Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Использование фармакологического прекондиционирования никорандилом для коррекции эндотелиальной дисфункции на модели L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота

На правах рукописи

С

Старосельцева Ольга Алексеевна

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОГО ПРЕКОНДИЦИОНИРОВАНИЯ НИКОРАНДИЛОМ ДЛЯ КОРРЕКЦИИ ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИИ НА МОДЕЛИ Ь-КАМЕ-ИНДУЦИРОВАННОГО ДЕФИЦИТА ОКСИДА АЗОТА (экспериментальное исследование)

14.03.06 — фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курским государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Покровский Михаил Владимирович Официальные оппоненты:

Резников Константин Михаилович, доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Воронежская государственная медицинская академия имени H.H. Бурденко» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, заведующий кафедрой фармакологии

Андрей Владиславович Воронков, доктор медицинских наук, доцент, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, заведующий кафедрой физической реабилитации и спортивной медицины с курсом восстановительной медицины, физиотерапии, лечебной физкультуры и спортивной медицины

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Защита состоится « И » JU3-SI 2012 г. в {\\00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.039.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО КГМУ Минздравсоцразвития РФ.

Автореферат разослан « а

Ученый секретарь диссертационного совета

Пашни Евгений Николаевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования.

В настоящее время артериальная гипертензия (АГ) является не только одним из наиболее распространенных заболеваний, но и одним из основных факторов, повышающих инвалидизацию и смертность населения. Это происходит чаще всего за счет таких грозных осложнений, как инфаркт миокарда и инсульт головного мозга. В России распространенность АГ и частота развития осложнений очень велики. Наша Страна занимает одно из первых мест по смертности от ИБС (ишемической болезни сердца). Одной из основных причин АГ является нарушение функциональных свойств эндотелия сосудистой стенки (Агеев Ф.Т., 2003).

Среди функций эндотелия выделяют синтез медиаторов, таких как вазоконстрикторы (эндотелии I, ангиотензин II) и вазодилататоры (эндотелиальный гиперполяризующий фактор, простациклин и оксид азота). Дисбаланс между вазодилататорами и вазоконстрикторами с преобладанием последних и принято называть эндотелиальной дисфункцией. Основным вазодилатирующим агентом является молекула оксида азота (NO). В нормально функционирующем эндотелии низкие уровни NO постоянно высвобождаются для поддержания кровеносных сосудов в состоянии дилатации. Таким образом, под эндотелиальной дисфункцией понимают нарушение синтеза N0 (Бувальцев В.И., 2002).

Результаты экспериментальных и клинических исследований последних лет подтвердили концепцию о важной причинно-следственной взаимосвязи между эндотелиальной дисфункцией и прогрессированием и/или развитием артериальной гипертонии, атеросклероза, хронической сердечной недостаточности, хронической почечной недостаточности и их осложнений (БабакОЛ.,2004).

Коррекция эндотелиальной дисфункции при сердечно-сосудистой патологии сегодня является одним из наиболее перспективных направлений, определяющих вероятность развития сосудистых осложнений и способствующих улучшению прогноза в целом (Небиеридзе Д.В., 2005).

Поиск эффективных средств коррекции нарушенной эндотелиальной функции у больных с ИБС остается одним из важных направлений современной кардиологии. В связи с этим интерес к изучению физиологического феномена, названного «прекондиционированием», со стороны как экспериментальной, так и практической медицины огромен. Свидетельством этому являются многочисленные публикации (Simon R.P., 2003; Ostadalova I., 2002; Perez-Pinzon М.А., 2007), в том числе в ведущих мировых научных изданиях (Becker К., 2009). Обнаружено, что устойчивость тканей к ишемии может повышаться в результате прекондиционирования, вызванного короткими эпизодами ишемии - реперфузии. Показано, что ишемическое прекондиционирование является общебиологическим механизмом и реализуется за счет активации АТФ-зависимых калиевых каналов в ответ на выделение аденозина, брадикинина, опиоидов и др. Данный

феномен был открыт и описан в 1986 г. Murry и соавт., которые впервые продемонстрировали, что четыре коротких эпизода коронароокклюзии, перемежающиеся 5-минутными периодами реперфузии перед длительной, 40-минутной коронароокклюзией, уменьшали размер инфаркта миокарда почти в 2 раза.

Исследования последних лет показали, что одного эпизода преходящей ишемии достаточно, чтобы вызвать прекондиционирование. Защитные свойства проявляются уже через 5 минут реперфузии. Тогда наступает первая защитная фаза. Продолжительность её - 1-2 часа. Затем эффект исчезает и возобновляется в промежуток времени от 24 до 96 часов. Это вторая защитная фаза (Бокерия J1.A., 2007).

В последнее время все чаще стали появляться публикации о применении различных видов феномена прекондиционирования: гипоксического, дистантного, стрессового и др. К гипоксическому прекондиционированию относится прекондиционирование инертными газами. Накопленные к настоящему времени сведения о прекондиционирующем действии гелия и его вкладе в NO-эргическую систему подтверждаются последними зарубежными исследованиями (Heinen А., 2008).

Исследования привели к необходимости поиска гуморального агента, способного при экзогенном введении инициировать процесс без ишемии или гипоксии. С клинической точки зрения прекондиционирование фармакологическими средствами выглядит предпочтительнее, так как технологически проще и лишено потенциальной опасности ишемических эпизодов для патологически измененных тканей (Perrault L.P., 2001).

В фармакологическом аспекте одним из наиболее перспективных гуморальных агентов, принимающих участие в реализации феномена прекондиционирования, является никорандил (Ahmed L.A., 2011). Никорандил выгодно отличается от прочих препаратов отсутствием побочных эффектов, а также сам по себе является донатором оксида азота.

Таким' образом, изложенное выше свидетельствует об актуальности исследования эндотелиопротективного действия фармакологического прекондиционирования никорандилом, поскольку именно эндотелию сосудов отводится ведущая роль в развитии сердечно-сосудистых заболеваний.

Цель исследования: провести комплексное изучение эндотелио- и кардиопротективного действия фармакологического прекондиционирования никорандилом в сравнении с дистантным ишемическим прекондиционированием и прекондиционированием инертным газом гелием при L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота в эксперименте.

Задачи исследования:

1. Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность фармакологического прекондиционирования никорандилом в дозе 4 мг/кг при моделировании дефицита оксида азота в эксперименте.

2. Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность прекондиционирования инертным газом гелием при моделировании дефицита оксида азота в эксперименте.

3. Изучить эндотелио- и кардиопротективнуго активность дистантного ишемического прекондиционирования при моделировании дефицита оксида азота в эксперименте.

4. Изучить роль АТФ-зависимых калиевых каналов в реализации эффектов различных форм прекондиционирования при L-NAME-индуцированной модели дефицита оксида азота путем введения блокатора калиевых каналов глибенкламида в дозе 4 мг/кг.

5. Дать оценку эндотелио- и кардиопротективной активности фармакологического прекондиционирования никорандилом в дозе 4 мг/кг в сравнении с дистантным ишемическим прекондиционированием и прекондиционированием инертным газом гелием при L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота в эксперименте.

Научная новизна исследования. В работе решена актуальная задача фармакологии по доклинической оценке эндотелиотропной активности феномена прекондиционирования с использованием коэффициента эндотелйальной дисфункции (КЭД), результатов проведения функциональных проб, определения биохимических маркеров и морфологических исследований.

В качестве потенциального эндотелиопротектора экспериментально обосновано использование никорандила, вызывающего индукцию биосинтеза оксида азота. Никорандил 4 мг/кг способствовал преобладанию эндотелийзависимого расслабления сосудов, снижению КЭД до значений 1,76±0,18 усл. ед. и предупреждению снижения концентрации конечных стабильных метаболитов оксида азота (NOx), а также предупреждению повышения С-реактивного белка.

Морфологические исследования обнаружили предотвращение развития мембранозной гломерулопатии, гипертрофии кардиомиоцитов и их некроза, а также деструктивных изменений эндотелия сосудов и признаков гипертрофии их стенок в почках и миокарде.

По результатам проведенных экспериментальных исследований подана I заявка tía получение патента РФ, получено свидетельство ноу-хау РФ.

Практическая значимость. В работе обоснована эффективность коррекции эндотелйальной дисфункции путем применения фармакологического прекондиционирования никорандилом при

L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота в эксперименте. Показано, что его использование позволяет нормализовать изменение соотношения сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзавиеимая вазодилатация) и нитропрусснд (эндотелийнезависимая вазодилатация), что выразилось в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении коэффициента эндотелйальной дисфункции.

Одновременно результаты нагрузочных проб, биохимических и морфологических исследований свидетельствовали о положительной динамике морфофункционапьных показателей сердечно-сосудистой системы (снижение адренореактивности, предотвращение исчерпания миокардиального резерва, нормализация структуры гломерулярных капилляров, отсутствие деструктивных изменений эндотелия сосудов и признаков гипертрофии их

стенок, отсутствие гипертрофических изменений кардиомиоцитов), и о восстановлении активности МО-продуцирующей функции эндотелия >(повышение концентрации конечных стабильных метаболитов оксида азота) и противовоспалительной активности (понижение концентрации С-реактивного белка).

Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные доклинические и клинические испытания никорандила в качестве эндотелиотропного аддитива при лечении патологических состояний, связанных с развитием эндотелиальной дисфункции.

Внедрение результатов научных исследований. Полученные данные вошли в учебные программы и используются в лекционных курсах кафедры фармакологии ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России, кафедры фармакологии и фармацевтических дисциплин ИПМО ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет», кафедры фармакологии и биохимии ФГБОУ ВПО «Орловский государственный университет».

Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе дизайна исследования, определении целей и задач работы. Автором проанализированы отечественные и зарубежные источники по теме диссертационного исследования, проведены серии экспериментов, получены и обобщены результаты исследования, проведены статистическая обработка и анализ полученных данных (доля участия 100%). В публикациях в соавторстве доля участия автора 80%.

Связь с планом НИР. Диссертация выполнена в соответствии с планом НИР ГБОУ ВПО ЬСГМУ Минздравсоцразвития России. Номер государственной регистрации темы - 01201155760.

Апробация работы. Материалы работы доложены на 76-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежная наука и современность», Курск, 2011 г.; Межвузовской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы фармакологии и фармации - 2011», Белгород, 2011 г.; Всероссийской интернет-конференции «Достижения клинической фармакологии и фармации в начале XXI века», Белгород, 2011 г.; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 45-летию фармацевтического факультета КГМУ «Традиции и инновации фармацевтической науки и практики», Курск, 2011 г.; Четвертой международной дистанционной научной конференции «Инновации в медицине», Курск, 2011 г.

По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, 3 из них -в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.

Положения, иыносимые на защиту.

1. Фармакологическое прекондиционирование никорандилом, проводимое в течение 7 дней, оказывает наиболее выраженное эндотелиопротективиое действие в сравнении с прекондиционированием инертным газом гелием и дистантным ишемическим прекондиционированием на модели L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота.

2.АТФ-зависимые калиевые каналы принимают участие в реализации эндотелиопротективных эффектов различных форм прекондиционирования на модели L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота. Глибенкламид в дозе 4 мг/кг блокирует АТФ-зависимые калиевые каналы и нивелирует эндотелио- и кардиопротективные эффекты различных форм прекондиционирования на модели L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов экспериментальных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка используемой литературы, включающего 176 источников, из них 58 отечественных и 118 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 157 страницах машинописного текста, содержит таблиц - 15, рисунков - 42, формул - 2.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Моделирование L-NAME-uHdyiiupoeaHHoii эндотелиальной дисфункции. Опыты проводили на белых крысах-самцах линии Wistar массой 250-300 г. Условия содержания животных: стандартная экспериментальная биологически чистая комната, освещение 12 ч/12 ч светлый/темный цикл, t 22-24°С. Все исследования проводили в одно и то же время суток во второй половине дня с соблюдением принципов, изложенных в «Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1986). N-nnTpo-L-аргинин метиловый эфир (L-NAME) вводили ежедневно один раз в сутки внутрибрюшинно в дозе 25 мг/кг.

Оценка эндотелийзависимых и эндотелийнезависимых сосудистых реакций. Через 7 дней от начала эксперимента под наркозом (хлоралгидрат 300 мг/кг) вводили катетер в левую сонную артерию для регистрации показателей; болюсное введение фармакологических агентов осуществляли в правую бедренную вену. Показатели гемодинамики: систолическое артериальное давление (САД), диастолическое артериальное давление (ДАД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряли непрерывно посредством датчика и компьютерной программы "Biopac Systems, lnc". Эндотелийзависимая (ЭЗВД) и эндотелийнезависимая (ЭНВД) сосудистые реакции оценивались посредством проведения функциональных проб с внутривенным введением ацетилхолина (АХ) - 40 мкг/кг (Laursen J.В., 1997) и нитропруссида натрия (НП) - 30 мкг/кг (Галаган М.Е., 1991).

Исследование сократимости миокарда. У наркотизированных крыс, находящихся на управляемом дыхании, после моделирования патологии

проводилось исследование сократимости миокарда. Полость левого желудочка зондировали иглой через верхушку сердца и посредством датчика RX 104 А "Biopac Systems, Inc." и компьютерной программы "Biopac Systems, Inc.", США, регистрировали показатели кардиогемодинамики (левожелудочковое давление (ЛЖД), максимальную скорость сокращения (+dp/dt max), максимальную скорость расслабления (-dp/dt max), частоту сердечных сокращений (ЧСС) и интенсивность функционирования структур (ИФС).

Для оценки функциональных возможностей миокарда у животных проводили нагрузочные пробы в представленной последовательности:

1. Проба на адренореактивность - внутривенное одномоментное введение раствора адреналина гидрохлорида 1,10-5моль/л, из расчета 0,1 мл наЮО г. (Гладченко М.П., Покровский М.П., Артюшкова Е.Б. и др., 1999; Гурбанов К.К., Ковалев Г.В., Паперно A.A., 1991).

2. Нагрузка сопротивлением - пережатие восходящей аорты на 30 сек (Гладченко М.П., Покровский М.П., Артюшкова Е.Б. и др., 1999).

3. 3-минутная гипоксия с последующей реоксигенацией (Пашин E.H., 1993; Петрищев H.H., Власов Т.Д., 2000; Пичугин В.В., 1979).

Биохимические маркеры энОотелшиьной дисфункции. Биохимическими маркерами эндотелиальной дисфункции служили Total NO (NOx) и концентрация С-реактианого белка.

Нами использована модификация метода определения стабильных метаболитов NO. Принцип метода заключается в одновременном восстановлении нитратов в нитриты в присутствии хлористого ванадия и реакции диазотирования с последующим развитием окраски.

Уровень С-реактивного белка определяли иммунотурбидиметрическим методом измерения при длине волны 340 нм, с использованием нелинейной калибровки при помощи реагентов "Human" (Германия) на автоматическом биохимическом анализаторе "Виталаб Флексор".

Для .морфологического подтверждения развития моделируемых патологических процессов кусочки органов фиксировали в 10% нейтральном формалине и заливали в парафин по общепринятым методикам (Меркулов Г.А., 1969). Парафиновые срезы толщиной 8-10 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. В почках обращали внимание на состояние капилляров клубочков, толщину стенок артерий и артериол и их эндотелия. В сердце изучали общее состояние эндокарда и перикарда, кардиомиоцитов и стромы, оценивали состояние сосудов миокарда и их эндотелия. Кроме этого, в миокарде левого желудочка с помощью окуляр-микрометра измеряли диаметр кардиомиоцитов.

Обоснование доз исследуемых препаратов. При моделировании L-NAME-индуцированного дефицита NO проводилось изучение эндотелиопротективного действия фармакологического прекондиционирования никорандилом. Никорандил вводили в дозе 4 мг/кг в виде раствора внутрижелудочно через зонд 2 раза в сутки в течение 7 дней непосредственно перед введением L-NAME.

S

Для изучения участия АТФ-зависимых калиевых каналов в реализации эндотелиопротективных эффектов различных форм прекондиционирования применялся блокатор калиевых каналов глибенкламид. Глибенкламид вводили в дозе 4 мг/кг внутрибрюшинно 1 раз в сутки в течение 7 дней на фоне введения L-NAME.

Принятые схемы соответствуют основной массе экспериментальных исследований, выполненных на крысах при данной модели патологии.

Таким образом, исследования проводились на крысах линии Wistar в терапевтической дозе, полученной в результате переноса доз с человека на крысу, с использованием формулы межвидового переноса и коэффициента пересчета доз для разных видов животных в зависимости от массы тела (Freireichata 1., 1966; Уланова И.П. и др., 1968).

Дистантное ишемическое прекондиционирование (ДИП) проводили в течение 7 дней 10 минутным пережатием бедренной артерии непосредственно перед моделированием патологии. ДИП проводили путем наложения жгута на верхнюю треть бедра. Контролем правильности наложения жгута служило отсутствие пульса на артериях голени.

Прекондиционирование инертным газом гелием проводили в течение 7 дней 5 минутным пребыванием крысы в закрытом стеклянном сосуде с вдыханием смеси гелия с кислородом в объеме 3:1, непосредственно перед моделированием патологии.

Статистическая обработка результатов исследования. Достоверность наблюдавшихся при действии исследованных препаратов изменений параметров, как абсолютных, так и в процентах от исходного уровня, определяли путем расчета средней арифметической (М), ошибки средней арифметической (±т) и достоверности различий сравниваемых параметров между группами с использованием t-test для групп с разными дисперсиями, достоверными считались различия сравниваемых параметров при р<0,05.Для расчетов использовали программу для статистического анализа Microsoft Excel 2003.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

L. Исследование эндотелно- и кардиопротектпвных эффектов фармакологического прекондиционпровання никорандилом,

прекондиционпрования инертным газом гелием и дистантного ишемического прекоидиционированпя при моделировании L-NAME-HiiflymipoBaiiiioro дефицита оксида азота

Обнаружено, что все виды прекондиционирования предотвращали развитие выраженной гипертензии и значения САД и ДАД были достоверно ниже соответствующих значений в группе животных с моделированием L-NAME патологии (рис. I ад).

Проведенные нами исследования показали, что среди представленных видов прекондиционирования фармакологическое прекондиционирование никорандилом по сравнению с нефармакологическими способами обладает

наиболее выраженным эндотелиопротективным эффектом, выражающимся в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД). Так, КЭД в группах животных с применением фармакологического прекондиционирования никорандилом составил 1,7б±0,18 усл. ед., прекондиционирования смесью гелия с кислородом - 2,57±0,21 усл. ед., дистантного ишемического прекондиционирования (ДИП) - 2,5±0,3усл. ед. по сравнению с группой Ь-МАМЕ-патологии - 5,4±0,б усл. ед. (рис. 1 кэд).

Для оценки функциональных возможностей миокарда у животных с Ь^АМЕ-индуцированным дефицитом оксида азота проводились нагрузочные пробы. Проба на адренореактивность показала снижение максимальных цифр ЛЖД до значений 188,1±14,2 мм рт. ст., 165,5±12,2 мм рт. ст. и 199,2±14,3 мм рт. ст. при применении ДИП, прекондиционирования смесью гелия с кислородом и прекондиционирования никорандилом соответственно (рис. 1 адр). В группе с Ь-МАМЕ-патол огней данный показатель составил 243±4,8 мм рт. ст.

Проведение пробы на нагрузку сопротивлением выявило способность всех способов прекондиционирования предотвращать исчерпание миокардиального резерва. Сократимость левого желудочка на 25-й секунде проведения пробы у интактных животных составила 83,6±4,6% от величины 5-й секунды, принятой за 100%, у животных с Ь-ЫАМЕ патологией -бб,0±2,5%. В1 группах с применением ДИП, прекондиционирования смесью гелия с кислородом (Не с СЬ) и прекондиционирования никорандилом данный показатель был на уровне 87,1 ±6,4%, 91,9±7,8% и 77,2±8,3% соответственно (рис. 1нс)

ТМО-продуцирующая функция эндотелия исследована нами на основании определения в сыворотке крови концентрации конечных стабильных метаболитов оксида азота (>Юх). Концентрация КОх на фоне всех видов прекондиционирования увеличивалась, приближаясь к уровню интактных животных (7,3±0,73 мкмоль/л) и составила 6,2±0,25 мкмоль/л, 4,8±0,29 мкмоль/л и 5,1 ±0,1 мкмоль/л при проведении прекондиционирования никорандилом, ДИП и прекондиционирования смесью гелия с кислородом соответственно (рис. 1 ыох).

Противовоспалительная активность исследована нами на основании определения в сыворотке крови концентрации С-реактивного белка. Концентрация С-реактивного белка на фоне всех видов прекондиционирования снижалась, приближаясь к уровню интактных животных (0,37±0,07 мг/дл), и составила 0,6±0,06 мг/дл, 0,74±0,05 мг/дл и 0,78±0,04 мг/дл при проведении прекондиционирования никорандилом,ДИП и прекондиционирования смесью гелия с кислородом соответственно (рис. 1 срб).

Данные морфологических исследований показали, что применение всех видов прекондиционирования положительно повлияло на морфологические изменения почек и сердца крыс с экспериментальной артериальной гипертензией (рис. I дкмц). Так, отмечались нормализация структуры капилляров, предотвращение развития гипертрофических изменений диаметра

кардиомиоцитов (ДКМЦ), отсутствовали деструктивные изменения эндотелия сосудов и признаки гипертрофии их стенок. В почках почти полностью исчезли признаки мембранозной гломерулопатии и капилляры клубочков выглядели в большинстве случаев так же, как и у интактных крыс.

Таким образом, анализ совокупности функциональных, биохимических и морфологических показателей свидетельствует о выраженности эндотелио- и кардиопротективных эффектов различных способов прекондиционирования при Ь^АМЕ-индуцированной модели дефицита оксида азота в эксперименте.

1- Интактные;

2- Ь-ЫАМЕ;

3- дистантное ишемическое прекондиционирование;

4- прекондиционирование смесью гелия с кислородом;

5- прекондиционирование никорандилом в дозе 4 мг/кг.

Рис. 1. Функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании Ь^АМЕ-индуцированного дефицита оксида азота на фоне различных способов прекондиционирования.

Примечание. Здесь и везде далее: АД - артериальное давление, КЭД -коэффициент эндотелиальной дисфункции. АДР - адренореактнвиость, НС - нагрузка сопротивлением, ЫОх - концентрация конечных стабильных метаболитов оксида азота, СРБ-концентрация С-реактивного белка, ДКМЦ - диаметр кардиомиоцитов.

* - при р<0,05 в сравнении с группой интактных животных, **- при р<0,05 в сравнении с группой животных, получавших Ы^АМЕ,

«

Л

- р; Иг/ Й : а

Рис. 2. Сердце крысы на фоне проведения ДИП (А), прекондиционирования смесью гелия с кислородом (Б), прекондиционирования никорандилом (В). 8-е сутки эксперимента: интрамуральные артерии без признаков гипертрофии стенок и с непораженным эндотелием. Отсутствие гипертрофических изменений кардиомиоцитов. Окраска гематоксилином и эозином. Микрофото, х 400.

.Т Г. <• • ~ 1 - т 1 ЙП . ' * ' } ' ' / Л^Й! Р-г * , . V • . . • "......' . в 1", » " • г ЩЩЙЙ % | ..... ? Яр ШтШ 1МЙ я щ^щшшшшщ ШШй^ш * С 5' Ш Щ ЖУ'^Ш ш ¿шН - | ,■ ' ' .' I ' ■•■;. , •' т*-^

ИЬ - •'"1 .......Г ."• ■ г- V 'Ч'' ^■■¿УМ^и^/ ■гХТ]

Рис. 3. Почка крысы на фоне проведения ДИП (А), прекондиционирования смесью гелия с кислородом (Б), прекондиционирования никорандилом (В).8-е сутки эксперимента: капилляры клубочка почки без патологических изменений; артериола коркового вещества без признаков гипертрофии, эндотелий не поражен. Окраска гематоксилином и эозином. Микрофото, х 400.

2. Глибенкламид в дозе 4 мг/кг блокирует АТФ-зависимые калиевые каналы и нивелирует эндотелио- и кардиопротективные эффекты различных форм прекондиционирования на модели

Ь-МАМЕ-индуцнровапного дефицита оксида азота

Обнаружено, что введение глибенкламида нивелировало эффекты всех видов прекондиционирования. При этом происходило развитие выраженной артериальной гипертензии и значения САД и ДАД были близки к соответствующим значениям в группе животных с моделированием Ь^АМЕ-патологии (рис. 4 ад).

Проведенные нами исследования показали, что глибенкламид нивелировал эндотелиопротективные эффекты всех способов прекондиционирования, что выражалось в повышении коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), при этом значения приближались к таковым в группе с Ь-ЫАМЕ-патологией (5,4±0,6 усл. ед.) и составили 4,17±0,37 усл. ед., 3,7±0,3 усл. ед. и 4,5±0,5 усл. ед. при введении глибенкламида на фоне прекондиционирования никорандилом, ДИП и прекондиционирования смесью гелия с кислородом соответственно (рис. 4 кэд).

Для оценки функциональных возможностей миокарда у животных с Ь^АМЕ-индуцированным дефицитом оксида азота проводились нагрузочные пробы. Проба на адренореактивность при введении глибенкламида показала повышение максимальных цифр ЛЖД во всех экспериментальных группах (226,3± 1 1 мм рт. ст., 208,7±8,5 мм рт. ст., и 241,8±8,0 мм рт. ст. при введении глибенкламида на фоне прекондиционирования никорандилом, ДИП и прекондиционирования смесью гелия с кислородом соответственно) (рис. 4 адр).

Проведение пробы на нагрузку сопротивлением при введении глибенкламида выявило исчерпание миокардиального резерва при всех способах прекондиционирования (79,0±4,2%, 75,2±6,9% и 67,8±3,8% при ДИП, прекондиционировании смесью гелия с кислородом и прекондиционировании никорандилом соответственно) (рис. 4 не).

Концентрация 1МОх на фоне всех видов прекондиционирования при введении глибенкламида снижалась, приближаясь к уровню животных с моделированием Ь-ЫАМЕ-патологии (2,3±0,21 мкмоль/л), что составило 3,9±0,1 мкмоль/л, 3,1 ±0,21 мкмоль/л и 5,5±0,12 мкмоль/л при проведении на фоне глибенкламида ДИП, прекондиционирования смесью гелия с кислородом и прекондиционирования никорандилом соответственно) (рис. 4 N0.*).

Концентрация С-реактивного белка на фоне всех видов прекондиционирования при введении глибенкламида повышалась и приближалась к уровню животных с моделированием Е^АМЕ-патологии (2,3±0,17 мг/дл). При этом концентрация С-реактивного белка составила 1,05±0,08 мг/дл, 1,27±0,03 мг/дл и 1,66±0,11 мг/дл при проведении прекондиционирования никорандилом, ДИП и прекондиционирования смесью гелия с кислородом соответственно (рис. 4 срв).

Данные морфологических исследований показали, что применение глибенкламида на фоне всех видов прекондиционирования отрицательно

повлияло на морфологические изменения почек и сердца крыс с экспериментальной артериальной гипертензией (рис. 4дкмц), Так, отмечалось развитие мембранозной гдомерулопатии, гипертрофии кардиомиоцитов, а также деструктивных изменений эндотелия сосудов и признаков гипертрофии их стенок в почках и миокарде на фоне Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота.

Таким образом, анализ совокупности функциональных, биохимических и морфологических показателей свидетельствует о нивелировании эндотелио- и кардиопротективных эффектов различных способов прекондиционирования путем введения глибенкламида при Ь-ЫАМЕ-индуцированной модели дефицита оксида азота в эксперименте.

241,8*

208,7

226,3 АДР

fililí

1 - miß i...........165,5 s liite&föb i;.......zzztp-JAU _ 199,2 Щ||

.......... - ......r" '

!...... lili

о -мм рг.

91,9%

ш

н с

ilIK- ? ■ ■

ilir 75,2%

III * ^

Í î §

ii|| :' : M y'X'Si

/'-ï

77,2%

: 67,8%*

шж--

NOK

5,1

111 ÏÎS

ill

lip

Ii 3,1*

f

6,2

5,5*

Щ ■

jS'll

Sí-fe-

im

iim

0,30 I

мг/дл

1,27*

0,70

СРВ

1,66*

0,78 :

m

Pli 1111

i-

0,60

1,05*

20 ' 18 Дб

.14

И

ю 4 8 1

с -мнм

1- Интактные;

2- Ь-ЫАМЕ;

3- дистантное ишемическое прекондиционирование;

4- прекондиционирование емесыо гелия с кислородом;

5- прекондиционирование никорандилом в дозе 4 мг/кг;

6- дистантное ишемическое прекондиционирование + глибенкламид в дозе 4 мг/кг;

7- прекондиционирование смесью гелия с кислородом^ глибенкламид

в дозе 4 мг/кг;

8- прекондиционирование никорандилом в дозе 4 мг/кг + глибенкламид в дозе 4 мг/кг.

Рис. 4. Функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании Ь-КАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота и введении глибенкламида.

Примечание.*- при р<0,05 в сравнения с группой интактных животных, **- при р<0,05 в сравнении с группой животных, получавших 1,-ЫАМЕ.

Рис. 5. Почка крысы на фоне введения глибенкламида. 8-е сутки эксперимента: интрамуральные артерии резко гипертрофированы и с пораженным эндотелием (А). Клубочки имеют «лапчатые» очертания, базальные мембраны капилляров утолщены («проволочные петли») (Б). Выраженная гипертрофия кардиомиоцитов, увеличение их в диаметре, укрупнение ядер (В). Окраска гематоксилином и эозином. Микрофото, х 400.

выводы

1. Дистантное ишемическое прекондиционирование проявило выраженное эндотелио- и кардиопротективное действие на модели ЫЧАМЕ-индуцированного дефицита N0, что выразилось в снижении КЭД до2,5±0,3 усл.ед., предупреждении снижения концентрации >Юх (4,8±0,29 мкмоль/л) и повышения концентрации С-реактивного белка (0,74±0,05 мг/дл), предотвращении развития гиперадренореактивности, а также в повышении сократимости миокарда до 87,1±6,4% при проведении пробы на нагрузку сопротивлением. Морфологические исследования обнаружили снижение развития мембранозной гломерулопатии, гипертрофии кардиомиоцитов и их некроза, деструктивных изменений эндотелия сосудов и признаков гипертрофии их стенок в почках и миокарде.

2.Прекондиционирование инертным газом гелием в виде смеси гелия с кислородом в отношении 3:1 проявило выраженное эндотелио- и кардиопротективное действие на модели Ь->1АМЕ-индуцированного дефицита>Ю, что выразилось в снижении КЭД до 2,57±0,21 усл. ед. и предупреждении снижения концентрации ТМОх (5,1±0,1 мкмоль/л) и повышения концентрации С-реактивного белка (0,78±0,04 мг/дл), а также в повышении сократимости миокарда до 91,9±7,8% при проведении пробы на нагрузку сопротивлением. Морфологические исследования обнаружили предотвращение развития мембранозной гломерулопатии, гипертрофии кардиомиоцитов и их некроза, снижение утолщения базальных мембран клубочков и отсутствие некротических изменений в миокарде.

3. Фармакологическое прекондиционирование никорандилом в дозе 4 мг/кг проявило выраженное эндотелио- и кардиопротективное действие на модели Ы^1АМЕ-индуцированного дефицита N0, что выразилось в снижении КЭД до 1,76±0,18усл.ед., полном предупреждении снижения концентрации >Юх (6,2±0,25 мкмоль/л) и повышения концентрации С-реактивного белка (0,6±0,1 мг/дл), предотвращении развития гиперадренореактивности, а также в повышении сократимости миокарда до 77,2±8,3% при проведении пробы на нагрузку сопротивлением. Морфологические исследования обнаружили снижение развития мембранозной гломерулопатии, гипертрофии кардиомиоцитов и их некроза, деструктивных изменений эндотелия сосудов и признаков гипертрофии их стенок в почках и миокарде.

4. Глибенкламид в дозе 4 мг/кг блокировал АТФ-зависимые калиевые каналы и нивелировал эндотелио- и кардиопротективные эффекты дистантного ишемического прекондиционирования, прекондиционирования инертным газом гелием, фармакологического прекондиционирования никорандилом при Ь^АМЕ-индуцированной модели дефицита оксида азота. Это выразилось в повышении КЭД до значений, близких к группе с введением Ь-ЫАМЕ, снижении концентраций МОх и повышении концентраций С-реактивного белка во всех группах. Одновременно обнаружилось снижение сократимости миокарда при проведении пробы на нагрузку сопротивлением. Морфологические исследования обнаружили утолщения базальных мембран клубочков почек и наличие некротических изменений в миокарде,

деструктивных изменений эндотелия сосудов и признаков гипертрофии их стенок в почках и миокарде.

5. Фармакологическое прекондиционирование никорандилом в дозе 4 мг/кг в сравнении с дистантным ишемическим прекондиционированием и прекондиционированием инертным газом гелием проявило наиболее выраженное эндотелиопротективное действие, что выразилось в снижении КЭД до 1,76±0Д8 усл. ед. против 2,5±0,3 усл. ед. и 2,57±0,21 усл. ед. при дистантном ншемическом прекондиционировании и прекондиционировании инертным газом гелием соответственно на модели L-NAME-индуцированного дефицита

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние феномена ишемического посткондиционирования на размер зоны повреждения головного мозга у крыс / O.A. Старосельцева, А.Е. Королев, К.А. Горкавенко, Ю.А. Петрова // Молодежная наука и современность: материалы 76-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием (Курск, 19-20 апр. 2011 г.). - Курск: Изд-во КГМУ, 2011. -Ч. 3. - С. 296-297.

2. Влияние феномена ишемического прекондиционирования на размер зоны инфаркта у кроликов / O.A. Старосельцева, А.Е. Королев, Е.В. Аболенская, Д.Е. Непогодина // Молодежная наука и современность: материалы 76-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием (Курск, 19-20 апр. 2011 г.). - Курск- Изд-во КГМУ, 2011.-Ч. 3. - С. 295-296.

3. Дистантное прекондиционирование в коррекции эндотелиальной дисфункции при ADMA-подобной модели гестоза / О.С. Полянская, A.A. Барсук, O.A. Старосельцева, И.Н. Уколова, А.П. Почечун // Молодежная наука и современность: материалы 76-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием (Курск, 19-20 апр 2011 г.). - Курск: Изд-во КГМУ, 2011. -Ч. 2. - С. 50.

4. Жуков C.B. Моделирование ишемического повреждения на изолированном по Лангендорфу сердце крыс / C.B. Жуков, O.A. Старосельцева, К.А. Лебедев // Молодежная наука и современность: материалы 76-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием (Курск, 19-20 апр. 2011 г.). - Курск: Изд-во КГМУ 2011.-Ч.З.-С. 187-188.

5. Использование морфологических срезов при изучении кардиологических феноменов / О.А Старосельцева, Е.С. Черноморцева, Л.А. Мантулина, Н.В. Щербакова // Молодежная наука и современность: материалы 76-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием (Курск, 19-20 апр. 2011 г.). - Курск- Изд-во КГМУ, 2011. - Ч. 2. - С. 297.

6. Рекомбинантный эритропоэтин как прекондиционирующий агент при ишемических повреждениях органов брюшной полости / С.А. Алехин, М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, В.В. Алехина, Д.И. Колмыков!

Jl.И. Иванова, В.В. Гуреев, O.A. Старосельцева и др. // Приволжский научный вестник. -201 !.-№ 2.-С. 68-73.

7. Старосельцева, O.A. Использование морфологических срезов при изучении новых кардиологических феноменов / O.A. Старосельцева, E.G. Черноморцева, Л.А. Мантулина // Инновации в медицине: материалы IV Международной дистанционной научной конференции (Курск декабрь 2011 г.).

- Курск, 2011.~ С. 97-98.

8. Фармакологическое прекондициопирование эритропоэтином при ишемии конечности / И.М. Колесник, М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, О.С. Гудырсв, Л.М. Даииленко, М.В. Корокин, С.А. Алехин, А.П. Григорёико, O.A. Старосельцева и др. // Биомедицина. -2011. -№ 4/2. -С. 90-91.

9. Эндотелиопротективное действие дистантного ишемического прекоидиционирования / O.A. Старосельцева, С.А. Алехин, В.А. Савин и др. II Научные ведомости БелГУ. - 2012. - Вып. 17/2, № 22(117).

- С. 238-242.

10. Эндотелиопротективные эффекты прекоидиционирования инертным газом гелием при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота / М.В. Покровский, O.A. Старосельцева, М.В. Корокин и др. // Научные ведомости БелГУ. - 2012. - Вып. 17/2, № 22(117).-С. 232-238.

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ.

АГ - артериальная гипертензия

ИБС - ишемическая болезнь сердца

NO - оксид азота

АТФ - аденозин трифосфат

L-NAME -N-HUTpo-L-apniHHii метиловый эфир

КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции

САД - систолическое артериальное давление

ДАД - диастолическое артериальное давление

ЧСС - число сердечных сокращений

АХ — ацетилхолин

НП - нитропруссид

ЭЗВД — эндотелийзависимая вазодилятация

ЭНВД - эндотелийнезависимая вазодилятация

ЛЖД — левожелудочковое давление

-dp/dt — максимальная скорость расслабления

+dp/dt— максимальная скорость сокращения

ИФС - интенсивность функционирования структур

ДИП - дистантное ишемическое прекондиционирование

АДР - адренореактивность

НС - наг рузка сопротивлением

СРВ - С-реактивный белок

ДКМЦ - диаметр кардиомиоцитов

Лицензия ЛР № 020862 от 30.04.99г. Сдано в набор 11.04.2012 г. Подписано в печать 13.04.2012 г. Формат 30x421/8. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 194"А". Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.