Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Фармакологическое прекондиционирование и посткондиционирование рекомбинантным эритропоэтином в коррекции то-тального ишемического и реперфузионного повреждения изолированного сердца крысы.

На правах рукописи

Каплин Антон Николаевич

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ПРЕКОНДИЦИОНИРОВАНИЕ И ПОСТКОНДИЦИОНИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫМ ЭРИТРОПОЭТИНОМ В КОРРЕКЦИИ ТОТАЛЬНОГО ИШЕМИЧЕСКОГО И РЕПЕРФУЗИОННОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ ИЗОЛИРОВАННОГО СЕРДЦА КРЫСЫ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

2 8 НОЯ 2013

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

005539852

Курск - 2013

005539852

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор Покровский Михаил Владимирович

Официальные оппоненты:

Быстрова Наталья Анатольевна - доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАЕН, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор кафедры биологической химии.

Николаев Сергей Борисович - доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет», профессор кафедры хирургических болезней факультета последипломного медицинского образования.

Ведущая организация:

Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Зашита диссертации состоится «0(? » (ЩсМг^^Л^ 2013 г. в часов

на заседании диссертационного совета д" 208.03^.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России

Автореферат разослан « 0£» 013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Овод Алла Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Актуальность исследования. По статистическим данным, приведенным некоторыми группами исследователей, в Российской Федерации смертность от сердечно-сосудистых заболеваний составляет примерно 58% от общей структуры смертности. Ежегодно от сердечно-сосудистых заболеваний в нашей стране умирает более 1,2 миллиона человек (Шальнова С.А. и соавт., 2012). Главенствующая роль в структуре смертности от сердечно-сосудистых заболеваний принадлежит ишемической болезни сердца (ИБС) - 35%. Возможность профилактики и коррекции ишемических и, последующих после восстановления кровотока, реперфузионных повреждений миокарда при ишемической болезни сердца^ является актуальной проблемой современной медицины. Отрицательный прогноз саногенеза тесно связан с общностью индуцированной гипоксией проапоптотической активностью в кардиомиоцитах и прямой цитотоксической реперфузионной травмой (Coetzee W.A., 1990; Ambrosio G., 1991; Seal J.B., 2005). В связи с этим возникает интерес к детальному изучению ишемического прекондиционирования и посткондиционирования, суть которых состоит в активации эндогенных цитопротекторных механизмов подпороговыми периодами ишемии, которые способны снижать степень повреждения клеток в результате последующей длительной ишемии и реперфузии (Murry С.Е., 1986' Yellon D.M., 2003; Downey J.M., 2007; Zhao. Z.Q., 2003; Hausenloy D.J.,2007)! Ишемическое прекондиционирование не только снижает объем некротической зоны, но и стимулирует процессы восстановления ишемизированных тканей (Бокерия Л.А., 2007; Dirnagl U., Becker К, Meisel А, 2009). Учитывая все обстоятельства, понятия «пре- и посткондиционирование» дало начало интенсивному поиску механизмов реализации защитного действия данных феноменов, ключевая роль которых может быть заключена в активации сигнальных путей (Yellon D.M., 2003; Penna С., 2006; Lim S.Y., 2007).

Дальнейшее изучение эффектов ишемического прекондиционирования и ишемического посткондиционирования подтвердило предположение о том, что точки приложения реализуется не локально, а представляют систему многоуровневого иерархического дублирования, включающую нейрогенный компонент, гуморальный и внутриклеточный (Inserte J., 2009), что привело к необходимости поиска гуморального агента, выделяющегося в ответ на ишемию и реперфузию, способного при экзогенном введении инициировать процесс без ишемии. С клинической точки зрения прекондиционирование и посткондиционирование фармакологическими средствами выглядит более предпочтительно, так как технологически проще и лишено потенциальной опасности ишемических эпизодов для патологически измененных тканей. Еще больший интерес для клинического применения представляет возможность дозировать введение фармакологических средств, что делает управляемым временной интервал периода толерантности к ишемии. Из литературных источников известно, что при хирургическом восстановлении кровотока в ишемизированном миокарде ВОЗ рекомендовано введение циклоспорина как

фармакологического агента посткондиционирования (Prévention of Cardiovascular Disease Pocket Guidelines for Assessment and Management of Cardiovascular Risk Geneva, 2007), но в связи с высокой степенью цитотоксичности и осложнениями после его введения (Вознесенская Т.С., 2005; Tedesco D, 2012) наиболее перспективным для изучения, с нашей точки зрения, является эритропоэтин. Это гликопротеиновый гормон, главным фактором, регулирующим его продукцию, является гипоксия. Период полувыведения эритропоэтина значительно выше, чем у других гуморальных агентов прекондиционирования (аденозин, брадикинин, опиоиды), следовательно, временной интервал периода толерантности к ишемии, инициируемый им, должен быть существенно шире. Кроме того, открытие рецепторов эритропоэтина на мезангиальных клетках и в миокарде, фибробластах мышечной ткани и нейронов позволило изучать неэритропоэтические функции гормона (Захаров Ю.М., 2007; Fantacci M., Bianciardi P., Caretti A., 2006;

Brines M.L., Ghezzi P., Keenan S., 2000).

Наиболее изучено влияние прекондиционирования и посткондиционирования на сердце и головной мозг. Однако предполагается изучение механизма реализации феномена прекондиционирования на изолированном органе, что исключает иные воздействия адаптационных механизмов организма, позволяющем непосредственно выявить цитопротекторные свойства изучаемого препарата в минимальных дозах для дальнейшего его универсального использования в хирургическом и терапевтическом лечении и профилактике ишемического и реперфузионного

повреждения миокарда.

Цель исследования: повышение эффективности борьбы с ишемическими и реперфузионными повреждениями изолированного сердца крысы путем использования фармакологического пре- и посткондиционирования с помощью рекомбинантного эритропоэтина.

Задачи исследования:

изучить влияние ишемического прекондиционирования и посткондиционирования на площадь повреждения и функциональное состояние миокарда при тотальном ишемическом и реперфузионном повреждении изолированного по Лангендорф сердца крысы;

- определить влияние фармакологического прекондиционирования и посткондиционирования рекомбинантным эритропоэтином в различных дозах на морфофункциональное состояние изолированного сердца после его ишемического и реперфузионного повреждения;

- оценить влияние циклоспорина как агента фармакологического прекондиционирования и посткондиционирования на площадь повреждения и функциональное состояние сердца крысы;

- провести оценку статистической зависимости между функциональными и морфологическими изменениями в ткани миокарда применительно к данным исследованиям;

- изучить роль АТФ-зависимых калиевых каналов в реализации цитопротекторного эффекта фармакологического прекондиционирования рекомбинантным эритропоэтином.

Научная новизна исследования. Впервые проведено углубленное изучение дозозависимых эффектов фармакологического пре- и посткондиционирования с использованием рекомбинантного эритропоэтина на изолированном сердце крысы. Впервые установлено и подтверждено макроскопически и на основании функциональных показателей деятельности сердца, что влияние рекомбинантного эритропоэтина, как эффектора прекондиционирования, на площадь повреждения сердечной мышцы аналогично влиянию ишемического прекондиционирования и ишемического посткондиционирования и превосходит по эффективности фармакологическое посткондиционирование эритропоэтином и посткондиционирование циклоспорином. Показано, что АТФ-зависимые калиевые каналы являются необходимым звеном в реализации цитопротекторного эффекта ишемического прекондиционирования, ишемического посткондиционирования и прекондиционирования рекомбинантным эритропоэтином.

Практическая значимость. В работе экспериментально обоснована эффективность применения ишемического прекондиционирования и ишемического посткондиционирования для профилактики и коррекции ишемических и реперфузионных повреждений ткани миокарда, развивающихся при различных нарушениях коронарного кровотока и последующего спонтанного, терапевтического или хирургического его восстановления. Показана возможность инициации процесса прекондиционирования рекомбинантным эритропоэтином, а также обоснована предпочтительность применения рекомбинантного эритропоэтина в сравнении с рекомендуемым ВОЗ циклоспорином.

Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные клинические испытания рекомбинантным эритропоэтином в субэритростимулирующей дозе как агента фармакологического прекондиционирования для профилактики и коррекции ишемических и реперфузионных повреждений миокарда.

Внедрение результатов научных исследований. Материалы диссертации вошли в учебный процесс и научно-исследовательскую работу кафедры фармакологии, кафедры патологической анатомии Курского государственного медицинского университета; кафедры фармакологии и фармацевтических дисциплин факультета последипломного медицинского образования Белгородского государственного национального

исследовательского университета.

Положения, выносимые на защиту:

1. Ишемическое прекондиционирование, ишемическое посткондиционирование, фармакологическое прекондиционирование рекомбинантным эритропоэтином и фармакологическое посткондиционирование циклоспорином снижают площадь ишемического и реперфузионного повреждения миокарда на модели изолированного по Лангендорф сердца крысы.

2. Ишемическое прекондиционирование, ишемическое посткондиционирование, фармакологическое прекондиционирование рекомбинантным эритропоэтином и фармакологическое посткондиционирование циклоспорином улучшают функциональное состояние миокарда после перенесенного тотального ишемического и реперфузионного повреждения.

3. Блокада АТФ-зависимых калиевых каналов глибенкламидом полностью нивелирует цитопротекторный эффект ишемического прекондиционирования, ишемического посткондиционирования фармакологического прекондиционирования рекомбинантным эритропоэтином на модели тотального ишемического и репефузионного повреждения изолированного по Лангендорф сердца крысы.

Стспспь достоверности. Научные положения и выводы диссертации основаны на анализе достаточного объема экспериментального материала, адекватном подборе экспериментальных групп животных и применении современных методов исследования морфофункционального состояния миокарда. В работе использовались сертифицированные лекарственные препараты, позволившие получить достоверные данные об их фармакологической активности в сердце. Для статистической оценки результатов использовались современные методики сбора и обработки исходных количественных данных.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на 77-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежная наука и современность» (Курск, 2012), X итоговой научно-практической конференции клинических ординаторов, интернов, молодых ученых «Актуальные вопросы современной клинической и экспериментальной медицины» (Белгород, 2012), Всероссийской научной сессии сотрудников Курского государственного медицинского университета и Центрально-Черноземного научного Центра РАМН и отделения РАЕН, посвященной 78-летию Курского государственного медицинского университета (Курск, 2013), 78-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежная наука и современность» (Курск, 2013).

Публикация материалов исследования. По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе 3 из них - в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. Зарегистрировано ноу-хау - свидетельство № 123 от 23 мая 2013 г. «Метод компьютерной пиксельной морфометрии».

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология. Результаты проведённого исследования соответствуют пункту 3 «Исследование механизмов действия фармакологических веществ в экспериментах на животных, на изолированных органах и тканях, а также на культурах клеток», пункту 4 «Исследование взаимодействий между организмом и лекарственными средствами, изучение их

фармакодинамики, фармакокинетики и метаболизма. Установление связей между дозами, концентрациями и эффективностью лекарственных средств. Экстраполяция фармакологических параметров с биологических моделей на человека».

Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе, научному обосновании и обобщении полученных результатов. Автором лично проведен набор экспериментального материала й его обработка. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях, докладах и внедрения в практику.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 193 источника, из которых 26 отечественных и 167 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 111 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц и 24 рисунка.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проведены на 395 крысах-самцах линии Wistar массой 250-300 г. Для исследования взяты крысы без внешних признаков заболевания, прошедшие карантинный режим вивария Курского государственного медицинского университета. В ходе эксперимента животные содержались в условиях стандартной экспериментальной биологически чистой комнаты, температура воздуха составляла 22-24°С, освещение - 12 ч/12 ч светлый/темный цикл, крысы получали гранулированный корм и фильтрованную водопроводную воду.

Все исследования проводили в одно и то же время суток во второй половине дня с соблюдением принципов, изложенных в «Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1986). Наркотизацию осуществляли эфиром. -

Животных распределяли по группам (не менее 10 крыс в группе) путем стратифицированной рандомизации со стратификацией по массе тела, условиям содержания и питания, а также по проводимым операциям и манипуляциям.

Для подтверждения гипотезы о возможности осуществления пре- и посткондиционирования миокарда через реализацию эндогенных механизмов, ведущих к активации специфического ингибирования фосфатидилинозитол 3-киназы (РОК/Akt-пути), активации К+-каналов эксперименты проводились на изолированном органе. Осуществлялось ингибирование апоптоза на фоне введения субэритропоэтических доз рекомбинантного эритропоэтина, было проведено изучение данных свойств на изолированном по Лангендорф сердце крысы. Это позволило исключить нейрогуморальные и иные влияния на

защитный эффект (Ьагщепс1огГГ О., 1895). Установка изолированного сердца состоит из четырех кон туров (рис. 1).

1000 мм водного столба для поддержания уровня перфузионного раствора, обеспечивающего постоянное давление перфузии.

Перфузионный раствор Кребса-Хензелейта (КХ) по физико-химическим характеристикам близок к составу крови (NaCI 118,0 ммоль/л, KCI 4,7 ммоль/л, MgS04 25% амп. 1,2 ммоль/л, КН2Р04 1,2 ммоль/л, СаС12 10% амп. 2,0 ммоль/л, глюкоза 40% 5,5 ммоль/л, NaHC03 25,0 ммоль/л).

Контур изменения параметров предназначен для непрерывной регистрации давления, развиваемого левым желудочком, частоты сердечных сокращений и других параметров. Для измерения параметров в состав контура входит программно-аппаратный комплекс Biopac Systems, inc и AcqKnowledge 3.8.1.

У наркотизированных крыс производили вскрытие грудной полости. Далее извлекали сердце и погружали его в заранее приготовленный гепаринизированный ледяной раствор КХ. В аорту вводилась канюля и соединялась с перфузионным контуром аппарата. После стабилизации сердечной деятельности тотальное гипоксическое повреждение моделировалось путем полного перекрытия перфузионного контура.

Эмпирический подбор доз эритропоэтина был необходим для подтверждения гипотезы о негемопоэтических его эффектах и минимальной дозе, способной вызвать индукцию эндогенных антиапоптотических механизмов. Первая доза составляла 1000 ME в 1 мл и была разведена в 1 л

перфузата. Далее было произведено исследование 600 ME в 1 мл, 500 ME в мл, 450 ME в мл и 425 ME в мл.

Из каждого сердца после проведения экспериментов готовили макропрепараты в виде срезов толщиной 2 мм и помещали в раствор трифенил гетразолия хлорида (ТТХ) на 15 минут в термостат при температуре 37,5°С. Раствор ТТХ окрашивает живую ткань с сохраненной лактатдегидрогеназной активностью, а ишемизированную ткань с утраченной ферментной активностью не окрашивает. Окрашенные срезы фотографировали в строго стандартизированных условиях рассеянного освещения во избежание бликов, камерой DCM 310 SCOPE при максимальном разрешении, подключенной к настольной лупе с настроенным 4-кратным увеличением и отрегулированной четкостью. Выходные данные в формате RGB24 затем обрабатывали с помощью программы Adobe Photoshop CS6 методом компьютерной пиксельной морфометрии. В программе проводился подсчет площади поврежденной ткани в пикселях/1000000 и отношения площади повреждения к общей площади ткани в процентах (Каплин А.Н., 2013).

Показатели функционального состояния миокарда, левожелудочковое давление (ЛЖД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряли непосредственно после стабилизации непрерывно в течение всего эксперимента посредством датчика, введенного в левый желудочек (Biopac Systems, Inc, USA), и компьютерной программы AcqKnowledge 3.8.1.

Ишемическое прекондициоиирование проводили путем моделирования грех коротких 5-минутных повторяющихся эпизодов ишемии/реперфузии непосредственно перед наступлением длительной 40-минутной ишемии и последующей 2-часовой реперфузии (Murry, Jennings, Reimer, 1986).

Ишемическое посткондиционирование заключалось в прерывании 40-минутной тотальной ишемии тремя короткими 15-секундными повторяющимися эпизодами ишемии/реперфузии перед проведением 2-часовой реперфузии (Vinten-Johansen J., 2003).

Фармакологическое прекондициоиирование рекомбинантным эритропоэтином («Эпокрин» эпоэтин альфа; ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых препаратов» Федерального медикобиологического агентства, г. Санкт-Петербург, Россия) состояло в проведении перфузии сердца раствором КХ с добавлением в него различных доз препарата в течение 5 минут непосредственно перед наступлением длительной 40-минутной ишемии.

Фармакологическое посткондиционирование циклоспорином

(«Сандиммун® Неорал®» Novartis pharma, AG произведено r.p. Scherer, GmbH & со. Kg) заключалось в проведении перфузии сердца раствором КХ с добавлением в него циклоспорина в дозе 25 мг/л в течение 5 минут непосредственно после длительной 40-минутной ишемии.

Для подтверждения гипотезы о возможности реализации эффекта различных форм прекондиционирования через активацию АТФ-зависимых калиевых каналов на фоне введения препаратов и проведения прекондиционирования вводили глибенкламид как блокатор АТФ-зависимых

калиевых каналов в дозе 0,4 мг/л перфузата (Самойленкова Н.С., Гаврило-ва С.А., Дубина А.И. и др., 2007; Miyra Т., Liu Y. et al„ 2001; Negrjni J.A. et al„ 2002).

Статистическая обработка результатов. Все полученные данные были исследованы на соответствие закону нормального распределения в тестах Колмагорова-Смирнова и Шапиро-Уилка и графическим методом путем использования нормальной вероятностной бумаги. Достоверность изменений параметров, наблюдавшихся при действии исследованных препаратов, как в абсолютных значениях, так и в процентах от исходного уровня, определяли разностным методом вариационной статистики с нахождением: средней арифметической (М), ошибки средней арифметической (±ш), вероятности возможной ошибки (Р) по апостерным критериям и оценки достоверности различий сравниваемых параметров между группами с использованием однофакторного дисперсионного анализа по Шидак. Также был проведен корреляционный и регрессионый анализ полученных данных. Различия оценивали как достоверные, начиная с р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изучение кардиопротсктивной активности ишемического прскондиционирования, ишемического посткондиционирования, фармакологического прскондиционирования и фармакологического посткондиционирования при моделировании тотального гиноксического и реперфузионного повреждения миокарда с использованием результатов морфомстрических исследований

Перед моделированием ишемического и реперфузионного повреждения было проведено исследование интактной группы животных, сердца которых не подвергались воздействию, и лишь после введения канюли в аорту проводили перфузию их в течение 2 часов. После 2-часовой перфузии проводили морфометрическое исследование, результатами которого являлось отсутствие очаговых изменений в ткани миокарда.

Группа животных с проведенным нами тотальным ишемическим и реперфузионным повреждением была принята за контрольную группу. Площадь повреждения миокарда в отношении общей площади изучаемой ткани составила 44,15± 1,9%, значение достоверно (р<0,05). Ишемическое прекондиционирование приводило к уменьшению площади поврежденной ткани до 24,62±3,3%, результат достоверно ниже результата, полученного в контрольной группе животных (р<0,05). Ишемическое посткондиционирование уменьшало зону повреждения ткани до 8,5±1,2%, что достоверно ниже предыдущих групп изучаемых феноменов (р<0,05). Результаты введения рекомбинантного эритропоэтина в эксперименте, как эквивалента феномена ишемического прскондиционирования, в дозе 1000 МЕ/л, 600 МЕ/л и 500 МЕ/л достоверно (р<0,05) не отличаются от результатов интактной группы животных, т.к. зоны повреждения выявлено не было. Введение эритропоэтина в дозе 450 МЕ/л позволило снизить площадь зоны повреждения до 12,12±2,1%, что достоверно сопоставимо с результатами группы ишемического

посткондиционирования (р<0,05). Снижение дозы эритропоэтина на 25 МЕ/л при введении в перфузат до наступления ишемического и реперфузионного повреждения приводит к снятию кардиопротекторного действия. При введение циклоспорина (CSA) в дозе 25 мг/л было выявлено снижение площади зоны повреждения до 27,76±0,8%, (р<0,05) (рис. 2).

Рис. 2. Макроскопические фотографии срезов сердца. Сердце крысы интактное (I), на фоне проведения тотальной ишемии (II), ишемического прекондиционирования (III), ишемического посткондиционирования (IV), фармакологического прекондиционирования эритропоэтином в дозе 450 МЕ/л (V), фармакологического посткондиционирования циклоспорином в дозе 25 мг/л (VI). Светлые участки повреждения миокарда, красные участки интактной ткани. Окраска ТТХ. Макрофото, х 4.

Таким образом, в ходе проведенного нами экспериментального исследования было выявлено, что ишемическое прекондиционирование, ишемическое посткондиционирование, введение рекомбинантного эритропоэтина и посткондиционирование циклоспорином способствовали уменьшению площади поврежденной ткани миокарда при ишемическом и реперфузионном его повреждении в 1,8, 5, 4 и 1,6 раза соответственно в сравнении с контрольной группой животных (рис. 3).

100%

90 Объем площади

™ повреждения*

Контроль ИПре ИПост ЕРО CSA

Рис. 3. Показатели изменения площади повреждения миокарда при моделировании ишемического и реперфузионного его повреждения.

Примечание: * - процентное отношение к общей площади, исследуемой ткани; ИПре - ишемическое прекондиционирование; ИПост - ишемическое посткондиционирование; ЕРО - рекомбинантный эритропоэтин вводится в перфузат в дозе 450 МЕ/л в течение 5 минут до моделирования ишемического и реперфузионного повреждения миокарда; CSA - введение циклоспорина в дозе 25 мг/кг после длительной ишемии в течение 5 минут в ранний реперфузионный период.

2. Изучение кардиопротективной активности ишемического прекондициоиирования, ишемического посткондиционирования, фармакологического прекондициоиирования и фармакологического посткондиционирования при моделировании тотального гипоксического и реперфузионного повреждения миокарда с использованием результатов оценки функционального состояния миокарда

Среднее значение ЛЖД в группе интактных животных составило 120± 1,2 мм рт.ст. (р<0,05). Частота сердечных сокращений (ЧСС) составляет 343±5 (р<0,05). На основании этих данных можно сделать вывод, что функциональное состояние миокарда в группе интактных животных не отличается от значений данных показателей у нормальных животных с соответствующими возрастными и массовыми показателями. В группе животных с моделированным тотальным ишемическим и реперфузионным повреждением, было определено снижение ЛЖД до 76,9± 1,98 мм рт.ст. (р<0,05). ЧСС незначительно отличалось от цифр интактной группы - 351,8±5,5 мм рт.ст. (р<0,05). При моделировании ишемического прекондициоиирования, фармакологического прекондициоиирования рекомбинантным эритропоэтином ЛЖД претерпевало волнообразные изменения в форме падения при наступлении длительной ишемии с дальнейшим восстановлением до пределов нормы 94,4±1 мм рт.ст. (р<0,05). При введении эритропоэтина в течение 5 минут последующее падение давления происходит медленнее и до более высоких цифр 108,9±1,5 (р<0,05). Восстановление функциональной активности происходит за более короткий срок. Значения частоты сердечных сокращений в

данных экспериментальных группах животных претерпевают содружественные волнообразные изменения с постепенным приближением к нормальным значениям. Для группы животных, подверженных ишемическому прекондиционированию, ЧСС 324,1±2,5 (р<0,05), а для фармакологического прекондиционирования эритропоэтином ЧСС 323,6±3,6 (р<0,05). Ишемическое посткондиционирование и фармакологическое посткондиционирование циклоспорином обозначилось обратными волнообразными изменениями ЛЖД и ЧСС в связи с временными изменениями наступления проапоптотических влияний гипоксии и последующей реперфузии (ИПост - ЛЖД - 112,2±1,5 мм рт.ст.; ЧСС - 331±5,8; CSA - ЛЖД - 93,3±1,2 мм рт.ст; ЧСС - 325±4,3 (р<0,05)) (табл. 1).

Таблица 1

Влияние фармакологического пре- и посткондиционирования рекомбинантным эритропоэтином и циклоспорином на функциональные показатели изолированного сердца крысы (М±ш; п=10)

Экспериментальная группа ЛЖД (мм рт.ст.) ЧСС (уд./мин)

Контроль 120,3±1,2 343,6±5,7

Ишемия 76,9±1,9* 351,8±5,5*

ИПре 94,4±1,1 ** 324,1 ±2,5**

ИПост 112,2±1,5** 331,1±5,8**

ЕРО (450 МЕ/л) 108,9±1,5** 323,6±3,6**

ЕРО (450 МЕ/л) 73,9±1,8* 372,5±7,5*

CSA (25 мг/л) 78,1±1,8* 370,8±6,9*

CSA (25 мг/л) 93,3±1,2** 325,1±4,3**

Примечание: * - р<0,05 по сравнению с контролем. ** - р<0,05 по сравнению с ишемией; контроль - значение показателей сократимости через 120 мин после реперфузии изолированного сердца крысы; ишемия - тотальное прекращение перфузии на 30 мин.

Фармакологическое прекондиционирование эритропоэтином и фармакологическое посткондиционирование циклоспорином наряду с ишемическим пре- и посткондиционированием снижают функциональную недостаточность при ишемическом и реперфузионном повреждении и способствуют более активному восстановлению функции миокарда. Свидетельством этого являются результаты регистрации ЛЖД и ЧСС. Уровень показателей, объективно отражающих сократительную способность миокарда, во всех опытных группах значительно быстрее приближается к результатам группы интактных животных. То есть можно говорить не только о компенсаторных механизмах восстановления функции сердца, но и о благоприятном влиянии феноменов пре- и посткондиционирования. Введение в перфузат рекомбинантного эритропоэтина и циклоспорина способно активировать эндогенные пути восстановления функционального состояния миокарда.

Отсутствие достоверных отличий между показателями деятельности сердца в ишемизированных тканях животных всех опытных групп свидетельствует о равнозначности кардиоиротекторного действия ишемического прекондиционирования, ишемического посткондиционирования, фармакологического прекондиционирования рекомбинантным эритропоэтином и фармакологического посткондиционирования циклоспорином.

3. Изучение роли АТФ-зависимых калиевых каналов в реализации эффектов различных форм прекондиционирования и посткондиционирования при моделировании тотального гипоксического и рсиерфузионного повреждения миокарда с использованием результатов функциональных проб и морфометрических исследований

Введение блокатора АТФ-зависимых калиевых каналов глибенкламида в перфузат контрольной группы не привело к достоверному изменению площади повреждения ткани 47,61±1,08% по сравнению с показателем в контрольной группе 44,15-1:1,9% (р<0,05), что свидетельствует об отсутствии непосредственного влияния глибенкламида в применяемой дозе на выживаемость ишемизированных тканей. Введение его перед проведением ишемического прекондиционирования и ишемического посткондиционирования способствовало увеличению площади повреждения ткани миокарда до 46,2±1,12% и до 49,5±2,3%, что достоверно не отличается от показателей в контрольной группе. Аналогичная картина наблюдалась при введении глибенкламида животным перед применением эритропоэтина. Площадь неповрежденной ткани у животных этой группы составила 45,2± 1,7%, значение также не имеет достоверных отличий от такового в контрольной группе (р<0,05) (рис. 4).

Площадь повреждения *

ШЬе;Гяи я Г ли

Рис. 4. Определение роли АТФ-зависимых калиевых каналов в реализации цитопротекторного эффекта ишемического прекондиционирования, ишемического посткондиционирования и фармакологического прекондиционирования рекомбинантным эритропоэтином. Показатели площади поврежденной ткани миокарда.

Примечание: * - процентное отношение к общей площади исследуемой ткани; I 'ли - глибенкламид в дозе 5 мг/л (растворитель диметилсульфоксид).

Функциональное состояние миокарда при введении глибенкламида во всех опытных группах статистически незначимо отличалось от значений в контрольной группе животных (табл. 2).

Таблица 2

Функциональные показатели состояния сердца при моделировании различных видов пре- и посткондиционирования на фоне введения блокатора АТФ-зависимых калиевых каналов глибенкламида

Экспериментальная группа ЛЖД (мм рт.ст.) ЧСС (уд./мин)

Контроль 120±1,2 343±5,1

Ишемия 76,9±1,9* 351,8±5,5

ИПре 74,3±2,1** 348,2±2,2

ИПост 78,5±0,8** 349,4±4,3

ЕРО (450 МЕ/л) 75, 4±0,8** 350,2±2,4

Примечание: * - р<0,05 по сравнению с контролем. ** - р<0,05 по сравнению с ишемией; контроль - значение показателей сократимости через 120 мин после реперфузии изолированного сердца крысы; ишемия - тотальное прекращение перфузии на 30 мин.

Анализируя полученные результаты, можно говорить о полной отмене цитопротекторного эффекта как ишемического прекондиционирования, ишемического посткондиционирования, так и фармакологического прекондиционирования с помощью рекомбинантного эритропоэтина глибенкламидом.

АТФ-зависимые калиевые каналы являются необходимым звеном в механизме реализации цитопротекторного эффекта как дистантного ишемического прекондиционирования, так и рекомбинантного эритропоэтина. Доказанная ранее возможность увеличения выживаемости изолированного кожного лоскута на питающей ножке дистантным ишемическим прекондиционированием и рекомбинантным эритропоэтином была полностью нивелирована предварительным введением опытным животным неселективного блокатора АТФ-зависимых калиевых каналов глибенкламида (Колесник И.М., 2012).

4. Анализ зависимости функциональных и морфологических изменений в миокарде

В ходе корреляционного анализа полученных данных была выявлена высокозначимая обратная связь между левожелудочковым давлением, частотой сердечных сокращений и площадью повреждения. Корреляция Пирсона между площадью повреждения и ЛЖД составляет -0,648, значимость менее 0,01. Корреляция Пирсона между ЧСС и ЛЖД равна -0,507 при значимости 0,001. Значимой зависимости между ЧСС и площадью повреждения выявлено не было.

11оследующий регрессионный анализ позволил выявить взаимосвязь между зависимой переменной величиной (площадь повреждения) и вариационной переменной (ЛЖД). Регрессия для ЛЖД составляет 0,087, остаток 0,119, константа 0,389±0,060 и коэффициент ЛЖД ^0,003±0,001 (значимость полученных данных менее 0,001).

Применительно к данным исследованиям в общем виде уравнение регрессии имеет следующий вид (формула 1).

у=Ы)+Ь1х+Е, (1)

где Ы) константа, полученная в результате регрессиоиого анализа, Ы - коэффициент для независимой переменной, полученный в результате регрессивного анализа, х — переменная, е остаток, полученный в ходе дисперсионного анализа.

Применительно к данным исследованиям была обнаружена высокозначимая связь между ЛЖД и площадью повреждения, что позволяет судить об уменьшении давления, развиваемого миокардом, при увеличении площади повреждения во всех исследуемых нами группах. Дальнейший регрессионный анализ позволил вывести уравнение регрессии и создать модель, отслеживающую связь между двумя переменными, зависимой и независимой, что делает возможным использование математической модели для отслеживания изменений переменных величин.

В результате эксперимента установили, что глибенкламид в применяемой дозе не оказывает непосредственного влияния на площадь повреждения миокарда. Однако блокада А'ГФ-зависимых калиевых каналов полностью нивелировала цитопротекторный эффект рекомбинантного эритропоэгина увеличив объем повреждения ткани миокарда до уровня в группе ишемии. Следовательно, АТФ-зависимые калиевые каналы являются необходимым звеном в механизме реализации цитопротекторного эффекта рекомбинантного эритропоэгина (рис. 5).

Глибенкламид Эритропоэтин

бпохатор активатор

К" Л7Ф каналов К' - АТ«г> кималов

Г П" I " > 1

Аиотоз Щ тРТР Цитопротекция

^__

Циклоспорин А Опокатор тРТР

Рис. 5. Схема, отображающая фрагмент механизма ишемического прекондиционирования и гипотетическая роль эритропоэгина в нем.

Примечание: К'-АТФ каналы - АТФ-зависимые калиевые каналы; тРТР высокопроницаемые митохондриальные поры.

Из этого следует, что рекомбипантный эритропоэтин в субэритростимулирующей дозе можно рекомендовать как препарат для фармакологического прекондиционирования.

Полученные результаты позволяют проводить дальнейшее исследование возможности универсального применения фармакологического прекондиционирования рекомбинангным эритропоэтином в

субэритростимулирующей дозе в хирургии и терапии с целыо профилактики и коррекции последствий ишемии и последующей возможной реперфузии.

ВЫВОДЫ

1. 5-минутное прекоидиционирование за 30 минут до 40-минутной тотальной ишемии изолированного по Лангендорф сердца крысы с последующей 2-часовой реперфузией приводило к ограничению зоны повреждения миокарда в 1,8 раза, предотвращало падение ЛЖД до 94,4±1 мм рт.ст. Посткондиционирование в виде трех повторяющихся эпизодов 15-секундной ишемии/реперфузии оказывало более мощное защитное воздействие, чем прекоидиционирование, характеризовалось резким ограничением зоны некроза в 5 раз и предотвращением падения ЛЖД до 112,2±1,5 мм рт.ст.

2. Рекомбинантый эритропоэтин в диапазоне доз от 1000 МЕ до 450 МЕ при фармакологическом нрекондиционировашш проявлял кардиопротективное действия, уменьшая объем повреждения миокарда в 4 раза, при этом кардиопротекция реализовалась с субэритростимулируещей дозы 450 МЕ. ЛЖД составляло 109±1,5 мм рт.ст. При использовании эритропоэтина в дозе 450 МЕ как фармакологического агента посткондиционирования нротективный эффект выявлен не был

3. Референс-препарат циклоспорин (25 мг/л) в режиме фармакологического посткондиционирования проявлял умеренный кардиопротективный эффект, уменьшая зону повреждения в 1,6 раза, параллельно обнаруживалась положительная динамика функционального состояния миокарда (ЛЖД 93,3±1,2 мм рт.ст.) Циклоспорин в режиме прекондиционирования оказался не эффективен.

4. В ходе статистической обработки данных, применительно к данному исследованию, было выведено уравнение регрессии, позволяющее использовать математическую модель для прогнозирования и отслеживания морфофункциональных изменений в изолированном сердце.

5. Использование в качестве фармакологического анализатора блокатора АТФ-зависимых калиевых каналов глибенкламида в условиях изолированного по Лангендорф ссрда крысы показало, что эффект эритропоэтина как агента прекондиционирования и посткондинионирования реализуется с участием АТФ-зависимых калиевых каналов, при этом наиболее выраженно снимался эффект прекондиционирования.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Рекомендовать целенаправленные клинические испытания фармакологического прекондиционирования рекомбинантным эритропоэтином в субэритростимулирующей дозе (450 ME в неделю) для цитопротекции при ишемических и реперфузионных повреждениях миокарда и при терапевтическом и хирургическом лечении заболеваний сердца.

2. Установленная эффекторная роль АТФ-зависимых калиевых каналов в механизме цитопротекции рекомбинантного эритропоэтина позволяет для пациентов, страдающих сахарным диабетом второго типа, ставить вопрос о замене производных сульфонилмочевины на альтернативные препараты при дестабилизации ИБС.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Жуков, C.B. Изучение модели ишемического прекондиционирования на изолированном по Лангендорфу сердце крыс / C.B. Жуков, К.А. Лебедев, А.Н. Каплин // Молодёжная наука и современность: материалы 77-й Всерос. науч. конф. студентов и молодых учёных с междунар. участием. - Курск, 2012. -Ч. 2.-С. 8.

2. Каплин, А.Н. Изучение кардиопротективных свойств ишемического прекондиционирования и посткондиционирования на изолированном по Лангендорфу сердце крыс / А.Н. Каплин, C.B. Жуков, К.А. Лебедев // Молодёжная наука и современность: материалы 77-й Всерос. науч. конф. студентов и молодых учёных с междунар. участием. - Курск, 2012. - Ч. 2. -С. 9-10.

3. Каплин, А.Н. Сравнительная характеристика кардиопротективных свойств ишемического прекондиционирования и посткондиционирования на изолированном по Лангендорфу сердце крыс / А.Н. Каплин, C.B. Жуков, К.А. Лебедев // Молодёжная наука и современность: материалы 77-й Всерос. науч. конф. студентов и молодых учёных с междунар. участием. - Курск, 2012. -Ч.2.-С. 10-11.

4. Каплин, А.Н. Изучение кардиопротективных доз препарата «Эпокрин» на изолированном по Лангендорфу сердце крыс / А.Н. Каплин, C.B. Жуков, К.А. Лебедев // Молодёжная наука и современность: материалы 77-й Всерос. науч. конф. студентов и молодых учёных с междунар. участием. - Курск, 2012. -Ч. 2.-С. 12-13.

5. Моделирование ишемического и фармакологического прекондиционирования на изолированном сердце крыс / А.Н. Каплин,

C.B. Жуков, K.A. Лебедев [и др.] : материалы IV Всерос. науч.-практ. семинара молодых ученых с междунар. участием «Современные проблемы медицинской химии. Направленный поиск новых лекарственных средств» // Вестн. Волгоград, мед. ун-та. - 2012. - Приложение. - С. 144.

6. Эндотелиопротективное действие дистантного ишемического прекондиционирования / O.A. Старосельцева, С.А. Алехин, А.Н. Каплин [и др.] // Науч. ведомости Белгород, гос. ун-та - 2012. - № 4(123), вып. 17/1. -С. 228-232.

7. Жуков, C.B. Кардиопротективные эффекты феномена ишемического посткондиционирования на изолированном по Лангендорфу сердце крыс / C.B. Жуков, А.Н. Каплин, К.А. Лебедев // Актуальные вопросы современной клинической и экспериментальной медицины : сб. тр. X науч.-практ. конф. студентов, интернов, ординаторов, аспирантов, молодых ученых, посвящ. 10-летию Ин-та последиплом. мед. образования. - Белгород, 2012. — С. 120-121.

8. Каплин, А.Н. Исследование кардиопротективных свойств препарата «Эпокрин» на изолированном по Лангендорфу сердце крыс / А.Н. Каплин, К.А. Лебедев C.B. Жуков // Актуальные вопросы современной клинической и экспериментальной медицины: сб. тр. X науч.-практ. конф. студентов, интернов, ординаторов, аспирантов, молодых ученых, посвящ. 10-летию Ин-та последиплом. мед. образования. - Белгород, 2012. - С. 121-122.

9. Лебедев, К.А. Изучение инфарктлимитирующих свойств ишемического прекондиционирования на изолированном по Лангендорфу сердце крыс / К.А. Лебедев, C.B. Жуков, А.Н. Каплин // Актуальные вопросы современной клинической и экспериментальной медицины: сб. тр. X науч.-практ. конф. студентов, интернов, ординаторов, аспирантов, молодых ученых, посвящ. 10-летию Ин-та последиплом. мед. образования. - Белгород, 2012. - С. 133-134.

10. Лебедев, К.А. Характеристика кардиопротективных эффектов ишемического пре- и посткондиционирования на изолированном по Лангендорфу сердце крыс / К.А. Лебедев, А.Н. Каплин, C.B. Жуков // Актуальные вопросы современной клинической и экспериментальной медицины: сб. тр. X науч.-практ. конф. студентов, интернов, ординаторов, аспирантов, молодых ученых, посвящ. 10-летию Ин-та последиплом. мед. образования. - Белгород, 2012. - С. 134-135.

11. Изучение способов кардиопротекции на изолированном по Лангендорфу сердце крыс / А.Н. Каплин, О.II. Кузмицкая, A.A. Шапошников [и др.] // Науч. ведомости Белгород, гос. ун-та. - 2012. -№ 22 (141), вып. 20/3 - С. 117-119.

12. Каплин, А.H. Коррекция реперфузионного повреждения миокарда препаратом эпокрин / А.Н. Каплин, C.B. Жуков, К.А. Лебедев // Материалы итоговой науч. конф. сотрудников КГМУ, Центр.-Чернозём. науч. центра РАМН и отд-ния РАЕН, посвящ. 78-летию Курск, гос. мед. ун-та. - Курск, 2013. -Т. 2.-С. 208-210.

13. Каплин, А.Н. Экспрессия кардиопротективных свойств рекомбинантного эритропоэтина / А.Н. Каплин, C.B. Жуков, К.А. Лебедев // Молодежная наука и современность: материалы 78-й Всерос. науч. конф. студентов и молодых ученых с междунар. участием, посвящ. 78-летию КГМУ и 80-летию со дня рождения чл.-корр. РАМН, проф. A.B. Завьялова. - Курск, 2013. - Ч. 1. -С. 310-311.

14. Влияние рекомбинантного эритропоэтина на функциональное состояние миокарда после ишемии/реперфузии / А.Н. Каплин, Ю.Ю. Полевой, C.B. Жуков [и др.] // Молодежная наука и современность: материалы 78-й Всерос. науч. конф. студентов и молодых ученых с междунар. участием, посвящ. 78-летию КГМУ и 80-летию со дня рождения чл.-корр. РАМН, проф. A.B. Завьялова. - Курск, 2013. - Ч. 1. - С. 311-312.

15. Морфофункциональная оценка тотального ишемического и реперфузионного повреждения сердца крыс / Ю.Ю. Полевой, А.Н. Каплин, C.B. Жуков [и др.] // Молодежная наука и современность: материалы 78-й Всерос. науч. конф. студентов и молодых ученых с междунар. участием, посвящ. 78-летию КГМУ и 80-летию со дня рождения чл.-корр. РАМН, проф. A.B. Завьялова. - Курск, 2013. - Ч. 1. - С. 201-202.

16. Каплин, А.Н. Сравнительная характеристика кардиопротекции эритропоэтином и циклоспорином при ишемическом и реперфузионном повреждении миокарда / А.Н. Каплин, М.В. Покровский, М.В. Корокин // Кубан. науч. мед. вести. - 2013 - № 7(142). - С. 169-174.

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

АТФ - аденозинтрифосфат

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

ИПК - ишемическое прекондиционирование

КХ - раствор Кребса-Хензелейта

ЛЖД - левожелудочковое давление

ЧСС - частота сердечных сокращений

ИБС - ишемическая болезнь сердца

МЕ - международные единицы

ТТХ - трифенил тетразолия хлорид

СБА - циклоспорин

Лицензия ЛР № 020862 от 30.04.99 г. Сдано в набор 30.10.2013 г. Подписано в печать 05.11.2013 г. Формат 30х42'/8 Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 255"А". Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.