Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Влияние дистантного ишемического и фармакологического прекондиционирования никорандилом и минокси-дилом на выживаемость кожного лоскута на питающей ножке и состояние микроциркуляторного русла в ишемиз

На правах рукописи

Ефременкова Дарья Афанасьевна

ВЛНЯНИЕ ДИСТАНТНОГО ИШЕМИЧЕСКОГО И ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОГО ПРЕКОНДИЦИОНИРОВАНИЯ НИКОРАНДИЛОМ И МИНОКСИДИЛОМ НА ВЫЖИВАЕМОСТЬ КОЖНОГО ЛОСКУТА НА ПИТАЮЩЕЙ НОЖКЕ И СОСТОЯНИЕ МИКРОЦИРКУЛЯТОРНОГО РУСЛА В ИШЕМИЗИРОВАННОЙ МЫШЦЕ ГОЛЕНИ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

005050501

1 ч МАР 2013

Курск - 2013

005050501

Работа выполнена в Федеральном государственном автономном ■ образовательном учреждении высшего профессионального образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Покровский Михаил Владимирович Официальные оппоненты:

Лазарев Алексей Иванович, доктор медицинских наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор кафедры оториноларингологии.

Воронков Андрей Владиславович, доктор медицинских наук, «Пятигорский филиал государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения России», заведующий кафедрой фармакологии и патологии.

Ведущая организация:

ОАО «Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ»

л-а

Защита состоится г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 208.639.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России.

Автореферат разослан « ' » 2013 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета Пашин Евгений Николаевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Гипоксия и ишемия тканей являются ведущими патогенетическими факторами в альтерации тканей при множестве патологических состояний. В основе таких заболеваний как инсульт, транзиторная ишемическая атака головного мозга и инфаркт миокарда лежит острая нехватка кислорода в тканях. Таким образом, профилактика и коррекция последствий локальной ишемии, развивающейся при различных патологических состояниях и хирургических вмешательствах, является актуальной проблемой современной медицины (Apostolakis Е. et al., 2012).

Этим объясняется возрастающий интерес учёных к явлению ишемического прекондиционирования, суть которого состоит в том, что короткие подпороговые периоды ишемии активируют эндогенные защитные механизмы, снижающие степень повреждения клеток в результате последующего продленного ишемического эпизода (Huerta L. et al., 2012; Wan-Ying Lin et al., 2013).

В 1993 году было открыто дистантное ишемическое прекондиционирование, суть которого состоит в том, что кратковременные эпизоды ишемии одного органа повышают устойчивость других органов к тяжелым ишемическим повреждениям. Открытие данного феномена подтвердило предположение о том, что эффект прекондиционирования реализуется не локально, а представляет систему многоуровневого иерархического дублирования, включающую нейрогенный компонент, гуморальный и внутриклеточный. Последнее привело к необходимости поиска гуморального агента, выделяющегося в ответ на ишемию и способного при экзогенном введении инициировать процесс без локальной ишемии. Это явление названо фармакологическим прекондиционированием (ФПК) (Лупанов В.П., Максименко A.B., 2011; Jensen H.A. et al, 2011; Adam T. et al., 2013).

С клинической точки зрения прекондиционирование фармакологическими средствами выглядит предпочтительнее, так как технологически проще и лишено потенциальной опасности ишемических эпизодов для патологически измененных тканей. Еще больший интерес для клинического применения представляет возможность дозировать введение фармакологических средств, что делает управляемым временной интервал периода толерантности к ишемии (Колесник И.М., 2010; Ghaemian A. et al., 2012; Lomivorotov V. V. et al., 2012).

Эффект ФПК, по данным литературы, может стимулироваться различными механизмами, но наиболее изученным из них является активация АТФ-зависимых каналов. Открытие даже небольшой части (0,01-0,1 %) этих каналов во время ишемии может помочь клетке пережить «чрезвычайное положение», в котором его функции становятся нерегулируемыми (Saad A. et al., 2011; Belliard A. et al., 2013).

В литературе имеются данные о положительном влиянии ФПК активаторами АТФ-зависимых калиевых каналов на толерантность тканей головного мозга и миокарда при ишемических эпизодах. При этом возможность прекондиционирования мягких тканей при травматических повреждениях и хирургических вмешательствах остаётся малоизученной (Simón С. et al., 2012; Gross G. J. et. al., 2013).

В связи с этим, наиболее перспективным для изучения с нашей точки зрения является никорандил и миноксидил, которые выступают в роли активаторов АТФ-зависимых калиевых каналов.

Цель исследования: изучить влияние дистантного ишемического и фармакологического прекондиционирования никорандилом и миноксидилом на выживаемость кожного лоскута на питающей ножке и состояние микроциркуляторного русла в ишемизированной мышце голени.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние фармакологического прекондиционирования никорандилом и миноксидилом на выживаемость кожного лоскута на питающей ножке.

2. Исследовать состояние микроциркуляции и морфологические изменения в мышечной ткани при моделированной ишемии конечности и применении никорандила и миноксидила.

3. Изучить влияние сочетанного использования дистантного ишемического и фармакологического прекондиционирования никорандилом и миноксидилом на выживаемость кожного лоскута на питающей ножке и состояние микроциркуляторного русла.

4. Установить роль АТФ-зависимых калиевых каналов в реализации эффектов фармакологического прекондиционирования никорандилом и миноксидилом.

5. Определить роль нитроксидэргической системы в формировании эффектов фармакологического прекондиционирования никорандилом и миноксидилом.

Научная новизна исследования

В работе впервые изучена возможность фармакологического прекондиционирования ишемизированного кожного лоскута никорандилом (1,3 мг/кг/сут) и миноксидилом (0,5 мг/кг/сут).

Показана возможность стимуляции микроциркуляции в ишемизированой мышце голени крысы фармакологическим прекондиционированием никорандилом и миноксидилом.

Сопоставлены механизмы реализации дистантного ишемического и фармакологического прекондиционирования никорандилом и миноксидилом при их сочетанном использовании.

Доказана возможность сохранения эффекта фармакологического прекондиционирования никорандилом при блокаде АТФ-зависимых калиевых каналов на модели кожного лоскута на питающей ножке.

Установлена роль индуцибельной NO-синтазы в реализации механизмов фармакологического прекондиционирования как никорандилом, так и миноксидилом при моделировании кожного лоскута на питающей ножке и ишемии мышц голени.

Практическая значимость

В работе экспериментально обоснована эффективность применения фармакологического ишемического прекондиционирования никорандилом и миноксидилом для профилактики и коррекции ишемических повреждений мягких тканей. Выявлено стимулирующее действие исследуемых препаратов на состояние микроциркуляторного русла в ишемизированной скелетной мышце голени крысы.

Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные клинические испытания никорандила и миноксидила для профилактики и коррекции ишемических повреждений мягких тканей.

Внедрение результатов научного исследования

Материалы диссертации вошли в учебный процесс и научно-исследовательскую работу кафедры клинической фармакологии и фармацевтических дисциплин иститута последипломного медицинского образования ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет», кафедр фармакологии и клинической фармакологии ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет, кафедры фармакологии ГБОУ ВПО «Воронежская государственная медицинская академия им. H.H. Бурденко».

Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе дизайна исследования, определении целей и задач работы. Автором проанализированы отечественные и зарубежные источники по теме диссертационного исследования, выполнены серии экспериментов, получены и обобщены результаты исследования, проведены статистическая обработка и анализ полученных данных (доля участия 100%). В публикациях в соавторстве доля участия автора 80%.

Связь с планом НИР. Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательской работы ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет». Номер государственной регистрации темы - 01201277256.

Апробация работы

Материалы работы были представлены на совместном заседании кафедр медицинского и фармацевтического факультетов ФГАОУ ВПО НИУ «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»; X итоговой научно-практической конференции клинических ординаторов, интернов, молодых ученых «Актуальные вопросы современной клинической и экспериментальной медицины» (Белгород, 27 апреля, 2012); IV съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (18-21 сент. 2012 г., г. Казань); IV всероссийском научно-практическом семинаре молодых ученых с международным участием «Современные

проблемы медицинской химии. Направленный поиск новых лекарственных средств» (Волгоград, 2012); VIII международной научно-практической конференции «Образование и наука в XXI веке - 2012» (17-25 октября 2012, София).

По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, 5 из них — в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук, согласно п. 10 «Положения о порядке присуждения ученых степеней», в которых содержится необходимый объем информации, касающейся темы диссертации.

Положения, выносимые на защиту

1. Фармакологическое прекондиционирование никорандилом (1,3 мг/кг/сут) и миноксидилом (0,5 мг/кг/сут) увеличивает выживаемость кожного лоскута на питающей ножке и стимулирует микроциркуляцию в ишемизированной мышце голени крыс, сводит к минимуму гистологические проявления ишемической альтерации мышечной ткани и приводит к повышению экспресии маркера роста сосудов - CD-105 (эндоглина) и iNOS.

2. Совместное применение дистантного ишемического и фармакологического прекондиционирования исследуемыми препаратами не приводит к увеличению показателей выживаемости кожного лоскута на питающей ножке и уровня микроциркуляции в ишемизированной мышце голени в сравнении с их одиночным использованием.

3. Блокада АТФ-зависимых калиевых каналов глибенкламидом уменьшает эффект фармакологического прекондиционирования никорандила и полностью нивелирует действие миноксидила на модели кожного лоскута на питающей ножке; блокада iNOS аминогуанидином приводит к снижению прекондиционирующего эффекта никорандила на моделях кожного лоскута на питающей ножке и ишемии мышцы голени крыс и полностью отменяет фармакологического прекондиционирования миноксидилом на данных моделях.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 230 источников, из которых 83 отечественных и 147 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц и 21 рисунок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводили на 365 здоровых половозрелых крысах линии «Wistar» массой 200-250 г. Лабораторные животные были взяты без внешних признаков заболевания, прошедшие карантинный режим вивария Белгородского национального исследовательского университета. Все животные содержались в одинаковых условиях, на обычном пищевом

режиме. Для получения статистически достоверных результатов группы формировали из 10 животных.

Все исследования проводили в одно и то же время суток, во второй половине дня, с соблюдением принципов, изложенных в «Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1986), и согласно правилам лабораторной практики РФ (приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г.).

Наркотизацию осуществляли внугрибрюшинным введением водного раствора хлоралгидрата в дозе 300 мг/кг веса. Выведение животных из эксперимента - его передозировкой.

Животных распределяли по группам путем стратифицированной рандомизации со стратификацией по массе тела, а также по проводимым операциям и манипуляциям.

Для изучения прекондиционирующего эффекта никорандила использовали таблетки Коронель® (производитель ПИК-ФАРМА, Россия), содержащие 10 мг никорандила, которые измельчали в ступке, растворяли в крахмальном киселе и вводили животным через зонд внутрижелудочно.

Для исследования прекондиционирующего действия миноксидила использовали таблетированную его форму Минона® (Мтопа®, производства РАЯМОБ, Финляндия), содержащую 100 мг миноксидила. Таблетки также гомогенезировали, растворяли в крахмальном киселе и вводили внутрижелудочно через зонд.

Выбор дозы препаратов осуществляли согласно литературным данным, посвященным экспериментальным исследованиям на животных (вош-АПо В. е1 а1., 2008), инструкции по применению препаратов, а также коэффициентов пересчета доз (мг/кг на мг/м2) для крысы и человека в зависимости от массы тела (Рге1геюИ ЕЛ. е1 а!., 1966).

Протокол эксперимента по изучению влияния фармакологического прекондиционирования никорандилом и миноксидилом на выживаемость кожного лоскута на питающей ножке

Моделирование кожного лоскута на питающей ножке проводили на вторые сутки эксперимента. После наркотизации в асептических условиях выкраивали кожный лоскут: основание - 1 см, длина - 4 см, изолировали в полиэтиленовый пакет, края кожи ушивали узловыми швами (капрон 3/0).

Животные были разделены на 5 групп: 1 контрольную, 4 опытных групп. В контрольную группу входили животные, которым производили только моделирование кожного лоскута на питающей ножке. В опытных группах оценивали эффект изолированного ФПК никорандилом (в дозе 1,3 и 4,4 мг/кг/сут) и миноксидилом (в дозе 0,5 и 1,0 мг/кг/сут). Препараты вводили внутрижелудочно, через зонд, половинную суточную дозу за 12 и за 1 час до операции, далее через 48 и 60 часов. На шестые сутки эксперимента проводили оценку выживаемости кожного лоскута, планиметрически, по Г.Г. Автандилову (Автандилов Г.Г., 1994).

Протокол эксперимента по изучению влияния фармакологического прекондиционирования никорандилом и миноксидилом на состояние микроциркуляторного русла в ишемизированной мышце голени

Влияние ФПК на состояние микроциркуляторного русла в ишемизированной скелетной мышце проводили на модели ишемии мышц голени крысы (Артюшкова Е.Б. и др, 2008; Колесник И.М., 2010; Sugano С., 2004). Для этого наркотизированному животному в асептических условиях выполняли разрез кожи вдоль бедра по внутренней поверхности. Выделяли бедренную артерию у места ее начала, до отхождения а. saphena накладывали лигатуру и пересекали. Участок магистрального сосуда, включающий бедренную, подколенную артерию и начальные отделы передней и задней болыпеберцовых артерий, удаляли. Рану на бедре ушивали.

Животные были разделены на 5 групп. Интактным животным проводили измерение микроциркуляции методом лазерной доплеровской флоуметрии (ЛДФ). Группа ложнооперированных животных введена с целью определения влияния операционной травмы и наркоза на показатели микроциркуляции. В этой группе проводилось только выделение магистральных сосудов без их перевязки. В группе контроля животным осуществлялось моделирование ишемии голени без применения ФПК. Животным остальных групп наряду с операцией проводили ФПК с применением никорандила и миноксидила.

Исследуемые препараты вводили внутрижелудочно, через зонд, половинную суточную дозу, за 12 часов и за 1 час до операции, далее через каждые 48 и 60 часов в течение семи суток эксперимента.

Оценку уровня микроциркуляции проводили под наркозом на 21 и 28-е сутки при помощи оборудования производства компании Biopac systems: полиграфа MP 100 с модулем ЛДФ - LDF100C и инвазивного игольчатого датчика TSD144. На обнажённый участок мышцы устанавливали датчик, исключая возникновения воздушной прослойки, попадания свежей крови и пересыхания мышцы. Уровень микроциркуляции регистрировали в пяти точках, затем вычисляли среднее значение. Запись и обработку данных производили при помощи программы AcqKnowledge 4.9.2, значения микроциркуляции выражались в перфузионных единицах (ПЕ).

Протокол эксперимента по изучению сочетанного влияния дистантного ишемического и фармакологического прекондиционирования никорандилом и миноксидилом на состояние ишемизированных мягких тканей

Изучение сочетанного влияния дистантного ишемического прекондиционирования (ДИП) и ФПК проводили на модели кожного лоскута и на модели ишемии мышцы голени крысы по вышеописанным методикам. Схемы введения препаратов не меняли.

ДИП проводили непосредственно перед операцией - за 40 минут до моделирования кожного лоскута, путем наложением жгута на верхнюю треть

бедра до прекращения пульсации на 10 минут с 30-минутной реперфузией, затем на 3,5-е сутки после вмешательства.

На каждый опыт животные были разделены на 3 группы: в одной из которых животным моделировали ДИП, в двух других - сочетание ДИП с ФПК никорандилом и миноксидилом соответственно.

Оценка результатов проводилась по описанным в предыдущих протоколах методикам.

Протокол эксперимента по определению роли АТФ-зависимых калиевых каналов в реализации дистантного ишемического и фармакологическо прекондиционирования никорандилом и миноксидилом

Блокаду АТФ-зависимых калиевых каналов осуществляли с помощью введения специфического неселективного блокатора АТФ-чувствительных калиевых каналов - глибенкламида. Было сформировано 4 группы животных: с изолированным- введением глибенкламида и его комбинаций с никорандилом, миноксидилом и ДИП.

Глибенкламид вводили внутрижелудочно через зонд в дозе 5 мг/кг веса за 30 минут до проведения ДИП или введения препарата.

Протокол эксперимента по определению роли оксида азота в формировании эффектов фармакологического прекондиционирования никорандилом и миноксидилом

Определение роли оксида озота в реализации феномена ФПК проводили путём блокады индуцибельной NO-синтазы на моделях кожного лоскута и ишемии мышц голени.

Блокада индуцибельной NO-синтазы моделировалась внутрибрюшным введением аминогуанидина, специфического блокатора индуцибельной NO синтазы (iNOS) в дозе 100 мг/кг/сут, ежедневно, на протяжении всего периода введения препарата (Королев А.Е., 2011).

Было сформировано три группы животных на каждую исследуемую модель: с изолированным введением аминогуанидина и его комбинации с никорандилом и миноксидилом. Схемы введения препаратов не меняли.

Методы морфологического исследования

Морфологическое исследование выполнено с применением общегистологических и иммуногистохимических методов прямой детекции изучаемых продуктов клеточной экспрессии в лаборатории научно-образовательного центра «Прикладной иммуноморфологии и цитогенетики» НИУ «БелГУ».

После выведения животных из эксперимента стандартным способом полностью иссекали задние мышцы голени и фиксировали в 10% растворе формалина. Срезы для гистологического исследования изготавливали в строго продольном к мышечным волокнам направлении на ротационном микротоме с системой транспортировки и расправления срезов «НМ 340Е» (Microm International GMbH, Германия). Срезы для стандартного гистологического исследования окрашивали гематоксилином и эозином в

автомате для окраски гистологических срезов и мазков (Microm International GMbH, Германия).

Для иммуногистохимического исследования из тех же блоков изготавливали срезы толщиной 4 мкм, их монтировали на предметные стекла для иммуногистохимических исследований с адгезивным полилизиновым покрытием (Menzel, Германия). При этом на одном стекле монтировали по 2 среза из разных серий на расстоянии 3 см друг от друга и выполняли реакцию на один и тот же антиген. После стандартной депарафинизации выполняли иммуногистохимические исследования. Демаскировку антигенов выполняли в цитратном буфере с рН=7,0. Для выявления реакции применены полимерные системы детекции Ultra Vision (ThermoScientifïc, Великобритания) и Histofme (Nichirei Biosciences, Япония) с хромогеном -диаминобензидином.

В соответствии с задачами работы исследовали экспрессию эндотелиальной (eNOS) и индуцибельной (iNOS) NO-синтазы. Маркером цитопротекции и потенциального роста эндотелия явился CD105 (эндоглин).

На компьютерных изображениях микропрепаратов определяли характер распределения иммуногистохимических реакций и удельную площадь иммунореактивного вещества.

Статистическая обработка результатов исследования

Статистический анализ полученных данных осуществляли в программе Microsoft Excel версии 10.0 при помощи средств пакета анализа. «Описательная статистика» применялась для нахождения среднего значения (М) показателей и ошибки среднего (m) в каждой группе животных; данные в тексте и таблицах представлены в виде М±т. «Двухвыборочный t-тест с различными дисперсиями» использовался для сравнения соответствующих показателей в различных группах животных и определения достоверности различий между ними путем вычисления вероятности возможной ошибки (р). Статистически значимыми считали различия при значениях двустороннего р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изучение влияния фармакологического прекондиционирования никорандилом и миноксидилом на выживаемость кожного лоскута на питающей ножке

При моделировании кожного лоскута на питающей ножке в контрольной группе площадь выжившей ткани составила 1,59±0,03 см2.

В группах с использованием никорандила в дозе 1,3 мг/кг/сут площадь выжившего кожного лоскута составила 2,95±0,04 см2 против 2,42±0,08 см2 в дозе 4,4 мг/кг/сут. Таким образом, в нашем исследовании лучший результат показала доза никорандила - 1,3 мг/кг/сут (р<0,05), которую использовали в дальнейших экспериментах.

При изучении эффективности различных доз миноксидила, наилучшая его прекондиционирующая активность также выявлена в группе с его минимальной дозой (0,5 мг/кг/сут) (р<0,05). Площадь кожного лоскута составила 2,37±0,06 см2, а в группе с максимальной дозой - 2,33±0,70 см2. То есть, целесообразно использовать дозировку миноксидила - 0,5 мг/кг/сут (рис. 1).

| И 1,59 Контрольная

| ■ 2.95* Никорандил 1,3 мг/кг/сут

! Иг!^* Никорандил 4,4 мг/кг/сут

ММ П

2,37* Миноксидил 0,5 мг/кг/сут

Щ 2,33* Миноксидил 1,0 мг/кг/сут

0,5 1 1,5 2 2,5 3 см!

Примечание: * — здесь и далее - р < 0,05 в сравнении с показателями в контрольной группе.

Рисунок 1. Средняя площадь выжившей ткани кожного лоскута при ФПК никорандилом и миноксидилом

Установлено, что никорандил и миноксидил обладают феноменом ФПК и позволяют достоверно увеличить выживаемость кожного лоскута по сравнению с группой контроля, возможный механизм которого реализуется за счет активации АТФ-зависимых калиевых каналов и системы оксида азота.

Более эффективным ФПК обладали меньшие дозы препаратов. Вероятнее всего, это связано с их общим гипотензивным действием: с уменьшением артериального давления неминуемо уменьшается уровень периферической микроциркуляции тканей, что негативно сказывается на их выживаемости, несмотря на прекондиционирующее действие препаратов. С уменьшением дозы никорандила и миноксидила снижается гипотензивное действие, улучшается перфузия тканей и, наряду с феноменом ФПК, выживаемость тканей увеличивается.

2. Оценка влияния фармакологического прекондиционирования никорандилом и миноксидилом на состояние микроциркуляторного русла в ишемизированной мышце голени

Среднее значение уровня микроциркуляции в интактных мышцах голени крыс составило 527±10 ПЕ (рис. 2). В группе ложнооперированных животных на 21 и 28-е сутки уровень микроциркуляции составил 526±10 и 532±13 ПЕ, что доказывает отсутствие негативного влияния анестезирующих средств и операционной травмы на чистоту эксперимента.

У животных контрольной группы среднее значение показателей микроциркуляции было самое низкое в эксперименте и составило 323±7 ПЕ на 21 и 361±9 ПЕ на 28-е сутки.

Использование никорандила позволило увеличить микроциркуляцию в мышце голени крыс на 21 и 28-е сутки по сравнению с группой контроля до 471±39 ПЕ и 759±13 ПЕ соответственно.

Внутрижелудочное введение миноксидила так же способствовало эффективному и достоверному повышению уровня микроциркуляции в мышце голени в сравнении с контрольной группой как на 21-е сутки -428±20 ПЕ, так и на 28-е сутки - 830±36 ПЕ.

759*

Контроль

Никорандил (1,3 мг/кг/еут)

Миноксидил (0,5 мг/кг/сут)

8 | | | 8 | | ПР.

Рисунок 2. Средние значения уровня микроциркуляции в ишемизированной мышце голени при ФПК никорандилом и миноксидилом

При морфологическом исследовании на 21 и 28-е сутки в мышцах голени животных с моделированной ишемией выявлены признаки редукции сосудов микроциркуляторного русла, остаточные изменения в мышечных волокнах и строме мышц. Количество кровеносных капилляров в стромальных промежутках резко снижено. Основная масса мышц была представлена компактно расположенными мышечными волокнами, в которых определялись очаговые дистрофические изменения в виде неравномерности поперечной исчерченности, стертости продольного миофибриллярного рисунка саркоплазмы, участков сегментации саркомеров. Морфологических признаков развития коллатерального кровотока нами не выявлено (рис. 3).

При морфологическом исследовании положительные эффекты ФПК заключались в следующем: в срезах отсутствовали дистрофические изменения мышечных волокон и существенные признаки имевшихся ишемических повреждений. Капилляризация пучков мышечных волокон была равномерной, четко идентифицировалась по структуре стенок капилляров (рис.4). При ФПК в группах с применением обоих препаратов соотношение капилляр/мышечное волокно — составило от 1,0 до 1,2 и не отличалось по срокам.

Рисунок 3.

Морфологические изменения мышц голени на 21-е сутки экперимента: А - очаги фиброзного замещения мышечных волокон; Б — резкое разрежение капиллярной сети с единичными кровенаполненными капиллярами. Окр. Г+Э. Ув. х 40.

Рисунок 4.

Морфологические изменения мышц голени на 21-е сутки эксперимента: равномерная капилляризация

межмышечных промежутков в серии с ФПК никорандилом (А) и миноксидилом (Б); Отмечается выраженное полнокровие венул в мышцах голени. Окр. Г+Э. Ув. х 40.

При иммуногистохимическом исследовании экспрессии СЮ 105 и ¡N08 нами выявлено следующее. В группах с моделированной ишемией в микрососудах мышц голени снижена экспрессия СЭ105 как на 21-е, так и на 28-е сутки. На фоне введения как миноксидила и никорандила экспрессия СО 105 равномерно в высокой степени определялась в эндотелии межмышечных капилляров во всех участках исследованных мышц голени, (рис. 5).

Рисунок 5. Экспрессия CD105 в эндотелии капилляров мышц голени на 21-е (А) и 28-е (Б) сутки эксперимента; повышение экспрессии CD105 при применении миноксидила (В) и никорандила (Г). Иммуногистохимические реакции. Микрофото, х 200.

Экспрессия ¡N08 соответствовала характеру распределения и интенсивности реакции, коррелировала с реакцией на СБ 105 и была наиболее интенсивной в сериях с введением миноксидила и никорандила (рис. 6).

ЫШШШШШШЯЯШШЯШ кмИЧНННМ

Рисунок 6. Экспрессия ¡N08 в эндотелии капилляров мышц голени на 21-е сутки эксперимента после моделированной ишемии (А); на фоне введения миноксидила

(Б) и никорандила (В). Иммуногистохимические реакции. Микрофото, х 200.

3. Оценка сочетанного влияния дистантного ишемического и фармакологического прекондиционирования никорандилом и миноксидилом на состояние ишемизированных мягких тканей

Площадь выжившего кожного лоскута в группе ДИП составила 2,36±0,Ю см2, что достоверно больше, чем в контрольной группе.

Эффективность совместного использования ФПК препаратов и ДИП оказалась меньше, чем при их отдельном использовании. Так для схемы ДИП + ФПК никорандилом средняя площадь выжившей ткани кожного лоскута составила 2,14±0,15 см2, а для схемы ДИП + ФПК миноксидилом -2,36±0,06 см2 (рис. 7).

1,59

.. сутки

Контрольная

2,36* дап

2,14* ДИП + никорандил (1,3 мг/кг/сут)

2,36* ДИП + миноксидил (0,5 мг/кг/сут) 28

0,5 1 1,5 2 2,5 3

Рисунок 7.

Средняя площадь выжившей ткани кожного лоскута при сочетанном

Контроль

702* ДИП

* . ДИП + никорандил (1,3 мг/кг/сут)

662'

- миноксидил (0.5 мг/кг/сут)

§ 1 I

Рисунок 8.

Средние значения уровня

микроциркуляции в ишемизированной мышце голени при сочетанном применении ДИП и ФПК никорандилом применении ДИП и ФПК никорандилом

и миноксидилом.

и миноксидилом.

Уровень микроциркуляции при использовании ДИП на 21-е сутки составил 450±8,4 ПЕ, а на 28-е - 702±23 ПЕ, что достоверно превышает показатели контрольной группы (рис. 8).

Совместное применение ФПК препаратами и ДИП также не приводило к потенциированию прекондиционирующего действия на модели ишемии мышц голени. Так, при использовании схемы ДИП + ФПК никорандилом уровень микроциркуляции составил: 523±27 ПЕ на 21 и 662±28 ПЕ на 28-е сутки эксперимента. Схема ДИП + ФПК миноксидилом позволила добиться уровня микроциркуляции 456±21 и 787±10 ПЕ на 21 и 28-е сутки соответственно.

Положительные эффекты ДИП подтверждены данными гистологического исследования, особенно, к 28-м суткам. Отмечалась равномерная капилляризация пучков мышечных волокон. Структура стенки капилляров и степень насыщенности сосудистых участков форменными элементами крови не отличались от интактных животных. Соотношение капилляр/мышечное волокно составляло в среднем 0,16-0,20 на 21 и 28-е сутки соответственно.

Морфологические изменения при совместном использовании ДИП и ФПК значимо не отличались от эффектов, достигнутых при применении ФПК обоими исследуемыми препаратами. Отмечена равномерная и большая степень капилляризации мышц в сравнении с группой ДИП как на 21-е, так и на 28-е сутки эксперимента.

При иммуногистохимическом исследовании в группах с совместным применением ДИП и ФПК выявлено снижение экспрессии СБ 105 и ¡N08 в сравнении с группами с изолированным использованием ФПК.

Таким образом, при совместном использовании ФПК никорандилом и миноксидилом с ДИП не происходит суммации их эффектов на показатели микроциркуляции в мышцах голени и на выживаемость кожного лоскута.

Это объясняется тем, что применение изучаемых препаратов до оперативного вмешательства вызывает эффект прекондиционирования. В тканях запускается биохимический каскад, активирующий антиапоптические механизмы, одним из которых является активация ЫО-синтазы, что в дальнейшем приводит к накоплению в плазмолемме свободных радикалов, которые препятствуют развитию эффекта ДИП. Учитывая тот факт, что никорандил имеет свойство самостоятельно активировать ЫО-синтазу, следовательно, ещё больше повышать концентрацию МО-радикалов, применение его должно ещё больше блокировать развитие ДИП.

4. Определение роли АТФ-зависимых калиевых каналов в реализации дистантного ишемического и фармакологического прекондиционирования никорандилом и миноксидилом

Роль АТФ-зависимых калиевых каналов в механизме реализации цитопротекторного эффекта никорандила и миноксидила изучали на модели кожного лоскута на питающей ножке.

При введении глибенкламида площадь выжившего кожного лоскута составила 1,59±0,03 см2, что сравнимо с показателями контрольной группы (рис. 9). То есть, глибенкламид в применяемой дозе не влияет на

выживаемость ишемизированных тканей. Применение глибенкламида совместно с ДИП и ФПК миноксидилом практически полностью нивелирует цитопротекторную активность последнего: 1,62±0,03 см2 и 1,65±0,04 см соответственно. Никорандил на фоне введения глибенкламида позволяет увеличить выживаемость кожного лоскута до 1,85±0,05 см2, что достоверно больше, чем в контрольной группе.

Контрольная Глибенкламид (5 мг/кг/сут)

Глибенкламид н

ДИП ДИП

Глибенкламид 2,95»

ь никорандил (I,3 мг/кг/сут) Никорандил (1,3 мг/кг/сут)

Глибенкламид + миноксидил (0,5 мг/кг/сут) Миноксидил (0,5 мг/кг/сут)

0,5

1,5 2 2,5 3

Рисунок 9. Влияние глибенкламида на выживаемость кожного лоскута при ДИП и ФПК никорандилом и миноксидилом

Таким образом выявлено, что изолированное использование глибенкламида не влияет на выживаемость кожного лоскута в ишемическом эпизоде. В группах при совместном его применении с ДИП и миноксидилом происходит полная отмена их прекондиционирующих эффектов. Объяснением этого служит факт блокирования процесса активации АТФ-зависимых калиевых каналов, которые играют ведущую пусковую роль в реализации эффекта ишемического прекондиционирования.

Введение глибенкламида на фоне никорандила значительно уменьшает показатель выживаемости кожного лоскута, однако не отменяет его действия полностью. Это может быть объяснено нитратоподобными свойствами препарата, тем самым способным активировать эндотелиаьную ЫО-синтазу, которая напрямую участвует в каскаде биохимических процессов при формировании толерантности тканей к ишемическим эпизодам.

5. Определение роли оксида азота в формировании эффектов фармакологического прекондиционирования никорандилом и миноксидилом

Введение аминогуанидина привело к достоверному уменьшению площади выжившей ткани по сравнению с контролем и составила 0,92±0,05см2. Данный факт еще раз доказывает немаловажную роль оксида азота в реализации естественных механизмов защиты при ишемии.

Блокада ¡N05 у животных, которым вводился никорандил привела к достоверному уменьшению выживаемости кожного лоскута до 1,91±0,04 см2, но результат достоверно выше, чем в группе контроля (рис. 10).

На фоне введения миноксидила, аминогуанидин нивелирует действие

1 1 II

■ 1.3»

1 ! 1

0,92* 1 1 I

1.91*

1 1 1

1 1,7

2,37

1 1 1 1

Контрольная

Аминогуанидин (100 мг/кг/сут)

Аминогуанидин + никорандил (1,3 мг/кг/сут) 2,95* Никорандил (1,3 мг/кг/сут)

Аминогуанидин + миноксидил (0,5 мг/кг/сут) Миноксидил (0,5 мг/кг/сут)

0,5 1 1,5 2 2,5 3 смз

Рисунок 10. Средняя площадь выжившей ткани кожного лоскута при блокаде ¡N08 аминогуанидином

Роль ¡N08 при ФПК никорандилом и миноксидилом в восстановлении микроциркуляторного русла ишемизированной скелетной мышцы исследовали на модели ишемии мышц голени.

При проведении ЛДФ в группе с введением аминогуанидина, уровень микроциркуляции составил 295±24 ПЕ на 21 и 340±13 ПЕ - на 28-е сутки (рис. 11). Таким образом, введение аминогуанидина оказывает негативное влияние на показатели перфузии тканей.

Контроль

Аминогуанидин (100 мг/кг/сут) Аминогуанидин + никорандил (1,3 мг/кг/сут) Никорандил (1,3 мг/кг/сут) миноксидил (0,5 мг/кг/сут) Миноксидил (0,5 мг/кг/сут)

g 759«

Аминогуанидин

830»

? ПЕ

Рисунок 11. Средние значения микроциркуляции в ишемизированной мышце голени при блокаде ¡N08 аминогуанидином

При использовании никорандила на фоне введения аминогуанидина показатель ЛДФ был достоверно выше, чем в группе контроля и составил 412±17 и 545±26 ПЕ на 21 и 28-е сутки соответственно.

При изучении совместного применения миноксидила и аминогуанидина уровень перфузии тканей составил 344±20 ПЕ на 21 и 324±14 ПЕ на 28-е сутки эксперимента. Данные показатели были на одном уровне с показателями контрольной группы, что говорит о полной отмене прекондиционирующего действия миноксидила.

При морфологическом исследовании мышц после применения миноксидила и аминогуанидина, как и в контрольной группе выявлены признаки редукции сосудов микроциркуляторного русла, очаги фиброзного

17

замещения мышечных волокон (рис.12). В группе с введением никорандила и аминогуанидина не выявлено существенных отличий от группы с изолированным введением никорандила. Мышцы голени характеризовались равномерной степенью васкуляризации (рис. 13).

Рисунок 13. Морфологичекие изменения мышщ голени на 28-е сутки в группе никорандил+миногсидил: равномерная высокая степень капилляризации мышц голени, полнокровие венулярных сосудов микроциркуляторного русла. Окр. Г+Э. Ув. х 40.

При морфологическом исследовании в группе с использованием миноксидила и аминогуанидина выявлено резкое снижение количества кровеносных капилляров в стромальных промежутках между мышечными волокнами. Основная масса мышц представлена компактно расположенными мышечными волокнами, в которых определялись очаговые дистрофические изменения в виде неравномерности поперечной исчерченности, стертости продольного миофибриллярного рисунка саркоплазмы, участков сегментации саркомеров.

При иммуногистохимическом исследовании выявлено некоторое снижение экспрессии как СО 105, так и ¡N08 в эндотелии капилляров и других сосудов микроциркуляторного русла. Распределение и интенсивность реакции были очагово снижены (рис. 14).

9НННШВМ

Рисунок 14. Экспрессия ¡N08 в эндотелии капилляров мышц голени на фоне введения аминогуанидина на 28-е сутки эксперимента: снижение экспрессии при применении никорандила (А) и миноксидила (Б). Иммуногистохимические реакции. Микрофото, х 200.

РИСУНОК юи^ч'"'""..

изменения мышц голени на 28-е сутки экперимента в группе миноксидил+аминогуанидин: очаговые дистрофические изменения, стертость поперечной исчерченности, резкое разрежение капиллярной сети.

Окр. Г+Э. Ув. х 40.

Полученный результат свидетельствует о важной роли индуцибельной КЮ-синтазы в механизме компенсаторных реакций после ишемических эпизодов. В поздней фазе ИПК и механизме восстановления перфузии тканей на первый план выходит индуцибельная 1ЧО-синтаза, выполняющая триггерную роль.

Исследование выявило неполную блокаду прекондиционирующего эффекта никорандила аминогуанидином, и полную отмену действия миноксидила на моделях кожного лоскута на питающей ножке и ишемии мышцы голени крыс.

Данный результат объясняется тем, что активация АТФ-зависимых калиевых каналов, через сложный каскадный механизм приводит к увеличению синтеза индуцибельной ЫО-синтазы, блокада которой приводит к уменьшению выработки оксида азота и, в конечном итоге, снижению толерантности тканей к ишемии. Никорандил, самостоятельно являющийся донатором N0, позволяет поддерживать концентрацию молекул N0, тем самым, реализуя эффект прекондиционирования.

При применении миноксидила увеличение активности индуцибельной ЫО-синтазы происходит только через активацию АТФ-зависимых калиевых каналов, что приводит к реполяризации клеточной мембраны, увеличению концентрации активных форм кислорода (рис. 15).

Примечание. К-АТФ каналы - АТФ зависимые калиевые каналы; еЫОБ -эндотелиальная МО-синтаза; ¡N05 - индуцибельная ЫО-синтаза; N0 - оксид азота; РФК - реактивные формы кислорода; ЦОГ-2 - циклооксигеназа-2. Рисунок 15. Фрагмент механизма ишемического прекондиционирования и гипотетическая роль никорандила и миноксидила в нем

РгтиЯриь-памип

Миноксидил

На фоне ишемии в тканях увеличивается количество молекул оксида азота, которые взаимодействуя с активными формами кислорода приводят к образованию пироксинитритрадикалов, которые, в свою очередь, активируют протеинкиназу С. е-изоформа протеинкиназы С запускает комплексный сигнальный каскад, включающий активацию различных тирозинкиназ, митогенактивируемых протеинкиназ и транскрипционного фактора, что приводит к увеличению выработки индуцибельной ИО-синтазы.

Следовательно при блокаде ¡N08 не происходит реализации эффекта прекондиционирования миноксидила. При введении никорандила также происходит активация АТФ-зависимых калиевых каналов, что приводит к реализации вышеперечисленного каскада с увеличением активности ¡N08. Однако, никорандил, самостоятельно выступающий в роли донатора N0, позволяет поддерживать достаточную концентрацию N0 в клетках, тем самым реализуя свой прекондиционирующий эффект.

Результаты, полученные в нашем исследовании, позволяют говорить о выраженных прекондиционирующих свойствах никорандила и миноксидила, в основе механизма реализации которых лежит активация АТФ-зависимых калиевых каналов и запуск «системы оксида азота». Препараты также могут быть рекомендованы к дальнейшему изучению для профилактики ишемических повреждений в хирургии, неврологии и кардиологии.

ВЫВОДЫ

1. Никорандил (1,3 мг/кг/сут) и миноксидил (0,5 мг/кг/сут) способствуют увеличению выжившей ткани кожного лоскута на питающей ножке в 1,9 и 1,5 раз соответственно в сравнении с группой контроля.

2. Применение никорандила (1,3 мг/кг/сут) и миноксидила (0,5 мг/кг/сут) при моделированной ишемии мышц голени способствует повышению уровня микроциркуляции к 28-м суткам в 2,1 и 2,3 раза соответственно, в сравнении с группой контроля, нивелирует ишемическое повреждение мышечной ткани и способствует повышению уровня экспрессии СО-105 (эндоглина) и ¡N08 в эндотелии капилляров.

3. Сочетанное применение дистантного ишемического и фармакологического прекондиционирования никорандилом и миноксидилом не приводит к суммации их эффектов, напротив, показатели выживаемости кожного лоскута на питающей ножке и уровня микроциркуляции в ишемизированной мышце голени при сочетанном применении не превосходили аналогичные показатели в группах с изолированным их использованием, что доказывает наличие единых, конкурирующих механизмов в реализации прекондиционирующих эффектов.

4. Блокада АТФ-зависимых калиевых каналов глибенкламидом (5 мг/кг/сут) на модели кожного лоскута на питающей ножке снижает эффекты фармакологического прекондиционирования никорандила и полностью нивелирует эффект миноксидила.

5. Блокада ¡N08 аминогуанидином (100 мг/кг/сут) приводит к снижению прекондиционирующего эффекта никорандила на моделях кожного лоскута на питающей ножке и ишемизированной мышцы голени и отмене действия миноксидила на данных моделях.

20

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Экспериментально обоснованные данные о возможности применения фармакологического прекондиционирования никорандилом и миноксидилом для оптимизации выживаемости ишемизированных тканей и улучшения в них уровня микроциркуляции могут использоваться в учебном процессе на кафедрах фармакологии и хирургии медицинских вузов.

2. Полученные результаты эффектов фармакологического прекондиционирования никорандилом и миноксидилом позволяют рекомендовать их для проведения доклинических и клинических испытаний при ишемическом повреждении кожи и мягких тканей.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Фармакологическоепрекондиционирвание эритропоэтином при ишемии конечности / И.М. Колесник, М.В. Покровский, Т.Г. Покровская [и др.] // Биомедицина. - 2011. - № 4. - С. 90-93.

2. Использование никорандила и миноксидила как средств для фармакологического прекондиционирования / Д.А. Ефременкова, И.М. Колесник, A.M. Ефременков // Актуальные вопросы современной клинической и экспериментальной медицины: материалы X науч.-практ. конф. студентов, интернов, ординаторов, аспирантов, молодых ученых, посвящ. 10-летию Института последипломного мед. образования (Белгород, 27 апр. 2012 г.). - Белгород, 2012. - С. 159-160.

3. К вопросу о роли индуцибельной NO-синтазы в реализации цитопротекторного эффекта фармакологического прекондиционирования никорандилом / Д.А. Ефременкова, И.М. Колесник, A.M. Ефременков // Актуальные вопросы современной клинической и экспериментальной медицины: материалы X науч.-практ. конф. студентов, интернов, ординаторов, аспирантов, молодых ученых, посвящ. 10-летию Института последипломного мед. образования (Белгород, 27 апр. 2012 г.). - Белгород, 2012.-С. 161-162.

4. Колесник, И.М. Фармакологическое прекондиционирование никорандилом и миноксидилом - возможность применения в хирургии / И.М. Колесник, Д.А. Ефременкова, М.В. Покровский // Современные проблемы медицинской химии. Направленный поиск новых лекарственных средств: материалы IV Всерос. науч.-практ. семинара молодых ученых с междунар. участием: прил. к журн. Вестник ВолГМУ. - 2012. - С. 147-149.

5. Новая возможность применения миноксидила в хирургии / Д.А. Ефременкова, И.М. Колесник, C.B. Ходов [и др.] // Актуальные вопросы современной клинической и экспериментальной медицины: материалы X науч.-практ.конф. студентов, интернов,ординаторов, аспирантов, молодых ученых, посвящ. 10-летию Института последипломного мед. образования (Белгород, 27 апр. 2012 г.). - Белгород, 2012. - С. 121-123.

6. Перспектива применения фармакологического прекондиционирования в хиругии / И.М. Колесник, Д.А. Ефременкова, О.В. Молчанова [и др.] // Науч. ведомости Белгород.гос. ун-та. - 2012. - № 4 (123). -С. 13-19.

7. Роль индуцибельнойсинтазы в цитопротекторном эффекте дистантного ишемического прекондиционирования и фармакологического прекондиционированияникорандилом и миноксидилом / И.М. Колесник, М.В. Покровский, В.А. Лазаренко, Д.А. Ефременкова // Образованието и

21

науката на XXI век - 2012: материали за VIII междунар. науч.-практ. конф. (София, 17-25 октомври 2012 г.). Т. 36: Лекарство. - София, 2012. - С. 41-43.

8. Сочетанное применение дистантного ишемического и фармакологического прекондиционированияникорандилом / Д.А. Ефремен-кова, И.М. Колесник, A.M. Ефременков // Актуальные вопросы современной клинической и экспериментальной медицины: материалы X науч,-практ.конф. студентов, интернов, ординаторов, аспирантов, молодых ученых, посвящ. 10-летию Института последипломного мед. образования (Белгород, 27 апр. 2012 г.). - Белгород, 2012. - С. 162-163.

9. Способ фармакологической коррекции ишемии скелетной мышцы силденофилом / С.В. Ходов, И.М. Колесник, Д.А. Ефременкова[и др.] // Актуальные вопросы современной клинической и экспериментальной медицины: материалы X науч.-практ.конф. студентов, интернов,ординаторов, аспирантов, молодых ученых, посвящ. 10-летию Института последипломного мед. образования (Белгород, 27 апр. 2012 г.). - Белгород, 2012. - С. 150-151.

10. Экспериментальная оценка влияния силденафила на неоангиогенез в ишемизированной скелетной мышце / И.М. Колесник, С.В. Ходов, М.В. Покровский [и др.] // Инновации в современной фармакологии: материалы IV съезда фармакологов России (Казань, 18-21 сент. 2012 г.). - М., 2012.-С. 91.

11. Эффекты фармакологического прекондиционирования нико-рандилом и миноксидилом в хирургии / И.М. Колесник, М.В. Покровский, В.А. Лазаренко, Д.А. Ефременкова // Кубан. науч. мед.вестн. - 2012. - № 3 (132). - С. 86-88.

12. Экспериментальное обоснование возможности фармакологического прекондиционирования мягких тканей силденафилом / И.М. Колесник, М.В. Покровский, В.А. Лазаренко [и др.] // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия: Медицина. Фармация. - 2012. - № 22 (141). Выпуск 20/3. - С. 122-125.

13. Влияние фармакологического прекондиционирования активаторами АТФ-зависимых калиевых каналов на состояние микроциркуляторного русла в ишемизированной скелетной мышце / И.М. Колесник, М.В. Покровский, В.А. Лазаренко [и др.] // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия: Медицина. Фармация. - 2012. - № 22 (141). Выпуск 20/3. - С. 126-128.

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

АТФ - аденозинтрифосфат Г-Э - гематоксилин-эозин

ДИП - дистантное ишемическое прекондиционирование

ИПК - ишемическое прекондиционирование

ЛДФ - лазерная допплеровская флоуметрия

ПЕ - перфузионные единицы

РФК - реактивные формы кислорода

ФПК - фармакологическое прекондиционирование

eNOS - эндотелиальная NO-синтаза

iNOS — индуцибельная NO-синтаза

NO - оксид азота

Подписано в печать 04.02.2013. Формат 60x84/8 Гарнитура Times. Усл. п.л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 43. Оригинал-макет подготовлен и тиражирован в ИД «Белгород» 308015 г. Белгород, ул. Победы, 85