механизмы, эндотелиопротек-тивный фактор CD 105 (эндоглин) и СОХ-2 зависимые регуляторные механизмы.

2. Степень эффективности прекондиционирующих влияний и определяющие ее ведущие механизмы, отличаются в раннем и позднем периодах после ишемии-реперфузии почек. NO-зависимые механизмы реализуются как в раннем, так и отдаленном периодах после ишемии-реперфузии, тогда как CD 105 и СОХ-2 зависимые протективные эффекты преобладают в отдаленном периоде.

3. На синтез eNOS в эндотелии капилляров почечных клубочков в раннем периоде в наибольшей степени влияет сочетание эритропоэтина с тадалафилом. В отдаленном периоде более эффективен тадалафил и его сочетание с дистантным ишемическим прекондиционированием, коррелируя с положительным влиянием на экспрессию CD 105 и СОХ-2 зависимые механизмы. Сочетание эритропоэтина и тадалафила с дистантным ишемическим прекондиционированием оказывает протективное влияние на синтез iNOS вне зависимости от срока после ишемии-реперфузии.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследования, выводов, рекомендаций по использованию научных выводов и указателя литературы, включающего 152 источника, из которых 34 отечественных и 118 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 36 рисунков, включающих 15 графиков и схем, 73 макро- и микрофотографии.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материал исследования и методы эксперимента

Экспериментальное исследование выполнено на 185 особях белых крыс-самцов линии Wistar массой 180 - 250 гр. Все исследования выполнены в одно и то же время суток (с 15 до 19 часов) с соблюдением правил гуманного обращения с животными с осуществлением хирургических вмешательств под хло-ралгидратным наркозом (300 мг/кг массы внутрибрюшинно), выведением животных из эксперимента передозировкой хлоралгидрата внутрибрюшин-ным введением. Эксперименты выполнены в лабораториях центра «Фармация» и «Центра доклинических и клинических исследований» НИУ БелГУ. Распределение особей по группам эксперимента представлено в таблице 1.

Экспериментальное исследование выполнено на двух сроках: 1 сутки и 21 сутки после воздействий с учетом результатов предварительных исследований на промежуточных сроках. Дистантное ишемическое прекондиционирование создавали по ранее апробированной и обоснованной методике наложением эластично-

го жгута на верхнюю треть контрлатерального (правого) бедра на 10 минут с последующей 30 минутной реперфузией непосредственно перед моделированием ишемии почек. Продолжительность эпизода ишемии выбрана с учетом данных литературы [Колесник И.М., 2010]. Контролем эффективности пережатия служило исчезновение пульсации на артериях стопы и появление цианоза ее кожи в первые секунды после наложения жгута. После снятия жгута двигательных расстройств, которые могли бы быть связаны с механическим повреждением мышц бедра и крупных нервов, мы не наблюдали.

Ингибитор фосфодиэстеразы-5 тадалафил (препарат «Сиалис» производства Eli-Lilly, Великобритания) вводили внутрибрюшинно в дозе 1 мг/кг массы животного на 10% диметилсульфоксиде за 1 час до моделирования ишемии-реперфузии почек. Выбранная доза соответствует средней терапевтической дозе для человека 10 мг/кг, пересчитанной по формуле межвидового переноса доз [Покровская Т.Г. и соавт., 2010]. Рекомбинантный эритропоэтин (ЕРО) («Эпок-рин» эпоэтин альфа; ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых препаратов» Федерального медико-биологического агентства г. Санкт-Петербург, Россия) вводили подкожно в дозе 50 МЕ/кг за 12 часов до основной части эксперимента.

Для фармакологического контроля использовали блокатор АТФ зависимых калиевых каналов глибенкламид (Sigma), который вводили внутрибрюшинно в дозе 5 мг/кг веса на 10% диметилсульфоксиде за 30 минут до проведения дистантного ишемического прекондиционирования и/или введения изученных препаратов.

Таблица 1

Экспериментальные группы и распределение животных

Экспериментальные группы Количество животных и сроки эксперимента

1 сутки | 21 сутки Всего

Контрольная 11

Экспериментальные

1 Ишемия-реперфузия < 10 12 25

2 ДИП - ишемия ■. 10 12 25

3 Тадалафил - ишемия 10 10 20

4 Тадалафил — ДИП - ишемия 10 10 20

5 Глибенкламид - тадалафил - ишемия 10 10

6 Эритропоэтин - ишемия 10 10 20

7 Эритропоэтин - ДИП - ишемия 10 10 20

8 Эритропоэтин - тадалафил - ишемия 10 10 20

9 Эритропоэтин — тадалафил — ДИП - ишемия 10 10 20

Итого 185

ДИП - дистантное ишемическое прекондиционирование

Моделирование ишемического-реперфузионного повреждения проводили на левой почке. У наркотизированных животных после выделения почечной «ножки» под нее подводили шелковую лигатуру, которую затягивали одним про-

стым узлом с полным пережатием почечной артерии и вены. Почку погружали в рану, которую на протяжении периода ишемии прикрывали салфеткой, смоченной антисептиками. Концы лигатуры оставляли снаружи. Через 30 минут почку вновь выводили в рану и снимали лигатуру. Почку вновь погружали в рану после визуально различимого появления реперфузионного кровотока по сосудам. Рану послойно зашивали шелковыми нитями и обрабатывали антисептиками. В послеоперационном периоде производили наблюдение за животными и повторную обработку антисептиками послеоперационной раны. Осложнений, связанных с операциями и гибели животных от технических дефектов выполняемых манипуляций, не было.

Методы исследования

Методическую основу выполненного исследования составило морфологическое изучение изменений почек с применением как общегистологических и специальных методов, так и иммуногистохимических методов прямой детекции изучаемых продуктов клеточной экспрессии. Исследование выполнено в лаборатории научно-образовательного центра «Прикладной иммуноморфологии и цито-генетики» НИУ БелГУ.

После выведения животных из эксперимента производили макроскопическое исследование почек, взвешивание (в мг) с вычислением относительной массы (мг/гр массы тела животного). Подготовка образцов для гистологического исследования и изготовление микропрепаратов проведены с применением сертифицированного автоматизированного оборудования фирмы Leica (Германия). После фиксации обе половины почек отдельно полностью заливали в стандартном режиме в парафин. Срезы для стандартного гистологического исследования окрашивали гематоксилином и эозином, а также по Ван Гизон и Маллори с использованием стандартных наборов.

После обзорного гистологического исследования в каждом блоке выбирали стандартные репрезентативные участки площадью 5x5 мм, которые вырезали и перезаливали в тканевые мультиблоки по 10-15 кусочков из разных групп эксперимента. С полученных стандартных мультиблоков изготавливали срезы толщиной 4 мкм для иммуногистохимического исследования. Таким образом, на одном стекле одновременно выполняли иммуногистохимические реакции на 10-15 образцах в идентичных условиях. Демаскировку антигенов выполняли по стандартному протоколу высокотемпературной демаскировки в цитратном буфере с рН=7,0 или трис-ЭДТА буфере с рН=9,0 в зависимости от протокола исследования (таблица 2). Для выявления реакции применены полимерные системы детекции Ultra Vision (ThermoScientific, Великобритания) и Histofine (Nichirei Biosciences, Япония) с хромогеном - диаминобензидином. Характеристики использованных антител в соотвествии с задачами исследования и особенности протоколов представлены в таблице 2.

Основная часть морфологического исследования выполнена после создания электронной галереи изображений с помощью полуавтоматического сканера микропрепаратов Mirax Desk (Carl Zeiss Microimaging GMbH, Германия), что позволило полностью стандартизовать режимы морфометрии исследования. На компьютерных изображениях микропрепаратов определяли характер распределе-

ния иммуногистохимических реакций и удельную площадь иммунореактивного вещества, подсчитывали количество почечных клубочков с позитивными реакциями на изученные маркеры, количество отдельных иммунопозитивных клеток. С помощью программы для просмотра сканированных изображений «Раппога-micViewer 1.15» производили линейные измерения. Определение площадей иммунореактивного вещества проведено с использованием программы для анализа изображений WCIF ImageJ (США) после преобразования изображений с выделением зон реакций по типу «компьютерного скелетирования».

Таблица 2

Протоколы иммуногистохимических исследований

Антитела Клон Фирма Демаскировка* Разведение

eNOS/Nitric Oxide Synthase-Endothelial Polyclonal Spring Bioscience Citra 1:70

iNOS/ Nitric Oxide Synthase-Inducible Polyclonal Spring Bioscience Citra 1:100

CD 105/Endoglin/TGF-p Receptor Polyclonal Spring Bioscience Citra 1:50

VEGF Polyclonal Spring Bioscience Tris-EDTA 1:100

Factor VIII Polyclonal CellMarque Citra 1:500

COX-2 SP21 CellMarque Tris-EDTA 1:500

Citra - цитратный буфер, рН=6,0;

Tris- EDTA - трис-ЭДТА буфер, рН=9,0.

Количественные данные регистрировали в электронных таблицах MS Excel, средствами которой, а также с помощью программы Statistica 6.0 проведена статистическая обработка после определения характера распределения признаков с применением параметрических (критерий t Стьюдента) и непараметрических (критерий Пирсона - и Фишера), критериев сравнения средних, методов корреляционного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

По результатам макроскопических и общегистологических исследований в изученных группах установлены различия в зависимости от комбинации прекон-диционирующих агентов и сроков эксперимента. Особенностью прекондициони-рующих агентов, примененных в выполненных экспериментальных сериях, является развитие большей степени кровенаполнения сохранившихся внутрипочеч-ных сосудов при ДИП и применении ЭПО в изолированном виде и в сочетании с ДИП. Меньшая степень структурных повреждений через сутки после ишемии-реперфузии на фоне прекондиционирующих влияний закономерно отразилась в отдаленном периоде (через 21 сутки после повреждения) в виде меньшей выраженности постишемических склеротических изменений почек. Однако на уровне светомикроскопических характеристик почечных структур различия между эффектами прекондиционирующих агентов достоверно не выявляются, что определяет необходимость оценки более тонких изменений на уровне биохимических и

функциональных показателей, характеризующих эндотелий-ассоциированые и другие цитопротективные механизмы.

Изменения экспрессии эндотелиальной (€N08) и индуцибельной (¡N08) 1\0-сннтаз в структурах почек при их ишемии и на фоне дистантного и фармакологического прекондиционирования

У интактных животных eNOS экспрессируется в эндотелии всех типов сосудов. Площадь иммунореактивного (еЖ)8+) вещества составила в среднем 24,3+0,6%. Через 24 часа после ишемии в сохранившихся клубочках экспрессия eNOS достоверно (р<0,05) снижена почти в 8 раз - до 3,63+0,25%. Через 21 сутки в оставшихся вне зон склероза участках почечной паренхимы экспрессия е№)8 составила 5,73+0,33% по площади иммунореактивного вещества, оставаясь достоверно ниже контрольных значений.

Дистантное ишемическое прекондиционирование (ДИП) проявило по результатам иммуногистохимического исследования экспрессии eNOS частичный позитивный эффект. Через 24 часа после ишемии на фоне ДИП площадь eNOS+ участков в клубочках составила 10,93+0,27%. На 21-е сутки этот эффект был еще более выраженным, но площадь еИ08+ участков оставалась достоверно ниже интактных контрольных значений, составив 15,80+0,35%. Эффект фармакологического прекондиционирования препаратом тадалафил превосходил таковой у ДИП уже через сутки после ишемии. Уровень экспрессии eNOS по площади иммунореактивного вещества в клубочках не достигал контрольных значений, но был достоверно выше в сравнении с ДИП, составив в среднем 14,17+0,38% (р<0,05). На 21-е сутки был получен полный эффект достижения экспрессии eNOS в эндотелии клубочковых капилляров интактного уровня, даже в участках перигломе-рулярного склероза. Площадь eNOS+ вещества в клубочках составила в среднем 25,63+0,56%. Применение эритропоэтина (ЭПО) в использованном нами в эксперименте режиме на раннем сроке (24 часа) не влияло на экспрессию eNOS в эндотелии клубочковых капилляров. Однако при всех сочетаниях с ДИП и тадалафи-лом был достигнут достоверный эффект, который был наибольшим при сочетании ЭПО+Тадалафил (17,60+0,25%). На 21-е сутки выявлены значимые влияния введения ЭПО на экспрессию eNOS. Площади иммунореактивного вещества достоверно не отличались в сериях ЭПО, ЭПО+Тадалафил и ЭПО+ДИП+Тадалафил, составив соответственно 22,01+0,45%, 21,0+0,40% и 20,63+0,33%. Роль прекондиционирующих влияний/агентов во влиянии на экспрессию еМОБ в раннем и отдаленном периодах оказалась различной. Сочетание ЭПО+Тадалафил оказалось наиболее эффективным в раннем периоде, но не значимым на 21 -е сутки эксперимента. Напротив, сочетание Тадалафил+ДИП оказалось эффективнее в отдаленном периоде. ЭПО в чистом виде и особенно в комбинации с двумя другими прекондиционирующими агентами продемонстрировал наименьшую эффективность. Результаты морфометрии представлены на рис. 1, 2.

При исследовании влияния изученных прекондиционирующих агентов на экспрессию ¿N08 выявлена иная динамика как в эффектах, выявляемых по уровню экспрессии фермента, так и по срокам. Иммунореактивность на ¡ЫОБ у интактных животных выявляется в мезангиальных клетках почечных клубочков,

клетках внутреннего листка капсул почечных телец - подоцитах, интерстициаль-ных клетках в корковом и мозговом веществе, в стенках мелких артериол.

Рис. 1.

Соп1г 0-1 Э+0-1 Е+Э-1 Е+Э+0-1

1БСЬ-1 в-1 Е-1 Е+й-1

[д] Меап

X Меап±0,95 СопГ. 1п1епга!

1

СоШг 0-21 Э+0-21 Е+Э-21 Е+Э+0-21 |8С(1-21 в-21 Е-21 Е+0-21

§] Меап

X Меап±0,95 СопТ глегта

Рис. 2. Удельные площади положительной иммуногистохимической реакции (площадь иммунореактивного еМ08+ вещества) на еЫОБ в эндотелии клубочковых капилляров почек у интактных животных (Сопй"), после ишемии (I) и при прекондиционировании: в - тадалафил, О - ДИП, Е - эритропоэтин, и их сочетания. Срок эксперимента 1 сутки (рис. 1), 21 сутки (рис. 2).

По истечении первых суток после ишемии площадь ¡N08+ участков в клубочках составила в среднем 2,97+0,25% - в 7 раз меньше в сравнении с интакт-

ным контролем и была меньше, чем площадь еЫ08+ участков в этой же серии эксперимента. Последнее отличие закономерно, поскольку площадь потенциальной экспрессии ¡N08 в почечных тельцах меньше (мезангиальные клетки, подо-циты), чем площадь сМ08 экспрессирующего эндотелия. Значимой особенностью явилась экспрессии ¡N08 в многочисленных клетках реактивного инфильтрата в некротической и перинекротической зонах. Через 3 недели после ишемии экспрессия ¡N08 повышалась, но оставалась более чем в 3 раза меньшей в сравнении с интактным контролем (4,63+0,26%).

Исследованные прекондиционирующие влияния в различной степени оказывали позитивный эффект на экспрессию ¡N08, кроме введения эритропоэтина. В последнем случае через 24 часа после ишемии площадь ¡N08+ структур составила всего 3,03+0,25%. Во всех остальных случаях экспрессия ¡N08, оцениваемая по площади иммунопозитивных структур, возрастала в диапазоне от 6,87% (при ДИП) до 11.23% (при сочетании ЭПО+ДИП+Тадалафил). На 21-е сутки эксперимента все исследованные прекондиционирующие влияния обусловливали повышение экспрессии ¡N08 до величин, не отличающихся, или минимально отличающихся от интактного уровня, практически в равной степени, в отличие от еЖ)8. Это свидетельствует о более значимой роли ¡N08 на позднем сроке эксперимента (рис. 3).

Сотг 0-21 в+0-21 Е+Э-21 Е+в+0-21 13С11-21 5-21 Е-21 Е+0-21

[□I Меап

X Меап±0,95 СопГ 1Шегуа1

Рис. 3. Удельные площади положительной иммуногистохимической реакции (площадь иммунореактивного ¡N08+ вещества) на ¡N08 в структурах клубочков почек. Срок эксперимента 21 сутки.

При прекондиционирующих влияниях в перинекротической зоне существенно ниже была концентрация iNOS-экcпpeccиpyющиx реактивных клеток (лейкоцитов и макрофагов), что может быть положительным фактором в уменьшении распространенности некроза за счет снижения активности ¡N08 в реактивных

элементах с уменьшением потенциальной цитотоксичности повышенно продуцируемой NO.

Изменения экспрессии эндотелиальных маркеров: рецепторного комплекса трансформирующего фактора роста-p эндоглина (CD105), VEGF и фактора VIII в структурах почек при их ишемии и на фоне дистантного и фармакологического прекондиционирования

Через сутки после ишемии уровень экспрессии (по удельной площади иммунореактивного вещества) CD 105 в эндотелии в эндотелии клубочковых капилляров снижен более чем в 2 раза. Исследованные фармакологические агенты (ЭПО и тадалафил) как самостоятельно, так и в сочетании с ДИП оказывали достоверный цитопротекторный эффект на эндотелий клубочковых капилляров. При изолированном ДИП эффекта не выявлено. В остальных сериях экспрессия CD 105 повышена практически до контрольных величин в равной степени (рис. 4).

При корреляционном анализе экспрессии NOS и CD 105 в эндотелии клубочковых капилляров высокая степень связи между экспрессией eNOS и iNOS (коэффициент корреляции Спирмена = 0,914) выявлена только в серии с применением эритропоэтина, с CD 105 экспрессия NOS не коррелировала. На 21-е сутки после ишемии-реперфузии почек как визуально, так и при количественном анализе определяется достоверное снижение экспрессии CD 105 в клубочковых капиллярах вне зависимости от топографии и диаметров почечных телец. При корреляционном анализе не выявлено достоверной зависимости между экспрессией CD 105 и eNOS во всех сериях, кроме серии с введением глибенкламида. В этой серии коэффициент линейной корреляции составил 0,92, коэффициент корреляции Спирмена 0,88 (р<0,05). При различных вариантах прекондиционирования выявлены в целом положительные, но отличающиеся по степени выраженности эффекты. В серии с ДИП экспрессия CD 105 приблизилась к значениям у интактных контрольных животных. При фармакологическом прекондиционировании ингибитором фосфодиэстеразы-5 тадалафилом уровень экспрессии CD 105 оказался недостоверно ниже контрольных значений. При сочетании Тадалафил+ДИП показатель экспрессии CD 105 не отличался от контрольных значений. Введение глибенкламида, как показывают количественный анализ и визуально наблюдавшиеся изменения, в равной степени блокирует эффект комбинированного прекондиционирования в отношении как CD 105, так и eNOS. В сериях с применением ЭПО на 21-е сутки эксперимента также выявлена нормализация показателей экспрессии CD105. В целом эффективность влияния прекондицирования на экспрессию CD 105 через 24 часа после ишемии оказалась равной для фармакологических агентов и их сочетаний друг с другом и с ДИП, но не выявлена для ДИП.

Исследование экспрессии фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF) и фактора VIII выполнено с учетом этих веществ как маркеров жизнеспособного эндотелия. Однако во всех сериях реакция на них была однотипно на низком уровне, особенно фактора VIII, в связи с чем количественный анализ проведен не

был. Однако при визуальной оценке было выявлено, что реакции на эти маркеры находятся в прямой связи с уровнем экспрессии СБ 105, выражая цитопротектор-ный эффект последнего.

Рис. 4. Различия в экспрессии CD105 в контроле (А), на 21-е сутки после ишемии-реперфузии левой почки (Б), при ДИП (В), фармакологическом прекондиционировании тадалафилом (Г), при прекондиционировании Тадапафил+ДИП (Д) и на фоне введения глибенкламида (Е): равномерная экспрессия гликопротеина CD105 в эндотелии клубочковых капилляров в контроле, ее различная степень восстановления при прекондиционировании, резкое снижение экспрессии после ишемии в отдаленном периоде (Б) и на фоне введения глибенкламида (Е). Иммуногисто-химические реакции. Микрофото, х 400.

Схема возможных механизмов фармакологического прекондициониро-вания с участием системы CD105/NC) представлена на рис. 5. Эндоглин (CD105) является одним из важнейших регуляторов развития структур сердечнососудистой системы как в пренатальном онтогенезе, так и при различных состояниях в постнатальном периоде. CD105 - гомодимерный трансмембранный глико-протеин, который в ассоциации с рецепторами трансформирующего фактора роста р (TGF- р) связывает TGF- pi, TGF- (33, активин. Он конституитивно экспрес-сируется эндотелиальными клетками различных кровеносных сосудов, сосудистыми гладкими миоцитами, мезангиальными клетками. Роль CD105 в регуляции выработки эндотелием других вазоактивных факторов, в том числе NO, высоко вероятна в силу полипотентности TGF- Р1, что показано в имеющихся экспериментальных исследования. Между системой эндоглин/TGF-pi и eNOS имеется непосредственная связь, которая реализуется, в том числе и на генетическом уровне, так как в промоторной части гена eNOS потенциально имеются участки, чувствительные к действию TGF-pi. Эффекты действия CD105 на систему eNOS реализуются как на уровне увеличения синтеза матричной РНК eNOS, так и на посттрансляционных этапах, в частности, за счет увеличение периода полураспада eNOS. Кроме этого, активизация мембран-связанной системы CDl()5-eNOS, в комплексе с которой находятся кальмодулин, белок теплового шока 90 (HSP90) и кавеолин, требует связывания со свободным кальцием.

ния с участием системы С0105/К0

Таким образом, кумулятивный эффект действия дистантного и ишеми-ческого прекондиционирования может быть объяснен генетическими и эпи-

генетическими эффектами дистантного прекондиционирования за счет активизации систем антигипоксической защиты, в которые входят CD 105 и белки теплового шока, дополняемыми кальций-зависимой активизацией комплекса CD105-eNOS. Известно также, что ц-ГМФ является ингибитором белка р38, за счет чего увеличивается экспрессия антиапоптотического белка bcl-2 [Caretti A. et al., 2012].

Изменения экспрессии циклооксигеназы-2 (СОХ-2) в структурах почек при их ишемии и на фоне дистантного и фармакологического прекондиционирования

СОХ-2 является, в основном, индуцибельным ферментом. Однако в почках она конституционально присутствует в клетках толстого сегмента восходящей части петли Генле и в эпителиоцитах плотного пятна, в мозговом веществе СОХ-2 присутствует в интерстициальных клетках. Основной функцией фермента является обеспечение синтеза PgE2, но конечные эффекты активности СОХ-2 в корковом и мозговом веществе почек имеют некоторые отличия (рис. 6). В мозговом веществе синтез и секреция PgE2 обеспечивает вазодилатирующий эффект на прямые сосуды и блокирует ре-абсорбцию натрия [Harris R., 2000]. В корковом веществе PgE2, синтезируемые при участии СОХ-2, также оказывают дилатирующий эффект на арте-риолы. Кроме этого, доказанной функцией СОХ-2 в плотных пятнах является стимуляция секреции ренина юкстагломерулярными клетками артериол.

У контрольных животных экспрессия СОХ-2 выявлена в клетках плотных пятен, структурах почечных клубочков, по топографии и морфологическим признакам соответствующим подоцитам и мезангиальным клеткам, эпителиоцитах толстых сегментов петель нефронов и интерстициальных клетках мозгового вещества. В наибольшей степени реакция была выражена в интерстициальных клетках. Среднее количество почечных телец, в области которых выявлены плотные пятна с позитивной реакцией на СОХ-2 составило 9,1+1,0 %, количество им-мунопозитивных клеток в плотном пятне варьировало от 1 до 4 (в среднем 2,3+0,8). Количество иммунопозитивных клеток в составе эпителия толстых сегментов петель нефронов на 1 мм2 составило в среднем 10,3+1,3.

Через сутки после моделирования ишемии в зонах сохранившейся почечной паренхимы произошло достоверное (р<0,05) снижение количества почечных телец с экспрессией СОХ-2 до 2,9+1,0%, среднего количества им-мунореактивных клеток в толстых сегментах до 1,3+1,1 на 1 мм2 (р<0,05). Среднее количество клеток в плотных пятнах не изменилось. На 21-е сутки ишемии изменения в корковом и мозговом веществе имели различный характер. Экспрессия СОХ-2 в плотных пятнах не изменилась, оставаясь на низком уровне, среднее количество клеток от контроля. При этом количество клеток в тубулярном эпителии достоверно увеличилось в сравнении со сроком 1 сутки после моделирования ишемии-реперфузии, но не достигло контрольных значений. В мозговом веществе выявлена явная гиперплазия иммунореактивных на СОХ-2 интерстициальных клеток, которые определялись в виде крупных скоплений между канальцами. На фоне дистантного,

фармакологического прекондиционирования и их комбинации через сутки эксперимента достоверных количественных изменений в экспрессии СОХ-2 в сравнении с серией ишемии-реперфузии не выявлено. Количество почечных телец с иммунореактивными плотными пятнами, среднее количество СОХ-2 позитивных эпителиоцитов и интерстициальных клеток не отличалось от серии без прекондиционирования и было достоверно ниже контрольных значений.

СОХ-2

Локальные эффекты

Синтез Рв-► В мозговом веществе

вазодилатация

Секреция ренина —Синтез А1\Ю II Системные эффекты

Рис. 6. Основные механизмы регуляции почечного и системного кровотока, связанные с СОХ-2 (MD- macula densa; плотное пятно).

Принципиально иная динамика выявлена на 21-е сутки эксперимента со значимыми отличиями фармакологического прекондиционирования, дистантного прекондиционирования и их комбинированного действия. Количество почечных телец с иммунореактивными плотными пятнами в серии с введением тадалафила было достоверно (р<0,05) выше контрольных значений, превышая их почти в 3 раза (28,1+1,9%), что было заметно и на качественном уровне при обзорном изучении микропрепаратов, достоверно (р<0,05) выше было количество СОХ-2 позитивных клеток в тубулярном эпителии (14,8+1,9 на 1 мм2), сходной с контролем была насыщенность мозгового вещества СОХ-2 позитивными клетками. При дистантном прекондиционировании отдаленные эффекты проявлялись выравниванием показателей содержания СОХ-2 в плотных пятнах с контрольными значениями. Идентичным контролю было как количество почечных телец с иммунореактивными плотными пятнами, так и среднее количество СОХ-2 позитивных эпителиоцитов в них. Однако количество СОХ-2 позитивных клеток в тубулярном эпителии было достоверно (р<0,05) выше контрольных значений (13,3+1,8 на 1 мм2) и приближалось к таковому в серии с введением тадалафила. При комбинированном фармакологическом и дистантном прекондиционировании отличий от фармакологического прекондиционирования не выявлено по количеству почечных телец с СОХ-2 позитивными плотными пятнами и среднему количеству иммунореактив-

ных клеток в них. Выше оказалось количество СОХ-2 позитивных клеток в тубу-лярном эпителии (16,7+2,4 на 1 мм2), но оно достоверно не отличалось от серии с фармакологическим прекондиционированием тадалафилом. В сериях с применением ЭПО максимальный эффект при оценке относительного количества почечных телец с СОХ-2 позитивными плотными пятнами достигнут при сочетании ЭПО+ДИП+Тадалафил. Сочетание ЭПО+ДИП оказалось наименее эффективным.

Полученные результаты и их анализ в сопоставлении с данными литературы позволяют сделать следующие выводы.

ВЫВОДЫ

1. Тадалафил в дозе 1 мг/кг, рекомбинантный эритропоэтин в дозе 50 МЕ/кг, дистантное ишемическое прекондиционирование и их сочетания оказывают протективное действие на структуры почек при йшемии-реперфузии в эксперименте.

2. Защитное действие фармакологического и дистантного прекондициони-рования реализуется через МО-зависимые механизмы, эндотелиопротективный фактор СБ 105 (эндоглин) и СОХ-2 зависимые регуляторные механизмы, отличающиеся в раннем и позднем периодах после ишемии-реперфузйи почек.

3. В первые сутки после ишемии-реперфузии почек наибольшим влиянием на синтез еКОБ в эндотелии капилляров почечных клубочков обладает сочетание эритропоэтина с тадалафилом, близкий эффект имеет изолированное применение тадалафила. В отдаленном периоде (21-е сутки) более эффективен тадалафил и его сочетание с дистантным ишемическим прекондиционированием.

4. На синтез ¡N08 в структурах почек наибольшее протективное воздействие оказывает сочетание эритропоэтина и тадалафила с дистантным ишемическим прекондиционированием вне зависимости от срока после ишемии-реперфузии.

5. На экспрессию СБ 105 (эндоглина) в эндотелии капилляров почечных клубочков в отдаленном периоде в наибольшей степени влияет комбинация тадалафила с дистантным ишемическим прекондиционированием. Данный эффект коррелирует с влиянием на синтез €N08.

6. СОХ-2 зависимые механизмы фармакологического и дистантного ишеми-ческого прекондиционирования в почках после ишемии-реперфузии реализуются в отдаленном периоде и в наибольшей степени выражены при применении тадалафила или его сочетания с дистантным ишемическим прекондиционированием.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Ингибитор фосфодиэстеразы-5 тадалафил и эритропоэтин обладают про-тективным действием при ишемии-реперфузии почек как при монотерапии, так и в комбинации, что определяет перспективность их клинического исследования как возможных средств профилактики и коррекции гемодинамических повреждений почечной паренхимы.

2. В раннем периоде после ишемического-реперфузионного повреждения почек большую эффективность проявляет комбинация эритропоэтина с тадала-

филом, в отдаленном периоде более эффективен тадалафил или его сочетание с дистантным ишемическим прекондиционированием.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Фармакологическое прекондиционирование эритропоэтином при ишемии конечности / И.М. Колесник, М.В. Покровский, И.Н. Должикова и др. // Биомедицина. - 2011. - № 4. - С. 90-92.

2. Влияние дистантного и ишемического прекондиционирования на экспрессию эндоглина и эндотелиальной NO-синтазы в почках в отдаленном периоде после ишемии-реперфузии / М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, И.Н. Должикова и др. // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия Медицина. Фармация. - 2012. - №4 (123). - Вып. 17/1. - С. 135 - 141.

3. Экспрессия циклооксигеназы-2 (СОХ-2) в почках после ишемии-реперфузии на фоне дистантного и фармакологического прекондиционирования / М.В. Покровский, A.A. Должиков, И.Н. Должикова и др. // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия Медицина. Фармация. -2012.-№4(123).-Вып. 17/1.-С. 142- 150.

4. Экспрессия эндоглина и эндотелиальной NO-синтазы в почках при дистантном и фармакологическом прекондиционировании / М.В. Покровский, В.И. Кочкаров, И.Н. Должикова и др. //Буковинський медичний вюник. - 2012. -Т. 16.-№3(63), 4.2.-С. 185 - 188.

5. Уровень экспрессии циклооксигеназы-2 в почках после ишемии-реперфузии и на фоне дистантного и фармакологического прекондиционирования / М.В. Покровский, В.И. Кочкаров, И.Н. Должикова и др. //Буковинський медичний вкник. - 2012. - Т. 16. - №3 (63), ч. 2. - С. 188 - 191.

6. Изучение участия циклооксигеназы-2 в механизмах дистантного и фармакологического прекондиционирования почек при ишемии-реперфузии / М.В. Покровский, A.A. Должиков, И.Н. Должикова, К.В. Коломыцев // Матер. Международной научно-практической телеконференции «Актуальные проблемы современной науки» / Альманах научных открытий. - Томск, 2012. - Т. 1. - № 3. -С. 58-63.

7. Фармакологический анализ влияния прямого и дистантного прекондиционирования на микроциркуляцию в печеночной паренхиме в условиях ее ишемии и реперфузии / С.А. Алехин, М.В. Покровский, И.Н. Должикова и др. // Материалы IV съезда фармакологов России «Инновации в современной фармакологии». - Казань, 2012. - С. 9.

8. Должикова, И.Н. Экспрессия NO-синтаз в структурах почек при ишемии и на фоне дистантного и фармакологического прекондиционирования / И.Н. Должикова // Матер. I Международной конференции «Морфо-клинические аспекты безопасности жизнедеятельности». - Воронеж, 2012. - С. 111 - 114.

9. Должикова, И.Н. Эндотелиальная NO-синтаза в структурах почек при ишемии и на фоне прекондиционирования / И.Н. Должикова // Материалы итоговой научной конференции сотрудников КГМУ, Центрально-Чернозёмного

научного центра РАМН и отделения РАЕН, посвященной 78-летию Курского государственного медицинского университета. Курск, 2013. - С. 193-197.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ДИП - дистантное ишемическое прекондиционирование

ИПК - ишемическое прекондиционирование

ФДЭ-5 - фосфодиэстераза-5

ЭПО - эритропоэтин

eNOS - эндотелиальная NO-синтаза

iNOS - индуцибельная NO-синтаза

PgE2 - простагландин Е2

TGF-P - трансформирующий фактор роста р

VEGF - фактор роста сосудистого эндотелия

Подписано в печать 14.02.2013. Гарнитура Times New Roman. Формат 60x84/16. Усл. п. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 61. Оригинал-макет подготовлен и тиражирован в ИД «Белгород» НИУ «БелГУ» 308015 г. Белгород, ул. Победы, 85