Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Применение рекомбинантного эритропоэтина для фармакологической коррекции ишемических повреждений миокарда и эндотелиальной дисфункции

На правах рукописи

4841040

Королев Антон Евгеньевич

ПРИМЕНЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО ЭРИТРОПОЭТИНА ДЛЯ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ КОРРЕКЦИИ ИШЕМИЧЕСКИХ ПОВРЕЖДЕНИЙ МИОКАРДА И ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИИ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Курск-2011

О Л М . гэ

^ 1 ¿и 11

4841843

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Покровский Михаил Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Резников Константин Михайлович доктор медицинских наук, профессор Ивашев Михаил Николаевич

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Росздрава».

Защита состоится « » СХ^М^ _2011 г. в — часов

на заседании диссертационного 'совета Д 208.039.03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВГ10 КГМУ Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан а'// » "-СССО/Ь^Ъ^2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Пашин Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Эритропоэтин (ЕРО) - индуцибельный гипоксией гормон, который является существенным для нормального эритропоэза в костном мозге. Введение рекомбинантного эритопоэтина -эффективный и безопасный терапевтический подход к лечению анемии, связанной с хронической почечной недостаточностью (Collins A.J., 2003). Однако рецепторы ЕРО также широко распространены в сердечно-сосудистой системе, включая эндотелиальные, гладкомышечные и другие типы клеток, а негемопоэтические эффекты рекомбинантного эритропоэтина становятся все более и более очевидными. В настоящее время эритропоэтин рассматривают как мощный защитный тканевой цитокин. Появляются сведения о том, что у рекомбинантного эритропоэтина есть потенциально благоприятное воздействие на сердечно-сосудистую систему. Кроме того, ЕРО увеличивает число функционально активных предшественников эндотелиальных клеток, стимулируя таким образом ангиогенез (Smith K.J., Bleyer A.J., Little W.C., 2003).

Многочисленные фундаментальные исследования последних лет подтвердили роль дисфункции сосудистого эндотелия в патогенезе многих сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). Доказано, что ключевую роль в патогенезе атеросклероза, артериальной гипертонии и ишемической болезни сердца играет именно эндотелиальная дисфункция (ЭД) (Астанина И.А., 2004; Белоусов Ю.Б., 2004). При этом ЭД проявляет себя либо в виде спазма артерий, либо в виде отсутствия реакции в ответ на воздействие физиологических или фармакологических стимулов, тогда как нормальные сосуды реагируют дилатацией. Такая патологическая реакция эндотелия считается начальным этапам развития атеросклероза с вовлечением не только крупных артерий, но и сосудов микроциркуляторного русла (Bell D.M., 2001; Berk B.C., 2002). При этом тяжесть течения атеросклероза всегда коррелирует с ЭД (Vasa M., 2002), а стандартная терапия ССЗ не устраняет ЭД, при этом сохраняется повышенный риск развития осложнений (Галенко A.C., Шуленин С.Н., 2006; Spicket C.V., 2007).

Нарушенная NO-зависимая вазодилатация и парадоксальная вазоконстрикция эпикардиальных сосудов приобретают особое клиническое значение для развития ишемии миокарда в условиях умственного и физического стресса или холодовой нагрузки. Учитывая тот факт, что перфузия миокарда регулируется резистивными коронарными артериями, тонус которых зависит от вазодилататорной функции коронарного эндотелия, даже при отсутствии атеросклеротических бляшек дефицит NO в коронарном эндотелии способен привести к миокардиальной ишемии.

Поиск эффективных средств коррекции нарушенной эндотелиальной функции у больных с инфарктом миокарда остается одним из важных направлений современной кардиологии. В связи с этим интерес к изучению физиологического феномена, названного прекондиционированием, со стороны как экспериментальной, так и практической медицины огромен.

Свидетельством этому являются многочисленные публикации (Simon R.P., 2003; Ostadalova I., 2002; Perez-Pinzon M.A., 2007), в том числе в ведущих мировых научных изданиях (Becker К., 2009). Метод прекондиционирования нашел широкое применение в кардиохирургии (Parsa С.J., 2007), сосудистой хирургии, операциях на почках и головном мозге (Ren С., Gao X., 2008; Siddiq A., Aminova L.R., 2009; Tramontano A.F., 2003).

Обнаружено, что устойчивость тканей к ишемии может повышаться в результате прекондиционирования, вызванного короткими эпизодами ишемии - реперфузии. При этом появляется «временное терапевтическое окно» для проведения хирургических вмешательств. Показано, что ишемическое прекондиционирование является общебиологическим механизмом и реализуется за счет активации АТФ-зависимых калиевых каналов (К+АТФ-каналы) в ответ на выделение аденозина, брадикинина, опиоидов и др. (Gross G.J., 2001). Свидетельством естественного механизма реализации является система многоуровневого иерархического дублирования, включающая нейрогенный, гуморальный и внутриклеточный компоненты, связанные с дыханием в митохондриях. Последнее указывает на существование универсальной «фармакологической мишени» для запуска феномена прекондиционирования.

Интригующим с точки зрения практического использования и, одновременно малоизученным является феномен дистантного прекондиционирования, суть которого состоит в том, что кратковременные эпизоды ишемии одного органа (почки, брыжейки, нижней конечности) повышают устойчивость других органов к тяжелым ишемическим повреждениям (Dave K.R., 2006). Наибольшее развитие данная концепция получила в работах, посвященных изучению реакции сердца и головного мозга. Однако предполагаемый механизм реализации феномена прекондиционирования указывает на возможность его универсального использования в хирургии для защиты органов в условиях редуцированного кровообращения и, возможно, стимуляции неоангиогенеза.

В фармакологическом аспекте одним из наиболее перспективных гуморальных агентов, принимающих участие в реализации феномена прекондиционирования, является эритропоэтин. Предпосылкой к этому являете^ то, что период полувыведения его значительно выше, чем других гуморальных агентов прекондиционирования (аденозин, брадикинин, опиоиды), следовательно, «временное терапевтическое окно» должно быть существенно шире. Не исключается возможность использования эритропоэтина как специфического активатора фактора роста эндотелия сосудов для стимуляции неоваскулогенеза (Van der Meer P., 2005).

В лаборатории кардиофармакологии НИИ экологической медицины КГМУ ранее проводились исследования влияния рекомбинантного эритропоэтина и дистантного ишемического прекондиционирования (ДИП) на выживаемость кожного лоскута на питающей ножке и неоваскулогенез. Полученные результаты позволили сделать заключение о том, что применение рекомбинантного эритропоэтина и дистантного ишемического

прекондиционирования увеличивает выживаемость изолированного кожного лоскута на ножке и показатели микроцикуляции в ишемизированной контрлатеральной конечности за счет уменьшения очага некроза и стимуляции неоваскулогенеза.

Отдельно, вселяют оптимизм сведения об эндотелио- и кардиопротективных эффектах как прекондиционирования, так и эритропоэтина, что, несомненно, требует дальнейшего углубленного изучения.

Таким образом, изложенное свидетельствует об актуальности исследования механизмов протективного действия и возможности использования дистантного ишемического прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина как универсального пути оптимизации выживания ишемизированных тканей.

Цель исследования: провести оценку эффективности применения рекомбинантного эритропоэтина при моделировании коронаро-окклюзионного инфаркта миокарда и Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние рекомбинантного эритропоэтина на величину зоны некроза при моделировании коронаро-окклюзионного инфаркта миокарда у лабораторных кроликов.

2. Изучить влияние дистантного ишемического прекондиционирования на величину зоны некроза при моделировании коронаро-окклюзионного инфаркта миокарда у лабораторных кроликов.

3. Оценить эффективность комбинации рекомбинантного эритропоэтина и ишемического прекондиционирования на модели коронаро-окклюзионного инфаркта миокарда у лабораторных кроликов.

4. Изучить механизмы реализации эффектов рекомбинантного эритропоэтина через активацию системы синтеза оксида азота и АТФ-зависимые калиевые каналы по механизму ишемического прекондиционирования.

5. Изучить противовоспалительные эффекты рекомбинантного эритропоэтина на модели формалинового отека стопы у мышей и влияние на сосудистую проницаемость по методу И.А. Ойвина.

6. Изучить эндотелио- и кардиопротективные эффекты рекомбинантного эритропоэтина при Ь-ЫАМЕ-индуцированном дефиците оксида азота.

Научная новизна исследования. В результате выполнения исследования впервые предложены эффективные способы уменьшения зоны некроза при моделировании коронаро-окклюзионного инфаркта миокарда с помощью рекомбинантного эритропоэтина и дистантного ишемического прекондиционирования. Обоснована возможность применения рекомбинантного эритропоэтина в субэритропоэтических дозах как средства для фармакологического прекондиционирования при состояниях, сопровождающихся ишемическими нарушениями и эндотелиальной

дисфункцией. В экспериментах на лабораторных мышах и лабораторных кроликах-альбиносах доказаны противовоспалительные эффекты рекомбинантного эритропоэтина.

Показано, что положительный эффект рекомбинантного эритропоэтина обусловлен их конечным действием на митохондриальные К+АТФ-каналы, eNOS и iNOS. Механизмы реализации кардиопротективного действия ишемического прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина обусловлены их влиянием на нитроксидэргическую систему, сосудистую проницаемость и АТФ-зависимые калиевые каналы. Это позволяет рассматривать эритропоэтин как основной триггер в развитии положительного протективного эффекта дистантного прекондиционирования.

Изучена возможность коррекции L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции рекомбинантным эритропоэтином в субэритропоэтических дозах и показаны его эндотелио- и кардиопротективные эффекты.

По результатам проведенных экспериментальных исследований получен 1 патент РФ на полезную модель, получено 1 положительное решение о выдаче патента РФ на изобретение, подано 3 заявки на получение патента РФ.

Практическая значимость. В работе экспериментально обоснована эффективность применения дистантного ишемического и фармакологического прекондиционирования для профилактики и коррекции ишемических нарушений в миокарде.

Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные клинические испытания дистантного прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина в субэритропоэтических дозах для профилактики и коррекции ишемических нарушений в миокарде.

Внедрение результатов научных исследований. Результаты работы используются в лекционных курсах кафедры фармакологии ГОУ ВПО КГМУ, кафедры фармакологии и фармацевтических дисциплин ИПМО ГОУ ВПО БелГУ и кафедры фармакологии, клинической фармакологии и фармации медицинского института ГОУ ВПО «Орловский государственный университет».

Апробация работы. Материалы работы доложены на итоговых научных сессиях и международных конференциях молодых ученых (Курск, 2009-2010), III Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология и биомедицинская инженерия» (Курск, 2010), XVI и XVII национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2010). Апробация диссертации проведена на научно-практической конференции кафедр фармакологии; травматологии; ортопедии и военно-полевой хирургии; клинической фармакологии; внутренних болезней № 2; анатомии человека; биоорганической химии; инфекционных болезней и эпидемиологии; мобилизационной подготовки здравоохранения и медицины катастроф; нормальной физиологии

им. профессора A.B. Завьялова; общей химии; фармакогнозии и ботаники; НИИ Экологической медицины КГМУ.

По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе три из них - в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.

Положения, выносимые на защиту.

1. Рекомбинантный эритропоэтин достоверно, по сравнению с контрольной группой, уменьшает величину зоны некроза при моделировании коронаро-окклюзионного инфаркта миокарда. Блокада АТФ-зависимых калиевых каналов глибенкламидом, неселективная блокада NO-синтазы с помощью L-NAME, селективная блокада индуцибельной NO-синтазы с помощью аминогуанидина полностью нивелирует корригирующий эффект дистантного прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина при моделировании коронаро-окклюзионного инфаркта миокарда.

2. Рекомбинантный эритропоэтин достоверно, по сравнению с контрольной группой, оказывает противовоспалительное действие при моделировании формалинового отека стопы мышей и изучении сосудистой проницаемости по методу И.А. Ойвина, которое реализуется по механизму дистантного ишемического прекондиционирования с вовлечением АТФ-зависимых калиевых каналов, eNOS и iNOS.

3. Рекомбинантный эритропоэтин, вводимый подкожно в дозе 50 МЕ/кг на первые, третьи и пятые сутки эксперимента, оказывает эндотелио- и кардиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции, выражающееся в уменьшении коэффициента эндотелиальной дисфункции, снижении адренореактивности, предотвращении исчерпания миокардиального резерва, нормализации биохимических маркеров и морфологических показателей функции сосудистого эндотелия, которые реализуются по механизму дистантного ишемического прекондиционирования с вовлечением АТФ-зависимых калиевых каналов, eNOS и iNOS.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 272 источника, из которых 53 отечественных и 219 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста, содержит 12 таблиц и 31 рисунок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проведены на 30 крысах линии Wistar массой 250-300 г, 102 лабораторных кроликах массой 2-2,5 кг, 60 лабораторных мышах массой 18-22 г. Для исследования взяты животные без внешних признаков заболевания, прошедшие карантинный режим вивария Курского

государственного медицинского университета. В ходе эксперимента животные содержались в условиях стандартной экспериментальной биологически чистой комнаты, температура воздуха составляла 22-24°С, освещение - 12 ч/12 ч светлый/темный цикл, крысы получали гранулированный корм и фильтрованную водопроводную воду.

Все исследования проводили в одно и то же время суток во второй половине дня с соблюдением принципов, изложенных в «Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1986). Наркотизацию осуществляли внутрибрюшинным введением водного раствора хлоралгидрата в дозе 300 мг/кг. Выведение животных из эксперимента - его передозировкой.

Животных распределяли по группам (не менее 10 животных в группе при проведении исследований на крысах и мышах, не менее 6 животных в группе при проведении исследования на кроликах) путем стратифицированной рандомизации со стратификацией по массе тела, условиям содержания и питания, а также по проводимым операциям и манипуляциям.

Влияние рекомбинантного эритропоэтина на размер зоны некроза при инфаркте миокарда проводили на модели коронаро-окклюзионного инфаркта миокарда у кроликов. При этом инфаркт миокарда воспроизводился на наркотизированных животных (хлоралгидрат 300 мг/кг), находящихся на управляемом дыхании, путем перевязки нисходящей ветви левой коронарной артерии на уровне нижнего края ушка левого предсердия, с последующей регистрацией ЭКГ во II стандартном отведении в течение 20 минут.

Фармакологическое прекондиционирование осуществляли с помощью внутривенного введения рекомбинантного эритропоэтина в дозе 50 МЕ/кг. Локальное ишемическое прекондиционирование моделировали путем трех периодов временной окклюзии левой коронарной артерии на 2 и 5 минут в чередовании с периодами реперфузии. Дистантное ишемическое прекондиционирование осуществляли путем наложения жгута на верхнюю треть бедра на 10 минут. Контролем правильности наложения жгута служило отсутствие пульса на артериях голени.

После выведения животных из эксперимента поперечные срезы миокарда производили через каждые 0,8 см, начиная с уровня 0,8 см ниже места .наложенной лигатуры. Таким образом, от каждого животного исследованию подвергались 4 поперечных среза миокарда.

Срезы миокарда помещали в емкости, содержащие фосфатный буфер (pH 7,4) и 1 мг/мл трифенилтетразолия бромида. Соотношение масс участков ткани и буфера составляло 1:9. Бюксы помещали в термостат, инкубировали при 37°С для образования красного формазана. После образования красного формазана срезы фотографировали. Подсчет площадей интактного и некротизированного миокарда левого желудочка производили на каждом из четырех произведенных срезов с помощью попиксельного анализа в программе Adobe Photoshop 9.0.

Противовоспалительный эффект рекомбинантного эритропоэтина оценивали на модели формалинового отека стопы у мышей и по методу

{-i.A. Ойвина. Фармакологическое прекондиционирование осуществляли с помощью введения рекомбинантного эритропоэтина в дозе 50 МЕ/кг, дистантное ишемическое прекондиционирование - путем наложения жгута на верхнюю треть бедра на 10 минут.

С целью подтверждения гипотезы о реализации эффектов прекондиционирования через активацию системы синтеза оксида азота и АТФ-зависимые калиевые каналы животным вводили L-NAME в дозе 25 мг/кг/сут., глибенкламид в дозе 0,4 мг/кг и аминогуанидин в дозе 100 мг/кг.

Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов фармакологического прекондиционирования с помощью рекомбинантного эритропоэтина при моделировании L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции. L-NAME вводили внутрибрюшинно в дозе 25 мг/кг/сут в течение 7 дней. Рекомбинантный эритропоэтин вводили внутрибрюшинно в дозе 50 МЕ/кг на первые, третьи и пятые сутки от начала эксперимента.

На 8-й день от начала эксперимента под наркозом (хлоралгидрат 300 мг/кг) вводили катетер в левую сонную артерию для регистрации показателей. Болюсное введение фармакологических агентов осуществляли в правую бедренную вену. Показатели гемодинамики: систолическое артериальное давление (САД), диастолическое артериальное давление (ДАД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряли непрерывно посредством аппаратно-программного комплекса "Biopac". Проводили функциональные пробы: внутривенное введение ацетилхолина (АХ) (40 мкг/кг) (Laursen J.B., 1997) и нитропруссида натрия (НП) (30 мкг/кг) (Галаган М.Е., 1991).

Исследование сократимости миокарда после моделирования патологии проводили у наркотизированных крыс, находящихся на управляемом дыхании. Полость левого желудочка зондировали иглой через верхушку сердца и посредством аппаратно-программного комплекса "Biopac" регистрировали показатели кардиогемодинамики (левожелудочковое давление (ЛЖД), максимальную скорость сокращения (+dp/dt max), максимальную скорость расслабления (-dp/dt max), частоту сердечных сокращений (ЧСС)).

Для оценки функциональных возможностей миокарда у животных проводили нагрузочные пробы в представленной последовательности:

1. Проба на адренореактивность - внутривенное одномоментное введение раствора адреналина гидрохлорида 110" моль/л, из расчета 0,1 мл на 100 г (Меерсон Ф.З., 1980).

2. Нагрузка сопротивлением - пережатие восходящей аорты на 30 секунд (Меерсон Ф.З., 1980).

3. 3-минутная гипоксия с последующей реоксигенацией (Пашин Е.Н.,

1993).

Биохимическими маркерами эндотелиальной дисфункции служили Total NO (NOx) и экспрессия эндотелиальной NO-синтазы (eNOS). Патоморфологическую оценку проводили по морфометрическим показателям поперечного сечения кардиомиоцитов.

Статистический анализ полученных данных осуществляли в программе Microsoft Word 2003 при помощи средств пакета анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты исследования влияния рекомбинантного эритропоэтина на величину зоны некроза при моделировании коронаро-окклюзионного инфаркта миокарда

Наложение лигатуры на нисходящую ветвь левой коронарной артерии у крыс в контрольной группе животных приводило к развитию некроза миокарда левого желудочка, размер которого составил 27,3±1,2% (табл. 1).

Таблица 1

Влияние рекомбинантного эритропоэтина, местного и дистантного прекондиционирования на величину зоны некроза при моделировании _коронаро-окклюзионного инфаркта миокарда (М±ш, п=6)_

Группа Площадь некроза, %

Контроль (ИМ) 27,3±1,2

ИМ + местное прекондиционирование 11,8±0,8*

ИМ + дистантное прекондиционирование 9,4±0,5 *

ИМ + эритропоэтин 13,2±0,3*

ИМ + эритропоэтин + дистантное прекондиционирование 7,4±0,6*

Примечание. ИМ - здесь и везде далее - инфаркт миокарда; * - р<0,05 в сравнении с контролем.

Применение местного прекондиционирования путем пережатия левой коронарной артерии за 30 минут до моделирования инфаркта миокарда привело к достоверному уменьшению площади некротизированного миокарда до 11,8±0,8% (табл. 1).

Применение дистантного прекондиционирования путем пережатия бедренной артерии, фармакологического прекондиционирования путем внутривенного введения рекомбинантного эритропоэтина в дозе 50 МЕ/кг и их сочетания за 30 минут до моделирования коронаро-окклюзионного инфаркта миокарда привело к достоверному уменьшению площади некротизированного миокарда.

Наибольшая протективная активность обнаружена при сочетанном применении эритропоэтина и дистантного ишемического прекондиционирования, показатель площади некротизированного миокарда в данной группе животных составил 7,4±0,6% (табл. 1).

Неселективная блокада ЫО-синтазы с помощью внутривенного введения Ь-ЫАМЕ в дозе 25 мг/кг и селективная блокада индуцибельной Т^О-синтазы (¡N08) с помощью внутривенного введения 100 мг/кг на фоне моделирования инфаркта миокарда, применения рекомбинантного эритропоэтина и дистантного ишемического прекондиционирования привела к блокированию эффектов ишемического и фармакологического прекондиционирования. Величина зоны некроза в группе животных, получавших Ь-ЫАМЕ и рекомбинантный эритропоэтин на фоне моделирования инфаркта миокарда,

составила 23,5±1,2%, в группе животных, получавших Ь-ЫАМЕ и дистантное прекондиционирование, - 25,3±0,8%, аминогуанидин и рекомбинантный эритропоэтин - 28,6±2,9%, аминогуанидин и дистантное прекондиционирование - 22,8±2,0% (табл. 2).

Таблица 2

Влияние блокады КО-синтазы и АТФ-зависимых калиевых каналов

на эффекты рекомбинантного эритропоэтина и дистантного прекондиционирования при моделировании коронаро-окклюзионного

Группа Площадь некроза, %

ИМ + L-NAME + дистантное прекондиционирование 23,5±1,2

ИМ + L-NAME + эритропоэтин 25,3±0,8

ИМ + глибенкламид + дистантное прекондиционирование 24,2±1,5

ИМ + глибенкламид + эритропоэтин 21,2±1,1

ИМ + аминогуанидин + дистантное прекондиционирование 22,8±2,0

ИМ + аминогуанидин + эритропоэтин 28,6±2,9

Блокада АТФ-зависимых калиевых каналов с помощью внутрибрюшинного введения глибенкламида дозе 0,4 мг/кг на фоне моделирования инфаркта миокарда, применения рекомбинантного эритропоэтина и дистантного ишемического прекондиционирования привела к блокированию эффектов ишемического и фармакологического прекондиционирования. Величина зоны некроза в группе животных, получавших глибенкламид и рекомбинантный эритропоэтин на фоне моделирования инфаркта миокарда, составила 24,2±1,5%, в группе животных, получавших аминогуанидин и дистантное прекондиционирование, -21,2±1,1%.

Исследование противовоспалительного действия рекомбинантного эритропоэтина на моделях формалинового отека стопы мышей и по методу ILA. Онвина

Результаты исследования противовоспалительной активности препаратов по методу И.А. Ойвина представлены на рисунках 1,2.

В результате проведенных исследований обнаружено, что подкожное введение рекомбинантного эритропоэтина в дозе 50 ME/кг не оказывает статистически значимого влияния на среднюю площадь сине-окрашенных пятен, однако время появления пятен при введении эритропоэтина достоверно увеличивается. Проведение дистантного ишемического прекондиционирования позволило достоверно снизить площадь сине-окрашенных пятен и увеличить время до их появления. Одновременное применение эритропоэтина и прекондиционирования не влияло на среднюю площадь пятен, однако при анализе времени появления пятен обнаружено положительное фармакодинамическое взаимодействие. Введение аминогуанидина и

глибенкламида практически полностью блокировало эффекты эритропоэтина и дистантного ишемического прекондиционирования.

1 - Интактные; 2 - ЕРО; 3 - ДИП; 4 - ЕРО+ДИП; 5 - ЕРО+ДИП+аминогуанидин; 6 - ЕРО+ДИП+глибенкламид.

Рис. 1. Влияние эритропоэтина, дистантного ишемического прекондиционирования, глибенкламида, аминогуанидина и их комбинаций на среднюю площадь сине-окрашенных пятен при исследовании противовоспалительной активности по методу И.А. Ойвина.

Примечание. Здесь и везде далее: ЕРО - рекомбинантный эритропоэтин, ДИП -дистантное ишемическое прекондиционирование; *- р<0,05 в сравнении с интактными.

1 - Интактные; 2 - ЕРО; 3 - ДИП; 4 - ЕРО+ДИП; 5 - ЕРО+ДИП+аминогуанидин; 6 - ЕРО+ДИП+глибенкламид.

Рис. 2. Влияние эритропоэтина, дистантного ишемического прекондиционирования, глибенкламида, аминогуанидина и их комбинаций на время появления сине-окрашенных пятен при исследовании противовоспалительной активности по методу И.А. Ойвина.

Примечание. *- р<0,05 в сравнении с интактными.

В соответствии с протоколом исследования противовоспалительную активность исследовали при моделировании формалинового отека стопы мышей.

Данные, представленные в таблице 3, показывают, что однократное подкожное введение ЕРО в дозе 50 МЕ/кг и дистантное ишемическое

прекондиционирование вызывают достоверное антиэкссудативное действие, проявляющееся в уменьшении степени прироста массы стопы по сравнению с интактными животными. При исследовании комбинированного применения ДИП и ЕРО обнаружен максимальный ингибируюшиЯ эффект.

Таблица 3

Противовоспалительная активность эритропоэтина, дистантного ншемнческого преконднционирования, глибенкламида, аминогуанидина и нх комбинаций при формалиновом отеке стопы мышей (М±т, п=10)

Группа Прирост массы стопы, % Ингибирующий эффект %

Интактные 48,3±6,0

ЕРО 36,1±3,7* 25,3

ДИП 25,5±3,4* 47.2

ЕРО + ДИП 21,1±3,6* 56,2

ЕРО + ДИП + аминогуанидин 39,2±2,4У 19,5

ЕРО + ДИП + глибенкламид 40,3±1,2У 18,9

Примечание. * - р<0,05 в сравнении с интактными;у - р<0,05 по сравнению с группой ЕРО + ДИП.

Введение аминогуанидина и глибенкламида практически полностью блокировало эффекты ЕРО и ДИП.

В целом полученные результаты исследования противовоспалительного действия рекомбинантного эритропоэтина и дистантного ишемического преконднционирования позволяют заключить, что примененные подходы к коррекции состояний, сопровождающихся процессами повышения сосудистой проницаемости, являются эффективными и патогенетически обоснованными.

Исследование эндотелио- и кардиопротективной активности рекомбинантного эритропоэтина при Ь^АМЕ-индуцированном дефиците оксида азота с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований

Влияние исследуемых веществ на исходные показатели артериального давления (АД) у наркотизированных крыс с моделированием Ь-ЫАМЕ-индуцированной патологии представлены в таблице 4.

Одновременное введение Ь-ЫАМЕ и рекомбинантного эритропоэтина привело к статистически значимому снижению показателей исходных значений АД: САД - 132,3±6,4, ДАД - 103,0±6,6 мм рт. ст. Также отмечалось потенциирование снижения показателей артериального давления в ответ на введение АХ (табл. 4).

Таблица 4

Динамика показателей АД и ЧСС при моделировании дефицита оксида

азота и коррекции эндотелиальной дисфункции рекомбинантным эритропоэтином в сравнении с интактными животными (М±ш, п=10)

Группа Функциональные пробы САД, мм рт. ст. ДАД, мм рт. ст. ЧСС, уд. в мин.

Интактные Исходные 137,7±3,7 101,9±4,3 420,0±9,0

АХ 84,3±4,5 38,7±2,8 416,0±14,0

НП 83,0±3,7 42,1 ±4,4 415,0±10,0

L-NAME Исходные 190,3±6,7* 145,0±3,9* 428,0±11,0

АХ 110,6±5,2* 82,8±6,6* 426,0±14,0

НП 88,7±4,7 50,8±4,2 426,0±13,0

L-NAME + ЕРО Исходные 132,3±6,4** 103,0±6,6** 350,0±1б,2

АХ 84,3±3,7* * 48,6±1,3** 322,0±12,8

НП 94,3±7,1 53,6±2,7 355,9±14,9

Примечание. Здесь и везде далее: САД - систолическое артериальное давление, ДАД - диастолическое артериальное давление, ЧСС - частота сердечных сокращений, АХ - ацетилхолин, НП - нитропруссид натрия; * - р<0,05 в сравнении с интактными, ** - р<0,05 в сравнении с группой животных, получавших Ь-ЫАМЕ.

Для дальнейшей оценки влияния АХ и НП нами использован коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД). Так, в группе, где на фоне введения Ь-ЫАМЕ вводился рекомбинантный эритропоэтин, значение КЭД соответствовало значению 1,8±0,2 (табл. 5).

Таблица 5

Показатели, отражающие влияние рекомбинантного эритропоэтина на L-NAME-индуцированную эндотелиальную дисфункцию (М±ш, п=10)

Группа Функциональные пробы Падение АД, мм рт. ст. Время сосудистой реакции, сек. Площадь сосудистой реакции, усл. ед. КЭД

Интактные АХ 59,9±2,9 J 42,2±0,8 1268,0±74,8 1,1±0,1

НП 61,0±3,0 45,1±1,0 1375,3±93,7

L-NAME АХ 68,0±4,1 20,0±1,4* 695,3±87,6* 5,4±0,6*

НП 98,0±2,0* 67,4±1,4* 3322,7±П6,7*

L-NAME + ЕРО АХ 60,5±1,8 42,6±3,6** 1141±168,2** 1,8±0,2**

НП 67,1±3,6** 72,7±4,0* 1934,9±259,3**

Примечание. * - р<0,05 в сравнении с интактными, ** - р<0,05 в сравнении с группой животных, получавших L-NAME.

Таким образом, в результате проведенных исследований обнаружено выраженное эндотелиопротективное действие рекомбинантного эритропоэтина на модели Ь-МЛМЕ-индуцированного дефицита оксида азота.

При переводе животных на управляемое дыхание обнаружено, что исходные показатели сократимости левого желудочка у животных, получавших рекомбинантный эритропоэтин, имели наиболее близкие значения к интактным животным (табл. 6).

Таблица б

Влияние рекомбинантного эритропоэтина на показатели сократимости левого желудочка сердца крыс при моделировании дефицита оксида азота _введением L-NAME (М±т, п=10)_

Группа ЛЖД, мм рт. ст. +dp/dtmax, мм рт. ст./с -dp/dtmax, мм рт. CT Je ЧСС, уд./мин ИФС, мм рт. ст./ уд./мин

Интактные 108,614,3 62081703 -3974+391 390+17 4279412973

L-NAME 167,815,6* 96831420* -55771216* 383 + 10 6477013391*

L-NAME + ЕРО 131,3110,1** 68901204** -4139+125** 37518 49239+3451**

Примечание. Здесь и везде далее: ЛЖД - леаожелудочховое давление, +с1р/сНтах - максимальная скорость сокращения, ^р/Лтах - максимальная скорость расслабления, ИФС - индекс функционирования структур; * - р<0,05 в сравнении с интактными, ** - р<0,05 в сравнении с группой животных с Ь-ЫАМЕ-индуцированным дефицитом N0.

Проба на адренореактивность. Как представлено в таблице 7, применение рекомбинантного эритропоэтина не только полностью предотвращало повышение адренореактивности у животных с моделированием Ь-МАМЕ-индуцированной патологии, но и снижало абсолютные цифры ЛЖД на пробе с введением адреналина. Так, в группе Ь-ЫАМЕ + эритропоэтин ЛЖД составило 198,3±15,1, ЫМАМЕ - 247,3±4,8, а у интактных 199,2±8,3 мм рт. ст.

При проведении пробы на нагрузку сопротивлением (табл. 7) применение рекомбинантного эритропоэтина привело к предотвращению падения показателя исчерпания миокардиального резерва. Значение прироста ЛЖД от 5-й к 25-й секунде пережатия восходящей аорты в группе с моделированием Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0 составило 66,0%. У интактных животных - 83,6%, при введении эритропоэтина в дозе 50 МЕ/кг - 84,1% (рис. 3). Последнее указывает на сохранение значительного сократительного резерва у животных, которым вводили рекомбинантный эритропоэтин в субэритростимулирующей дозе.

Результаты гипоксической пробы представлены в таблице 7. Обращает на себя внимание, что в группе животных, получавших рекомбинантный эритропоэтин, пиковые значения ЛЖД в период реоксигенации были достоверно ниже, чем в группе животных с Ь-ЫАМЕ-индуцированным

дефицитом оксида азота, и составляли 197,3±7,2 и 222,3±6,5 мм рт.ст. соответственно.

Таблица 7

Влияние рекомбннантного эритропоэтина на показатели сократимости

левого желудочка сердца крыс при проведении нагрузочных проб на фоне L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота (Mim, п-=10)

Группа лжд, мм рт. ст. +dp/dtmax, мм рт. ст./с -dp/dw. мм рт. ст./с чсс, уд./мин ИФС, мм рт. ст./ уд./мин

Адренореактивность

Интактные 199,218,3 10362±579 5720±482 385114 7767515419

L-NAME 247,3±4,8* 12109±263* 6820±303* 371±10 91767±2800*

L-NAME + ЕРО 198,3115,1** 11076±178** 5879±124** 392119 7773312154**

Пе режатие аорты, 5-я секунда

Интактные 240,7±8,5 8728±461 3837±216 281116 6729013941

L-NAME 253,5±6,7* 10244±329* 3863±189 279±14 71001±441*

L-NAME + ЕРО 239,812,1 9410±151** 4373±228 301114 7193911221

Пережатие аорты, 25-я секунда

Интактные 222,5±10,2 7169±489 3520±314 294125 6391714882

L-NAME 206,2±6,0 6630±283 2734±177* 201±17* 41416±3371*

L-NAME + ЕРО 221,0 + 4,1 6980±241 3671 ±149** 285115** 629951489**

Реоксигенацип

Интактные 200,218,1 89191506 46181242 250113 5008913193

L-NAME 222,3±6,5* 7433±512* 3549±253* 243±15 54306±4150*

L-NAME + ЕРО 197,3±7,2** 8139±341 47801151** 243110 4787112119

Примечание. * - р<0,05 в сравнении с интактными, ** - р<0,05 в сравнении с группой животных, получавших L-NAME.

ЫО-продуцирующая функция эндотелия исследована на основании данных увеличения экспрессии еМОБ (в процентах от контроля) и содержания нитрит-ионов (КОх). Обнаружено, что использование рекомбинантного эритропоэтина приводит к статистически значимому увеличению экспрессии еЫОЗ. Так, у интактных животных данный показатель составил 72,9±6,1, у животных с Ь-ЫАМЕ-индуцированным дефицитом оксида азота - 21,4±2,9, у животных, получавших рекомбинантный эритропоэтин в субэритростимулирующей дозе, - 48,9±3,4 процентов от контроля (рис. 4).

1 - интактные 2-Ь-ШМЕ З-Ь-ШМЕ + ЕРО Рис. 3. Влияние рекомбинантного эрктропоэтина на показатели исчерпания миокардиального резерва у крыс с моделированием Ь-МАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота.

Примечание. * - р<0,05 - в сравнении с интактными, ** - р<0,05 - в сравнении с 1-ЫАМЕ.

% от контроля

1 - интактные 2 - ЬЫАМЕ 3 - Ь-ЫАМЕ + ЕРО Рис. 4. Влияние рекомбинантного эритропоэтина на уровень экспрессии еЫОБ под влиянием сыворотки крыс с моделированием Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота.

Примечание. * - р<0,05 - в сравнении с интактными, ** - р<0,05 - в сравнении с Ь-ЫАМЕ.

Концентрация нитрит-ионов под влиянием рекомбинантного эритропоэтина увеличивалась и достоверно не отличалась от показателей интактных животных (рис. 5).

Таким образом, на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита азота использование рекомбинантного эритропоэтина предотвращало падение концентрации нитрит-ионов и экспрессии еМОЗ,

При морфологическом исследовании сердца также обнаружен кардиопротективный эффект рекомбинантного эритропоэтина в дозе 50 МЕ/кг (рис. б). В сердце контрольной группы (Ь-ЫАМЕ-индуцированный дефицит N0) обнаружена гипертрофия кардиомиоцитов левого желудочка до

18,5±0,9 мкм (у интактных животных - 9,1±0,1 мкм), сосудистые изменения в виде спастического состояния артериол, утолщения их стенок. При окраске гематоксилином Pero выявлялись очаговые сегментарные или тотальные повреждения кардиомиоцитов контрактурного типа. Использование рекомбинантного эритропоэтина достоверно предотвращало увеличение поперечного диаметра кардиомиоцитов (рис. 6).

мкМоль

во АО 20 О

1 - интактные 2 - Ь-ЫАМЕ 3 - Ь-Т^АМЕ + эритропоэтин

Рис. 5. Влияние рекомбинантного эритропоэтина на концентрацию нитрит-ионов в сыворотке крови животных с моделированием Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота.

Примечание. * - р<0,05 - в сравнении с интактными, ** - р<0,05 - в сравнении с Ь-ЫАМЕ.

1 - интактные 2 - Ь-КАМЕ 3 - Ь-ЫАМЕ + эритропоэтин

Рис. 6. Влияние рекомбинантного эритропоэтина на диаметр кардиомиоцитов у животных с моделированием Ь-НАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота.

Примечание. * - р<0,05 - в сравнении с интактными, ** - р<0,05 - в сравнении с Ь-ЫАМЕ.

Таким образом, применение рекомбинантного эритропоэтина эффективно предотвращало развитие гипертрофиии миокардиоцитов на фоне Ь-МАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота.

выводы

1. Введение рекомбинантного эритропоэтина достоверно, относительно контрольной группы животных, уменьшало распространенность зоны некроза миокарда левого желудочка при моделировании коронаро-окклюзионного инфаркта миокарда до 13,2±0,3%, тогда как в контрольной группе животных данный показатель составил 27,3±1,2%.

2. Проведение дистантного ишемического прекондиционирования достоверно уменьшало площадь некротизированного миокарда левого желудочка при моделировании коронаро-окклюзионного инфаркта миокарда до 9,4±0,5%.

3. При использовании комбинации введения рекомбинантного эритропоэтина и проведения дистантного ишемического прекондиционирования обнаружено положительное фармакодинамическое взаимодействие, выразившееся в наиболее эффективном уменьшении площади некротизированного миокарда. Площадь некротизированного миокарда в данной группе животных составляла 7,4±0,6%.

4. Предварительная блокада АТФ-зависимых калиевых каналов глибенкламидом, неселективная блокада ИО-синтазы с помощью Ь-ЫАМЕ и селективная блокада индуцибельной ИО-синтазы с помощью аминогуанидина полностью нивелировала протекторное действие дистантного прекондиционировния и рекомбинантного эритропоэтина при моделировании коронаро-окклюзионного инфаркта миокарда. Защитное действие рекомбинантного эритропоэтина осуществляется за счет активации системы синтеза оксида азота и через АТФ-зависимые калиевые каналы, что доказывает реализацию эффектов рекомбинантного эритропоэтина по механизму, схожему с механизмом реализации эффектов дистантного ищемического прекондиционирования.

5. Дистантное ишемическое прекондиционирование, рекомбинантный эритропоэтин и их комбинация оказывали достоверное противовоспалительное действие при формалиновом отеке стопы мышей. Максимальный ингибирующий эффект достигнут в группе животных, получавших дистантное ишемическое прекондиционирование и рекомбинантный эритропоэтин.

Дистантное ишемическос прекондиционирование, рекомбинантный эритропоэтин и их комбинация достоверно снижали проницаемость сосудов микроциркуляторного русла при проведении исследования по методу И.А. Ойвина. Минимальная площадь сине-окрашенных пятен и максимальное время до их появления обнаружены в группе животных, получавших дистантное ишемическое прекондиционирование и рекомбинантный эритропоэтин. Блокирование индуцибельной ЫО-синтазы и АТФ-зависимых калиевых каналов полностью нивелировало защитный эффект проводимых манипуляций.

6. Применение рекомбинантного эритропоэтина в дозе 50 МЕ/кг оказывало эндотелио- и кардиопротективное действие на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота, выражавшееся в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции, положительной динамике результатов нагрузочных проб, биохимических и морфометрических исследований.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Фармакологическая коррекция L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота рекомбинантным эритропоэтином / Л.В. Корокина, И.М. Колесник, А.Е. Королев и др. // Кубанский научный медицинский вестник. - 2009. - № 9. - С. 66-69.

2. Коррекций L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции рекомбинантным эритропоэтином / А.Е. Королев, И.М. Колесник, М.В. Коро-кин М.В. и др.// IV Международная научная конференции молодых ученых-медиков (25-26 февраля 2010, г. Курск). - Курск, 2010. - С. 121.

3. Дистантное и фармакологическое прекондиционирование - новые возможности стимуляции неоваскулогенеза / И.М. Колесник, М.В. Покровский, А.Е. Королев и др. // Кубанский научный медицинский вестник. -2010.-№6.-С. 56-58.

4. Возможности применения рекомбинантного эритропоэтина для фармакологической коррекции L-NAME индуцированной эндотелиальной

дисфункции / И.М. Колесник, М.В. Покровский, А.Е, Королев и др. // Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием ((Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов (20-22 мая 2010, г. Санкт-Петербург). - СПб., 2010.-С. 103.

5. Влияние дистантного ишемического прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина на воспаление / JI.M. Даниленко, М.В. Покровский, А.Е. Королев и др. // V Конгресс «Рациональная фармакотерапия и клиническая фармакология». - СПб., 2010. - С. 98-99.

6. Кардиопротективные эффекты эритропоэтина при ишемии/реперфузии миокарда в сочетании с ишемическим прекондицнонированием / Л.М. Даниленко, М.В. Покровский, А.Е. Королев и др. // V Конгресс «Рациональная фармакотерапия и клиническая фармакология». - СПб., 2010. - С. 101-102.

7. Ишемическое прекондиционирование и местный противовоспалительный эффект / Л.М. Даниленко, М.В. Покровский, А.Е. Королев и др. // III Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием: «Биотехнология и биомедицинская инженерия». - Курск, 2010, -С. 195-198.

8. Эндотелиопротективные эффекты рекомбинантного эритропоэтина / И.М. Колесник, Л.В. Корокина, А.Е. Королев и др. // XVII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» (12-16 апреля 2010 г., г. Москва). - М., 2010. - С. 644.

9. Митохондриальные АТФ-зависимые калиевые каналы как точка приложения действия при дистантном прекондиционировании / Даниленко Л.М., Покровский М.В., Королев А.Е. и др. // Научные ведомости БелГУ. - 22(93) - 2010. - № 12/2. - С. 17-20.

10. Пат. 97615 Российская Федерация, МПК7 А16В 17/12. Устройство для дистантного прекондиционирования / Новиков О.О., Покровский М.В., Кочкаров В.И. и др.; заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО БелГУ. - № 2010110708/22; заявл. 23.03.2010; опубл. 20.09.2010. Бюл. № 26. -2 е.: ил.

Лицензия ЛР № 020862 от 30.04.99 г. Сдано в набор 11.03.2011 г. Подписано в печать 12.03.2011 г. Формат 30х42'/8 Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 153"А". Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.

Актуальность исследования. Эритропоэтин (ЭПО) является индуцибельным гипоксией гормоном, который является существенным для нормального эритропоэза в костном мозге. Введение рекомбинантного ЭПО - эффективный и безопасный терапевтический подход к лечению анемии, связанной с хронической почечной недостаточностью [101]. Однако рецепторы ЭПО также широко распространены в сердечно-сосудистой системе, включая эндотелиальные, гладкомышечные и другие типы клеток, а негемопоэтичекие эффекты рекомбинантного эритропоэтина становятся все более и более очевидными [64, 129, 259]. В настоящее время эритропоэтин рассматривают как мощный защитный тканевой цитокин [122, 259]. Появляются сведения о том, что у рекомбинантного эритропоэтина есть потенциально благоприятное воздействие на сердечно-сосудистую систему [259]. Кроме того, ЭПО увеличивает число функционально активных предшественников эндотелиальных клеток, таким образом увеличивая ангиогенез [114].

В экспериментальных исследованиях показано, что при проведении экспериментов на животных с высокой концентрацией эритропоэтина зафиксировано увеличение синтеза оксида азота [206]. Точный молекулярный механизм ЭПО-вызванной активации еЫ08 остается не решенным.

Многочисленные фундаментальные исследования последних лет подтвердили роль патологии эндотелия в патогенезе многих сердечнососудистых заболеваний. Доказано, что ключевую роль в патогенезе атеросклероза, артериальной гипертонии и ишемической болезни сердца играет именно эндотелиальная дисфункция (ЭД), характеризующаяся нарушением регуляции сосудистого тонуса, продукции оксида азота, неадекватным (увеличенным или сниженным) образованием в эндотелии различных биологических веществ и повышением сосудистой 6 проницаемости [4, 9, 258]. При этом ЭД проявляет себя либо в виде спазма артерий, либо в виде отсутствия реакции в ответ на воздействие физиологических или фармакологических стимулов, тогда как нормальные сосуды реагируют дилатацией. Такая патологическая реакция эндотелия считается начальным этапам развития атеросклероза с вовлечением не только крупных артерий, но и сосудов микроциркуляторного русла [68, 73]. При этом тяжесть течения атеросклероза всегда коррелирует с ЭД [212], а стандартная терапия сердечно-сосудистых заболеваний не устраняет ЭД, сохраняется риск развития их осложнений в 3 раза [9, 12, 116, 267].

Механизм участия эндотелия в возникновении и развитии различных патологических состояний многогранен и связан не только с регуляцией сосудистого тонуса, но и с участием в процессе атерогенеза, тромбообразования, защиты целостности сосудистой стенки, изменения ее проницаемости и т.д.

В последнее время инфаркт миокарда стремительно молодеет. Ныне не редкость, когда он поражает людей, едва перешагнувших тридцатилетний порог. Нарушенная Ж)-зависимая вазодилатация и парадоксальная вазоконстрикция эпикардиальных сосудов приобретают особое клиническое значение для развития ишемии миокарда в условиях умственного и физического стресса или холодовой нагрузки. Учитывая тот факт, что перфузия миокарда регулируется резистивными коронарными артериями, тонус которых зависит от вазодилататорной функции коронарного эндотелия, даже при отсутствии атеросклеротических бляшек дефицит N0 в коронарном эндотелии способен привести к миокардиальной ишемии.

Поиск эффективных средств коррекции нарушенной эндотелиальной функции у больных с инфарктом миокарда остается одной из важных направлений современной кардиологии. В связи с этим, интерес к изучению физиологического феномена, названного «прекондиционированием», со стороны как экспериментальной, так и практической медицины огромен.

Свидетельством этому являются многочисленные публикации [56, 110, 168, 7

226] в том числе в ведущих мировых научных изданиях [109]. Этот метод нашел широкое применение в кардиохирургии [219], сосудистой хирургии, операциях на почках и головном мозге [112, 127, 180, 227, 255].

Обнаружено, что устойчивость тканей к ишемии может повышаться в результате прекондиционирования, вызванного короткими эпизодами ишемии — реперфузии [197]. Показано, что ишемическое прекондиционирование является общебиологическим механизмом и реализуется за счет активаци АТФ-зависимых калиевых каналов (К+АТФ-каналы) в ответ на выделение аденозина, брадикинина, опиоидов и др. [37] .

Свидетельством естественного механизма реализации является система многоуровневого иерархического дублирования включающая нейрогенный компонент, гуморальный и внутриклеточный, связанный с дыханием в митохондриях. Последнее указывает на существование универсальной «фармакологической мишени» для запуска феномена ■ прекондиционирования.

Интригующим с точки зрения практического использования и , одновременно мало изученным является феномен дистантного (remote) прекондиционирования, суть которого состоит в том, что кратковременные эпизоды ишемии одного органа (почки, брыжейки, нижней конечности) повышают устойчивость других органов к тяжелым ишемическим повреждениям [8]. Наибольшее развитие данная концепция получила в работах, посвященных изучению реакции сердца и головного мозга. Однако предполагаемый механизм реализации феномена прекондиционирования указывает на возможность его универсального использования в клинической практике для защиты органов в условиях ишемии и, возможно стимуляции неоангиогенеза.

В фармакологическом аспекте одним из наиболее перспективных i гуморальных агентов, принимающих участие в реализации феномена прекондиционирования, является эритропоэтин. Предпосылкой к этому является то, что период полувыведения его значительно больше, чем других 8 гуморальных агентов прекондиционирования (аденозин, брадикинин, опиоиды), следовательно «временное терапевтическое окно» должно быть существенно шире. Не исключается возможность использования эритропоэтина как специфического активатора фактора роста эндотелия сосудов для стимуляции неоваскулогенеза [182, 234]. Кроме того, предстоит выяснить механизмы, лежащие в основе сосудистых негемопоэтических эффектов рекомбинантного эритропоэтина.

Отдельно вселяют оптимизм сведения об эндотелио- и кардиопротективных эффектах как прекондиционирования, так и ч эритропоэтина, что, несомненно, требует дальнейшего углубленного изучения.

Таким образом, изложенное свидетельствует об актуальности исследования механизмов протективного действия и возможности использования дистантного ишемического прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина как универсального пути оптимизации выживания ишемизированных тканей и эндогенного защитного механизма, повышающего резистентность к различного рода повреждениям.

Цель исследования: провести оценку эффективности применения рекомбинантного эритропоэтина при моделировании коронаро-окклюзионного инфаркта миокарда и Ь-МАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние рекомбинантного эритропоэтина на величину зоны некроза при моделировании коронаро-окклюзионного инфаркта миокарда у лабораторных кроликов.

2. Изучить влияние дистантного ишемического прекондиционирования на величину зоны некроза при моделировании коронаро-окклюзионного инфаркта миокарда у лабораторных кроликов. 9

3. Оценить эффективность комбинации рекомбинантного эритропоэтина и ищемического прекондиционирования на модели коронаро-окклюзионного инфаркта миокарда у лабораторных кроликов.

4. Изучить механизмы реализации эффектов рекомбинантного эритропоэтина через активацию системы синтеза оксида азота и АТФ-зависимые калиевые каналы по механизму ишемического перкондиционирования.

5. Изучить противовоспалительные эффекты рекомбинантного эритропоэтина на модели формалинового отека стопы у мышей и по методу И.А. Ойвина.

6. Изучить эндотелио- и кардиопротективные эффекты рекомбинантного эритропоэтина при Ь-КАМЕ-индуцированном дефиците оксида азота.

Научная новизна исследования. В результате выполнения исследования впервые предложены эффективные способы уменьшения зоны некроза при моделировании коронаро-окклюзионного инфаркта миокарда с помощью рекомбинантного эритропоэтина и дистантного ишемического прекондиционирования. Обоснована возможность применения рекомбинантного эритропоэтина в субэритропоэтических дозах как средства для фармакологического прекондиционирования при состояниях, сопровождающихся ишемическими нарушениями и эндотелиальной дисфункцией. В экспериментах на лабораторных мышах и лабораторных кроликах-альбиносах доказаны противовоспалительные эффекты рекомбинантного эритропоэтина и ишемического прекондиционирования.

Показано, что положительный эффект рекомбинантного эритропоэтина обусловлен их конечным действием на митохондриальные К+АтФ-каналы, еЖ)8 и ¿ТчЮБ. Механизмы реализации кардиопротективного действия ишемического прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина обусловлены их влиянием на нитроксидэргическую систему, сосудистую

10 проницаемость и АТФ-зависимые калиевые каналы. Это позволяет рассматривать эритропоэтин как основной триггер в развитии положительного протективного эффекта дистантного прекондиционирования.

Изучена возможность коррекции Г-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции рекомбинантным эритропоэтином в субэритропоэтических дозах и показаны его эндотелио- и кардиопротективные эффекты.

По результатам проведенных экспериментальных исследований получен 1 патент РФ на полезную модель, получено 1 положительное решение о выдаче патента РФ на изобретение, подано 3 заявки на получение патентов на изобретения РФ.

Практическая значимость. В работе экспериментально обоснована эффективность применения дистантного ишемического и фармакологического прекондиционирования для профилактики и коррекции ишемических нарушений в миокарде.

Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные клинические испытания дистантного прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина в субэритропоэтических дозах для профилактики и коррекции ишемических нарушений в миокарде.

Внедрение результатов научных исследований. Результаты работы используются в лекционных курсах кафедры фармакологии ГОУ ВПО КГМУ, кафедры фармакологии и фармацевтических дисциплин ИПМО ГОУ ВПО БелГУ и кафедры фармакологии, клинической фармакологии и фармации медицинского института ГОУ ВПО «Орловский государственный университет».

Апробация работы. Материалы работы доложены на итоговых научных сессиях и международных конференциях молодых ученых КГМУ в 2009-2010 гг., III Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология и биомедицинская инженерия», XVI и XVII национальных конгрессах «Человек и лекарство». Апробация диссертации проведена на научно-практической конференции кафедр фармакологии; травматологии, ортопедии и военно-полевой хирургии; клинической фармакологии; внутренних болезней №2; анатомии человека; биоорганической химии; инфекционных болезней и эпидемиологии; мобилизационной подготовки здравоохранения и медицины катастроф; нормальной физиологии им. профессора A.B. Завьялова; общей химии; фармакогнозии и ботаники; НИИ Экологической медицины КГМУ. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе три из них - в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.

Положения, выносимые на защиту:

1. Рекомбинантный эритропоэтин достоверно, по сравнению с контрольной группой, уменьшает величину зоны некроза при моделировании коронаро-окклюзионного инфаркта миокарда. Блокада АТФ-зависимых калиевых каналов глибенкламидом, неселективная блокада NO-синтазы с помощью L-NAME, селективная блокада индуцибельной NO-синтазы с помощью аминогуанидина полностью нивелирует корригирующий эффект дистантного прекондиционировния и рекомбинантного эритропоэтина при моделировании коронаро-окклюзионного инфаркта миокарда.

2. Рекомбинантный эритропоэтин достоверно, по сравнению с контрольной группой, оказывают противовоспалительное действие при моделировании формалинового отека стопы мышей и изучении сосудистой проницаемости по методу И.А. Ойвина, которое реализуется по механизму дистантного ишемического прекондиционирования с вовлечением АТФ

12 зависимых калиевых каналов, е!чЮ8 и ¡ИОВ.

3. Рекомбинантный эритропоэтин вводимый подкожно в дозе 50 МЕ/кг на первые, третьи и пятые сутки эксперимента оказывет эндотелио- и кардиопротективное действие на модели Ь-МАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции, выражающееся в уменьшении коэффициента эндотелиальной дисфункции, снижении адренореактивности, предотвращении исчерпания миокардиального резерва, нормализации биохимических маркеров и морфологических показателей функции сосудистого эндотелия, которое реализуется по механизму дистантного ишемического прекондиционирования с вовлечением АТФ зависимых калиевых каналов, е>Ю8 и 1Ж)8.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 272 источника, из которых 53 отечественных и 219 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста, содержит 12 таблиц, и 31 рисунок.

выводы

1. Введение рекомбинантного эритропоэтина достоверно, относительно контрольной группы животных, уменьшало распространенность зоны некроза миокарда левого желудочка при моделировании коронаро-окклюзионного инфаркта миокарда до 13,2±0,3%, тогда как в контрольной группе животных данный показатель составил 27,3±1,2%.

2. Проведение дистантного ишемического прекондиционирования достоверно уменьшало площадь некротизированного миокарда левого желудочка при моделировании коронаро-окклюзионного инфаркта миокарда до 9,4±0,5%.

3. При использовании комбинации введения рекомбинантного эритропоэтина и проведения дистантного ишемического прекондиционирования обнаружено положительное фармакодинамическое взаимодействие, выразившееся в наиболее эффективном уменьшении площади некротизированного миокарда. Площадь некротизированного миокарда в данной группе животных составляла 7,4±0,6%.

4. Предварительная блокада АТФ-зависимых калиевых каналов глибенкламидом, неселективная блокада ЫО-синтазы с помощью Ь-ИАМЕ и селективная блокада индуцибельной 1ЧО-синтазы с помощью аминогуанидина полностью нивелировала протекторное действие дистантного прекондиционировния и рекомбинантного эритропоэтина при моделировании коронаро-окклюзионного инфаркта миокарда. Защитное действие рекомбинантного эритропоэтина осуществляется за счет активации системы синтеза оксида азота и через АТФ-зависимые калиевые каналы, что доказывает реализацию эффектов рекомбинантного эритропоэтина по механизму, схожему с механизмом реализации эффектов дистантного ищемического прекондиционирования.

5. Дистантное ишемическое прекондиционирование, рекомбинантный эритропоэтин и их комбинация оказывали достоверное противовоспалительное действие при формалиновом отеке стопы мышей. Максимальный ингибирующий эффект достигнут в группе животных, получавших дистантное ишемическое прекондиционирование и рекомбинантный эритропоэтин. Дистантное ишемическое прекондиционирование, рекомбинантный эритропоэтин и их комбинация достоверно снижали проницаемость сосудов микроциркуляторного русла при проведении исследования по методу И.А. Ойвина. Минимальная площадь сине-окрашенных пятен и максимальное время до их появления обнаружены в группе животных, получавших дистантное ишемическое прекондиционирование и рекомбинантный эритропоэтин. Блокирование индуцибельной >Ю-синтазы и АТФ-зависимых калиевых каналов полностью нивелировало защитный эффект проводимых манипуляций.

6. Применение рекомбинантного эритропоэтина в дозе 50 МЕ/кг оказывало эндотелио- и кардиопротективное действие на модели Ь-МАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота, выражавшееся в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции, положительной динамике результатов нагрузочных проб, биохимических и морфометрических исследований.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На сегодняшний день ишемическая болезнь сердца (ИБС) является главной причиной инвалидизации и смертности населения всех развитых стран, что заставляет искать новые возможности прогнозирования, оценки риска, диагностики, профилактики и лечения. Наиболее значимое и опасное проявление ИБС - острый коронарный синдром. Он преобладает и в структуре смертности от всех сердечно-сосудистых заболеваний, и в структуре частоты госпитализаций, связанных с ИБС [261]. Универсальным механизмом, через который реализуется действие всех факторов риска развития ИБС, признана эндотелиальная дисфункция [1]. Даже до появления видимых атеросклеротических поражений эта дисфункция может проявляться в виде количественного изменения определенных биохимических показателей крови [1]. Преимущественное нарушение функционального состояния эндотелия зависит от локализации патологического процесса, наличия гемодинамических сдвигов, преобладания различных гуморальных факторов, повреждающих эндотелий.

По современным представлениям в патогенезе атеросклероза и его осложнений решающую роль играет воспаление. В частности, воспаление способствует разрыву нестабильных атеросклеротических бляшек и эрозированию интимы, оба эти процесса могут привести к коронарному тромбозу. Воспалительный процесс при атеросклерозе является следствием ответной реакции эндотелия на повреждающее действие атерогенных факторов, к которым относятся, прежде всего, окисленные липопротеины низкой плотности, а также С-реактивный белок, антифосфолипидные антитела, гипергомоцистеинемия, липопротеин (а), цитокины.

Также показано, что данные атерогенные факторы вызывают апоптоз эндотелиоцитов [66, 67]. Апоптоз эндотелия представляет форму повреждения, в результате которого увеличивается проницаемость сосудистой стенки для цитокинов, факторов роста, липидов, повышается

91 адгезия лейкоцитов, а также активируется система коагуляции и снижается выработка NO.

Дисфункция эндотелия — это дисбаланс между продукцией вазодилатирующих, антипролиферативных факторов (N0, простациклин, тканевый активатор плазминогена, С-тип натрийуретического пептида, эндотелиального гиперполяризующего фактора), с одной стороны, и вазоконстриктивных, протромботических, пролиферативных факторов (эндотелии, супероксид-анион, тромбоксан А2, ингибитор тканевого активатора плазминогена) - с другой.

Среди указанных биологически активных веществ, вырабатываемых эндотелием, важнейшим является оксид азота. Открытие ключевой роли N0 в сердечно-сосудистом гемостазе было удостоено Нобелевской премии в 1998 г. Сегодня это самая изучаемая молекула, вовлеченная в патогенез сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). Нормально функционирующий эндотелий отличает непрерывная базальная выработка N0 с помощью эндотелиальной NO-синтетазы (eNOS) из L-аргинина. Это необходимо для поддержания нормального базального тонуса сосудов. В то же время NO обладает ангиопротективными свойствами, подавляя пролиферацию гладкой мускулатуры сосудов и моноцитов и предотвращая этим патологическую перестройку сосудистой стенки (ремоделирование), прогрессирование атеросклероза.

N0 ингибирует агрегацию и адгезию тромбоцитов, эндотелиально-лейкоцитарные взаимодействия и миграцию моноцитов.

При хронических ССЗ, как правило, наблюдается снижение синтеза N0, что связано с нарушением экспрессии или транскрипции eNOS, в том числе метаболического происхождения, снижением доступности запасов L-аргинина для эндотелиальной NOS, ускоренным метаболизмом N0 (при повышенном образовании свободных радикалов) или их комбинацией.

Сегодня доказано, что NO уменьшает адгезию лейкоцитов к эндотелию, тормозит трансэндотелиальную миграцию моноцитов,

92 поддерживает нормальную проницаемость эндотелия для липопротеидов и моноцитов, ингибирует окисление липопротеидов низкой плотности в субэндотелии, а также тормозит пролиферацию и миграцию гладкомышечных клеток сосудов и синтез ими коллагена.

Кроме того, N0 обладает антитромботическими свойствами, ингибируя адгезию тромбоцитов, их активацию и агрегацию, активирует тканевый активатор плазминогена. N0 является вазодилататором, действующим опосредованно через повышение уровня цГМФ, поддерживая базальный тонус сосудов и осуществляя вазодилатацию в ответ на различные стимулы -напряжение сдвига крови, ацетилхолин, серотонин и другие факторы.

Нарушенная МО-зависимая вазодилатация и парадоксальная вазоконстрикция эпикардиальных сосудов приобретают особое клиническое значение для развития ишемии миокарда в условиях умственного и физического стресса или холодовой нагрузки. Учитывая тот факт, что перфузия миокарда регулируется резистивными коронарными артериями, тонус которых зависит от вазодилататорной функции коронарного эндотелия, даже при отсутствии атеросклеротических бляшек дефицит N0 в коронарном эндотелии способен привести к миокардиальной ишемии.

Кратковременная (преходящая) ишемия миокарда инициирует каскад определенных биохимических процессов в кардиомиоцитах. Эти процессы направлены на защиту миокарда от повреждений, связанных с его ишемизацией. Благодаря этому короткому, но эффективному «курсу закаливания» миокард становится подготовленным к последующей ишемии, в связи с чем он гораздо более успешно защищается от агрессивных факторов, обусловленных ухудшением питания и оксигенации сердца. Этот физиологический феномен, названный «ишемическим прекондиционированием» (ишемическая предподготовка), был открыт не так давно, но уже привлек к себе внимание со стороны множества ученых. В случае острой ишемии этот механизм может предотвратить развитие инфаркта миокарда, а если последний все же происходит, ишемическое

93 прекондиционирование обеспечивает меньшие размеры инфаркта, уменьшает вероятность появления аритмии, предохраняет от значительных нарушений функций миокарда левого желудочка, а также уменьшает повреждения миокарда, связанные с реперфузией.

Впервые феномен ишемического прекондиционирования был обнаружен R. Lange et al. (1984), которые в своем экспериментальном исследовании на животных показали, что исчерпание АТФ после повторных коротких ишемий происходит в меньшей степени, чем в случае однократного эпизода ишемии. Уже в 1986 г. С.Е. Murry et al. представили результаты работы, в которой были описаны преимущества коротких эпизодов преходящей ишемии (продолжительностью 5 мин) на миокард, а именно уменьшение размера инфаркта на 25% при последующей окклюзии коронарной артерии сердца собаки продолжительностью 40 мин (по сравнению с отсутствием предварительного проведения 5-минутной ишемии в группе контроля). Для обозначения этого любопытного феномена авторы предложили использовать термин «ишемическое прекондиционирование». Это исследование не только убедительно продемонстрировало реальные преимущества обнаруженного защитного механизма, но и представило популярную впоследствии модель изучения ишемического прекондиционирования. С тех пор этот феномен активно изучается различными авторами.

В 1991 г. G.S. Liu et al. установили, что для активации ишемического прекондиционирования необходима стимуляция аденозинового рецептора А1 (аденозином или агонистом аденозиновых рецепторов), а использование антагониста этого рецептора блокирует запуск ишемического прекондиционирования. Так был обнаружен один из основных триггеров этого процесса - аденозин. Вскоре были открыты два других механизма запуска ишемического прекондиционирования - посредством брадикинина и опиоидов.

Важным открытием стало то, что ишемическое прекондиционирование уменьшает повреждения миокарда, связанные с реперфузией. Этот феномен еще называют «посткондиционированием», хотя по сути он представляет собой ту же предподготовку миокарда к ишемическим повреждениям, только в условиях уже состоявшейся критической ишемии (воспроизводится путем создания коротких ишемических эпизодов либо фармакологическим стимулированием механизма прекондиционирования уже на фоне реперфузии) [99]. Считают это открытие одним из революционных, позволивших изменить парадигму практического использования феномена прекондиционирования.

Одним из препаратов, которые возможно использовать для проведения фармакологического прекондиционирования, на наш взгляд, является рекомбинантный эритропоэтин и его негемопоэтические эффекты.

Перспективы применения эритропоэтина в клинике объясняются его плеотропными эффектами. Он способствует антиапоптозу эндотелия и нервной ткани [125, 152] редуцированию гипертрофии JDK, увеличению толерантности к физической нагрузке у больных с хронической сердечной недостаточностью (ХСН) [54].

Krista Caiola, 2004 проанализировали публикации в базе MEDLINE (1966-июнь 2004) по применению эритропоэина у больных с ХСН и анемией. ЭПО способствовал улучшению клинического течения ХСН, но требуется дальнейшее изучения вопроса, чтобы рекомендовать данную стратегию для широкого применения в клинической практике [86].

В ряде исследований показано, что у пациентов с хронической почечной недостаточностью (ХПН) лечение анемии эритропоэтином приводит к уменьшению гипертрофии левого желудочка [93], предотвращению дилатации левого желудочка [55], а в случаях ХСН - к увеличению фракции выброса, ударного объема и сердечного выброса [244].

Возможным объяснением улучшения сердечной функции может быть непосредственный эффект, который эритропоэтин сам оказывает на функцию

95 миокарда, на рост его клеток и улучшением функции эндотелия, не связанный с его действием на анемию [159, 136].

ЭПО может быть главным фактором при коррекции анемии не только из-за редкости возникновения побочных реакций на него, но также из-за того, что он вызывает образование и высвобождение молодых клеток из костного мозга в кровь. Кривая диссоциации кислорода у этих клеток сдвинута вправо относительно нормальных клеток, вызывая высвобождение повышенного количества кислорода в ткани, чем это происходит в норме [239].

Во многих исследованиях было показано протективное действие ЭПО на ишемию — реперфузию в различных органах и тканях, включая головной мозг [133], спинной мозг, почки [228], мышечную ткань сосудов [132], сердце [133]. В частности доказан независимый кардиопротективный эффект ЭПО, снижение зоны ИМ и улучшение функции сердца при ишемии-реперфузии вне зависимости от изменения гемоглобина, числа эритроцитов и напряжения кислорода в крови. В ряде исследования показано, что снижение апоптоза - один из возможных главных механизмов защитного эффекта ЭПО [158].

Каким образом ишемия может сыграть прекондиционирующее, то есть подготавливающее», действие? Во время кратковременного (нефатального) ишемического эпизода кардиомиоциты начинают выделять аденозин и брадикинин, что, в свою очередь, вызывает активацию универсального внутриклеточного мессенджера — протеинкиназы С. Под ее действием АТФзависимые калиевые каналы гладкомышечных клеток сосудов и кардиомиоцитов, закрытые в норме, открываются. За счет этого происходит защитное укорочение сердечных потенциалов действия. Такой эффект имеет энергосберегающее значение, и при возникновении в ближайшее время повторной ишемии миокарда отмечаются снижение его метаболической активности, уменьшение скорости распада АТФ, замедление гликогенолиза и снижение скорости нарастания внутриклеточного ацидоза. Благодаря всему

96 этому миокард лучше переносит ишемию, в том числе более длительную и выраженную.

Анализируя стадию реализации защитных эффектов прекондиционирования, многие исследователи обращают внимание на значительную роль АТФ-зависимых К+-каналов (К+АтФ-каналы). Реализацию их защитного потенциала связывают с гиперполяризацией мембраны вследствие их открытия, активацией системы оксида азота, антиапоптатическими механизмами. Каналы этого типа располагаются на плазматической мембране нервных клеток, на внутренней мембране митохондрий, широко представлены в эндотелии и гладком ышечных клетках мозговых сосудов. Все их изоформы способны принимать участие в реализации защитного эффекта прекондиционирования. Однако в настоящее время большинство исследований направлено на изучение роли митохондриального пула К+ЛТф-каналов.

Такое разнообразие путей активации ишемического прекондиционирования свидетельствует об исключительной важности этого феномена: даже если в силу каких-то обстоятельств блокируется один из путей, остальные позволяют полноценно запустить защитный механизм. При этом аденозиновый путь, который является самым коротким, простым и потому реже повреждается, чаще всего играет роль основного.

Таким образом, вышеизложенное свидетельствует об актуальности изучения влияния дистантного и местного ишемического прекондиционирования, фармакологического прекондиционирования на оптимизацию выживания ишемизированного миокарда, а так же изучение возможных путей реализации прекондиционирующего действия ишемического и фармакологического прекондиционирования.

Для реализации поставленной цели было проведено экспериментальное исследование на 102 лабораторных кроликах, 30 крысах линии «"ЭД^аг» и 60 белых лабораторных мышах. Нами определены следующие направления:

1 - изучение влияния рекомбинантного эритропоэтина и дистантного ишемического прекондиционирования, на величину зоны некроза при моделировании коронаро-окклюзионного инфаркта миокарда;

2 - изучение влияния рекомбинантного эритропоэтина и дистантного ишемического прекондиционирования, на фоне болкады ЫО-синтазы и АТФ-зависимых калиевых каналов на величину зоны некроза при моделировании коронаро-окклюзионного инфаркта миокарда;

3 - изучение влияния дистантного прекондиционирования, рекомбинантного эритропоэтина аминогуанидина и глибенкламида на воспаление и проницаемость сосудов микроциркуляторного русла;

4 - изучение влияния рекомбинантного эритропоэтина (ЭПО) на эндотелиальную дисфункцию.

При проведении первого экспериментального исследования животные были разделены на одиннадцать групп, в каждую включили 6 животных лабораторные кролики), которым моделировали коронаро-окклюзионный инфаркт миокарда. Опыты проводились на лабораторных кроликах массой

2-2,5 кг. Инфаркт миокарда воспроизводился на наркотизированных животных (хлоралгидрат 300 мг/кг), находящихся на управляемом дыхании, путем перевязки нисходящей ветви левой коронарной артерии на уровне нижнего края ушка левого предсердия, с последующей регистрацией ЭКГ во

II стандартном отведении в течении 20 минут. Через 30 минут после коронарной окклюзии животное забивали. Поперечные срезы миокарда производили через каждые 0,8 см начиная с уровня 0,8 см ниже места наложенной лигатуры. Таким образом, от одного животного из каждой экспериментальной группы исследованию подвергались 4 поперечных среза миокарда. После этого срезы миокарда помещали в емкость содержащие фосфатный буфер (рН 7,4) и 1 мг/мл трифенилтетразолия бромида.

Соотношение масс участков ткани и буфера составляет 1:9. Бюксы помещали в термостат, инкубировали при 37 °С для образования красного формазана.

После образования красного формазана срезы фотографировали Первая

98 группа - контрольная. Во второй группе проводили коррекцию локальным прекондиционированием. В третьей группе - дистантным ишемическим прекондиционированием (ДИП). В четвертой группе - рекомбинантным эритропоэтином. Животным пятой группы проводилось комбинированное лечение, включающее сочетание дистантного прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина. В шестой группе инфаркт миокарда и ДИП осуществляли на фоне Ь-ИАМЕ индуцированного дефицита оксида азота. В седьмой группе проводили инфаркт миокарда на фоне Ь-ЫАМЕ индуцированного дефицита оксида азота рекомбинантным эритропоэтином. Животным 8 и 9 групп проводили коррекцию инфаркта миокарда дистантным прекондиционированием и рекомбинантным эритропоэтином соответственно, на фоне блокады АТФ-зависимых калиевых каналов глибенкламидом. Животным 10 и 11 групп проводили коррекцию, инфаркта миокарда дистантным прекондиционированием и рекомбинантным эритропоэтином соответственно, на фоне блокады индуцибельной N0-синтазы аминогуанидином.

Применение локального (местного), дистантного прекондиционирования, рекомбинантного эритропоэтина и комбинации подкожного введения эритропоэтина и проведения ДИП позволило достоверно относительно контрольной группы животных уменьшить площадь зоны некроза миокарда левого желудочка. Наилучшие результаты получены при применении ДИП и комбинации ДИП+эритропоэтин. Площадь некротизированного миокарда с утраченной НАДФН ферментативной активность составила в приведенных группах 9,4±0,5% и 7,4±0,6% соответственно, тогда как в контрольной группе животных данный показатель составил 27,3±1,2%.

Предварительная блокада АТФ-зависимых калиевых каналов глибенкламидом, неселективная блокада ЫО-синтазы и селективная блокада индуцибельной Ж)-синтазы полностью нивелировала протекторное действие и дистантного прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина при моделировании коронаро-окклюзионного инфаркта миокарда.

При изучении влияния дистантного ишемического прекондиционирования, рекомбинантного эритропоэтина, аминогуанидина и глибенкламида на воспалительную реакцию и проницаемость сосудистой стенки поставлено две серии экспериментов.

Первая серия экспериментов выполнялась на белых лабораторных кроликах. Для исследования влияния препаратов на сосудистую проницаемость по методу Ойвина кролики фиксировались, предварительно выстригалась шерсть на коже живота (участок 13 х 5 см). Трипановую синь (индикатор проницаемости) вводили в краевую вену уха в виде 1%-ного раствора на 0,9%-ном растворе натрия хлорида из расчета 2 мл на 1 кг массы животного. Затем на участок кожи живота наносили 12 капель о-ксилола. Показателем проницаемости капилляров служило время появления на коже сине-окрашенных пятен и их диаметр. По разнице во времени появления пятен и их диаметру до и после введения препарата судили о его действии на проницаемость капилляров. Животные были разделены на 6 экспериментальных групп по 6 кроликов в каждой: 1 группа - контроль; 2 группа - ДИП; 3 группа - ЭПО; 4 группа - ДИП + ЭПО; 5 группа - ДИП + ЭПО + глибенкламид; 6 группа - ДИП + ЭПО + аминогуанидин.

Вторая серия экспериментов проводилась на лабораторных мышах.

Противовоспалительный эффект оценивали в условиях острого асептического воспаления стопы мышей, вызванного формалином, по степени ингибирования прироста отека стопы на фоне препаратов по сравнению с контролем - группой нелеченных животных. Экссудативный отек вызывали путем субплантарной инъекции в правую заднюю стопу мышей 0,02 мл 2% водного раствора формалина. Массу стопы измеряли через 4 часа (на пике отека) после инъекции флогистика на электронных весах с точностью до 1 мг, в качестве контроля использовали левую лапку того же животного в которую параллельно с введением флогистика

100 инъецировали равный объем изотонического раствора ЫаС1. Животные были разделены на 5 экспериментальных групп по 12 мышей в каждой: 1 группа -ДИП; 2 группа - ЭПО; 3 группа - ДИП + ЭПО; 4 группа - ДИП + ЭПО + глибенкламид; 5 группа - ДИП + ЭПО + аминогуанидин.

Оценка противовоспалительного действия рекомбинантного эритропоэтина и ДИП при формалиновом отеке стопы мышей позволяет сделать заключение о достоверном предотвращении отека стопы животного после введения формалина. Блокирование индуцибельной ЫО-синтазы и АТФ-зависимых калиевых каналов полностью нивелировало защитный эффект проводимых манипуляций.

Аналогичные данные были получены при изучении влияния ДИП и эритропоэтина на проницаемость сосудов по методу И.А. Ойвина.

Можно предположить, что снижение проницаемости сосудистой стенки, лежащее в основе воспалительной реакции, является важным компонентом эндотелиопротективного действия рекомбинантного эритропоэтина и дистантного ишемического прекондицонирования. По современным представлениям в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний одну из важных ролей играет воспаление. В частности, воспаление способствует разрыву нестабильных атеросклеротических бляшек и эрозированию интимы, оба эти процесса могут привести к коронарному тромбозу. Воспалительный процесс при атеросклерозе является следствием ответной реакции эндотелия на повреждающее действие атерогенных факторов, к которым относятся, прежде всего, окисленные липопротеины низкой плотности, а также С-реактивный белок, антифосфолипидные антитела, гипергомоцистеинемия, липопротеин (а), цитокины. Несомненно, что под воздействием медиаторов, повышающих проницаемость сосудов, происходит изменение формы эндотелиоцитов, образование складчатости их плазматических мембран и расширение промежутков между ними.

При проведении эксперимента по изучению влияния рекомбинантного эритропоэтина на дисфункцию эндотелия все экспериментальные животные были разделены на 3 группы. Первая группа - интактные. Животным второй группы моделировали эндотелиальную дисфункцию. Животным третьей группы проводили коррекцию эндотелиальной дисфункции рекомбинантным эритропоэтином. Для анализа коррекции эндотелиальной дисфункции использованы физиологические, биохимические и морфологические показатели характеризующие функциональную активность сосудистого эндотелия.

Эндотелиальную дисфункцию моделировали во всех экспериментальных исследованиях ежедневным внутрибрюшинным введением с первых суток эксперимента N-нитро-Ь-аргинин метилового эфира (L-NAME) в дозе 25 мг/кг/сут.

Рекомбинантный эритропоэтин («Эпокрин» эпоэтин альфа; ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых препаратов» Федерального медикобиологического агентства г. Санкт-Петербург, РОССИЯ.) вводили подкожно в дозе 50 МЕ/кг на первые, третьи и пятые сутки эксперимента в утренние часы.

Достоверность изменений параметров наблюдавшихся при действии исследованных препаратов, как в абсолютных значениях, так и в процентах от исходного уровня, определяли разностным методом вариационной статистики с нахождением средних значений (М), ошибки средней арифметической (±ш) и вероятности возможной ошибки (Р) по таблицам Стьюдента. Различия оценивали как достоверные, начиная с р<0,05. Для расчетов использовали программу для статистического анализа Microsoft Excel 2003.

В результате экспериментального исследования этдотелиопротективных свойств эритропоэтина выявлено, что рекомбинантный эритропоэтин, вводимый подкожно в дозе 50 МЕ/кг на первые, третьи и пятые сутки эксперимента в утренние часы оказал

102 выраженное эндотелиопротективное действие на модели Ь-ИАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции, что выражалось в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции, приближая его к уровню интактных животных.

Результаты проведения нагрузочных проб на открытом сердце позволяют сделать вывод о выраженном кардиопротективном действии рекомбинантного эритропоэтина выражающемся в снижении адренореактивности, предотвращении исчерпания миокардиального резерва и снижении реактивности в ответ на 3-х минутную гипоксию. Результаты физиологических исследований подтвердились при проведении биохимических и морфологических исследований. Так, применение рекомбинантного эритропоэтина, позволило нормализовать показатели концентрации стабильных метаболитов оксида азота и экспрессии эндотелиальной ЫО-синтазы а также предотвратить гипертрофию кардиомиоцитов.

Исходя из результатов экпериментов, дистантное ишемическое прекондиционирование и рекомбинантноый эритропоэтин обладают в равной степени выраженными эндотелио- и кардиопротекторным действием. АТФ зависимые калиевые каналы являются важным эффекторным звеном в реализации цитопротекторного действия как дистантного прекондиционирования, так и рекомбинантного эритропоэтина. Оксид азота играет важную роль в реализации эндотелио- и кардиопротекторных эффектах рекомбинантного эритропоэтина. И в том и другом случае синтез его осуществляется за счет активации индуцибельной N0 синтазы, однако в механизме цитопротекции большое значение имеет эндотелиальная N0 синтаза, выполняющая по всей вероятности триггерную роль. Доказанная способность эритропоэтина активировать протеинкиназы [57, 94] позволяет предположить их триггерную роль в процессе реализации плейотропных эффектов эритропоэтина. Фрагмент механизма ишемического

103 прекондиционирования и гипотетиеская роль эритропоэтина в нем представлены на рисунке 4.1.

Аминогуанидин

ЦОГ-2

Синтез белков У

Ядро клетки 1-НАМЕ

Брадикинин

02

I-аргинин еЫОЭ

Эндотелио- и кардиопротекц и я

К+АТФ каналы ж ^

Опиоиды в белок

Тирозинкиназаи О р протеинниназы

Протеинкиназа С

Са++ Аденозин

Гпибенкламид

Рис. 4.1. Фрагмент механизма фармакологического прекондиционирования и гипотетическая роль эритропоэтина в нем.

Примечание. К+АТФ каналы - АТФ-зависимые калиевые каналы; еЫОБ -эндотелиальная ЫО-синтаза; ¡ЫОБ - индуцибельная ЫО-синтаза; Ь-ЫАМЕ - Ы-нитро-Ь-аргинина метиловый эфир; N0 - оксид азота; ЦОГ-2 - циклооксигеназа-2.

Вышеизложенное подтверждает наше предположение о том, что эритропоэтин является триггером ишемического прекондиционирования и может вызывать фармакологическое прекондиционирование, а реализация естественных механизмов защиты от ишемии осуществляется за счет активации АТФ-зависимых калиевых каналов и биосинтеза оксида азота.

Таким образом, результаты проведенного исследования позволяют сделать вывод о достоверном снижении площади некротизированного миокарда при применении рекомбинантного эритропоэтина, дистантного ишемического прекондиционирования и их комбинации. Указанное защитное действие ишемического и фармакологического прекондиционирования реализуется за счет коррекции эндотелиальной дисфункции, повышения устойчивости миокарда к гипоксии, активации синтеза оксида азота, активации АТФ-зависимых калиевых каналов, угнетения воспалительной реакции и нормализации сосудистой проницаемости.