Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Влияние дистантного прекондиционирования и ингибитора аргиназы L-норвалина на ишемические и реперфузионные повреждения печени (экспериментальное исследование)

Лопатин Дмитрий Владимирович

ВЛИЯНИЕ ДИСТАНТНОГО ПРЕКОНДИЦИОНИРОВАНИЯ И ИНГИБИТОРА АРГИНАЗЫ Ь-НОРВАЛИНА НА ИШЕМИЧЕСКИЕ И РЕПЕРФУЗИОННЫЕ

ПОВРЕЖДЕНИЯ ПЕЧЕНИ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

17 ОКТ 2013

Смоленск - 2013

005535344

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель: Покровский Михаил Владимирович

доктор медицинских наук, профессор, ИГГМО НИУ Белгородского государственного университета Минобрнауки РФ, кафедра фармакологии и фармацевтических дисциплин, заведующий кафедрой

Официальные оппоненты: Литвинов Александр Васильевич

доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО СГМА Минздрава РФ, кафедра терапии и ультразвуковой диагностики, профессор Яворский Александр Николаевич доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава РФ, профессор

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Минздрава РФ

Защита состоится «А О» СШ_У< и^оА.Л 2013 года в « часов на заседании диссертационного совета ^ 208.097.02, при ГБОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации (214019, Россия, г. Смоленск, ул. Крупской, д. 28).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Смоленская государственная академия» МЗ РФ.

Автореферат разослан « ^ 6 »

Ученый секретарь диссертационного совета

2013 г.

Яйленко Анна Андриановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. По данным ВОЗ, каждый третий взрослый человек на Земле страдает тем или иным заболеванием печени. Заболеваемость патологией этого органа стабильно находится на четвертом месте в структуре общей заболеваемости, и с 1960 г. отмечается неуклонный рост числа данных пациентов. В патогенезе большинства заболеваний печени далеко не на последнем месте находится регионарная или генерализованная ишемия, в одних случаях играющая инициирующую роль, в других усугубляющая течение патологии. Большой процент тяжелых поражений печени требует хирургической коррекции, зачастую усугубляя тяжесть ишемического повреждения, что является причиной неблагоприятных исходов (Вишневский В.А., 2003; Yuan G.J., 2005). В связи с чем непрерывно ведется поиск технологий и фармакологических агентов, способных уменьшить влияние как ишемического, так и реперфузионного повреждения.

Одной из ключевых мишеней при ишемии является митохондрия, повреждаемая как при прекращении кровотока в сосудах органа, так и при его восстановлении (Jaeschke Н., 2003; Sinay L., 2008; Zhou G., 2009). Митохондриальное окислительное повреждение усиливается образованием активных форм кислорода, провоспалительных цитокинов, факторов активации апоптоза (Jia С., 2011; Kin Н., 2008). Во многом регуляция как оксидативного стресса, так и функции различных систем, в том числе и регуляция кровообращения, принадлежит универсальному мессенджеру - оксиду азота NO, который образуется из L-аргинина под действием ферментов эндотелиальной и индуцибельной NO-синтаз (Lauzier В., 2008; Raat N.. 2009; Zaouali М.А., 2010).

Уровень NO является ключевой точкой фармакологической коррекции, изменение его сказывается на выраженности как ишемического, так и реперфузионного поражения тканей. Исследования последних лет показали, что метаболизм L-аргинина протекает двумя путями: с участием NO-синтаз до цитрулина и с участием аргиназ до орнитина и мочевины (Chicoine L.G., 2004). Другими словами, аргиназы и NO-синтазы конкурируют за один и тот же субстрат - L-аргинин, причем активность аргиназ в 1000 раз превосходит активность NO-синтазы, что приводит к субстратному ингибированию продукции оксида азота. Угнетение активности аргиназ сказывается на повышении доступности L-аргинина для NO-синтаз. Ранее in vitro была показана активность целого ряда веществ, обладающих ингибирующей активностью в отношении аргиназ (Reid К., 2006).

Одним из наименее изученных препаратов данной группы является L-норвалин (2-аминопентановая кислота) - неметаболизирующийся аналог L-валина, являющийся одним из самых мощных ингибиторов аргиназы. L-норвалин ингибирует активность аргиназы в связи с его структурным подобием орнитину по механизму обратной связи, угнетающему активность фермента (Bommarius A.S., 1994). Ранее в нашей лаборатории были показаны

роль Ь-норвалина в коррекции Ь-ЫАМЕ индуцированного дефицита азота и также его эдотелио- и кардиопротективные эффекты.

В связи с вышеизложенным особый интерес вызывает исследование влияния данного препарата в возможной коррекции ишемического и реперфузионного поражения печени.

Номер государственной регистрации темы - 01201366150.

Цель исследования: повысить эффективность борьбы с ишемическими и реперфузионными повреждениями печени путйм использования дистантного прекондиционирования и ингибитора аргиназы Ь-норвалина в условиях эксперимента.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние прямого и дистантного ишемического прекондиционирования на морфофункциональное состояние печени в условиях ее ишемии и реперфузии.

2. Исследовать возможные механизмы реализации действия прямого и дистантного ишемического прекондиционирования на ишемию и реперфузию печени путем применения фармакологического анализатора - блокатора АТФ зависимых К+ каналов глибенкламида.

3. Изучить влияние ингибитора аргиназ Ь-норвалина в дозировках 10 и 100 мг/кг на морфофункциональное состояние печени в условиях ее ишемии и реперфузии.

4. Исследовать возможные механизмы реализации действия Ь-норвалина на ишемию и реперфузию печени путем применения фармакологических анализаторов ингибитора индуцибельной ЫО-синтазы аминогуанидина и блокатора АТФ-зависимых К+ каналов глибенкламида.

5. Изучить влияние сочетанного применения ишемического прекондиционирования и Ь-норвалина на морфофункциональное состояние печени при ее ишемии и реперфузии.

Научная новизна. В работе впервые проведено сравнительное исследование эффективности защитного эффекта и механизмов реализации прямого и дистантного прекондиционирования при ишемии и реперфузии печени.

В работе впервые показано, что применение ингибитора аргиназ Ь-норвалина в дозировке 10 и 100 мг/кг вызывает выраженный протекторный эффект, по эффективности сравнимый с защитным действием ишемического прекондиционирования. В работе впервые проведено исследование сочетанного применения ишемического прекондиционирования и ингибитора аргиназ Ь-норвалина в дозировке 100 мг/кг.

В ходе работы впервые проведен анализ возможных механизмов реализации действия ингибитора аргиназ Ь-норвалина.

Впервые обосновано сочетанное применение Ь-норвалина и дистантного ишемического прекондиционирования и доказана его эффективность в отношении уменьшения повреждения печени при ее ишемии и реперфузии.

Новизна научных исследований подтверждена 1 патентом на изобретение, 1 патентом на полезную модель и положительным решением о

выдаче патента РФ на изобретение.

Праю-ическая значимость. В исследовании показана эффективность защитного эффекта дистантного ишемического прекондиционирования при ишемии и реперфузии печени, сопоставимая с прямым ишемическим

прекондиционированием.

В работе определена эффективность гепатопротекторного действия ингибитора аргиназ Ь-норвалина при ишемии и реперфузии печени в дозировках 10 и 100 мг/кг, в особенности в сочетании с ишемическим прекондиционированием. Учитывая выраженность защитного эффекта от применения Ъ-норвалина, значительно превышающую таковую у адеметионина, представляется возможным его применение с целью ограничения патологического влияния ишемических и реперфузионных расстройств при оперативных вмешательствах на печени. Результаты исследования позволяют рекомендовать ингибитор аргиназ Ь-норвалин для проведения клинических исследований.

Внедрение результатов научных исследований. На основании данных диссертационной работы планируется проведение целенаправленных клинических исследований ингибитора аргиназ Ь-норвалина, а также его комбинаций с препаратами, использующимися в стандартной коррекции ишемического повреждения печени.

Полученные результаты используются в учебных программах кафедр фармакологии, клинической фармакологии Курского государственного медицинского университета, кафедры фармакологии Орловского государственного университета и кафедры фармхимии и фармакогнозии, фармакологии и фармацевтических дисциплин, биохимии и фармакологии Белгородского государственного университета, кафедры фармакологии Воронежской медицинской академии.

Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, постановке цели и поиске путей её достижения. Проанализированы отечественные и зарубежные источники по теме диссертации, на основании чего выдвинуты рабочие гипотезы о возможных фармакотерапевтических стратегиях и биологических моделях для исследования эндотелиопротективной активности выбранных веществ и препаратов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах экспериментального исследования. Доля личного участия 90%.

В опубликованных работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведена разработка дизайна и протокола исследования, определены ключевые критерии оценки морфофункциональных нарушений при моделировании исследуемой патологии и оценки эффективности вводимых

тестируемых препаратов. При непосредственном участии автора проводилось выведение животных из эксперимента с регистрацией физиологических показателей, забор тканей и органов для биохимического и морфологического исследований, биохимические и морфологические исследования, статистическая обработка полученных данных, научное обоснование! обобщение и представление полученных результатов.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы представлены на 78-й итоговой межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых «Молодежная наука и современность» (Курск, 2013), XVII международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации (Лондон, 2013), на 3-ем, 5-ом, 8-ом заседаниях «Ассоциации онкологов Брянской области» (Брянск, 2012, 2013).

Апробация диссертации проведена на научно-практической конференции кафедр фармакологии, клинической фармакологии, внутренних болезней № 2, анатомии человека, биологической химии, мобилизационной подготовки здравоохранения и медицины катастроф, НИИ экологической медицины Курского государственного медицинского университета, фармакологии и фармацевтических дисциплин ИПМО НИУ Белгородского государственного университета.

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. Получено 2 патента РФ и 1 положительное решение на выдачу патента на изобретение РФ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Эпизод прямого и дистантного ишемического прекондиционирования, воспроизведенный за 30 минут до глубокой ишемии печени и последующей реперфузии, обладает сопоставимым гепатопротекторным действием, уменьшая выраженность морфофункциональных показателей гепатоцеллюлярного повреждения, реализуя свое действие через К зависимые митохондриальные АТФазы, что подтверждается полной отменой протекторного влияния при введении глибенкламида в дозе 5 мг/кг за 30 минут до ишемического прекондиционирования.

2. Ингибитор аргиназы Ь-норвалин в дозах 10 и 100 мг/кг, вводимый внутрибрюшинно двухкратно за 30 минут до моделирования ишемии печени и сразу после возобновления кровотока, оказывает выраженное гепатопротекторное действие, причем действие Ь-норвалина более сильное, чем адеметионина, в основном опосредованное N0 и имитирующее «второе окно» ишемического прекондиционирования, однако полностью эффект не отменяется ни применением блокатора N0-синтазы аминогуанидина в дозировке 300 мг/кг, ни применением блокатора К+АТФазы глибенкламида.

3. Протекторный эффект от сочетанного применения ишемического прекондиционирования и введения ингибитора аргиназ Ь-норвалина в

дозировке 100 мг/кг выше, чем в случае их раздельного применения, что

говорит об усилении их влияния.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка используемой литературы, включающего 245 источника, из которых 52 отечественных и 193 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 12В страницах машинописного текста, содержит таблиц - 9, рисунков - 35.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводились на 276 самцах крыс линии Wistar массой 250300 г.

Условия содержания животных: стандартная экспериментальная биологически чистая комната, освещение 12 ч/12 ч светлый/темный цикл, t 22-24°С. Все исследования проводили в одно и то же время суток во второй половине дня с соблюдением принципов, изложенных в «Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1986).

Обоснование доз исследуемых фармакологических агентов и дизайн эксперимента

В процессе проведения исследовательской работы проводилось изучение эндотелиопротективного действия ингибитора аргиназы L-норвалина (WIRUD GmbH, Hamburg). L-норвалин вводился в дозе 10 мг/кг. Согласно данным современных исследователей, именно начиная с этой дозировки L-норвалин способен ингибировать фермент аргиназу (Ming X.F., 2009). С целью оценки дозозависимого эффекта была выбрана дозировка L-норвалина, 10-кратно превышающая минимальную. Введение L-норвалина производили внутрибрюшинно за 30 минут до эпизода ишемии и повторно в такой же дозе по восстановлении кровотока.

В качестве препарата сравнения был выбран адеметионин, который использовался в дозировке 400 мг/кг внутрибрюшинно за 30 минут до эпизода ишемии (Cozens D.D., 1988).

Фармакологические анализаторы глибенкламид и аминогуанидин вводились в стандартных дозировках 5 мг/кг и 300 мг/кг, достаточных для отмены ишемического прекондиционирования и блокады индуцибельной NO-синтазы, за 30 минут до прекондиционирования или введения фармакологического агента.

Ишемическое реперфузионное повреждение печени воспроизводили путем 15-минутного пережатия аналога печено-двенадцатиперстной связки крысы с последующим восстановлением кровотока и выведением животного из эксперимента на сроке 1 сутки, данный режим дозирования ишемии был выбран как один из наиболее распространенных при исследовании надпорогового ишемического стимула (Hossain М.А., 2003).

Прямое ишемическое прекондиционирование производили за 30 минут до эпизода более глубокой 15-минутной ишемии путем пережатия аналога печеночно-двенадцатиперстной связки крысы на более короткий срок 5 минут.

Дистантное ишемическое прекондиционирование производили так же, как и прямое ишемическое прекондиционирование, за 30 минут до эпизода 15-минутной ишемии по разработанной нами методике путем эластической компрессии артерий верхней трети бедра в течение 15 минут.

Дизайн эксперимента состоит из следующих блоков:

1. Группа по отработке методов исследования, доз и режимов наркоза, методик прекондиционирования.

2. Интактная группа (животные, у которых определяли биохимические показатели, забирали образцы печени на морфологическое и гистохимическое исследование без воспроизведения ишемии и ее коррекции).

3. Группа ишемии/реперфузии (животные, у которых воспроизводили 15-минутную ишемию печени и последующую реперфузию)

4. Группа исследования эффективности воздействия прямого ишемического прекондиционирования на морфофункциональное состояние печени (животные, которым до 15-минутной ишемии печени производили эпизод прямого ишемического прекондиционирования и исследование его отмены блокатором К+АТФазы глибенкламидом).

5. Группа исследования эффективности воздействия дистантного ишемического прекондиционирования на морфофункциональное состояние печени (животные, которым до 15 минутной ишемии печени производили эпизод дистантного ишемического прекондиционирования и исследование его отмены блокатором К+АТФаз глибенкламидом).

6. Оценка эффективности коррекции морфофункциональных нарушений при ишемии печени с использованием Ь-норвалина в дозе 10 мг/кг.

7. Оценка эффективности коррекции морфофункциональных нарушений при ишемии печени с использованием Ь-норвалина в дозе 100 мг/кг и эффективности отмены протекторного эффекта при использовании блокатора К+АТФазы глибенкламида и блокатора индуцибельной КЮ-синтазы аминогуанидина.

8. Оценка эффективности коррекции морфофункциональных нарушений при ишемии печени с использованием комбинации дистантного ишемического прекондиционирования и Ь-норвалина в дозе 100 мг/кг.

9. Группа сравнения с использованием в качестве гепатопротектора адеметионина в дозе 400 мг/кг.

Протокол эксперимента состоит из следующих разделов:

1. Введение фармакологических анализаторов за 30 минут до ишемического прекондиционирования или введения фаркмакологических агентов.

2. Ишемическое прекондиционирование или введение фармагентов за 30 минут до эпизода 15-минутной ишемии печени.

3. Эпизод 15-минутной ишемии печени с эпизодом реперфузии до 1 суток.

4. Забор крови для определения активности ферментов, участков печени для морфологического и гистохимического исследования на 1 сутки от момента воспроизведения 15-минутной ишемии печени.

Манипуляции выполнялись под общим обезболиванием (хлоралгидрат в дозе 300 мг/кг внутрибрюшинно).

Для оценки выраженности гепатоцеллюлярного повреждения определялась активность аспартатаминотрансферазы (АСТ) и аланинаминотрансферазы (AJIT) кинетическим фотоколориметрическим способом на автоматическом биохимическом анализаторе «Виталаб Флексор Е» (Нидерланды) с использованием реагентов фирмы "Biocon" и "Human" (Германия).

Для проведения гистологического исследования печени забирали участки размером 1x1x0,5 см в стандартных местах с последующим приготовлением гистологических микропрепаратов и окраской их гематоксилином и эозином, по Ван Гизону, Мак Манусу и Паппенгейму. Изучение микропрепаратов, фотопротоколирование и морфометрию проводили на микроскопе Leica DM4000B с системой видеорегистрации и обработки изображений.

Уровень экспрессии антиапоптотического белка Вс12 определяли иммуногистохимическим методом с последующей визуальной оценкой и ранжированием.

Статистическая обработка результатов исследования. Цифровые данные обрабатывали методами вариационной статистики: вариационные ряды проверяли на нормальность распределения, при его соблюдении количественные величины характеризовали средней арифметической (М) и ошибкой средней (ш), статистическую значимость количественных величин оценивали по критерию Стьюдента (t). Все расчеты выполнены с помощью пакета статистических программ Microsoft Excel 7.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование ишемического и реперфузионного повреждения печени

В ходе исследования было выяснено, что 15-минутная ишемия печени с последующей реперфузией вызывает значительную активацию ферментов цитолиза. Так, активность ACT у животных, перенесших ишемию/реперфузию печени, превышала показатели контрольной группы в 1,93 раза -соответственно 100,38±1,8 Ед/л у интактных и 193,0±27,1(р<0,05) Ед/л у животных после ишемии-реперфузии печени. Активность AJIT у животных, перенесших ишемию/реперфузию печени, превышала показатели интактной группы в 3,2 раза - соответственно 62,1±3,8 Ед/л у интактных и 196,8±26,9 (р<0,05) Ед/л у животных после ишемии/реперфузии печени (таблица 1).

Таблица 1

Влияние ишемии/репер( >узии печени на активность ACT и AJIT (М±т; п=12)

Группа Активность ACT (Ед/л) Активность AJIT (Ед/л)

Интактная 100,38±1,8 62,1±3,8

Ишемия/реперфузия 193,0±27,1* 196,8±26,9"

Примечание * р<0,05 при сравнении с группой интактных животных.

При морфологическом исследовании выявлено, что выраженные изменения ядер характеризуются вакуолизацией, фрагментацией хроматина до полного исчезновения, с остатками хроматина по периферии ядра, с кариолизисом и кариопикнозом. В гепатоцитах отмечаются немногочисленные неизмененные ядрышки. Цитоплазма с резко выраженной зернистой и жировой дистрофией. Отмечается значительный отёк, характеризующийся резким расширением пространства Диссе. Выражены очаги некроза с регенераторными гипертрофическими гепатоцитами по периферии и очаги лимфоцитарной и густой лейкоцитарной инфильтрации. Некрозы локализуются субкапсулярно и вокруг печеночных трактов. В среднем площадь некрозов составила 0,215±0,014 мм2. По ходу портальных трактов отмечается диффузная лимфолейкоцитарная инфильтрация с участками ступенчатых некрозов. Концентрация гликогена преимущественно по периферии долек (рис. 1).

Гликоген в гепатоцитах расположен диффузно, имеется не во всех клетках. При исследовании экспрессии антиапоптотического белка Вс12 было установлено повышение его локальной экспрессии при общем ее снижении.

Исследование влияния прямого ишемического прекондиционирования при ишемии/реперфузии печени Прямое ишемическое прекондиционирование, произведенное за 30 минут до 15-минутного эпизода ишемии печени, приводит к значительному снижению активности трансаминаз ACT и АЛТ до уровня 110,45±2,9 Ед/л и 62,5±5,3 Ед/л соответственно (таблица 2). Выраженные изменения затрагивают и структурные элементы при морфологическом исследовании, значительно уменьшается выраженность полиморфноядерно-лейкоцитарной инфильтрации, уменьшается отек паренхимы.

Таблица 2

Влияние блокады К+АТФазы глибенкламидом на активность ACT и АЛТ при

реализации гепатопротекторного эффекта ишемического прекондиционирования __(М±т; п=12)___

Группа Активность ACT (Ед/л) Активность АЛТ (Ед/л)

Ишемия/реперфузия 193,0±27,1 196,8±26,9

ИПК+ИР 110.4 5±2,9* 62,5±5,3

Глибенкламид+ИПК+ИР 203,6±14,7" 189,4±26,9

Приложение * р<0,05 при сравнении с группой ишемии реперфузии, ** р<0,05 при сравнении с группой ишемического прекондиционирования

Морфометоически определяется уменьшение очагов некроза до 0,082±0,014 мм". Экспрессия антиапоптотического белка Вс12 подвергается значительной редукции по сравнению с группой ишемии/реперфузии и проявляется в локальном виде, при этом значительно уменьшается и степень ее выраженности.

Гис. 1. Морфологические изменения в печени при ишемии/реперфузии. А) Интактная группа структура ткани печени сохранена, дольки и портальные тракты четкие. Б) Группа ишемии/реперфузии-структура нарушена, видны очаги некрозов, жировой: инфильтрации гепатоцитов. Окраска гематоксилином и эозином. Микрофото. X 100.

Рис. 2. Влияние прямого ишемического прекондиционирования на морфологические изменения в печени при ишемии реперфузии. Структура печени сохранена, единичные очаги некрозов. Окраска гематоксилином и эозином. Микрофото. X 100.

При введении блокатора АТФзависимых К+ каналов глибенкламида в дозе 5 мг/'кг за 30 минут до прямого ишемического прекондиционирования защитный эффект его применения практически полностью нивелируется, активность ACT и AJTT возрастает до 203,6±14,7 и 189,4±26,9 Ед/л соответственно, инфильтративные изменения носят диффузный характер значительной степени выраженности, некрозы, увеличиваясь в размерах, достигают 0,207±0,021 мм2, экспрессия Вс12 носит диффузный характер (рис. 2).

Полученные данные говорят о выраженном гепатопротекторном действии ишемического прекондиционирования, реализующемся через активацию АТФзависимых К каналов и проявляющемся в снижении выраженности воспалительного повреждения, с одной стороны, и активации апоптоза - с другой.

Исследование влияния дистантного ишемического прекондиционирования при ишемии реперфузии печени

Применение дистантного ишемического прекондиционирования за 30 минут до 15-минутной ишемии печени, так же как в случае прямого ишемического прекондиционирования, приводит к уменьшению гепатоцеллюлярного повреждения. ACT и АЛТ находятся на уровне 118,2±3,7 и 60,8±4,1 (таблица 3), отек и нейтрофильная инфильтрация паренхимы и стромы

органа менее выражены, чем в группе ишемии/реперфузии, что не может не сказаться на уменьшении площадей некроза, которые в среднем для данной группы равны 0,125±0,008 мм2. Экспрессия Вс12 носит умеренный локальный характер. В целом морфологические изменения носят сходный характер с таковыми в группе прямого ишемического прекондиционирования. Однако выраженность защитного эффекта несколько меньше, чем в группе прямого ишемического прекондиционирования, что более заметно для размеров очагов некроза, которые в 1,7 раза меньше, чем в группе ишемии/реперфузии и при этом в 1,5 раза больше, чем в группе прямого ишемического прекондиционирования.

Таблица 3

Влияние дистантного ишемического прекондиционирования глибенкламидом и его отмены при ишемии/реперфузии печени на активность ACT и АЛТ (М±ш;

п=12)

Группа Активность ACT (Ед/л) Активность АЛТ (Ед/л)

Ишемия/реперфузии 193,0±27,1 196,8±26,9

ДИПК+ИР 118,2±3,7" 60,8±4,1"

Глибенкламид+ДИПК+ИР 198±12,4" 194±17Д"

Примечание * р<0,05 при сравнении с группой ишемии реперфузии, ** р<0,05 при сравнении с группой ишемического прекондиционирования.

С целью определения механизма реализации защитного действия нами использован в качестве фармакологического анализатора блокатор АТФзависимых К+каналов глибенкламид внутрибрюшинно за 30 минут до дистантного ишемического прекондиционирования в дозе 5 мг/кг. Применение глибенкламида приводило к подъему ACT и АЛТ до 198±12,4 Ед/л и 194±17,1 Ед/л соответственно, увеличению зон некрозов до 0,218±0,015 мм2, что сопоставимо с группой ишемии/реперфузии. Экспрессия Вс12 носит умеренный локальный характер.

Учитывая полученные в ходе исследования данные, можно сделать вывод о том, что защитный эффект дистантного ишемического прекондиционирования носит характер, аналогичный таковому при прямом ишемическом прекондиционировании, реализуется через идентичные механизмы, не достигая, однако, эффективности последнего.

Исследование влияния L-норвалина в дозе и адеметионина в дозе 400 мг/кг при ишемии/реперфузии печени

Применение блокатора аргиназы L-норвалина в 10 и 100 мг/кг за 30 минут до ишемии печени и сразу после восстановления кровотока приводило к уменьшению выраженности гепатоцеллюлярного повреждения, что проявлялось в уменьшении активности трансаминаз. Использование же адеметеонина для коррекции ишемически/реперфузионных повреждений в дозе 400 мг/кг за 30 минут до эпизода 15-минутной ишемии вызывало лишь незначительное изменение активности трансаминаз (таблица 4).

Таблица 4

Влияние L-норвалина и адеметионина на активность ACT и АЛТ при _ишемии /реперфузии печени (М±т; ¡1=12)

Группа Активность ACT Активность АЛТ

Ишемия/реперфузия 193,0±27,1 196,8±26,9

L-норвалин в дозе 10 мг/кг + И/Р 120,1±2,8* 59,3±2,5*

L-норвалин в дозе 100 мг/кг + И/Р 113,9±9,4" 31,2±3,7*

Адемегионин (гептрал) в дозе 400 мг/кг 174,9±6,5* 172,8±4,3*

Примечание * р<0,05 при сравнении с группой ишемии реперфузии

Морфологические изменения сводились к уменьшению отека пространств Диссе, уменьшению инфильтративных изменений, но наиболее выраженная динамика была в отношении размеров очагов некроза, которые в случае применения Ь-норвалина в дозировке 10 мг/кг были 1,15 раза меньше, чем в группе ишемии/реперфузии (0,186±0,011 мм2), увеличение же дозировки до 100 мг/кг приводило к уменьшению зон некроза в 1,33 раза по сравнению с группой ишемии/реперфузии (0,161±0,017 мм2) (рис. 3).

Рис. 3. Влияние Ь-норвалина в дозировках 10 и 100 мг/кг на ишемию/реперфузию печени. А) Группа с применением Ь-норвалина в дозе 10 мг/кг: умеренные очаги некрозов, отек пространств Диссе.

Б) Группа с применением Ь-норвалина в дозе 100 мг/кг: микронекрозы, жировая инфильтрация гепатоцитов. Окраска гематоксилином и эозином. Микрофото. X 100.

Зоны некроза при использовании адеметионина в дозе 400 мг/кг уменьшались в гораздо меньшей степени - в 1,09 раза; по сравнению с группой ишемии/реперфузии и в среднем составляли 0,196±0,011 мм. Отечно-инфильтративные изменения в печени также были выражены в значительной степени, чем группах с применением L-норвалина. Подобные изменения как в функции печени, так и морфологических проявлениях при применении адеметионина наводят на мысль о том, что в отношении ишемических и реперфузионных поражений данный препарат не обладает высокой эффективностью.

С учетом большей выраженности гепатопротекторного эффекта, было принято решение в дальнейших исследованиях использовать дозу 100 мг/кг. Исследование механизмов реализации гепатопротекции при использовании в качестве фарманализаторов блокатора АТФзависимых К каналов глибенкламида в дозе 5 мг/кг и блокатора идуцибельной NO-синтазы аминогуанидина в дозе 300 мг/кг выявило отсутствие полной отмены защитного эффекта, как в случае глибенкламида, так и в случае аминогуанидина. В отношении ACT эффективность отмены глибенкламидом составила 80,74%, a AJIT 63,2%. Эффективность отмены защитного эффекта L-норвалина в дозе 100 мг/кг аминогуанидином для ACT и АЛТ была 85,2% и 81,73% соответственно.

Для зон некроза эффективность отмены L-норвалина в дозе 100 мг/кг при применении блокатора АТФзависимых К+каналов глибенкламида в дозе 5 мг/кг была на уровне 92,27%, а для аминогуанидина составила 95,65%. Данные неполной отмены протекторного действия L-норвалина при действии двух различных по точкам приложения фарманализаторов говорят о том, что полностью защитный эффект от действии ингибитора аргиназы L-норвалина объяснить активацией митохондриальных К+АТФаз не представляется возможным, однако и блокатор индуцибельной NO-синтазы не в полной мере снимал протекторный эффект, что, с нашей точки зрения, связано с активацией не только индуцибельной, но и эндотелиальной NO-синтазы.

Таким образом, учитывая неполную отмену эффектов влияния L-норвалина аминогуанидином и глибенкламидом, создаются предпосылки для возможного усиления эффектов дистантного ишемического прекондиционирования путем сочетания с введением L-норвалина в дозе 100 мг/кг.

Исследование влияния сочетанного применения дистантного ишемического прекондиционирования и L-норвалина в дозе 100 мг/кг

Полученные в ходе исследования данные свидетельствуют, что максимальной эффективностью в отношении уменьшения выраженности гепатоцеллюлярного повреждения обладает прямое ишемическое прекондиционирование, значительно уменьшая как активность ферментов цитолиза, так и явления воспалительного повреждения, что выражается в меньшей величине некрозов печеной паренхимы. Ни L-норвалин в дозе 100 мг/кг, ни дистантное ишемическое прекондиционирование по величине

протекторного эффекта не достигает такового у прямого ишемического прекондиционирования. В связи в чем нами с целью усиления защитного эффекта использовано сочетанное применение дистантного прекондиционирования и L-норвалина в дозе 100 мг/кг.

Введение L-норвалина в дозе 100 мг/кг параллельно с дистантным ишемическим прекондиционированием, а затем повторно в дозе 100 мг/кг сразу по восстановлении кровотока после 15-минутной ишемии приводило к снижению активности ACT до уровня 112,3±8,5 Ед/л, что в 1,71 раза меньше, чем в группе ишемии/реперфузии, a AJIT до уровня 35,7±3,1 Ед/л, что 5,51 раза меньше в сравнении с ишемией/реперфузии (таблица 5).

Таблица 5

Влияние сочетаниого применения L-норвалина и дистантного ишемического прекондиционирования при ишемии/реперфузии печени на активность ACT и AJIT

(М±ш; 11=12)

Группа Активность ACT (Ед/л) Активность AJIT (Ед/л)

Ишемия/реперфузия 193,0±27,1 196,8±26,9

ДИПК+ИР 118,2±3,7* 60,8±4,Г

L-норвалин в дозе 100 мг/кг + И/Р 113,9±9,4* 31,2±15,3*

L-норвалин в дозе 100 мг/кг + ДИПК + И/Р 112,3±8,5* 35,7±3,1*

* р<0,05 при сравнении с группой ишемии реперфузии

Отечно-инфильтративное поражение было выражено в значительно меньшей степени, чем в группе ишемии/реперфузии, а распределение Вс12

Рис. 4. Влияние сочетанного применения дистантного ишемического прекондиционирования и Ь-норвалина в дозе 100 мг/кг на экспрессию Вс12. А) Диффузное распределение Вс12 в группе ишемии/реперфузии.

Б) Локальное распределение антиапоптотического фактора Вс12 в группе сочетанного применения дистантного ишемического прекондиционирования и Ь-норвалина в дозе 100 мг/кг. Иммуногистохимическое исследование.

Площадь зон некроза при использовании Ыюрвалина в сочетании с дистантным ишемическим прекондиционированием сократилась в 1,74 раза и составила в среднем 0,123±0,012 мм2 (таблица 6).

Таблица 6

Влияние ишемического прекондиционирования, Ь-норвалнна и их сочетанного

примеиения при ишемии/реперфузин печени на

размеры зон некроза (М±т; п=12)

п/п

Группы животных

Ишемия/реперфузия

ИПК

ДИПК

Ь-норвалин в дозе 10 мг/кг

Ь-норвалин в дозе 100 мг/кг

ДИПК + Ь-норвалин в дозе 100 мг/кг

Адеметионин (гептрал) в дозе 400 мг/кг

Площадь некроза, мм

0,215±0,014

0,082±0,014

0,125±0,008

0,18б±0,011

0,161±0,017

0,123±0,012

0,196±0,011

Примечание* р<0,05 при сравнении с группой ишемии/реперфузии.

Учитывая вышесказанное, можно сделать вывод, что сочетанное применение Ь-норвалина и дистантного ишемического прекондиционирования по степени выраженности гепатопротекторного эффекта сопоставимо с прямым ишемическим прекондиционированием.

Полученные в ходе работы данные свидетельствуют о мощном гепатопротекторном действии прямого ишемического прекондиционирования, что сопровождается уменьшением выраженности гепатоцеллюрярного повреждения при ишемических и реперфузионных повреждениях печени. Эффект полной отмены защитного действия на фоне применения блокатора митохондриальной К+АТФазы глибенкламида, с одной стороны, говорит о реализации защитного эффекта через АТФзависимые калиевые каналы, а с другой, что протекторный эффект полностью замыкается на митохондрии.

Дистантное ишемическое прекондиционирование реализуется по сходным механизмам, включающим в себя аналогичный комплекс митохондриальных АТФаз, что также подтверждается полной отменой защитного эффекта при действии глибенкламида, однако выраженность защитного эффекта не достигает таковой у прямого ишемического прекондиционирования, что говорит о наличии четко очерченной фармакологической мишени.

Дизайн исследования учитывает нанесение ишемического повреждения печени во время формирования «первого окна» защитного эффекта или так называемого «раннего» прекондиционирования, где в реализации, согласно мнению большинства авторов, основную роль играет аденозин. Несмотря на это, ранняя активация «второго окна» или позднего прекондиционирования, которая в ходе работы моделировалась введением блокатора аргиназы Ь-норвалина, благодаря перераспределению субстрата для синтеза N0, являющегося основным триггером в данном виде прекондиционирования,

также значительно уменьшала повреждение печени при ее ишемии и реперфузии.

Логичным решением по уменьшению печеночного повреждения при ишемии/реперфузии печени явилось усиление защитного эффекта за счет сочетанного воздействия триггеров обеих «окон» прекондиционирования одновременно, путем введения Ь-норвалина и воздействия дистантного прекондиционирования. Усиление гепатопротекторного эффекта при использовании сочетанного применения дистантного ишемического прекондиционирования и Ь-норвалина в дозе 100 мг/кг, полученное в ходе работы и проявляющееся уменьшением активности трансаминаз, но в первую очередь уменьшением площадей некроза, с нашей точки зрения, связано с эффектами Ь-норвалина не опосредованными активацией К+АТФаз, что подтверждается неполной отменой действия Ь-норвалина глибенкламидом.

Таким образом, данные, полученные в ходе исследования, о положительном гепатопротекторном действии ингибитора аргиназ Ь-норвалина и его сочетанном применении с дистантным ишемическим прекондиционированием могут быть использованы в дальнейших исследованиях на клинических моделях и рекомендоваться с целью уменьшения повреждающего действия ишемических и реперфузионных поражений тканей печени.

выводы

1. Прямое и дистантное ишемическое прекондиционирование обладает выраженным гепатопротекторным действием при ишемических и реперфузионных повреждениях печени, проявляющимся в предотвращении повышения активности ACT и АЛТ на фоне ишемии/реперфузии в 1,7 и 3,1 раза, уменьшении выраженности отечно-инфильтративных явлений, уменьшении площадей некрозов в 2,6 раза, что сопровождается усилением апоптоза, подтверждением чего является снижение экспрессии антиапоптотического белка Вс12. При этом защитный эффект дистантного ишемического прекондиционирования выражен в меньшей степени, чем прямого.

2. Использование блокатора АТФзависимых К+каналов глибенкламида (5 мг/кг внутрибрюшинно за 30 минут до проведения прекондиционирования) в качестве фармакологического анализатора полностью снимало гепатопротекторные эффекты прямого и дистантного прекондиционирования, что свидетельствует об общности пути реализации защитных эффектов.

3. Блокатор аргиназы L-норвалин в дозах 10 и 100 мг/кг уменьшает гепатоцеллюлярное повреждение при ишемических и реперфузионных повреждениях печени, что выражается в предотвращении повышения активности трансаминаз, сокращении площадей некроза в 1,1 и 1,3 раза (по сравнению с группой ишемии/реперфузии), уменьшении инфильтрации стромальных и паренхиматозных элементов печени полиморфноядерными лейкоцитами, уменьшении отека, снижении экспрессии фактора антиапоптоза Вс12. Защитное действие L-норвалина выше в дозе 100 мг/кг, но при этом не достигает эффективности протекторного действия прямого ишемического прекондиционирования.

4. Гепатопротекторный механизм L-норвалина при ишемии/реперфузии реализуется несколькими путями, включающими активацию митохондриальных К+АТФаз, активацию индуцибельной, а также эндотелиальной NO-синтазы, что подтверждается неполной отменой защитного действия на фоне введения блокатора К+АТФазы глибенкламида (5 мг/кг) и ингибитора iNOS аминогуанидина (300 мг/кг).

5. Сочетанное применение дистантного ишемического прекондиционирования и L-норвалина в дозе 100 мг/кг за 30 минут до ишемии и повторно по возобновлении кровотока приводит к усилению защитного эффекта до уровня, сопоставимого с защитным эффектом прямого ишемического прекондиционирования, что выражается в предотвращении повышения активности ACT и АЛТ на фоне ишемии/реперфузии в 1,7 и 5,5 раза, а также уменьшением отечно-инфильтративных изменений и сокращением зон некроза в 1,7 раза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В практике фармакологических исследований рекомендовать К+-АТФ-азные каналы, активируемые при феномене прекондиционирования, как одну из основных мишеней в коррекции ишемических повреждений органов и тканей.

2. Рекомендовать использование ингибиторов аргиназы для повышения эффективности коррекции реперфузионных повреждений печени в эксперименте.

3. Рекомендовать L-норвалин для проведения целенаправленных доклинических исследований по коррекции ишемических/реперфузионных повреждений печени.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Лопатин Д.В. Прекондиционирование при ишемических и реперфузионных повреждениях печени / H.H. Жернакова, С.А. Алехин, Д.И. Колмыков, A.A. Должиков, U.M. Колесник, Л.В. Иванова, Т.Г. Покровская, Д.В. Лопатин, Л.В. Котельникова // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Сер. Медицина. Фармация- 2012.- №4.- С.157-163.

2. Лопатин Д.В. Влияние дистантного и прямого прекондиционирования на динамику показателей стабильных метаболитов оксида азота при ишемии тонкого кишечника / Н.И. Жернакова, С.А. Алехин, М.В. Покровский Л.В. Иванова, И.М. Колесник, Д.И. Колмыков, М.В. Корокин, Д.В. Лопатин, Л.В. Котельникова // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Сер. Медицина. Фармация.- 2012.- №4.- С.163-168.

3. Лопатин Д.В. Коррекция эндотелиалыюй дисфункции комбинацией L-норвалина и мексидола / Е.А. Коновалова, Е.С. Черноморцева, М.В. Покровский, Э.Н. Дудина, Д.В. Лопатин, Т.А.Денисюк, Л.В. Котельникова, Ж.С. Лесовая// Научные ведомости Белгородского государственного университета. Сер. Медицина. Фармация.-2012.- №4.- С.175 -182.

4. Лопатин Д.В. Новые производные 3-гидроксипиридина в коррекции нарушений структурно- функциональных свойств эритроцитов при остром токсическом поражении печени / В.А. Рагулина, С.А. Алехин, Т.Г.

Покровская, О.С. Гудырев, M.B. Корокин, В.И. Кочкаров, A.A. Арустамова, Д.В. Лопатин, И.М. Колесник // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Сер. Медицина. Фармация,- 2012.- №4- С. 208-212

5. Лопатин Д.В. Коррекция ишемических и реперфузионных повреждений печени при хирургических вмешательствах с использованием метода дистантного прекондиционированияи фармакологической защиты L-норвалином / Лопатин Д.В., Алехин С.А., Покровский М.В., // Кубанский научный медицинский вестник.- 2012.- №4(133).- С.171-175.

6. Лопатин Д.В. Сравнительный анализ эффективности гепатопротекторного действия L-норвалина и адеметионина при ишемических и реперфузионных поражениях печени / Д.ВЛопатии, С.А.Алехин, М.В. Покровский [и др.] // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Сер. Медицина. Фармация,- 2012.-№22(141), выпуск 20/3.- С.132-137.

7. Лопатин Д.В. Геномные и экстрагеномные механизмы в реализации ишемических и реперфузионных повреждений органов брюшной полости / С.А.Алехин, М.В. Покровский, П.М, Назаренко, Д.В. Лопатин, В.В. Алехина, Л.В. Иванова, В.П. Трошин, В.Д. Луценко, СЛ. Сперанский // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Сер. Медицина. Фармация.- 2012.- №22(141), выпуск 20/3.- С.5-13.

8. Лопатин Д.В. Влияние дистантного ншемического прекондиционирования на морфофункциональные показатели и эксперссию фактора антиапоптоза в печени после перенесенного эпизода ишемии/реперфузии / С.А.Алехин, Д.ВЛопатии. М.В. Покровский и др // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Сер. Медицина. Фармация.- 2012.- №22(141), выпуск 20/3.- С.84-88.

9. Лопатин Д.В. Анализ механизмов реализации гепатопротекторного действия L-норвалина и ншемического прекондиционирования при ишемии/реперфузии печени / М.В.Покровский, С.А.Алехин, Д.ВЛопатии и др II Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова.- 2013.- Xsl.- С.56-60.

Патенты РФ на изобретения

1. Пат. на полезную модель № 97615 Российская Федерация. Устройство для дистантного прекондиционирования / О.О. Новиков, М.В. Покровский, В.И. Кочкаров [и др.]; заявитель и патентообладатель ГБОУ ВПО «Белгородский государственный университет». - № 97615; опубл. 20.09.2010 Бюл. № 26.

2. Пат. 2449783 Российская Федерация. Способ коррекции Ь-МАМЕ индуцированного дефицита оксида азота Ь-норвалином в эксперименте / М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, С.А. Цепелева [и др.]; заявитель и патентообладатель ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию». - № 2449783; опубл. 10.05.2012 Бюл. № 13.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АТФ - аденозинтрифосфат

ДИПК - дистантное ишемическое прекондиционирование ИПК - ишемическое прекондиционирование иРНК - информационная рибонуклеиновая кислота ЛДФ - лазерная допплеровская флоуметрия цГМФ - циклический гуанозин монофосфат е1>Ю8 - эндотелиальная N0 - синтаза гипоксия индуцибельный фактор ¡N08 - индуцибельная N0 - синтаза Ь-ЫАМЕ - метиловый эфир Ы-нитро-Ь-аргинина N0 - оксид азота

Лицензия ЛР № 020862 от 30.04.99 г. Сдано в набор 09.09.2013 г. Подписано в печать 12.07.2013 г. Формат 30х42'/8. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ №. 176"А". Издательство Смоленской государственной медицинской академии 214019, Россия, г. Смоленск, ул. Крупской, д. 28.