Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Влияние дипептидного аналога нейротензина дилепта на нейротрансмиттерные системы прилежащего ядра и дорзального стриатума

На правах рукописи

ШУБЕНИНА Евгения Вячеславовна

ВЛИЯНИЕ ДИПЕПТИДНОГО АНАЛОГА НЕЙРОТЕНЗИНА ДИЛЕПТА НА НЕЙРОТРАНСМИТТЕРНЫЕ СИСТЕМЫ ПРИЛЕЖАЩЕГО ЯДРА И ДОРЗАЛЬНОГО СТРИАТУМА

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации па соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2011

2 4 [,;АР 201?

4841290

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте фармакологии имени В.В. Закусона РАМИ

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

кандидат медицинских наук

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

Рита Ушеровна Островская Владимир Сергеевич Кудрин

Ковалев Георгий Иванович Каменский Андрей Александрович

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Российский Государственный медицинский университет имени

Н.И. Пирогова Росздрава

Защита диссертации состоится «7» апреля 2011 года

в ... часов на заседании диссертационного совета Д001.024.01 при НИИ фармакологии имени В.В, Закусова РАМН по адресу: 125315, Россия, Москва, ул.Балтийская, д.8

С диссертацией можно ознакомиться в ученой части НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН по адресу : 125315, Россия, Москва, ул.Балтийская, д.8

Автореферат разослан « »марта 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета, Доктор медицинских наук, профессор

Е.А. Вальдман

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Шизофрения - тяжелое психическое заболевание, распространенность которого, согласно различным статистическим данным, составляет от 0,5% до 1%. Раннее наступление болезни, ее прогрессирующий и часто необратимый характер, ведущий не только к ухудшению качества жизни, но и к полной дезадаптации больных в обществе, определяют высокую медико-социальную значимость этого заболевания.. Проблема лечения шизофрении является одной из важнейших задач современной медицины.

Наряду с проявлениями негативной и позитивной симптоматики, наблюдаемой при этом заболевании, когнитивный дефицит рассматривается в качестве важного самостоятельного или даже ведущего расстройства, в значительной степени определяющего социальный и терапевтический прогноз заболевания (Sharma Н, 2000; Мосолов С.Н. 2000; Hagan J.J. el al, 2008; Geyer M. А. 2009]. Используемые в клинической практике классические нейролептики эффективны преимущественно в отношении продуктивных симптомов заболевания, в то же время, их применение приводит к развитию экстрапирамидных неврологических нарушений, к усугублению когнитивной недостаточности,- а также к развитию гиперпролактинемии [Márchese G. and Pañi L., 2002; Mauri M.C. et а]., 2008; Emsley R., 2009]. Подобные нарушения связаны прежде всего с блокадой рецепторов дофамина (ДА) второго типа (Д2) в нигростриарном и тубероинфундибулярном путях [Janno S. et al., 2004; Montejo A.L., 2008]. Следствием пролактинемии может быть развитие диабета, гиперлипидемии, увеличение веса, нарушение минерального обмена костной ткани, а также сексуальные расстройства [Meaney A.M.,. et al., 2004].

Большинство атипичных нейролептиков оказывает менее выраженное влияние на уровень пролактина по сравнению с типичными антипсихотическими средствами (АПС) [Grant S. and Fitton А., 1994]. Терапия атипичными нейролептиками, характеризуется меньшей выраженностью экстрапирамидных нарушений, но не всегда сопровождается достаточным антипсихотическим эффектом. Кроме того, у атипичных АПС отмечаются собственные побочные эффекты, к которым относится седативное действие, агранулоцитоз, изменения обмена глюкозы и липидов, антихолинергические побочные эффекты, а также гипотензия и миокардиты [Montejo A.L., 2008]. Атипичные нейролептики недостаточно эффективны в отношении когнитивных нарушений, наблюдаемых при шизофрении [Harvey P.D. and Keefe R.S. , 2001; Renuliard S. et al., 2005]. Важно подчеркнуть, что 25-30%

пациентов, впервые заболевших шизофренией, полностью резистентны ко всем существующим антипсихотикам.

Указанные факты определяют актуальность разработки новых стратегий создания высокоэффективных нейролептиков, лишенных побочных эффектов и имеющих принципиально иной механизм действия. Установлено, что, помимо нарушения функционирования ДА-ергических систем мозга, при шизофрении происходит изменение баланса других нейромедиаторов, к числу которых относятся глутамат, ГАМК, ацетилхолин, серотонин, а также ряд нейропептидов [O'Connor W.T., 2001; Kinkead В. and Nemeroff C.B., 2004; Cherlyn S.Y., et al., 2010]. Выявление полимодального модулирующего влияния нейропептидов на изменения нейрохимического баланса мозга открывает перспективы для их использования в качестве потенциальных лекарственных средств. К нейропептидам с потенциальной антипсихотической активностью относится нейротензин (HT), роль которого в патогенезе шизофрении не вызывает сомнений [Kinkead В. and Nemeroff C.B., 2002; Câceda R., et al., 2006]. Способность HT препятствовать развитию эффектов дофаминомиметиков, угнетать условные рефлексы, потенцировать эффекты барбитуратов, вызывать гипотермию позволили сформулировать гипотезу о роли HT как эндогенного нейролептика [Nemeroff C.B. 1992]. Олигопептидная структура HT, обуславливающая его низкую биодоступность для мозга, является причиной того, что эффекты HT воспроизводятся только при введении этого тридекапептида в желудочки мозга или при подведении к его структурам [Boules M. et al., 2006]. Это исключает возможность клинического применения HT в качестве антипсихотического средства. Разработка миметиков кейротензина - гексапептидов, эффективных при системном введении, ведется на основе модифицирования главного метаболита HT (HT) 8.i3 [Kinkead В. and Nemeroff C.B., 2006].

Оригинальный подход к поиску высокоактивных пептидных препаратов, развиваемый в НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН, состоит в создании замещенных дипептидов, имитирующих структуру активного центра эндогенного пептида и непептидного лекарственного препарата с соответствующей активностью. За основу моделирования активных НТ-подобных нейролептиков был взят дипептид пролил-тирозин в связи с тем, что эта последовательность соответствует центральному фрагменту (3 - изгиба НТвоз, и имеет топологическое сходство с атипичным нейролептиком сульпиридом [Gudasheva Т.А. et al., 1998]. Из серии N-ацил-пролил-тирозинов для более подробного изучения был отобран N-капроил-Ь-пролил-Ь-тирозина метиловый эфир (Дилепт), продемонстрировавший нейролептикоподобную активность по стандартным показателям антипсихотического действия [Середенин С.Б., и др., Патент РФ №2091390]. Дилепт устраняет поведенческие эффекты дофаминомиметиков, вызывает гипотермию и потенцирует действие барбитуратов

[Гузеватых J1.C. и др., 2001]. Анализ эффектов Дилепта на моделях амнезии и дефицита препульсового торможения, вызванных блокатором NMDA - рецепторов [Островская Р.У. и др., 2009] позволил сделать заключение о глутаматпозитивном действии этого препарата.

Исследования влияния Дилепта на поведение животных показало сходство этого системно активного дипептида с известными для исходного пептида нейротензина в условиях его подведения к структурам мозга. Наряду с достаточно углубленным изучением поведенческих эффектов Дилепта, нейрохимические механизмы действия этого дипептида недостаточно изучены. Одним из информативных подходов к выяснению нейрохимических механизмов действия Дилепта может явиться изучение его влияния на нейротрансмиттерные системы прилежащего ядра и дорзального стриатума.

В основе реализации многих поведенческих эффектов антипсихотических препаратов и нейротензина лежит воздействие в области нигростриарной и мезолимбической систем. Прилежащее ядро и дорзальноый стриатум, входящие в состав базальных ганглиев, являются важнейшими частями указанных систем мозга. Механизм действия многих антипсихотиков в нигростриатной и мезолимбической петлях связан как с изменением активности системы ДА, так и с влиянием на системы глутамата и ГАМК в прилежащем ядре и дорзальном стриатуме [L.Ferraro, et al., 2007].

Прилежащее ядро выполняет функцию ретранслятора между лимбической и префронтальной областью; эта система осуществляет координацию когнитивных, эмоциональных и мотивационных процессов [Smith Y., 2005]. Показано что НТ при введении в прилежащее ядро проявляет антипсихотоподобные эффекты [Binder Е.В. et al, 2001] и что регуляция нейротензином ДА передачи в этом образовании осуществляется через системы глутамата и ГАМК [Ferraro L., et al. 2007].

В свете вышеизложенного, целью исследования являлось изучение влияния аналога нейротензина Дилепта на нейрохимические параметры глутамат-, ГАМК- и ДА- ергических систем прилежащего ядра и дорзального стриатума.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Изучить влияние Дилепта на содержание катехоламинов и их метаболитов в ткани прилежащего ядра и дорзального стриатума крыс Вистар

2. Оценить атияние Дилепта на синтез дофамина в прилежащем ядре и дорзальном стриатуме крыс Вистар в условиях модели прерывания импульсной активности нейронов

3. Исследовать с помощью метода микродиализа влияние Дилепта на внеклеточное содержание катехоламинов в прилежащем ядре и дорсальном стриатуме крыс Вистар

4. Провести исследование воздействия Дилепта на содержание нейротрансмиттерных аминокислот в ткани прилежащего ядра и дорзального стриатума крыс Вистар

5. Исследовать с помощью метода микродиализа воздействие Дилепта на внеклеточное содержание нейротрансмиттерных аминокислот в прилежащем ядре и дорзалышм стриатуме крыс Вистар

Научная новизна исследования. В работе впервые изучены эффекты Дилепта на аминоацидергические и моноаминергические системы прилежащего ядра и дорзального стриатума. Впервые с помощью метода внутримозгового микродиализа исследовано влияние Дилепта на внеклеточное содержание нейротрансмиттерных аминокислот и метаболитов ДА. Впервые установлены эффекты Дилепта, реализуемые через пресинаптические рецепторы ДА на ДА нейроне в прилежащем ядре и дорзальном стриатуме. Изучено влияние Дилепта на синтез и утилизацию дофамина, проанализирована взаимосвязь этих процессов на внутри- и внеклеточном уровне. Впервые показано, что эффекты Дилепта в прилежащем ядре сходны с действием нейротензина при введении последнего в эту структуру мозга.

Практическая значимость исследования. Выявленный нейрохимический спектр действия Дилепта, сочетающий увеличение скорости синтеза и метаболизма ДА в прилежащем ядре со способностью повышать активность системы глутамата и ГАМК в этом образовании, полностью соответствует результатам поведенческих экспериментов, выявившим у Дилепта сочетание антипсихотических свойств с положительным когнитотропным эффектом. Данные об отсутствии выраженных изменений этих показателей в дорзальным стриатуме согласуются с отсутствием экстрапирамидных расстройств при введении Дилепта. Полученные результаты расширяют представление о механизме действия Дилепта и обосновывают дальнейшее изучение этого дипептида в качестве потенциального антипсихотика, не вызывающего экстрапирамидных побочных эффектов.

Апробация работы. Результаты работы были доложены и обсуждены на III съезде Российского научного общества фармакологов (С-Петербург, 2007 г.); на V Международном Междисциплинарном Конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Украина, 2009 г.); на V международной конференции «Биологические

основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2010 г.); межлабораторной конференции НИИ фармакологии им.В.В.Закусова (март 2011 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ, из них 2 статьи в реферируемых журналах и 5 тезисов докладов. 2 статьи приняты в печать.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы посвященной описанию материалов и методов, главы с изложением результатов собственных исследований, заключения и выводов. Диссертация содержит 1 таблицу и 25 рисунков. Библиографический указатель включает 274 источника, в том числе 20 отечественных и 254 иностранных.

Личный вклад автора. Автор работы является основным исполнителем проведенного исследования на всех этапах: анализа данных литературы по теме работы, проведения исследования и анализа полученных результатов.

МАТЕРИАЛЫ, МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на 111 крысах-самцах линии Вистар массой 250-300г, содержавшихся в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и корму. Содержание животных соответствовало правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 351.000.3-96 и 51000.4-96) и приказу МЗ РФ №276 от 19.06.2003г.

1. Изучение содержания ДА, его метаболитов, возбуждающих н тормозных аминокислот в структурах головного мозга крыс

Животных случайным образом разделяли на 2 группы, по 15 в каждой. Крысам первой группы внутрибрюшишю (в/б) вводили Дилепт в дозе 0,8 мг/кг, а животным второй группы - эквивалентный объем 0,9 % раствора NaCl. Через 60 минут животных декапитировали, прилежащее ядро и стриатум извлекались на льду, взвешивались и замораживались в жидком азоте для проведения дальнейших нейрохимических экспериментов [Glowinsky et. al. 1982]. Выделенные структуры размельчали в гомогенизаторе в условиях "холодной комнаты". Дорзальный стриатум гомогенизировали в 1000 мкл, а прилежащее ядро в 500 мкл среды выделения, содержащей 0,1н HCJ04 и в качестве внутреннего стандарта диоксибензиламин в количестве 0.5 нмоль/мл. Затем пробы центрифугировали при 10000 g в течение 15 мин. В дальнейшем супернатант использовали для определения ДА и его основных метаболитов - диоксифенилуксусной (ДОФУК) и гомованилиновой (ГВК) кислот определяли методом обращеннофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (ВЭЖХ/ЭД) [Кудрин B.C., 1995], либо для детекции нейротрансмиттерных аминокислот (глутамат, ГАМК) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуоресцентной детекцией (ВЭЖХ/ФД) [Pearson et al., 1991].

1.1. Определение содержания ДА, ДОФУК и ГВК в ткани дорзалышго стриатума и прилежащего ядра методом ВЭЖХ/ЭД.

20 мкл супернатанта наносили на аналитическую колонку Phenomenex Ск 4 мкМ путем прямой инъекции. ДА, ДОФУК и ГВК разделяли на хроматографе, снабженном инжектором (Rheodine) и электрохимическим детектором (LC-304T (BAS, USA)). В качестве- подвижной фазы применяли 0,1 M цитратно-фосфатный буфер, содержащий 0,3 мМ ионопарного реагента октансульфоната натрия, 0,1 мМ ЭДТА и 8% ацетонитряла (рН

3,6). Определение ДА и его метаболитов осуществляли на стеклоуглеродном электроде при потенциале +0,85 В против Ag/AgCl электрода сравнения. Скорость потока подвижной фазы составляла 0,7 мл/мин. Данные об уровне ДА и его метаболитов представлялись в виде процентов относительно контрольной группы, принятой за 100%.

1.2. Определение уровня нейротрансмиттерных аминокислот (глутамат, ГАМК) в ткани дорзалыюго стриатума и прилежащего ядра методом ВЭЖХ/ФД. Количественная оценка нейротрансмиттерных аминокислот в супернатанте осуществлялась путем определения интенсивности фотоиндуцированной флуоресценции производных аминокислот (ВЭЖХ/ФД). Для деривации аминокислот использовался ОДМ боратный буфер и о-фтальальдегид-сульфитный реактив в ОДМ боратном буфере (pH 9,5). Глутамат и ГАМК в начальной концентрации 0,01 мкМ/мл в ОД н НСЮ4 использовали в качестве стандартной смеси для калибровки.

Исследования проводили с использованием колонки Agilent Hypersil ODS 5 mkM, 4,6*250. Регистрацию продуктов разделения проводили на флюоресцентном детекторе Agilent 1100 (США) при длине волны возбуждения 230 нм и длине волны эмиссии 392 нм. Подвижная фаза для определения нейромедиаторных аминокислот состояла из 0,06 М NaH2P04*H20, 0,0032 М Na2HP04, 0,025 mM ЭДТА, и 1,24 тМ СН3ОН, рН=5,6. Скорость подвижной фазы составляла 1.5 мл/мин.

2. Изучение влияния Дилепта на регуляцию синтеза дофамина пресинаитическимп рецепторами в условиях модели прерывания импульсной активности нейронов при введении гаммабутиролакгона (ГБЛ).

Введение гаммабутиролактона (ГБЛ) позволяет блокировать импульсную активность ДА нейронов, проецирующихся из черной субстанции в стриатум по нигростриарному пути [Walters J.R, Roth R.H., 1976] . При этом подавляется высвобождение дофамина в межсннаптическое пространство, повышается тропность пресинаптических Д2 рецепторов к предполагаемым лигандам. Введение ингибитора декарбоксилазы ароматических аминокислот 3-оксибензилгидразина (3-ОБГ) в ГБЛ модели позволяет оценить влияние исследуемого вещества на способность тирозингидроксилазы (активность которой зависит от интенсивности связывания ДА с пресинаптическими рецепторами дофамина) синтезировать предшественник ДА- диоксифенилаланин (ДОФА), который в норме практически не детектируется [Walters J.R, Roth R.H., 1976].

Опыты проводили на крысах - самцах линии Вистар, которых разделяли на 3 группы по 15 животных в каждой. Первой группе вводили в/б Дилепт (0,8 мг/кг), гаммабутиролактон и 3-ОБГ, второй группе - физиологический раствор (в/б), вместо Дилепта - физиологический раствор в эквивалентном объеме. Третьей группе вводили физиологический раствор 2 раза и 3-ОБГ. Через 25 минут после введения Дилепта, либо физиологического раствора животным первых двух групп внутрибрюшинно вводили ГБЛ (750 мг/кг), а спустя еще 15 минут 3-ОБГ (100 мг/кг). Животным третьей группы вводили 2 раза физиологический раствор и 3-ОБГ (100 мг/кг) в соответствии с протоколом эксперимента первых двух групп. Через 20 минут после последней инъекции проводили декапитацию. Затем прилежащее ядро и дорзальный стриатум извлекали на льду, замораживали в жидком азоте и гомогенизировали в 500 мкл среды выделения, содержащей ОД м НС104 и в качестве внутреннего стандарта диоксибензиламин в количестве 0,5 нмоль/мл. Далее пробы центрифугировали при 10000 g в течение 15 мин. В дальнейшем супернатант использовали для определения содержания ДОФА ВЭЖХ/ЭД.

3. Микродиализ дорзалыюго стриатума и прилежащего ядра на свободноподвшкных животных с последующим определением содержания катехоламинов и нейротрансмиттерных аминокислот методом ВЭЖХ

Работа выполнена на 36 крысах самцах линии Вистар массой 250-300 г. Проведено изучение эффектов Дилепта на внеклеточное содержание нейротрансмиттерных аминокислот (глутамата и ГАМК), а также ДА и его метаболитов в прилежащем ядре и дорзальном стриатуме мозга методом внутримозгового микродиализа. Животные

случайным образом были разделены на 4 группы по 9 особей в каждой. Крыс всех групп наркотизировали хлоралгидратом (400 мг/кг, в/б) и фиксировали в стереотаксисе. Затем, первой и второй групе животных в ПЯ имплантировали направляющие канюли для микродиализных зондов СМА12 с проницаемостью 20000 ДА (СМА Microdialisys, Швеция) по координатам АР +1,7 мм; L -2,6 мм; DV -8,2 мм [Paxinos G. And Watson С. 2004], под углом 10 градусов к сагиттальной плоскости, а третьей и четвертой группе - в дорзальный стриатум по координатам АР +0.5, L -3.0, DV б [Paxinos G.,Watson С., 2004] и крепили их к костям черепа. Через 48 часов после операции зонды помещали в направляющую канюлю и в течение двух часов производили перфузию искусственной цереброспинальной жидкостью со скоростью 2 мкл/мин (состав в mM: Na+150; К+ 3.0; Ca24 1.2, Mg2+ 0.8; Р04" 31.0; СГ 155; pH 7.4). В течение первых 60 минут собирались 3 базальных образца, затем первой и третьей группе животных вводили Дилепт (0,8 мг/кг, в/б), а второй и четвертой -физиологический раствор в эквивалентном объеме. После этого собирали еще 3 диализных пробы с интервалом 20 минут. Далее крыс декапитировали, головной мозг извлекали, замораживали в жидком азоте для приготовления срезов на микротоме [Microm HM 500, Walldorf, Germany]. Для статистической обработки использовали только образцы с подтвержденным расположением зондов в прилежащем ядре и дорзалышм стиатуме. Содержание ДА и его метаболитов, ДОФУК и ГВК, в диализатах определяли методом ВЭЖХ/ЭД [Кудрин B.C. и др., 1995] Уровень глугамата и ГАМК измеряли ВЭЖХ/ФД [Pearson et а!., 1991].

Статистическая обработка Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы STATISTICA 6.0 [StatSoft Inc.]. Достоверность различий оценивали по t-критерию Стыодента. Различия считались достоверными при р < 0,05. Данные представлены в % по отношению к контролю (М ± s.e.m.).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние Дилепта на содержание катехоламинов и их метаболитов в ткани прилежащего ядра н дорзального стриатума крыс Вистар при однократном введении Дилепта.

1.1 Влияние Дилепта па содержание ДА и его метаболитов в ткани прилежащего

ядра.

Обнаружено, что через 30 минут после введения Дилепта в дозе 0,8 мг/кг (в.б.) самцам крыс линии Вистар содержание основных метаболитов ДА - ДОФУК, ГВК составляло 126+5%, 125±3% соответственно по сравнению с группой, получавшей физиологический раствор (контроль). Комплексные показатели, характеризующие скорость утилизации ДА - ГВК/ДА и ДОФУК/ДА возрастали до 143+8% и 135+7% соответственно (Рис. 1).

ДА ДОФУК ГВК ДОФУК/ДА ГВЮДА

Рис. 1. Влияние Дилепта на содержание ДА и его метаболитов а прилежащем ядре крыс Вистар через 30 минут после введения препарата (в % к контролю). р < 0,05 по сравнению с контролем (1-критерий Стьюдента).

Через 60 минут после введения Дилепта в дозе 0,8 мг/кг величина показателя ДОФУК/ДА практически не изменилась по сравнению с результатом полученным через 30 минут (рис 1) и составила 127+4% по сравнению с контролем. Уровень ДА и его метаболитов через 60 минут после введения Дилепта не отличался от величин контроля.

Повышение через 30 минут после введения Дилепта соотношения ДА/ДОФУК -показателя, характеризующего, в основном, внутриклеточный оборот ДА, свидетельствует о возможной активации синтеза ДА и усилении его внутриклеточной утилизации. В исследованиях ОгишЬеПег А.О. и КесЬев А. [КесЬез А. е1 а)., 1983; ОгитЬеПег А.В. е( а]., 1990] сходное повышение значения ДОФУК/ДА был обнаружено и для нейротензина. Кроме того, авторами было установлено, что НТ также вызывал увеличение соотношения ГВК/ДА в ПЯ, показателя, определяющего, в основном, активность внеклеточного метаболизма ДА. Проведенные нами исследования показали, что через 30 минут после введения Дилепт вызывал повышение соотношения ГВК/ДА. Степень изменений скорости утилизации ДОФУК/ДА и ГВК/ДА после введения Дилепта в ПЯ соответствует величине изменений вызываемых в этой структуре нейротензином, а также атипичными антипсихотическими средствами [КесЬея А. е1 а!., 1983; БштЬеНег А.О. е( а1„ 1990].

1.2 Влияние Дилепта на содержание ДА и его метаболитов в ткани дорзапного стриатума.

Было показано, что через 30 минут после введения Дилепта (0,8 мг/кг в.б.) уровень ДА и его метаболитов не изменялся. Однако, через 60 минут после инъекции Дилепта содержание ДА, ГВК, ДОФУК составляло 127+4%, 119±3%, 133+5% соответственно по отношению к контролю (Рис. 2).

99

ДОФУК/ДА ГВК/ДА

Рис. 2. Влияние Дилепта на содержание ДА и его метаболитов в дорзачьном стриатуме крыс Вистар через 60 минут после вэеления препарата (в % к контролю).

*- р 5 0,05 по сравнению с контролем О-критерий Стьюдента). Светлый столбик-контроль, темный столбик - эффекты Дилепта.

Отсутствие влияния Дилепта на изменение оборота ДА может объясняться отсутствием или его слабым (ниже порога детекции метода ВЭЖХ) воздействием на пресинаптические рецепторы ДА стриатума. Известно, что экстрапирамидные расстройства, характерные для нейролептиков, проявляются при блокаде более 75% от общего числа Д2 рецепторов стриатума [АЫ-Ра^Ьат А., ег а1., 2002]. Типичные АПС увеличивают скорость метаболизма более, чем в 2 раза, тогда как АПС, такие, как сульпирид - не более чем на 25%-30% [Мирошниченко И.И. и др., 1988] .

Так как в наших исследованиях Дилепт не влиял на скорость утилизации ДА и не оказывал каталептогенного эффекта в ранее проведенных поведенческих экспериментах, [АвтакоУа Ь. а1., 1999] можно предполагать отсутствие у этого дипептида нежелательных эффектов на экстрапирамидную систему. Известно, что в опытах КесЬев А.,е1 а) [1983] была продемонстрирована способность НТ, а также АПС, в частности, сульпирида, изменять величину соотношений ДОФУК/ДА и ГВК/ДА и вызывать каталепсию [Бпцйеге Л. а1.,1982; Нопка\уа Н.Р. е1 а1., 1997]. Таким образом, в этом плане Дилепт отличается от НТ и антипсихотических препаратов.

Результаты наших исследований показывают, что Дилепт вызывает изменение метаболизма ДА только в прилежащем ядре и не влияет на этот показатель в дорзальном стриатуме.

2. Влияние Дилепта на синтез дофамина в условиях ГБЛ модели в прилежащем ядре и дорзальном стриатуме мозга крыс Вистар.

Повышение уровня ДОФА в условиях ГБЛ модели до детектируемого позволило оценить изменение синтеза дофамина после введения Дилепта. За 100% был принят уровень ДОФА, измеренный после введения физиологического раствора на фоне 3-ОБГ.

¡я

Р 160

2.1 Влияние Дилепта на синтез дофамина в прилежащем ядре условиях ГБЛ модели.

Совместное введение ГБЛ (750 ,мг/кг) и 3-ОБГ (100 мг/кг) приводило к увеличению содержания ДОФА до 324±20%. Введение Дилепта вызывало еще большее достоверное возрастание этого показателя до 405+41%, (Рис. 3), что свидетельствует об усилении синтеза ДА.

*

3-ОБГ 3-ОБГ 3-ОБГ

физ, р-р ГБЛ ГБЛ

фиэ, р-р физ. р-р Дилепт

Рис. 3, Влияние Дилепта (0,8 мг/кг, в/б) на содержание ДОФА в прилежащем ядре крыс Вистар в условиях модели прерывания импульсной активности нейронов, в присутствии ингибитора лекарбоксилазы ароматических аминокислот (3-ОБГ) (в % от контроля). * - р < 0,05 по сравнению с контролем (3-ОБГ). 'р < 0,05 по сравнению с группой ГБЛ +3-ОБГ.

Следует отметить, что ГБЛ модель создаёт условия для изучения способности веществ воздействовать на накопление ДОФА, устраняя, при этом, их влияние на высвобождение и метаболизм ДА, Показано, что в условиях ГБЛ модели агонисты ДА снижают уровень ДОФА, а антагонисты усиливают его накопление в стриатуме [УовМа Б-Т, е! а1., 2006]. Результаты данного эксперимента хорошо согласуются с полученными нами на первом этапе работы данными (исследование содержания ДА и его метаболитов в ткани ПЛ) (Рис. 1). На основе анализа результатов можно предположить, что одним из механизмов антипсихотикоподобного действия Дилепта является его способность усиливать синтез и ускорять метаболизм ДА.

2.2. Влияние Дилепта на синтез дофамина в дорзалъном стриатуме в условиях ГБЛ модели.

Введение ГБЛ (750 мг/кг) совместно с 3-ОБГ (100 мг/кг) приводило к увеличению содержания ДОФА до 340±22%. Введение Дилепта на фоне ГБЛ и 3-ОБГ приводило к еще большему достоверному возрастанию этого показателя до 409±20%, (Рис. 4), что свидетельствует об усилении синтеза ДА.

ш

450

*

250

350

150

50

3-ОБГ 3-ОБГ 3-06Г физ р-р ГБЛ ГБЛ

физ.р-р физ р-р Дилелт

Рис. 4 Влияние Дилепта (0,8 мг/кг, в/б) на содержание ДОФА в дорзальном стриатуме крыс Вистар в условиях модели прерывания импульсной активности нейронов, в присутствии ингибитора декарбокснлазы ароматических аминокислот (3-ОБГ) (в % от контроля). * - р < 0,05 по сравнению с контролем (3-ОБГ). ур < 0,05 по сравнению с группой ГБЛ +3-ОБГ.

Повышение уровня ДОФА в дорзальном стриатуме после введения Дилепта соответствует выраженности эффектов, наблюдаемых при исследовании атипичных нейролептиков и НТ [ИесЬе« А. е1 а1,, 1983; ОгитЬеИег А.Э. е1 а!., 1990] и незначительна по величине.

Повышение уровня ДОФА лишь на 25 % - как у атипичных АПС и НТ и отсутствие влияния на утилизацию ДА может свидетельствовать о слабом воздействии Дилепта на ауторецелторы дорзального стриатума. Совокупность полученных результатов исследования синтеза ДА (ГБЛ модель) и его метаболизма в ткани стриатума (Рис. 1), а также результатов проведенных ранее поведенческих тестов [Автакоуа Ъ. е! а!., 1999] свидетельствует об отсутствии у Дилепта выраженных эффектов на экстраиирамидную систему стриатума.

3. Изучение влияния Дилепта на внеклеточное содержание катехоламинов в прилежащем ядре и дорзальном стриатуме методом внутримозгового микродиализа.

3.1 Влияние однократного введения Дилепта на внеклеточное содержание ГВК в диализных образцах прилежащего ядра крыс.

Однократное введение Дилепта в дозе 0,8 мг/кг приводило к снижению содержания ГВК в межклеточном пространстве. Через 20 минут после введения препарата отмечалась тенденция к снижению концентрации нейротрансмиттера по сравнению с базальными уровнями, через 40 минут содержание нейротрансмиттера понизилось до 74±5% относительно базальных значений (Рис. 5).

-40 -20 0 20 40 60

Время (мин)

Рис. 5. Влияние Дилепта на внеклеточное содержание гомованилиновой кислоты в прилежашем ядре крыс Вистар (в % к базальному (исходному) уровню). Стрелкой показан момент введения Дилепта или 0,9% №С1.

# - 0,05 < р < 0,3, * - р < 0,05 по сравнению с контролем ^-критерий Стьюдента).

Проведенные микродиализные исследования продемонстрировали способность Дилепта снижать внеклеточный уровень ГВК, что, как мы полагаем, свидетельствует о снижении высвобождения ДА в межсинаптическую щель. Исследования, проведенные Тап§апе1Н 8. е( а1. [1994] показали, что НТ в низких концентрациях снижает высвобождение ДА в прилежащем ядре. Таким образом, можно полагать что Дилепт, по влиянию на высвобождение ДА, в прилежащем ядре дейтсвует подобно НТ.

3.2 Влияние Дшепта на содержание катехоламинов в дорзальном стриатуме.

Однократное введение Дилепта в дозе 0,8 мг/кг приводило к умеренному увеличению содержания ГВК в межклеточном пространстве в дорзальном стриатуме. Через 40 минут после введения препарата уровень ГВК составил 115±2% относительно базальных значений. В следущие 20 минут сохранялась тенденция к повышению содержания ГВК (Рис.б).

а. он -

О) —■—контроль—•—Дилепт 0,8 мг/кг

С!

8 40 ....................-.....-...........

-40 -20 0 20 40 60 80

Время (мин)

Рис. 6. Влияние Дилепта на внеклеточное содержание ГВК в дорзальном стриатуме крыс Вистар (в % к базальному (исходному) уровню). Стрелкой показан момент введения Дилепта или 0,9% Г>:аС1 # - 0,05 < р < 0,1, * - р < 0,05 по сравнению с контролем ^-критерий Стьюдента).

Повышение внеклеточного содержания метаболита ДА ГВК (Рис. 5), может свидетельствовать о вероятном усилении высвобождении ДА в межсинаптическую щель, Полученные результаты показывают, что Дилепт помимо усиления скорости метаболизма и синтеза ДА (Рис. 1, 3), оказывает влияние на его высвобождение в стриатуме.

4. Влияние Дилепта на содержание нейротрансмиттерных аминокислот глутамата и ГАМК в ткани прилежащего ядра и дорзального стриатума крыс Вистар.

4.1.Влияние Дилепта на содержание глутамата и ГАМК в ткани прилежащего ядра.

Было показано, что через 30 минут после введения Дилепта в дозе 0,8 мг/кг уровень глутамата в ПЯ составлял 114+3% по сравнению с контролем (Рис. 7). Изменений содержания ГАМК через 30 минут после введения Дилепта в прилежащем ядре обнаружено не было.

>. а

В Е

8 о

*

1

Рис. 7 Влияние Дилепта на содержание глутамата в прилежащем ядре крыс Вистар через 30 минут после введения препарата (в % к контролю). р < 0,05 по сравнению с контролем ([-критерий Стьюдента). Светлый столбик-контроль, темный столбик - эффекты Дилепта.

Через 60 минут после введения Дилепта в дозе 0,8 мг/кг уровень ГАМК составлял 118±2 % по сравнению с контролем (Рис. 8).

Я

140

5 § 120

100 -

* §

а

8 £

* § 80

* ё & 60

Рис. 8. Влияние Дилепта на содержание ГАМК в прилежащем ядре крыс Вистар через 60 минут после введения препарата (в % к контролю). * - р < 0,05 по сравнению с контролем (Ькритерий Стьюдента). Светлый столбик-контроль, темный столбик - эффекты Дилепта.

Изменений содержания глутамата в прилежащем ядре через 60 минут после введения Дилепта обнаружено не было.

Проведенные исследования продемонстрировали способность Дилепта вызывать увеличение содержания глутамата через 30 минут после введения препарата. Повышение уровня ГАМК наблюдалось в более позднем временном интервале (через 60 минут) по сравнению с глутаматом. Полагают, что активация ГАМК-ергических нейронов прилежащего ядра является эффектом, характерным для всех антипсихотических препаратов. Подобный механизм приводит к восстановлению глутаматергической активности в вентральных таламо-кортикальных проекциях, нарушенных у больных шизофренией (Carlsson A. et а!.. 1999; O'Connor W.T., 2001). Таким образом, можно полагать, что механизмы действия Дилепга аналогичен эффектам АПС в ПЯ обладают сходством.

4.2 Влияние Дилепта на содержание глутамата и ГАМК в ткани дорзалыюго стриатума.

Через 60 минут после введения Дилепта в дозе 0,8 мг/кг содержание глутамата возрастало до 122±4% по сравнению с контролем (Рис. 9).

140

Рис, 9. Влияние Дилепта на содержание глутамата в дорзальном стриатуме крыс Вистар через 60 минут после введения препарата (в % к контролю).

* - р 5 0,05 по сравнению с контролем (¡-критерий Стьюдента). Светлый столбик-контроль, темный столбик - эффекты Дилепта.

Через 30 минут после введения препарата изменений в содержании нейротрансмиттерных аминокислот обнаружено не было.

Известно в дорзальном стриатуме глутамат высвобождается из окончаний глутаматергических нейронов коры или таламуса [Sirinathsinghjiand Н., 1989; Parent and Hazrati, 1995]. Нельзя исключить, что повышение уровня глутамата в ткани является следствием активирующего влияния Дилепта на ауторецепторы, находящиеся на терминалях глутаматергических синапсов.

5. Влияние Дилепта на внеклеточное содержание катехоламинов и нейрогрансмиггерных аминокислот в прилежащем ядре и дорзальном стриатуме.

5.1 Микродиализное изучение влияния однократного введения Дтепта на внеклеточное содержание пейротрансмиттерных аминокислот глутамата и ГАМК в прилежащем ядре крыс.

Через 20 минут после введения Дилепта наблюдалось повышение содержания глутамата до 115±3%, после чего его уровень в течение последующих 20 минут снижался до исходных значений (Рис 10).

120

а га 110

га г«

2 га I 100

н

£ а> 3 60

X I н О во

ш 70

ч

8

60

—»—контроль —•—Дилепт 0,8 мг/кг

•40 -20 0 20 40 60

Время (мин)

Рис. 10. Влияние Дилепта на внеклеточное содержание глутамата в прилежащем ядре крыс Вистар (в % к базальному («сходному) уровню). Стрелкой показан момент введения Дилепта или 0,9% КаС1. * - р < 0,5 по сравнению с контролем ((-критерий Стьюдента).

Повышение содержания глутамата, обнаруженное в наших исследованиях, подтверждается увеличением уровня этой аминокислоты в ткани ПЯ. Кроме того, результаты наших нейрохимических исследований согласуются с данными поведенческих экспериментов, проведенных ранее, в которых также были показаны глутаматпозитивные эффекты Дилепта (Ретюнская и соавт. 2001, Островская и соавт. 2009). Повышение уровня глутамата в ПЯ характерно для НТ и антипсихотических препаратов [Бегаго е1 а1, 2007]. При изучении содержания ГАМК в ПЯ было показано, что через 20 минут после введения Дилепта наблюдалось достоверное повышение содержания этой аминокислоты до 131+6% относительно базальных значений. Через 40 минут уровень ГАМК достигал максимума и составлял 134±7%. Через 60 минут сохранялась ещё тенденция к повышению концентрации этой аминокислоты (Рис 12).

Рис. 11. Влияние Дилепта иа внеклеточное содержание ГАМК в прилежащем ядре крыс Вистар (в % к базалъному (исходному) уровню). Стрелкой показам момент введения Дилепта или 0,9% N30. 0,1 й # £ 0,05, 0,05 < р <0,1, -**р<0,01 по сравнению с контролем (1-критерий Стьюдента).

Результаты исследования концентрации ГАМК в ткани через 60 минут после введения препарата (Рис. 7) хорошо согласуются с полученными результатами микродиализных исследований (Рис. 11) в этой структуре. Таким образом, можно полагать, что Дилепт в ПЯ вызывает усиление синтеза и высвобождения ГАМК.

5.2 Микродиализное изучение влияния Дилепта на внеклеточное содержание нейротрансмиттерных аминокислот глутамата и ГАМК в дорзальном стриатуме крыс.

Через 40 минут после введения Дилепта наблюдалось повышение содержания глутамата на 137±10%, в течение следующих 20 минут уровень глутамата снижался до исходных значений (Рис. 12).

Рис. 12. Влияние Дилепта на внеклеточное содержание глутамата в прилежащем ядре крыс Вистар (в % к базальному (исходному) уровню). Стрелкой показан момент введения Дилепта или 0,9% №С1. * - р < 0.05 по сравнению с контролем (^критерий Стьюдента).

Изменений внеклеточного содержания ГАМК в дорзальном стриатуме после введения Дилепта обнаружено не было.

Значительное повышение уровня глутамата в неостриатуме может свидетельствовать о выраженных эффектах Дилепта на глутаматертическую систему (Рис. 10). Исследования проведенные Antonelli Т. et al. (Antonelli Т. et al 2006), выявили аналогичное повышение внеклеточного содержания глутамата в дорзальном стриатуме под действием нейротензина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

До недавнего времени основное внимание при исследовании механизмов действия НТ и его аналогов было направлено на изучение их эффектов на дофаминергическую систему мозга. Однако, исследованиями последних лет было показано, что НТ играет важную роль в регуляции баланса нейротрансмиттерпых аминокислот, которые, в свою очередь, оказывают воздействие на ДА-ергическую систему. Эти представления, а также данные о роли прилежащего ядра как системы - ретранслятора между лимбической и префронталыюй областью определили цель настоящего исследования. В результате выполненных экспериментов показано, что Дилепт ускоряет метаболизм ДА в прилежащем ядре на 30-40%. Известно, что типичные нейролептики, например галоперидол, увеличивают оборот ДА в прилежащем ядре (более чем вдвое), тогда как атипичные нейролептики, такие как, сульпирид, повышают этот показатель только на 25-35 % [Imazu Y., 1989]. Эффект, характерный для атипичных нейролептиков, также описан и для эндогенного нейролептика нейротензина [Drumheller A.D. et al., 1990]. Таким образом, можно сделать вывод, что Дилепт увеличивает метаболизм ДА, в степени, характерной для эффектов атипичньд антипсихотиков и НТ.

Известно, что введение ГБЛ в сочетании с ингибитором ароматических кислот вызывает повышение содержания ДОФА в прилежащем ядре [Walters J.R. and Roth R.H., 1976]. В наших экспериментах показано, что Дилепт на фоне введения ГБЛ вызывает дополнительное возрастание этого показателя, что свидетельствует об усилении синтеза ДА.

Компенсаторное усиление синтеза ДА в ДА-ергическом нейроне по принципу обратной связи рассматривается как ответ на блокаду гетерорецепторов на пресинаптической терминали ДА нейрона. Такое изменение ведет, в свою очередь, к активации метаболизма ДА. Следует отметить, что ГБЛ модель создаёт условия для изучения способности веществ воздействовать на накопление ДОФА, исключая их влияние на высвобождение и метаболизм ДА. Показано, что в условиях ГБЛ модели агонисты ДА снижают уровень ДОФА, а антагонисты, как и НТ усиливают его накопление в прилежащем ядре [Reches А., 1982]. Исследования, проведенные Drumheller A.D. [1990] показали, что НТ повышает величину соотношения ДОФУК/ДА и ГВК/ДА в прилежащем ядре. На основе полученных результатов можно предположить, что одним из механизмов нейролептикоподобного действия Дилепта

является его способность усиливать синтез и ускорять метаболизм ДА в ПЯ. Нельзя исключить, что способность Дилепта увеличивать синтез ДА связана с его антагонистическим влиянием на пресинаптические Д2 рецепторы, следствием чего является повышение активности тирозингидроксилазы.

В целом, полученные нами данные о способности Дилепта повышать содержание ДА и его метаболитов в ткани прилежащего ядра и увеличивать синтез ДА в условиях ГБЛ модели, указывает в пользу сходства нейрохимических механизмов действия этого дипептида и НТ.

Дилепт вызывал достоверное увеличение внеклеточной концентрации глутамата и ГАМК. Как следует из концепции, предложенной Ферраро (Ferraro L.) и др. [2007], в прилежащем ядре существует рецепторный комплекс, состоящий из рецепторов нейротензина подтипа 1 (НТР1) и рецепторов дофамина Д2. Этот комплекс располагается преимущественно на окончаниях аксонов глутаматергических нейронов, идущих из коры в ПЯ. Нейротензин, воздействуя на НТР1-Д2 комплекс, уменьшает аффинность Д2 рецепторов к ДА на глутаматергических терминалях, что приводит к повышению высвобождения глутамата и ГАМК. Можно предположить, что обнаруженное в наших исследованиях повышение высвобождения глутамата и ГАМК при введении Дилепта осуществляется за счет подобного механизма. Усиление тормозного сигнала ГАМК-ергических нейронов через коллатераль приводит к активации рецепторов ГАМКд типа, находящихся на окончаниях дофаминергических нейронов мезолимбического пути и к последующему снижению высвобождения ДА. Обнаруженное нами уменьшение экстраклеточного уровня ГВК в прилежащем ядре, вызванное Дилептом, как мы полагаем - результат сниженного высвобождения ДА в межсинаптическую щель в этой структуре. Подобный эффект, вероятно, возникает вследствие повышения высвобождения ГАМК в прилежащем ядре после введения Дилепта.

Гипофункция NMDA рецепторов и снижение скорости синтеза ГАМК рассматривается в настоящее время как важная причина когнитивного дефицита при шизофрении [Javitt D.C., 2007, Grayson D.R. et al., 2009]. Способность Дилепта повышать внеклеточное содержание глутамата и ГАМК в прилежащем ядре согласуется с выявленным ранее положительным влиянием этого дипетида на когнитивные функции [Островская и соавт, 2005].

Наши исследования показали отсутствие выраженного влияния Дилепта на ДА систему дорзального стриатума, что полностью соответствует данным поведенческих

исследований о сохранении контроля моторных функций даже при введении высоких доз Дилепта.

В целом, обнаруженные нами эффекты Дилепта в прилежащем ядре сходны с действием исходного тридекапептида НТ при его прямом введении в эту структуру. Дилепт может рассматриваться в качестве системно активного дипептидного миметика нейротензина, способного устранять нейрорегуляторный дисбаланс в глутамаг-, ГАМК- и ДА- ергических системах прилежащего ядра. Представленные данные нейрохимического анализа Дилепта в сочетании с его поведенческими характеристиками позволяют охарактеризовать его как потенциальный антипсихотик, эффективный в отношении позитивных, негативных и когнитивных нарушений и не вызывающий экстрапирамидной симптоматики.

ВЫВОДЫ

1. Дилепт при системном введении имеет нейрохимический спектр действия, характерный для атипичных антипсихотиков - вызывает увеличение содержания основных метаболитов ДА и повышает скорость метаболизма ДА в прилежащем ядре. Эффект сходен с действием нейротензина при введении в желудочки мозга.

2. Повышение уровня ДОФА в прилежащем ядре и дорзальном стриатуме на модели прерывания импульсной активности нейронов свидетельствует об усилении Дилептом синтеза ДА вследствие активации тирозингидроксилазы. Подобный эффект характерен для действия нейротензина и атипичных нейролептиков.

3. Дилепта повышает уровень глутамата и ГАМК в ткани прилежащего ядра, а также внеклеточное содержание данных аминокислот в этой структуре, что может являться нейрохимическим механизмом положительного когнитотропного эффекта препарата.

4. Дилепт повышает базальный уровень ДА и его основных метаболитов в дорзальном стриатуме, не изменяя при этом скорости утилизации ДА, что свидетельствует об отсутствии выраженного влияния на экстрапирамидную систему.

5. Дилепт оказывает более выраженное влияние на медиаторные системы прилежащего ядра, выполняющего роль переключателя сигналов между мезолимбической и кортикальной системами, чем на систему дорзального стриатума, участвующего в регуляции моторного контроля.

6. Дилепт воспроизводит эффекты нейротензина в отношении нейромедиаторных систем прилежащего ядра. Выявленный нейрохимический спектр действия в совокупности с данными поведенческих исследований позволяет рассматривать этот дипептид как потенциальный антипсихотик, эффективный в отношении позитивных, негативных и когнитивных нарушений и не вызывающий экстрапирамидной симптоматики.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шубенина, Е.В. Сравнительное изучение содержания возбуждающих и тормозных нейротрансмиттерных аминокислот в структурах мозга мышей С57В1/6 , BALB/C и DBA/2J [Текст] / Е.В. Шубенина, В.Б. Наркевич, П.М. Клодт, B.C. Кудрин, Р.У. Островская / Материалы III Съезда фармакологов России «Фармакология практическому здравоохранению», С,- Пб., 23-27 сентября 2007 г. // Психофармакология и биологическая наркология. - 2007. - Т. 7 (спец. выпуск); ч. 2. - С. 2019.

2. Шубешша, Е.В. Линейные различия в содержании возбуждающих и тормозных нейромедиаторных аминокислот в структурах мозга мышей линий DBA/2J, BALB/C и С57Ы/6- особенности действия дипептидного антипсихотического средства Дилепта [Текст] / Е.В. Шубенина, В.С.Кудрин, П.М.Клодт, А.А.Покровский, Т.А.Гудашева, Т.А.Воронина, Р.У. Островская II Экспериментальная и клиническая фармакология. -2008.-Т. 71,№4.-С. 7-10.

3. Кудрин, B.C. Содержание моноаминов и их метаболитов в структурах мозга мышей линий C57BI/6, BALB/C и DBA/2J: сравнительное изучение [Текст] / B.C. Кудрин Е.В. Шубенина, А.А Покровский, В.Б. Наркевич, П.М. Клодт, Р.У. Островская // Конференция с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга». С,- Пб., сентябрь 2008 г. - С.-Пб., 2008. - С. 77- 78

4. Шубенина, Е.В. Влияние нового дипептидного аналога нейротензина Дилепта на нейрохимический профиль мозга мышей линии DBA/2J [Текст] / Е.В. Шубенина, B.C. Кудрин, П.М., Клодт, В.Б. Наркевич, Р.У.Островская // «V Международный Междисциплинарный Конгресс «Нейронаука для медицины и психологии», Судак, Украина, 3-13 июня 2009 г. - Киев: Макс Пресс, 2009. - С. 248-249.

5. Шубенина, Е.В. Влияние дипептидного аналога нейротензина Дилепта на высвобождение моноаминов и нейротрансмиттерных аминокислот в прилежащем ядре [Текст] / Е.В. Шубенина, B.C. Кудрин, П.М. Клодт, Р.У. Островская / Материалы конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», 1-4 июня 2010 г. // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2010. - Приложение. - С. 96.

6. Кудрин, B.C., Дипептидный аналог нейротензина увеличивает синтез дофамина в дорзальном стриатуме и прилежащем ядре в условиях модели прерывания импульсной активности нейронов [Текст] / B.C. Кудрин, Е.В.Шубенина, П.М.Клодт,

В.Б.Наркевич, Р.У.Оетровская / Материалы конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», 1-4 июня 2010 г. // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2010. - Приложение. - С. 55.

7. Шубенина, Е.В. Влияние дипептидного аналога нейротензина дилепта на внеклеточное содержание глутамата, ГАМК и гомованилиновой кислоты в прилежащем ядре мозга крыс [Текст] / Е. В. Шубенина, B.C. Кудрин, П.М. Клодт, В.Б. Наркевич, Т.А. Гудашева, Р.У. Островская // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2010. - Т. 73, № 12. - С. 9-12.

8. Шубешша, Е.В. Влияние дипептидного аналога нейротензина Дилепта на метаболизм и синтез дофамина в прилежащем ядре мозга крыс Вистар [Текст] / Е.В. Шубенина, B.C. Кудрин, П.М. Клодт, В.Б.Наркевич, Е.А. Кузнецова, Т.А.Гудашева, Р.У.Островская // БЭБиМ. [В печати]

9. Шубенина, Е.В. Выявление роли дофаминергических систем прилежащего ядра в механизме действия дипептидного аналога нейротензина Дилепта [Текст] / Е.В. Шубенина, Р.У.Островская, В.С.Кудрин, П.М. Клодт, В.Б. Наркевич, Е.А. Кузнецова, Т.А. Гудашева // Казанский медицинский журнал [В печати]

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АПС-антипсихотические средства

ВЭЖХ/ФД - высокоэффективная жидкостная хроматография с флуоресцентной Детекцией

ВЭЖХ/ЭД - высокоэффективная жидкостная хроматография с электрохимической детекцией

ГАМК - у-аминомасляная кислота

ГВК - гомованилиновая кислота

ДА - дофамин

ДОФА-диоксифенилаланин

ДОФУК - 3,4-диоксифенилуксусная кислота

НТ-нейротензин

НТР-рецептор нейротензина

ПЯ-прилежащее ядро

З-ОБГ-З-оксибензилгидразин

Подписано в печать 03.03.2011 г.

Заказ № 154 Типография ООО "Медлайн-С" 125315, г. Москва, Ленинградский пр-т, д.78, к.5 Тел. (499)152-00-16 Тираж 100 шт.

Актуальность исследования.

Шизофрения^ - тяжелое психическое заболевание, распространенность которого; согласно различным статистическим данным, составляет от 0,5% до 1%. Раннее наступление болезни; ее прогрессирующий и.часто.необратимый характер, ведущий не только.к ухудшению качества жизни; но и к полной^ дезадаптации- больных в обществе, определяют высокую медико-социальную* значимость этого заболевания. (Тиганов А.С., 1999). Проблема лечения шизофрении1 является одной из важнейших задач современной медицины

Наряду с проявлениями негативной и позитивной, симптоматики, наблюдаемой при этом заболевании, когнитивный дефицит рассматривается в качестве важного самостоятельного или даже ведущего расстройства, в значительной, степени определяющего социальный и терапевтический прогноз заболевания (Sharma Н. and Harvey P.D., 2000; Мосрлов С.Н. и др., 2000; Hagan J.J. et al, 2005; Young J.W. 2009). Используемые в клинической практике классические нейролептики эффективны* преимущественно в отношении продуктивных симптомов' заболевания, в то же время, их применение приводит к развитию экстрапирамидных неврологических нарушений, к усугублению когнитивной недостаточности, а. также к развитию^ гиперпролактинемии (Márchese G. and Pañi L., 2002; Mauri M.C. et al., 2007; Emsley R., 2009). Подобные нарушения связаны прежде всего с. блокадой рецепторов дофамина (ДА) второго типа (Д2) в нигростриарном и тубероинфундибулярном путях (Janno S. et al., 2004; Montejo A.L., 2008). Следствием пролактинемии может быть развитие диабета, гиперлипидемии, увеличение веса, нарушение минерального обмена костной ткани, а также сексуальные расстройства (Меапеу А.М.,. et al., 2004).

Большинство атипичных нейролептиков оказывает менее выраженное влияние на уровень пролактина по сравнению с типичными антипсихотическими средствами (АПС) (Grant S. and Fitton A., 1994). Терапия атипичными нейролептиками, характеризуется меньшей выраженностью экстрапирамидных нарушений, но не всегда сопровождается достаточным антипсихотическим эффектом. Кроме того, у атипичных АПС отмечаются собственные побочные эффекты, к которым относится седативное действие, агранулоцитоз, изменения обмена глюкозы и липидов, антихол'инергические побочные эффекты, а также гипотензия и миокардиты (Montejo A.L., 2008). Атипичные нейролептики недостаточно эффективны в отношении когнитивных нарушений, наблюдаемых при шизофрении (Harvey P.D. and Keefe R.S., 2001). Важно подчеркнуть, что 25-30% пациентов, впервые заболевших шизофренией, полностью резистентны ко всем существующим антипсихотикам.

Указанные факты определяют актуальность разработки новых стратегий создания высокоэффективных нейролептиков, лишенных побочных эффектов и имеющих принципиально иной механизм действия. Установлено, что, помимо нарушения функционирования ДА-ергических систем мозга, при шизофрении происходит изменение баланса других нейромедиаторов, к числу которых относятся глутамат, ГАМК, ацетилхолин, серотонин, а также ряд нейропептидов (O'Connor W.T., 2001; Kinkead В. and Nemeroff C.B., 2004; Cherlyn S.Y., et al., 2010). Выявление полимодального модулирующего влияния нейропептидов на изменения нейрохимического баланса мозга открывает перспективы для их использования в качестве потенциальных лекарственных средств. К нейропептидам с потенциальной антипсихотической активностью относится нейротензин (HT), роль которого в патогенезе шизофрении не вызывает сомнений (Kinkead В. and Nemeroff C.B., 2002; Câceda R., et al., 2006). Способность HT препятствовать развитию эффектов дофаминомиметиков, угнетать условные рефлексы, потенцировать, эффекты барбитуратов, вызывать гипотермию позволили сформулировать гипотезу о роли HT как эндогенного нейролептика (Nemeroff C.B. 1992). Олигопептидная структура HT, обуславливающая его низкую биодоступность для мозга, является причиной того, что эффекты HT воспроизводятся только при введении этого тридекапептида в желудочки мозга или при подведении к его структурам (Boules M. et al., 2006). Это исключает возможность клинического применения HT в качестве антипсихотического средства. Разработка миметиков нейротензина - гексапептидов, эффективных при системном введении, ведется на основе модифицирования главного метаболита HT (HT) 8.13 (Kinkead В. and Nemeroff C.B., 2006).

Оригинальный подход к поиску высокоактивных пептидных препаратов, развиваемый в НИИ фармакологии^ имени В В. Закусова РАМН, состоит в создании замещенных дипептидов, имитирующих структуру активного центра эндогенного пептида и непептидного лекарственного препарата с соответствующей активностью. За основу моделирования активных НТ-подобных нейролептиков был взят дипептид пролил-тирозин в связи с тем, что эта последовательность соответствует центральному фрагменту Р - изгиба HT8i3, и имеет топологическое сходство с атипичным нейролептиком сульпиридом (Gudasheva T.A. et al., 1998). Из серии N-ацил-пролил-тирозинов для более подробного изучения был отобран К-капроил-Ь-пролил-Ь-тирозина метиловый эфир (Дилепт), продемонстрировавший нейролептикоподобную активность по стандартным показателям антипсихотического действия (Середенин С.Б., и др., Патент РФ №2091390). Дилепт устраняет поведенческие эффекты дофаминомиметиков, вызывает гипотермию и потенцирует действие барбитуратов (Гузеватых JI.C. и др., 2002). Анализ эффектов Дилепта на моделях амнезии и дефицита препульсового торможения, вызванных блокатором NMDA — рецепторов (Островская Р.У. и др., 2009) позволил сделать заключение о глутаматпозитивном действии этого препарата.

Исследования влияния Дилепта на^ поведение животных показало сходство этого системно активного дипептида с известными? для исходного пептида нейротензина в условиях его подведения- к структурам мозга. Наряду с достаточно углубленным изучением поведенческих эффектов Дилепта, нейрохимические механизмы действия? этого дипептида недостаточно изучены. Одним из информативных подходов к выяснению нейрохимических механизмов действия Дилепта может явиться^ изучение его влияния на нейротрансмиттерные системы прилежащего ядра и дорзального стриатума.

В основе реализации многих поведенческих эффектов антипсихотических препаратов и нейротензина лежит воздействие в области нигростриарной и мезолимбической систем. Прилежащее ядро и дорзальноый стриатум, входящие в состав базальных ганглиев, являются; важнейшими частями указанных система мозга. Механизм действия многих антипсихотиков в; нигростриатной и мезолимбической петлях связан как с изменением активности системы ДА, так и с влиянием на системы глутамата и ГАМК в прилежащем ядре и дорзальном; стриатуме (FerraroL., et al., 2007). Прилежащее ядро выполняет функцию ретранслятора между лимбической и префронтальной областью; эта система осуществляет координацию когнитивных, эмоциональных и мотивационных процессов (Smith Y., 2005). Показано что НТ при введении в прилежащее ядро проявляет антипсихотоподобные эффекты (Binder Е.В. et al, 2001) и что регуляция нейротензином ДА передачи в этом образовании осуществляется через системы глутамата и ГАМК (Ferrara L., et al. 2007).

В свете вышеизложенного, целью исследования являлось изучение влияния^ аналога нейротензина Дилепта на нейрохимические параметры глутамат-, ГАМК- и ДА- ергических систем, прилежащего; ядра и дорзального стриатума.

В свете вышеизложенного, целью; настоящей работы являлось изучение влияния аналога; нейротензина Дилепта на нейрохимические параметры глутамат-, ГАМК- и ДА- ергических систем прилежащего ядра и дорзального стриатума.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи::

1. Изучить влияние Дилепта5 на содержание катехоламинов и их метаболитов в ткани прилежащего ядра и дорзального стриатума крыс Вистар

2. Оценить влияние Дилепта на синтез дофамина в прилежащем ядре и; дорзальном стриатуме крыс Вистар в условиях модели прерывания импульсной активности нейронов

3. Исследовать с помощью- метода микродиализа влияние Дилепта на внеклеточное содержание катехоламинов; в: прилежащем ядре и дорзальном стриатуме крыс Вистар

4. Провести исследование: воздействия Дилепта на содержание нейротрансмиттерных аминокислот в ткани прилежащего ядра и? дорзального стриатума крыс Вистар

5. Исследовать с помощью метода микродиализа воздействие. Дилепта на внеклеточное содержание нейротрансмиттерных аминокислот в прилежащем ядре и дорзальном стриатуме крыс Вистар

Научная новизна.

В работе впервые изучены эффекты Дилепта на; аминоацидергические и моноаминергические системы прилежащего ядра и дорзального стриатума: Впервые с помощью метода внутримозгового микродиализа исследовано влияние Дилепта на внеклеточное содержание нейротрансмиттерных аминокислот и метаболитов ДА. Впервые установлены эффекты Дилепта, реализуемые через пресинаптические рецепторы^ ДА на ДА нейроне в - прилежащем? ядре и дорзальном стриатуме:, Изучено; влияние Дилепта на синтез? и утилизацию>дофамина;,проанализированащзаимосвязБ этих процессов на внутри- и внеклеточном^ уровне. Впервые: показано;, что эффекты Дилепта«; в прилежащем ядре сходны с действием: ненротензина при-введении последнего в эту структуру мозга.

Теоретическая и практическая значимость.

Выявленный* нейрохимический» спектр действия Дилепта;; сочетающий увеличение скорости синтеза ш метаболизма? ДА в; прилежащем ядре со способностью повышать активность, системы? глутамата и ГАМК в этом образовании, полностью, соответствует результатам поведенческих экспериментов; выявившим у Дилепта-сочетание антипсихотических свойств» с положительным« когнитотропным эффектом. Данные об отсутствии выраженных изменений^ этих показателей/ в? дорзальным стриатуме. согласуются с: отсутствием экстрапирамидных расстройств при введении; Дилепта: Полученные; результаты расширяют представление; о механизме действия. Дилепта^ и; обосновывают дальнейшее изучение этого дипептида в качестве; потенциального^ антипсихотика; не вызывающего экстрапирамидных побочных эффектов.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Психопатологические особенности симптомокомплекса при шизофрении.

Шизофрения - эндогенное: психическое заболевание, характеризующееся дисгармоничностью и утратой единства психических функций, длительным непрерывным или приступообразным течением и разной выраженностью позитивных (продуктивных) и негативных расстройств, приводящих к изменениям личности (Тиганов A.C. ,1999) Распространенность шизофрении, согласно различным статистическим данным, составляет от 0,5% до 1%. Раннее наступление болезни, ее прогрессирующий и часто необратимый характер, определяющий не только ухудшение качества жизни, но и полную дезадаптацию больных в обществе, определяют высокую медико-социальную значимость этого заболевания.

Отдельные симптоматические картины, характерные для этого заболевания, описывались различными авторами. Немецкий психиатр Kahlbaum (1828-1899) описал симптомы кататонии, другой немецкий психиатр Hecker (1843-1909) ввел понятие гебефрении. Однако, появлением шизофрении как нозологической единицы психиатрия обязана немецкому психиатру Kraepelin (1856-1926), который объединил ряд рассматривавшихся ранее отдельно психических расстройств термином "раннее слабоумие" (dementia praecox) и выделил основные подтипы заболевания (Александровский Ю.А. 1999).

До недавнего времени было принято представление о наличии при шизофрении позитивных (бред, галлюцинации, аффективные состояния) t и негативных (снижение яркости переживаемых эмоций и эмоциональных реакций, бедность речи (алогия), неспособность получать удовольствие (ангедония), потеря мотивации) расстройств. С точки зрения A.B. Снежневского (1985), каждый синдром, независимо от уровня поражения психики, представляет собой единство позитивных и негативных симптомов. Эта концепция восходит своими корнями к представлениям английского невролога J.H Jackson (1835-1911), считавшего, что патологический процесс поражает филогенетически более поздние корковые структуры мозга (дифференцированные уровни), приводя к выпадению высших корковых функций, что в клинике проявляется в виде негативных или «минус-симптомов». Нарушение контроля со стороны коры вызывает расторможение низших подкорковых структур (примитивных уровней), вызывая появление новых патологических форм реагирования, проявляющихся в виде психотических, аффективных или моторных расстройств (позитивные или «плюс-симптомы»). Согласно современным представлениям о высшей нервной деятельности как о многозвенной структуре психических функций, при патологии мозга происходит не выпадение (уменьшение) или усиление, а изменение протекания психических функций, что может приводить как к ухудшению и даже выпадению некоторых из них (негативные симптомы), так и к появлению таких эффектов (галлюцинации, бред), которые у здоровых людей в аналогичных условиях не возникают (позитивные симптомы) (Мосолов С.Н. 2000). На основе различий между позитивной и негативной симптоматикой английский ученый T.J. Crow сформулировал так называемую бисиндромальную, или дихотомическую гипотезу о существовании различных молекулярных механизмов, лежащих в основе «негативной» и «позитивной» шизофрении (Crow T.J., 1985). Crow предположил существование двух независимых патологических процессов: с доминированием и прогрессированием негативной симптоматики и с преобладанием позитивных расстройств. Эта гипотеза основывалась на ряде фактов. Во-первых, при негативной симптоматике, часто обнаруживаются расширение желудочков мозга, признаки церебральной атрофии, преимущественно в лобных корковых областях, а также потеря нейронов и уменьшение их функциональной активности; при этом наблюдается корреляция негативных расстройств с когнитивными нарушениями. Во-вторых, негативные расстройства не устранялись при терапии типичными ДА-блокирующими нейролептиками. В-третьих, в постмортальных исследованиях повышение плотности Дг рецепторов положительно коррелировало с преобладанием позитивных, но не негативных, симптомов. Это, по мнению Crow, свидетельствовало о наличии, по крайней мере, двух патогенетических механизмов — нейрохимического, объясняющего-эффект дофаминблокирующей терапии на позитивную симптоматику, и структурного (нейроморфологического), объясняющего развитие дефицитарных расстройств. При этом у каждого конкретного больного эти синдромы могут сосуществовать, но стереотип их развития различен.

На основании обнаруженной T.Crow тесной корреляции негативных расстройств с более грубыми когнитивными нарушениями, отражающими . явления недостаточности лобных структур (гипофронтальности), в дальнейшем была сформулирована новая клинико-нейропсихологическая парадигма шизофрении, в которой нейрокогнитивный дефицит определяется как недостаточность познавательных функций, развивающаяся в рамках негативного симптомокомплекса.

В последние годы все большее распространение получает трехфакторная модель шизофрении, согласно которой нейрокогнитивный дефицит (нарушения внимания, памяти, скорости переработки информации и исполнительских функций, способность к планированию и осуществлению целенаправленных действий) является важным самостоятельным расстройством, в значительной степени определяющим прогноз заболевания и влияющим на формирование другой психопатологической симптоматики (Sharma Т., Harvey Ph., 2000; Мосолов С.Н., 2001; Floresco et al., 2005).

Важно отметить, что когнитивные расстройства нередко прогрессируют по мере развития заболевания, а, кроме того, плохо поддаются лечению существующими в настоящее время антипсихотическими препаратами. Исследования показали что, типичные нейролептики не только не улучшают, но даже ухудшают когнитивные расстройства, а атипичные препараты "золотого стандарта" такие, как клозапии и оланзепии не являются достаточно эффективными (Harvey and Keefe, 2001; Remillard et al., 2005). Указанные недостатки известных нейролептиков определяют продолжающиеся поиски эффективных препаратов, лишенных побочных эффектов. К нарушениям когнитивной деятельности относят: нарушение ориентации во времени и месте; нарушение памяти (количество запоминаемых объектов, запоминания цифр, недавних событий); нарушение концентрации внимания; интерпретация абстрактных речевых конструкций (например, интерпретация поговорок, пословиц); обнаружение общих признаков в различных предметах; затруднения в решении элементарных математических задач (счет, сложение и вычитание цифр и т.п.). В 2003 году National Institute of Mental Health (USA) начал реализацию программы MATRICS (Measurement And Treatment Research to Improve Cognition in Schizophrenia), которая включает в себя применение стандартных тестов, позволяющих расширить понимание ряда когнитивных нарушений, наблюдаемых при шизофрении и направленных на создание препаратов улучшающих когнитивные способности, нарушенные при этом заболевании. Основное направление этих исследований — это оценка семи показателей когнитивных нарушений: скорость обработки информации, внимание, рабочая память, вербальное обучение и память, способность рассуждать и решать проблемы, вербальное апперцептивное познание, социальная когнитивная деятельность.

Наличие когнитивного дефицита и присутствие некоторых нейроанатомических гистологических и нейрохимических изменений свидетельствуют о важной роли нарушения активности в префронтальной коре, патология в которой может иметь отношение как к когнитивным расстройствам, так и к регуляции контроля других областей коры и подкорковых структур (Miller E.K. and Cohen J.D., 2001). С другой стороны, изменения сигналов, поступающих в префронтальные зоны коры из системы базальных ганглиев также могут приводить к нарушению функционирования префронтальной коры и проявлению когнитивных нарушений, "а также изменениям в эмоциональной сфере (Smith Y., 2005) (рис 1).

Рис. 1 Петля базальных ганглиев, вовлеченная в контроль когнитивных и аффективных процессов (по Buschmann et а1., 2007).

DL PFC - дорзолатеральная префронтальная кора, OFC-обонятельные бугорки, АСС-прилежащее ядро,УЬ- Thal -вентролатеральный таламус, MD - Thal-медиальный таламус, GPi- внутренняя часть бледного шара, GPe- наружная часть бледного шара, SNr-черная субстанция, STN-субталамическое ядро, VP-вентральный паллидум, VTA-вентральная тегментальная область.

Известно, что в начале заболевания наряду с нечеткими когнитивными изменениями, такими как нарушения памяти, концентрации внимания, умственной работоспособности, нередко обнаруживаются также отклонения в поведении пациентов, такие, как моторная гиперактивность и импульсивность (Lencz Т., et al., 2004).

Двигательные расстройства могут быть постоянным признаком первого эпизода шизофрении без предшествующего использования нейролептиков (Srinivasan T.N., et al., 2001; Gottesman I.I. and Gould T.D., 2003; Honer W.G., et al., 2005). Существование дискинезии и паркинсонизма при шизофрении до лечения, нейролептиками было обнаружено у 13 - 28% больных (Córtese et al., 2005; McCreadie RG et al., 2003).

6. выводы

1. Дилепт при системном введении имеет нейрохимический спектр действия, характерный для атипичных антипсихотиков - вызывает увеличение содержания основных метаболитов ДА и повышает скорость метаболизма ДА в прилежащем ядре. Эффект сходен с действием нейротензина при введении в желудочки мозга.

2. Повышение уровня ДОФА в прилежащем ядре и дорзальном стриатуме на модели прерывания импульсной активности нейронов свидетельствует об усилении Дилептом синтеза ДА вследствие активации тирозингидроксилазы. Подобный эффект характерен для действия нейротензина и атипичных нейролептиков.

3. Дилепта повышает уровень глутамата и ГАМК в ткани прилежащего ядра, а также внеклеточное содержание данных аминокислот в этой структуре, что может являться нейрохимическим механизмом положительного когнитотропного эффекта препарата.

4. Дилепт повышает базальный уровень ДА и его основных метаболитов в дорзальном стриатуме, не изменяя при этом скорости утилизации ДА, что свидетельствует об отсутствии выраженного влияния на экстрапирамидную систему.

5. Дилепт оказывает более выраженное влияние на медиаторные системы прилежащего ядра, выполняющего роль переключателя сигналов между мезолимбической и кортикальной системами, чем на систему дорзального стриатума, участвующего в регуляции моторного контроля.

6. Дилепт воспроизводит эффекты нейротензина в отношении нейромедиаторных систем прилежащего ядра. Выявленный нейрохимический спектр действия в совокупности с данными поведенческих исследований позволяет рассматривать этот дипептид как потенциальный антипсихотик, эффективный в отношении позитивных, негативных и когнитивных нарушений и не вызывающий экстрапирамидной симптоматики.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Шизофрения - эндогенное прогредиентное психическое заболевание, характеризующееся диссоциацией психических функций и протекающее с обязательным развитием психического дефекта в! эмоционально-волевой- сфере и разнообразными? продуктивными? психопатологическими? расстройствами (бред, галлюцинации;, аффективные расстройства, кататонические симптомы и др.) (Блейхер В.М. 1995): Лечение психотических расстройств, наблюдаемых при пшзофрении, является одной из важнейших проблем психиатрии.

Наряду с проявлениями? негативной? и позитивной симптоматики; наблюдаемош при этом заболевании; когнитивный дефицит рассматривается* в качестве важного самостоятельного или даже ведущего^ расстройства, в значительной степени^ определяющего* социальный! и терапевтический прогноз заболевания; (Breier А. 1999; Мосолов С.Н 2000, Sharma 2000, Elvevag and Goldberg, 2000.)

Показано, что нарушения« активности^ нейронов • в префронтальной области и в подкорковых структурах, таких как базальные ганглии, а также: нарушение нейрохимических связей между указанными образованиями; ведет к снижению когнитивной; функции и негативным изменениям, в эмоциональною сфере (Miller E.K. and Cohen J.D., 2001; Smith Y., 2005). Важно отметить, что когнитивные расстройства нередко прогрессируют по мере развития заболевания, а,, кроме того; плохо поддаются лечению; существующими: в настоящее время? антипсихотическими препаратами. Показано что, типичные: нейролептики не только не улучшают, но даже усугубляют тяжесть когнитивных расстройств, а атипичные препараты не: являются достаточно эффективными (Harvey and Keefe, 2001; Remillard et al., 2005).

Используемые в клинической практике классические нейролептики эффективны преимущественно в отношении продуктивных симптомов заболевания, в то же время, их: систематическое применение приводит к развитию экстрапирамидных неврологических нарушений; к усугублению или возникновению вторичной дефицитарной симптоматики заболевания, а также гиперпролактинемии (Márchese G. and Pañi L., 2002; Mauri M.C. et al., 2008;: Emsley R., 2009). Подобные нарушения связаны прежде всего с блокадой преимущественно Д2 рецепторов ДА в нигростриарном и тубероинфундибулярном путях (Janno S. et al., 2004; Montejo A.L., 2008).

Следствием пролактинемии может быть развитие диабета, увеличение веса, гиперлипидемии, а также сексуальные расстройства (Meaney A.M.,. et al., 2004).

Появление нового поколения средств нейролептической терапии, так называемых атипичных антипсихотиков; лишенных побочных эффектов позволило в значительной мере избежать указанных осложнений; характерных для типичных нейролептиков, что повлекло их широкое применение у больных с первым психотическим эпизодом (Correll C.U., 2010) •

Большинство атипичных нейролептиков не уступает типичным в плане устранения некоторых видов психотических состояний, наблюдаемых при шизофрении, и оказывает менее выраженное влияние на уровень пролактина по сравнению с типичными АПС (Grant S. and Fitton А., 1994). Терапия атипичными нейролептиками, характеризуется меньшей выраженностью экстрапирамидных нарушений, но не всегда сопровождается достаточным антипсихотическим эффектом. Кроме того;.у атипичных АПС отмечаются собственные побочные эффекты, к которым относится седативное действие, агранулоцитоз, изменения обмена глюкозы и липидов, антихолинергические побочные эффекты, а также гипотензия и миокардиты (Montejo A.L., 2008).

Указанные недостатки известных нейролептиков определяют актуальность разработки принципиально новых стратегий создания высокоэффективных нейролептиков, лишенных побочных эффектов и имеющих принципиально иной механизм действия. Исследования показывают, что наряду с изменением активности ДА-ергических систем мозга, при шизофрении происходит нарушение функционирования и других нейромедиаторов мозга, к числу которых относятся серотонин, глутамат, ГАМК, ацетилхолин, а также ряд нейропептидов (например, энкефалины, эндорфины, нейротензин, вазопрессин) (Griffith J.M. , 1998; O'Connor W.T. 2001; Kinkead В. and Nemeroff C.B., 2004; Rogers DP and Goldsmith CA. 2009; Tee S.F. et al., 2010; Toyohara J., 2010; Cherlyn S.Y., et al., 2010; Beneyto M. and Lewis D.A., 2010). Нейропептиды являются веществами с мультипотентной активностью, способными регулировать функционирование нейромедиаторных систем мозга, в связи с чем их изучение представляет фармакологический интерес. К подобным нейропептидным веществам с потенциальной антипсихотической активностью относится нейротензин, роль которого в патогенезе шизофрении не вызывает сомнений (Kinkead В. and Nemeroff C.B., 2002; Câceda R., et al., 2006).

Способность HT препятствовать развитию эффектов дофаминомиметиков угнетать условные рефлексы, потенцировать эффекты барбитуратов, вызывать гипотермию, позволили сформулировать гипотезу о роли HT как эндогенного нейролептика (В. Kinkead and C.B. Nemeroff 2006, C.B. Nemeroff 1992). Олигопептидная структура HT, обуславливающая его низкую биодоступность и неспособность проникать через ГЭБ, является причиной того, что эффекты HT воспроизводятся только при введении этого тридекапептида в желудочки мозга или при его непосредственной инъекции в определенные структуры (Boules M. et al., 2006). Это исключает возможность клинического применения HT в качестве антипсихотического средства. Разработка миметиков нейротензина - гексапептидов, эффективных при системном введении, ведется на основе модифицирования главного метаболита HT (HT8.i3)-Синтез таких аналогов рассматривается многими авторами в качестве перспективного направления дизайна нейролептиков (В. Kinkead and C.B. Nemeroff, 2006).

Оригинальный подход к поиску высокоактивных пептидных препаратов, развиваемый в НИИ фармакологии имени В.В. Закусова

РАМН, состоит в создании замещенных дипептидов, имитирующих структуру активного центра эндогенного пептида и непептидного лекарственного препарата с соответствующей активностью. За основу моделирования активных НТ-подобных нейролептиков был взят дипептид пролил-тирозин в связи с тем, что эта последовательность соответствует центральному фрагменту р-изгиба НТ8.1з, и имеет топологическое сходство с атипичным нейролептиком сульпиридом (Gudasheva T.A. et al., 1998). Из серии N-ацил-пролил-тирозинов для более подробного изучения был отобран ]М-капроил-Ь-пролил-Ь-тирозина метиловый эфир (Дилепт), продемонстрировавший нейролептикоподобную активность по стандартным показателям дофаминнегативного действия (Патент РФ №2091390, 1998). Так, Дилепт устраняет поведенческие эффекты дофаминомиметиков, в том числе вызванный последними дефицит препульсового торможения, а также вызывает гипотермию и потенцирует действие барбитуратов (Nemeroff C.B., 1992). Анализ эффектов Дилепта на моделях амнезии и дефицита препульсового торможения, вызванных блокатором NMDA - рецепторов (Островская Р.У. и др., 2009), позволил сделать заключение о глутаматпозитивном действии этого препарата.

Полагают, что высшие нервные центры, в частности, таламус, создают контекст (т.е., представление о том, какую задачу выполняет то или другое движение) и, исходя из этого контекста, подавляют или усиливают те или иные сенсорные сигналы. Считается, что многие симптомы шизофрении - результат гипофункции глутаматергической системы, в частности, гипоактивности NMDA рецепторов, что приводит к дисбалансу между Д1 и Д2 рецепторами на среднешипиковых нейронах стриатума. Такое изменение ведет к преимущественному усилению функционирования Д2 рецепторов по сравнению с Д1 и, как полагают, лежит в основе эмоциональных и двигательных нарушений, наблюдаемых при психозах (Surmeier D.J., et al., 2007). Нарушение баланса между глутамат- и ДА-ергическими системами приводит к повышению высвобождения ДА, активации FAMK-ергических нейронов неостриатума, подавлению прохождения возбуждения от таламуса к, коре, что приводит к повышению активности последней. Такая гиперактивность коры может, приводить к нарушению восприятия; внимания* анализа информации; а также проявлению психотических симптомов и двигательных нарушений (Keshavan M.S., 1999): '

Курсовое введение нейролептиков подавляет активность ДА и, тем самым, снижает гиперактивность коры., Однако, такое длительное подавление таламо-кортикальных связей приводит к развитию кортикальной гипоактивности, следствием чего могут быть экстрапирамидные расстройства.

Патогенез экстрапирамидных расстройств не до конца ясен, однако накопленные данные изучения нейролептиков позволяют предположить, что в его основе лежит блокада дофаминовых рецепторов в нигростриатном пути и связанное с этим высвобождение глутамата. Подобный эффект, приводит к дисбалансу нейротрансмиттеров, повреждению базальных ганглиев и подкорково-таламических связей; а также компенсаторному усилению синтеза, и высвобождения* дофамина (Boules M., 2006). Известно; что экстрапирамидные расстройства, характерные- для нейролептиков, проявляются при блокаде более 75% от общего числа Д2 рецепторов стриатума (Abi-Dargham A., et al., 2002), следствием чего является изменение метаболизма ДА. Типичные АПС увеличивают скорость метаболизма более чем на 50 %, тогда как атипичные АПС, в т.ч. сульпирид - только на 25% (Мирошниченко и др., 1988).

Исследование влияния Дилепта на содержание катехоламинов и их метаболитов в ткани дорзального стриатума выявило увеличение содержания ДА, ДОФУК и ГВК без изменения баланса последних (Рис. 11). Подобный эффект говорит о том, что Дилепт способен активировать биосинтез ДА в нигростриарной системе ДА, что может отразиться на регуляторных механизмах рецепторного контроля высвобождения ДА в синаптическое пространство. Отсутствие влияния Дилепта на изменение метаболизма'ДА может объясняться1 отсутствием или его слабым (ниже порога детекции метода ВЭЖХ) влиянием на пресинаптические рецепторы ДА стриатума. Как говорилось выше, экстрапирамидные расстройства,, характерные для нейролептиков проявляются при значительном, более 50%* увеличении скорости метаболизма. ДА (АЫ-Баг^ат А., е1 а1., 2002). Так как в наших исследованиях Дилепт не изменял скорость утилизации ДА-, и не оказавал каталептогенного эффекта в ранее проведенных исследованиях (Аэтакоуа Ь. е1 а1., 1999) можно полагать, что у этого дипептида отсутствуют нежелательные эффкты на экстрапирамидную систему. Важным представляется'то, что в опытах (КесЬеэ А.,е1 а1 1983) было показана способность НТ, а также атипичных атипсихотиков (сульпирид) изменять соотношения ДОФУК/ДА и ГВК/ДА и вызывать каталепсию (БпцсЬгз Я. et а1.,1982; Horikawa Н.Р. е! а1., 1997). Таким образом, в этом плане Дилепт отличается* от НТ и антипсихотических препаратов.

С другой стороны, применение ГБЛ. модели позволило установить, что введение Дилепта вызывает увеличение синтеза ДА (Рис. 13). Применение гаммабутиролактона (ГБЛ) в этой* модели позволяет блокировать импульсную активность ДА нейронов; относящихся^ к проекции черной субстанции в стриатум, резко усиливать синтез ДА,, подавлять высвобождение ДА в межсинаптическое пространство, за счет чего1 повышается способность пресинаптических Д2 рецепторов связываться с предполагаемыми лигандами. Дополнительное введение ингибитора декарбоксилазы ароматических аминокислот 3-оксибензилгидразина (3-ОБГ) в ГБЛ модели позволяет судить о влиянии исследуемого вещества на скорость синтеза предшественника ДА -диоксифенилаланина (ДОФА), определяемой активностью тирозингидроксилазы. Активность этого фермента находится в обратной зависимости от сигналов, исходящих от пресинаптических рецепторов ДА (Walters JiRi.and1 Roth: R.H;, 1976).

На основе полученных результатов исследования; эффектов; Дйлепта в тканю стриатума, (Еис: ш -данных-' ЕБЖ моделш (Рис., B)s- можно? предположить, что? одним из механизмов нейролептикоподобногодействия этого! дипептида8 является® его? способность» усиливать синтез? ДАч Компенсаторное: усиление, синтеза? ДА в» ДА-эргическом нейроне по принципу обратной связи может быть ответом на блокаду Д2 рецепторов* ДА (Yoshida: S.T., et al., 2006). Такое изменение:ведет,, в свою очередь, к: активации метаболизма ДА. Показано, что в условиях ГБЛ модели агонисты ДА снижают уровень ДОФА, а. антагонисты усиливают его накопление в дорзальном стритуме (Yoshida S.T., et: al., 2006). Важно? подчеркнуть, что нейротензин в условиях ГБЛ модели также усиливает синтез ДА в этой структуре (Reches A. et al., 1983). Позднее было показано, что этот нейропептид обладает способностью блокировать рецепторы дофамина, Д2/типа (©rumheller A.D; et al., 1990), и тем самым; усиливать активность тирозингидроксилазы (Binder Е.В., et al., 2001)

Нельзя. исключить, что способность Дйлепта увеличивать синтез; ДА связана с его антагонистическим влиянием на пресинаптические Д2 рецепторы, следствием чего5 является- повышение' активности» тирозингидроксилазы. Однако;, подобные предположения? требуют проверки в дальнейших экспериментах.

Таким образом, можно полагать, что Дйлепт оказывает активирующее: влияние на рецепторы ДА, находящиеся на; пресинаптической1 терминали ДА нейрона. Степень усиления синтеза ДА 1 соответствует выраженности эффектов,, наблюдаемых при введении, атипичных нейролептиков (Мирошниченко и др., 1988) и НТ (Reches Avet al., 1983; Drumheller A.D; et al., 1990) и незначительна по величине.

В; проведенных нами микродиализных исследованиях Дилепт вызывал в; дорзальном стриатуме повышение внеклеточного содержания ГВК

83 метаболита ДА (Рис. 15), что свидетельствует о вероятном усилении высвобождении ДА в межсинаптическую щель. Анализ результатов исследований об эффектах Дилепта на систему ДА в области дорзального стриатума позволяет заключить, что этот дипептид усиливает синтез ДА, не увеличивая при этом скорость метаболизма и, вероятно, повышает высвобождение ДА в межклеточное пространство.

Исследования влияния Дилепта на аминоацидергическую систему дорзального стриатума показали, что этот дипептид повышает как внутритканевое (Рис. 18), так и внеклеточное содержание глутамата (Рис. 21). Таким образом, можно полагать, что Дилепт повышает активность глутаматергической системы дорзального стриатума, усиливая высвобождение этой аминокислоты в межсинаптическое пространство данной структуры. Подобный эффект однонаправлен с действием НТ (Ferero L., et al., 2007). Так, исследования показали, что в неостриатуме основные нейромодуляторные эффекты НТ проявляются на ДА-ергических терминалях и на кортико-стриатных терминалях глутамата (Ferero L., et al., 2007).

НТ вызывает повышение внеклеточного содержания глутамата в дорзальном стриатуме, следствием чего является повышение уровня ГАМК в паллидуме. Таким образом, как считают авторы, НТ участвует в регуляции "непрямого" пути базальных ганглиев (непрямой путь регулируется через Д2 рецепторы стриатума, и осуществляет активирующие эффекты в области коры) (Antonelli Т. et al 2006). Реализация подобного механизма осуществляется за счет либо соматодендрических рецепторов НТ на ГАМК нейронах стриатума либо за счет рецепторов НТ, образующих комплекс с рецепторами дофамина Д2 типа, локализованных на окончаниях нейронов глутамата и таламуса, находящихся в дорзальном стриатуме (O'Connor et al., 1992; Ferraro et al., 1995 ,1997). Каталептогенный (нейролептический) эффект НТ, как полагают, связан с повышением высвобождения глутамата стриатума и

ГАМК палидума (Agnati et al.,1983; Nemeroff and Cain, 1985; Fuxe et al., 1992). Подобное увеличение, в свою очередь, может вызывать повышение внеклеточного уровня ГАМК в паллидуме и, в результате этого, снижается активность коры (Antonelli Т. et al 2006). В проведенных нами исследованиях Дилепт повышал высвобождение глутамата в дорзальном стриатуме, что аналогичто действия' НТ. Однако исследования' проведенные Асмаковой JL и др. (L.Asmakova et al., 1999) не показали наличия каталептогенных эффектов у Дилепта.В целом, анализ данных исследования влияния Дилепта на ДА-, глутамат- и ГАМК-ергические системы дорзального стриатума показывает сходство этого дипептида с НТ, однако при отсутствии у этого препарата способности вызывать выраженные изменения в экстрапирамидной системе. В' патогенезе шизофрении, как полагают, значительную роль играют нарушения нейрорегуляторных механизмов в мезолимбической петле. Она начинается во фронтальной коре, включая переднюю поясную извилину - медиальную префронтальную кору. От этих структур идут глутаматергические проекции в А10 (вентральную тегментальную область), где также находятся ДА- ергические нейроны. ДА нейроны VTA образуют путь, заканчивающийся в префронтальной коре. Этот путь включает три синапса (Рис. 22). Первый синапс расположен в прилежащем ядре и от него начинается ГАМК путь, идущий в вентральный паллидум (вентральный стриопаллидарный ГАМК путь). От ГАМК нейрона паллидума проекции направляютя в медиальное ядро таламуса, от которого, в свою очередь, идут глутаматергические проекции в медиальную префронтальную кору, где завершается мезолимбическая петля.

Mesolimbic Circuit

Рис. 22. Вентральная тегментальная область и прилежащее ядро в мезолимбической петле (O'Connor W.T., 2001). Mesolimbic Circuit -мезолимбическая петля.

Ventral tegmental area (VTA) - вентральная тегментальная область Nucleus accumbens — прилежащее ядро Ventral pallidum - вентральный паллидум Medial dorsal thalamus -медиаодорзальный таламус Medial prefrontal cortex (mPFC) - медиальная префронтальная кора Совокупность данных проведенных исследований показывает, что патофизиология шизофрении связана с повышением мезолимбического ДА (т.е.) гипердофаминергией со снижением таламо-кортикального глутамата (т.е. гипоглутаматергией) (Carlsson et al., 1999) (Рис. 23). Так, гиперактивация мезолимбических нейронов ДА при шизофрении ведет к активации дофаминергической нейротрансмиссии через активацию Д2 рецепторов. Это приводит к развитию гипоглутаматергии в префронтальной коре мозга из-за снижения глутаматергической регуляции медиодорзальным ядром таламуса (Carlsson et al., 1999, W.T. O'Connor 2001).

Рис. 23. Вентральный стриопаллидарный ГАМК-ергический путь и связь мезолимбической гипердофаминергии с таламо-префронтальной кортикальной гипоглутаматергией (O'Connor W.T., 2001).

Ventral tegmental area (VTA) - вентральная тегментальная область Nucleus accumbens - прилежащее ядро Ventral pallidum — вентральный паллидум Medial dorsal thalamus -медиаодорзальный таламус Medial prefrontal cortex (mPFC) - медиальная префронтальная кора Значительная роль в нарушении функционирования мезолимбической петли отводится дисбалансу нейрорегуляторных механизмов прилежащего ядра - структуры, выполняющей функцию ретранслятора между лимбической и префронтальной областью и осуществляющей координацию когнитивных, эмоциональных и мотивационных процессов. Полагают, что блокада Д2 рецепторов ДА в прилежащем ядре и последующая активация вентральной стриопаллидумной ГАМК трансмиссии - общий эффект антипсихотических препаратов, ведущий к восстановлению в таламо-префронтальных глутаматэргических проекциях возбудающих стимулов (Рис. 24), которые, как было установлено, ослаблены у пациентов с шизофренией (Carlsson et al., 1999; O'Connor W.T., 2001).

Рис. 24. Усиление вентральной стрио-паллидарной ГАМК-ергической нейропередачи нейтрализует корковую гипоглутаматергию в условиях наличия мезолимбической гипердофаминергии (O'Connor W.T., 2001).

Ventral tegmental area (VTA) - вентральная тегментальная область

Nucleus accumbens - прилежащее ядро

Ventral pallidum - вентральный паллидум

Medial dorsal thalamus -медиаодорзальный таламус

Medial prefrontal cortex (mPFC) - медиальная префронтальная кора

Эта концепция также подтверждается тем, что смешанный агонист ДА рецепторов амфетамин снижает высвобождение ГАМК в вентральном паллидуме. Такой эффект может лежать в основе нарушения памяти, проявления психозов и аффективных расстройств (Bourdelais and Kalivas, 1990; Linderfors et al., 1992). Более того, денервация ДА в ПЯ связана с повышением в диализатах уровней ГАМК, а снижение содержания ГАМК наблюдается после введения неселективного агониста ДА апоморфина (Bourdelais and Kalivas, 1992). Помимо этого, известно, что гипофункция NMDA рецепторов, вызванная снижением активности глутаматергической регуляции из медиодорзального ядра в префронтальную кору может лежать в основе негативных симптомов шизофрении (Stahl S.M., 2007). С другой стороны, изменения функциональной активности конвергентных префронтальных глутаматергических возбуждающих афферентов, входящих в прилежащее ядро, и/или дисфункция ингибиторных ГАМК -ергических эфферентных путей сами по себе могут также лежать в основе нарушения поведения и неустойчивости эмоциональной сферы при шизофрении (O'Donnell P. and Grace A.A. , 1998). Можно предположить, что изменения функционирования ДА мезолимбической системы может быть следствием компенсаторного ответа на подобные изменения, происходящие в ГАМК- и глутаматергических системах или следствием первичного дефекта, встречающегося в некоторых других нейронных системах сходящихся в прилежащем ядре или выходящих из него.

Значительную роль в регуляции нейротрансмиттерных систем прилежащего ядра, как известно, принадлежит нейротензину. Полагают, что нейротензин регулирует пресинаптическую ДА нейротрансмиссию в прилежащем ядре через рецепторы НТ, расположенные на глутамат и ГАМК-ергических окончаниях в этой структуре. Прямая активация малого количства рецепторов нейротензина, находящихся на ДА терминалях прилежащего ядра, участвует в подобной регуляции гораздо в меньшей степени. На основании многочисленных исследований об эффектах нейротензина в прилежащем ядре Беггаго е1 а1 был предложен механизм действия нейротензина (Рис. 25).

Рис. 25. Механизмы нейрорегуляции, регулируемые НТР1-Д2 комплексом в прилежащем ядре (в соответствии с концепцией Ферарро и соавт.).

ДА - дофамин, ГлуР - рецепторы глутамата. НТР-1-рецепторы нейротензина (подтип 1). Д2- рецепторы дофамина (подтип 2), ГАМКд - рецепторы у-аминомасляной кислоты (подтип А).

Как следует из представленной концепции, в прилежащем ядре существует рецепторный комплекс НТР1-Д2, располагающийся преимущественно на окончаниях аксонов глутаматергических нейронов, идущих из коры в ПЯ. НТ, воздействуя на НТР1-Д2 комплекс, вызывает блокаду Д2 рецепторов, что ведет к повышению высвобождения глутамата. Беггаго е1 а1. полагают, что внеклеточное повышение уровня глутамата в прилежащем ядре, вызванное введением НТ, ведет к ответной активации в этой структуре ГАМК - ергической импульсации. Далее, сигнал от ГАМК нейронов распространяется в двух направлениях: либо через коллатераль, идущую к окончаниям дофаминергических нейронов мезолимбического пути (W.T. O'Connor, 2001), либо через вентральный стрио-паллидарный ГАМК- ергический путь (Ferraro L. et al., 2007). Усиление тормозного1 сигнала FAMK-ергических нейронов через коллатераль приводит к активации рецепторов. ГАМК-А типа, находящихся на окончаниях дофаминергических нейронов, мезолимбического пути и к последующему снижению высвобождения ДА.

Полученые нами данные о способности аналога НТ Дилепта повышать синтез глутамата, ГАМК и усиливать их высвобождение в ПЯ (Рис. 16, 17, 19; 20) аналогичны эффектам НТ в этой структуре (Ferraro L. et al., 2007). Хотя применяемыми методами исследования не удалось детектировать внеклеточный уровень ДА, но на основании представленных механизмов действия НТ и полученных нами результатов мы полагаем, что снижение ГВК происходит из-за снижения высвобождения ДА в прилежащем ядре. Вероятно, что внеклеточное снижение уровня ГВК (Рис. 14) в прилежащем ядре происходит за счет повышения концентрации глутамата и ГАМК.

С другой стороны, при исследовании содержания в ткани прилежащего ядра катехоламинов и их метаболитов было обнаружено повышение содержания основных метаболитов ДА - ДОФУК и ГВК (Рис. 10), а также соотношения ГВК/ДА и ДОФУК/ДА. Однако; следует отметить, что повышение метаболизма ДА в ткани наблюдалось через 30 минут после введения Дилепта (рис. 10), а достоверное снижение внеклеточного уровня ГВК отмечалось начитная с 40 минут и усиливалось еще более спустя 60 минут после введения Дилепта (рис. 14). Таким образом, времянные интервалы действия Дилепта на снижение внеклеточного уровня ГВК и на повышение содержания показателя ГВК и ГВК/ДА в ткани различны.

Известно, что концентрация ГВК характеризует, в основном, скорость внеклеточного метаболизма ДА, расщепляемого ферментом катехол-о-метилтрансферазой (КОМ'Г). Функция КОМТ — утилизация, высвободившегося в синаптическующель и не попавшего обратно в. пресинаптическую терминаль посредством механизма обратного захвата, ДА. Исследования, показали, что в стриатуме КОМТ локализуется, преимущественно в глин и на постсинаптической мембране ДА нейронов, на пресинаптических терминалях она не обнаружена (Маптз1б Р.Т. апё Каакко1а 8. 1999): Это означает,, что образование ГВК может происходить, только после состоявшегося? высвобождения ДА в синаптическое, пространство. Таким образом, остается открытым вопрос о причинах; расхождения: данных, полученных при изучении тканевого содержания; при котором наблюдалось увеличение уровня ГВК, а также соотношения-ГВК/ДА (Рис. 12) и снижении ГВК (Рис. 16), отмечавшемся при микродиализном исследовании. Следует отметить, , что сходный эффект был обнаружен и у нейротензина. Так, по данным ряда авторов, ИТ повышал содержание в ткани прилежащего ядра ДА, ГВК, увеличивал соотношение ГВК/ДА, и, при этом, в условиях ГБЛ модели повышал синтез ДА в,прилежащем ядре (ДесЬеэ А. е1 а1., 1983; ВгитИеНег А.В. е1 а!., 1990): С другой стороны, показано, что НТ снижает высвобождение ДА в ГШ (Реггаго Ь., е1 а12007).

Повышение ДА и; соотношения ДА/ДОФУК - показателя, отражающего, , в основном, изменения внутриклеточного оборота: ДА на 35% (Рис 12, табл. 1) после введения Дилепта в ткани ПЯ предполагают активацию синтеза ДА и усиление внутриклеточного оборота ДА. Исследования проведенные РгитЬеИег АО, и ЯесЬез А (КесЬеэ А. еЬ а.,1 1983) показали, что НТ повышает соотношение ДОФУК/ДА в прилежащем ядре. Известно, что применение типичных нейролептиков^ таких, как галоперидол, усиливают скорость метаболизма ДА в ПЯ более чем на 50%, тогда как атипичные нейролептики, такие, как сульпирид, повышают этот показатель на 25-30% (Ъпаги У., 1989). Эффект, характерный для атипичных нейролептиков, также описан и для эндогенного нейролептика нейротензина. Таким образом, можно сделать вывод, что Дилепт вызывает повышение сокрость утилизации ДА, степень которой соответствует действию атипичных антипсихотиков и НТ.

Одним из механизмов, усиливающих синтез дофамина в ДА нейроне, является блокада ауторецепторов или гетерорецепторов (Miyake N 2011, Agnati LF 2009, 2010, Francesco AL 2008, Fuxe К 2010. ) на дофаминергической терминали, что приводит к компенсаторному усилению синтеза ДА по принципу обратной связи. Такое изменение ведет, в свою очередь, к активации метаболизма ДА (Yoshida S.T., et al., 2006). Исследования показали, что нейротензин в условиях ГБЛ модели (позволяющей наблюдать только пресинаптические эффекты препаратов, при ингибировании постсинаптических) усиливает синтез ДА (Reches A et al., 1983). Позднее было показано, что этот нейропептид блокирует рецепторы дофамина Д2 типа (Binder Е.В. et al., 2001) и, тем самым, усиливает активность тирозингидроксилазы (Najimi М., 2002).

Нами было показано, что Дилепт увеличивает содержание ДОФА в условиях ГБЛ модели ПЯ (Рис. 14). Степень усиления синтеза ДА соответствует значениям, полученным при изучении НТ в работах Reches (Reches A et al., 1983). Такой эффект гораздо менее выражен, чем у типичного нейролептика галоперидола и соответствует эффектам атипичных нейролептиков (сульпирид) (Burke E.et al., 1982). Нельзя исключить, что подобное усиление синтеза ДА, вызванное Дилептом, вероятно, реализуется за счет компенсаторного механизма обратной связи, который осуществляется через пресинаптические ауторецепторы или гетерорецепторы на ДА нейронах. В условиях блокады пресинаптических рецепторов активируется фермент ТГ и усиливается синтез ДА. Таким образом, данные исследований содержания КА в ткани ПЯ, ГБЛ модели (Рис. 10, Рис. 12, Табл. 1) и микродиализного исследования (Рис. 14) показывают, что внутри клетки происходит усиление синтеза и оборота

ДА, но, вероятно, при этом снижается релиз ДА, поэтому уровень ГВК снижен внеклеточно.

Из вышеизложенного можно сделать вывод о существовании как минимум двух механизмов действия Дилепта. Первый механизм-пресинаптические эффекты: блокада рецепторов на пресинаптической мембране ДА нейрона приводит к компенсаторному усилению синтеза ДА. Второй механизм: активация, синтеза глутамата и повышение его релиза ведет к ГАМК- зависимому снижению высвобождения ДА следствием чего является дефицит ДА в межсинаптической щели. Это, в свою очередь, вызывает понижение уровня связывания ДА с пресинаптическими рецепторами и в условиях такого дефицита связывания - повышение активности тирозингидроксилазы и увеличение синтеза ДА.

Такой эффект-повышение синтеза и увеличение внутриклеточного оборота ДА в ГШ сочетается с данными о действии антипсихотических средств и нейротензина. Снижение же высвобождения ДА опосредованно действием на систему глутамата и ГАМК, что также является общим эффектом антипсихотических препаратов и НТ в прилежащем ядре (Беггаго Ь. е1 а1., 2007)

В целом, обнаруженные нами эффекты Дилепта в прилежащем ядре сходны с действием исходного тридекапептида НТ в условиях его подведения к этой структуре. Таким образом, Дилепт может рассматриваться в качестве системно активного дипептидного миметика нейротензина, способного устранять нейрорегуляторный дисбаланс в глутамат-, ГАМК- и ДА- ергических системах прилежащего ядра. Полученные результаты нейрохимического изучения Дилепта в сочетании с данными о его поведенческих эффектов позволяют рассматривать последний в качестве потенциального антипсихотика.