Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармацевтический анализ и стандартизация новых лекарственных средств нейротропного действия

005002431

На правах рукописи

Грушевская Любовь Николаевна

Фармацевтический анализ и стандартизация новых лекарственных средств нейротропного действия

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук

1 7 НОЯ 2011

Москва-2011 г.

005002491

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский инстатут фармакологии имени В.В. Закусова РАМН

Научный консультант:

Доктор фармацевтических наук, профессор

Пятин Борис Михайлович

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук, профессор Доктор фармацевтических наук, профессор Доктор фармацевтических наук

Берлявд Александр Семенович Раменская Галина Владиславовна Эппггейн Наталья Борисовна

Ведущая организация:

ОАО «Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ»

Зашита диссертации состоится 2012 г. в _ час. _ мин

на заседании диссертационного совета Д 208.040.09 при ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова по адресу: 119019, Москва, Никитский бульвар, д. 13.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова (117998, г. Москва, Нахимовский проспект, 49).

Автореферат разослан

2011 г

Ученый секретарь диссертационного совета Д.208.040.09, доктор фармацевтических наук, профессор

Садчикова Наталья Петровна

Общая характеристика работы

Актуальность темы

В настоящее время в Российской Федерации продолжается рост объемов производства и продаж лекарственных средств-дженериков с изученной фармакологической активностью, эффективностью и безопасностью. Известно, что эти препараты обладают определенными побочными эффектами и противопоказаниями, которые ограничивают их применение у ряда пациентов.

Одним из направлений научной работы НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН является поиск принципиально новых, не имеющих мировых аналогов, лекарственных средств нейротропного действия, отвечающих современным задачам фармакотерапии и лишенных нежелательных эффектов, присущих уже существующим препаратам.

В рамках этого направления в НИИ фармакологии были созданы три новых нейротропных лекарственных средства, одно из которых принадлежит к группе производных бензимидазола (афобазол), а два других - к соединениям пептидной структуры (ноопепт и дилепт).

Афобазол является эффективным анксиолитиком, не обладающим в широком диапазоне доз гипноседативными эффектами, миорелаксантными свойствами и негативным влиянием на показатели памяти. Ноопепт -дипептидный аналог пирацетама, обладающий ноотропным и нейропротективным действием. Он обладает высокой специфической биодоступностью для тканей мозга и эффективен в сравнительно малых дозах. Дилепт - дипептидный аналог нейротензина, принадлежащий к группе атипичных нейролептиков и сочетающий нейролептикоподобное действие с положительным мнемотропным и нейропротективным эффектами. Дилепт не имеет побочных эффектов, характерных для типичных нейролептиков, и не обладает холинолитическим действием, обуславливающим отрицательное влияние на память.

Необходимым условием внедрения лекарственных средств в медицинскую практику является разработка адекватных методов контроля их качества и стандартизация, результатом которой становится установление экспериментально обоснованных норм качества на субстанции и лекарственные формы.

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы заключается в теоретическом и экспериментальном обосновании комплексного подхода к фармацевтической стандартизации новых лекарственных средств - производных 2-меркаптобензимидазола и препаратов пептидной структуры: афобазола, ноопепта и дилепта, разработке научно-обоснованных норм, позволяющих поддерживать качество выпускаемых препаратов на современном уровне эффективности и безопасности.

В задачи исследования входило:

- На основании теоретических и экспериментальных исследований сформулировать подходы к разработке методик контроля качества и изучения стабильности новых нейротропных лекарственных средств - афобазола, ноопепта и дилепта;

- Изучить химические и физико-химические свойства, спектральные характеристики новых нейротропных препаратов, оценить возможность использования особенностей структуры этих препаратов в их качественном и количественном анализе;

- Изучить хроматографическую подвижность новых препаратов, исходных и промежуточных продуктов их синтеза, продуктов деструкции, остаточных органических растворителей и других примесей с помощью методов тонкослойной (ТСХ), высокоэффективной (ВЭЖХ) и газо-жидкостной (ГЖХ) хроматографии; подобрать условия и разработать методики, позволяющие получить наиболее полную и точную информацию о качестве исследуемых препаратов;

- Изучить стабильность субстанций и лекарственных форм новых нейротропных лекарственных средств под действием факторов окружающей среды; определить условия хранения и сроки годности;

- Установить экспериментально обоснованные нормы качества новых нейротропных препаратов; оформить соответствующую нормативную документацию.

Научная новизна исследования

Впервые проведены комплексные исследования по разработке методик анализа и установлению научно-обоснованных норм качества новых

нейротропных лекарственных средств - афобазола, ноопепта и дилепта. Определены теоретически и экспериментально обоснованные подходы к разработке методик контроля качества и изучения стабильности этих новых, ранее не изученных лекарственных средств.

Проведено изучение физико-химических и химических свойств афобазола, ноопепта и дилепта с помощью современных методов анализа. Изучены спектральные характеристики с помощью ИК-, УФ-, ЯМР 'Н- и масс-спектроскопии, хроматографическая подвижность с помощью ТСХ и ВЭЖХ. Подобраны оптимальные условия, позволяющие разделить сами фармакологически активные вещества, исходные и промежуточные продукты их синтеза и продукты деструкции. Подобраны условия разделения наиболее вероятных остаточных растворителей в субстанциях с помощью метода ГЖХ.

Изучена стабильность новых лекарственных средств при хранении и под действием факторов окружающей среды, определены наиболее вероятные условия и пути деструкции, идентифицированы некоторые продукты разложения.

Практическая значимость результатов исследования

Разработаны методики анализа субстанций и лекарственных форм новых нейротропных лекарственных средств - афобазола, ноопепта и дилепта, и установлены научно-обоснованные нормы их качества, которые легли в основу нормативных документов контроля качества - фармакопейных статей предприятия (ФСП). Разработан комплекс аналитических методик для контроля производства субстанций и лекарственных форм новых лекарственных средств.

На основании проведенных исследований разработано одиннадцать проектов ФСП на субстанции и лекарственные формы новых нейротропных лекарственных средств, а также соответствующие разделы лабораторных регламентов на производство субстанций афобазола и ноопепта и лекарственных форм афобазола, ноопепта и дилепта:

- проект ФСП на субстанцию афобазола (для производства таблеток);

- проект ФСП на таблетки афобазола 5 мг;

- проект ФСП на субстанцию афобазола (для производства раствора для

инъекций);

- проект ФСП на афобазол, раствор для инъекций, 10 мг/мл;

- проект ФСП на субстанцию ноопепта (для производства таблеток);

- проект ФСП на таблетки ноопепта, 10 мг;

-проект ФСП на субстанцию ноопепта (для изготовления лиофилизированной инъекционной лекарственной формы);

- проект ФСП на ноопепт, лиофилизированный порошок для инъекций, 1 мг в ампуле;

- проект ФС на ноопепт, стандартный образец;

- проект ФСП на субстанцию дилепта (для производства таблеток);

- проект ФСП на таблетки дилепта 20 мг.

В настоящее время с применением полученных результатов утверждены: -ФСП на субстанцию афобазола (ФСП 42-0067620605, ФГУП «Центр по химии лекарственных средств» (ЦХЛС-ВНИИХФИ));

- ФСП на афобазол, таблетки 5 мг (ФСП 42-0055622105, ОАО «Щелковский витаминный завод»);

- ФСП на афобазол, таблетки 10 мг (ФСП 42-0055708505, ОАО «Щелковский витаминный завод»);

- НД на Нейрофазол, концентрат для приготовления раствора для инфузий 5 мг/мл (ЛСР-002102/10-160310, ЗАО «Фармацевтическая фирма «ЛЕККО»);

- НД на субстанцию ноопепта (НД 42-13988-05, ЗАО «Мастерлек», Россия, производитель Эррегиере С.п.А., Италия);

- ФСП на ноопепт, таблетки 10 мг (ФСП 42-0055699005, ЗАО «Мастерклон», производитель ОАО «Щелковский витаминный завод»).

Внедрение в практику. Методики анализа субстанций и лекарственных форм афобазола, ноопепта и дилепта внедрены в НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН для контроля производства, а также контроля качества при проведении фармакологических и токсикологических исследований на стадии доклинического изучения. По утвержденным ФСП и НД на субстанцию и таблетки афобазола и ноопепта а также на Нейрофазол, концентрат для приготовления раствора для инфузий, проводится контроль качества этих лекарственных средств на химико-фармацевтическом предприятии ЗАО «ЛЕККО» (Россия).

Апробация работы

Основные результаты проведенных исследований представлены на XII, XIII, XIV, XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2005, 2006, 2007, 2009); на II Всероссийском съезде фармацевтических работников (Сочи, 2005), на 4-й и 5-й Международных конференциях «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2006, 2010); на III Съезде фармакологов России «Фармакология практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007).

Личный вклад автора

Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведено планирование исследований, анализ и статистическая обработка, обобщение полученных результатов, принято участие в экспериментальных исследованиях по разработке и валидации аналитических методик. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач и их реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и их внедрения в практику.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 2 и 3 паспорта специальности фармацевтическая химия, фармакогнозия.

Публикации

По результатам исследований опубликовано 30 печатных работ. Получены патенты РФ на изобретение: «Инъекционная лекарственная форма для лечения острого инсульта, способ ее изготовления и применение» (патент РФ №2330680, Бюл. №22, 2008) и «Фармацевтическая композиция с антипсихотическим действием» (патент РФ №2420304, Бюл. №16,2011).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук

Диссертационная работа выполнена в соответствии с научным планом НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН в рамках комплексной темы

исследований: «Изучение механизмов эндо- и экзогенной регуляции функций центральной нервной системы. Разработка новых оригинальных нейропсихотропных средств», номер государственной регистрации 01.2.006.06601.

Основные положения, выносимые на защиту:

теоретическое и экспериментальное обоснование подходов к разработке методик контроля качества и изучения стабильности новых, ранее не изученных лекарственных средств пептидной структуры и производных 2-меркаптобензимидазола;

- экспериментальное обоснование показателей и норм качества субстанций и лекарственных форм афобазола, ноопепта и дилепта на основе комплексного изучения их физико-химических, химических свойств, спектральных и хроматографических характеристик;

- методики качественного и количественного анализа субстанций и лекарственных форм афобазола, ноопепта и дилепта и их валидационные характеристики;

оценка стабильности афобазола, ноопепта и дилепта под действием факторов окружающей среды и результаты определения сроков годности методом «ускоренного старения» и при хранении в естественных условиях.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 399 страницах машинописного текста, содержит 98 таблиц и 56 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 6 глав экспериментальных исследований, краткого заключения, общих выводов и приложения. Список литературы содержит 275 источников, из них 137 - зарубежных авторов.

Во введении сформулированы актуальность, цели и задачи исследования, показаны научная новизна и практическая значимость работы, связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук, описаны основные положения, выносимые на защиту. В обзоре литературы (глава 1) в первом разделе приведена краткая характеристика фармакологических свойств анксиолитиков, ноотропных средств и нейролептиков, а также фармакологических свойств афобазола, ноопепта и дилепта, как представителей этих трех классов

нейротропкых средств. Второй раздел содержит описание методов фармацевтического анализа субстанций и лекарственных форм производных бензимидазола, к которым относится афобазол и препаратов пептидной структуры, к которым относятся ноопепт и дилепт. В главе 2 представлена характеристика объектов исследования - субстанций и лекарственных форм афобазола, ноопепта и дилепта, приведено краткое описание синтеза субстанций, состава лекарственных форм, а также методов анализа, приборов и реактивов, использованных в работе. Глава 3 посвящена изучению физико-химических свойств и спектральных характеристик субстанций новых лекарственных средств нейротропного действия. Глава 4 содержит экспериментальные данные по применению химических методов в качественном и количественном анализе афобазола, ноопепта и дилепта. В главе 5 представлены результаты исследований с применением хроматографических методов (ТСХ, ВЭЖХ, ГЖХ) для качественного анализа новых нейротропных лекарственных средств. Глава 6 посвящена применению спектральных и хроматографических методов в количественном анализе афобазола, ноопепта и дилепта. В главе 7 представлены результаты изучения стабильности субстанций и лекарственных форм афобазола, ноопепта и дилепта под влиянием факторов внешней среды, а также установления сроков годности методом «ускоренного старения» и при хранении в естественных условиях. Глава 8 посвящена установлению норм качества субстанций и лекарственных форм афобазола, ноопепта и дилепта.

Объекты и методы исследования

Объектами исследований являлись субстанции и лекарственные формы афобазола, ноопепта и дилепта, промежуточные продукты синтеза, продукты гидролиза и окисления, которые могут присутствовать в образцах как примеси.

По химической структуре афобазол представляет собой 5-этокси-2-[2-(морфолино)-этилтио]бензимидазоладигидрохлорид.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

СиН^зОгБ • 2НС1 М.м. 380,34

В качестве веществ-свидетелей при разработке методик анализа афобазола были использованы промежуточные продукты синтеза (фенацетин, З-нитро-4-аминофенетол, 3,4-диаминофенетол, 5-этокси-2-меркаптобензимидазол (ЭМБ), хлорэтилморфолин), побочный продукт синтеза - 5-этокси-1(3)-(2-морфоли-ноэтил)-2-[2-(морфолино)этилтио] бензимидазол (ПНА), а также продукты деструкции - 5-гидрокси-2-[2-(морфолино)этилтио] бензимидазол (АДК 1087), сульфоксид афобазола (АДК 1090), 5-этокси-6-кетобензимидазола дигидрохлорид (АДК 1092) и 5-этокси-2-[2-(гидрокси)этилтио] бензимидазол (АДК 1093)).

Твердая дозированная лекарственная форма афобазола - таблетки следующего состава (на 1 таблетку): 0,0050 г афобазола; 0,0480 г крахмала картофельного; 0,0400 г целлюлозы микрокристаллической; 0,0485 г лактозы; 0,0070 г поливинилпирролидона низкомолекулярного; 0,0015 г магния стеарата.

Инъекционная лекарственная форма афобазола - изотонический раствор (10 мг/мл) в ампулах вместимостью 2 мл.

Ноопепт - этиловый эфир 1^-фенилацетил-Ь-пролилглицина.

с17н22тч204

М.м. 318,39

В работе использованы образцы субстанции, очищенные двумя различными способами: кристаллизацией из этилацетата при соотношении 1:2 (тип I) и двойной кристаллизации из этилацетата с добавлением активированного угля в количестве 5-10% (соотношение вещества и растворителей 1:2 и 1:3,0-3,5) (тип И).

В качестве веществ-свидетелей при разработке методик анализа ноопепта были использованы промежуточные продукты синтеза и продукты гидролиза: Ы-фенилацетил-Ь-пролин (ФАП), фенилуксусная кислота (ФУК), М-фенилацетил-Ь-пролилглицин (ФАПГ), этиловый эфир глицина (ЭЭГ).

Твердая дозированная лекарственная форма ноопепта - таблетки, состав (на 1 таблетку): 0,010 г ноопепта; 0,065 г лактозы; 0,020 г целлюлозы микрокристалллической; 0,004 г поливинилпирролидона; 0,001 г магния стеарата.

Инъекционная лекарственная форма ноопепта - лиофилизированный порошок, состав (на 1 ампулу): 0,0010 г ноопепта; 0,0100 г маннита.

Дилепт - метиловый эфир М-капроил-Ь-пролил-Ь- тирозина.

HjC(h:44

■он

М.м. 390,22

C21H30N2O5

HjCO

При разработке методик анализа дилепта были использованы промежуточные продукты синтеза и продукты гидролиза: метиловый эфир L-тирозина (МЭТ), N-капроил-Ь-пролин (КП), К-капроил-Ь-пролил-Ь-тирозин (КПТ), капроновая кислота.

Твердая дозированная лекарственная форма дилепта - таблетки, состав (на 1 таблетку): 0,0200 г дилепта; 0,1780 г лудипресса; 0,0020 г магния стеарата.

Исследования проводили при помощи методов ИК-, УФ-, ЯМР'Н-спектроскопии, масс-спектрометрии, тонкослойной (ТСХ), высокоэффективной жидкостной (ВЭЖХ), газовой хроматографии (ГХ), титриметрических методов.

Для изучения спектральных характеристик субстанции использовали УФ-спектрофотометр UV-1700 ("Shimadzu", Япония), ИК-спектрометр Bruker Vertex 70 (Германия), ПМР-спектрометр Bruker АС - 250 (Германия), масс-спектрометр SSQ-710 (Finnigan-MAT, США). Для хроматографического анализа в тонком слое сорбента использовали пластинки Kieselgel 60 F254 (Merck, Германия) и Силуфол УФ-254 (Хемопол, Чехия). Анализ методом ВЭЖХ проводили на жидкостных хроматографах LC-10AT (Shimadzu, Япония) и Golden System (Beckman, США) со спектрофотометрическими детекторами с переменной длиной волны.

Физико-химические свойства и спектральные характеристики новых лекарственных средств нейротропного действия

С целью разработки методик анализа и определения фармакопейных показателей качества трех новых нейротропных средств были изучены их физико-химические свойства и спектральные характеристики (табл. 1). Методы ИК- и УФ-спектроскопии предложены для идентификации афобазола, ноопепта и дилепта.

Таблица 1

Физико-химические свойства и спектральные характеристики субстанций новых нейротропных средств

Характеристики Наименование субстанции

Афобазол Ноопепт 1 | Ноопепт 11 Дилепт

Растворимость легко растворим в воде, растворим в спирте, мало растворим в хлороформе легко растворим в хлороформе, растворим в спирте этиловом 95%, мало растворим в воде, очень мало растворим в эфире диэтиловом легко растворим в хлороформе и этиловом спирте 95%, растворим в ацетоне, практически нерастворим в воле

ИК-спектр, см"1 (таблетки КВг, 4000-400 см"1) 3392-3435 (N-H); 2652 (N-H в RjN+H); 1636(C=N); 1493, 1456 и 1399 (С=С, Ar); 1305 (С-Н); 1165, 1089 и 1050 (Аг-О-СгНз) 1753 (карбонил -COOCiH5 ), 1694 (карбонил -CONH), 1635 (карбонил N-CO-), 1558 - 1635 и 1442 - 1500 (С=С замещенного бензола) и 621 -882 (пара-замещение в бензольном кольце) ЗЗЮ(ОН, NH); 1735 (-СООСН, ); 1660, 1640, 1594 (карбонилы -CONH, >N-00); 1594, 1519 (С=С Аг); 821 (1,4-замещенный бензол тирозина)

УФ-спектр (230 - 350 им) 238±2 нм и 302±2 нм (0.015 мг/мл, 0,0IM HCl) 253±2 нм, 259±2 нм и 265±2 нм (0,4 мг/мл, этанол 95%) 278±2нм, плечо (282-287) нм (0,1 мг/мл, этанол 95%)

ПМР-спектр, 8, м.д. ДМСО du: 1.37 (ЗН, т. СН,>: 3,37 (7Н, м., CH2NCH2); 3,58 (2Н, т., CIhS); 3,91 (4Н, м„ СН2ОСН2); 3,93 (2Н, т., CH2N); 4,08 (2Н, кв., СНгСНз); 7,04(111. д.л.,Н-6); 7,15 (1Н, д., Н-4); 7,59 (1Н, д., Н-7) ЛМСО dft: Транс-коиформер: 1.17 (311. т., СН3СН2О-); 1,70 - 2,25 (4Н, м., 3-СН2; 4-СН2Рго); 3,35 - 3,50 (2Н, м., 5-СН2Рго); 3,66 (2Н, е., СН2С6Н5); 3,79 (211, д., CH2Gly); 4,08 (211, кв., CHjCH20-); 4,31 (1Н, д.д., 2НРго); 7,14- 7,35 (5Н, м., СН2С6Н5); 8,29 (1Н, т., NHOly); Цис-конформер: 1,16 (ЗН, т., CHjCHjO-); 1,70 - 2,25 (4Н, м., 3-СН2; 4-СН2 Pro); 3,62 (2Н, е., СН2С6Н5); 3,85 (2Н, д., СН2С1у); 4,10 (2Н, кв., СН,СН20-); 4,17 (1Н, д.д., 2НРго); 8,63 (1Н, т. NHGly); Транс/цис: 60:40 CDCh: Транс-конформер: 0,86 (ЗН, т., СНз(СН2)4); 1,28 (6Н, м, СЬЬСН2СН2); 2,22 и 2,27 (2Н, т, СН,-С=0); 2,92 и 3,06 (2Н, д.д, OHPh-CH2); 3,30-3,53 (2Н, м, С^СНгРго); 3,69 (ЗН,е, О-СН,); 4,54 (1Н,д.д., СаН-Рго); 4,77 (1Н, м, -СН-СООСНз); 7,30 (1Н, д, NH-тирозина); 6,67 и 6,93 (4Н, м, Ph); 7,50 (1Н, ОН Ph); Цис-конформер: 0,85 (т, СН3(СН2)4); 2,9 и 3,14 (д.д, OHPh-CH2); 3,73 (с, О-СН3); 4,27 (д.д, С°Н-Рго); 6,36 (д, NH-тирозима); 6,75 и 6,90 (4Н, м, Ph); Транс/цис: 85:15

Т. пл., °С 191,0-197,5 95,0-97,0 95,5-97,5 119,0- 124,0

Потеря в массе при высуш-и, % 0,5-4,8 (130 °С) 0 - 0,07 (60 °С) 0-0,10(60 °С) 0-0,2(105 °С)

рН 2,2-2,7(1% раствор) 6,0 - 6,6 (0,5% раствор) 6,1 -6,7 (0,5% раствор) ...

Удельное вращение, ° — От-114,0 до-119,8° (2% раствор в хлороформе) От -1 16,5 до -119,0" (2% раствор в хлороформе) От -49,5 " до -51,0 (2% раствор в хлороформе)

Удельное поглощение Около 412 (302 им, раствор в 0,01М HCl) От 5,95 до 6,10 (258 им, раствор в этаноле 95%) от 5,92 до 6,02 (258 нм, раствор в этаноле 95%) Около 48 (278 нм, раствор в этаноле 95%)

В перечень показателей качества субстанций, помимо обязательных для включения в проект ФСП (согласно ОСТ 91500.05.001.00 «Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения»), для контроля качества ноопепта и дилептабыл включен показатель «Удельное вращение».

Химические методы в анализе новых нейротропных препаратов

Химические методы могут применяться для качественного и количественного анализа лекарственных средств. Для определения подлинности афобазола, ноопепта и дилепта возможно применение групповых химических реакций (например, гидроксамовая реакция на амидную связь пептидных производных или фармакопейная реакция на хлориды в анализе афобазола). Однако эти реакции неспецифичны, и при составлении проектов ФСП предпочтение было отдано спектральным и хроматографическим методам анализа. Фактически в проект ФСП была включена только одна качественная реакция -реакция на хлориды для субстанции афобазола.

При выборе метода количественного анализа субстанций изначально мы отдавали предпочтение более экономичным, простым и менее трудоемким фармакопейным методам, таким, как прямое кислотно-основное титрование. Однако в результате исследований подобрать условия титрования удалось только для субстанции афобазола. Для количественного определения субстанций ноопепта и дилепта был применен метод гидролиза в среде спиртового 0,1М раствора гидроксида калия с последующим определением избытка щелочи титрованием 0,1М раствором хлористоводородной кислоты, а также фармакопейный метод определения общего азота по Къельдалю. Фармакопейный метод позволил добиться высокой сходимости результатов и значительно снизить относительную ошибку количественного определения этих субстанций.

Для количественного анализа субстанции афобазола предложен метод неводного титрования в среде муравьиной кислоты и уксусного ангидрида 2:25, титрант - 0,1М раствор хлорной кислоты. В этих условиях протежирование идет по двум атомам азота, скачок потенциала в конечной точке титрования соответствовал переходу окраски индикатора от зеленовато-голубой до зеленой.

Содержание афобазола в субстанции составляло от 99,1 до 100,1% (табл. 2).

Для определения количественного содержания ноопепта и дилепта был выбран метод определения общего азота по Къельдалю (ГФ XII, часть 1). Для ускорения минерализации использовали металлический селен в качестве катализатора. Количественное содержание ноопепта в субстанции составляло от 98,6 до 99,2%, а дилепта - от 98,6 до 99,1% (табл. 3 и 4).

Таблица 2

Результаты количественного определения субстанции афобазола

№ серии 1 2 3 7 9

Количественное определение (%) Х = 99,08 Х = 99,44 Х = 99,75 Х = 100,12 X = 99,40

Метрологические Б = 0,24 5 = 0,16 8 = 0,21 8 = 0,16 8 = 0,11

характеристики ДХ = 0,30 ДХ = 0,19 ДХ = 0,26 ДХ = 0,20 ДХ = 0,14

(п=5, Р=95%) 8= 0,30% 8 = 0,20% 8 = 0,26% 8 = 0,20% 8 = 0,14%

Таблица 3

Результаты количественного определения субстанции ноопепта

№ серии 01-05 02-05 03-05 04-05 05-05

Количественное определение (%) Х = 99,04 Х= 99,18 Х = 98,60 Х = 98,72 Х= 98,68

Метрологические характеристики (п=5, Р=95%) 8 = 0,26 ДХ = 0,32 8= 0,33% 8 = 0,19 ДХ = 0,24 £ = 0,24% 8 = 0,08 ДХ = 0,1 £=0,10% 8 = 0,33 ДХ = 0,41 8 = 0,42% 8 = 0,13 ДХ = 0,16 £ = 0,16%

Таблица 4

Результаты количественного определения субстанции дилепта

№ серии 4-03 1-06 1-06ЭА 2-06 5-07

Количественное определение (%) Х= 98,84 Х= 98,72 Х= 98,75 Х= 98,58 Х= 99,13

Метрологические характеристики (п=5, Р=95%) Б = 0,06 ДХ = 0,08 8 = 0,33% 8 = 0,15 ДХ = 0,19 8= 0,38% 8 = 0,30 ДХ = 0,37 8= 0,05% 8 = 0,10 ДХ = 0,12 8= 0,12% 8 = 0,04 ДХ = 0,05 8= 0,08%

Хроматографические методы в качественном анализе новых нейротропных препаратов

Определение хроматографической чистоты афобазола, ноопепта и дилепта было проведено с помощью методов ТСХ и ВЭЖХ. Афобазол

Исследования методом ТСХ были проведены на пластинках 8Пи&1 № 254 и Клевере! 60 Р254. Для обнаружения зон адсорбции использовали УФ-свет с длиной

волны 254 нм и пары йода. Оптимального разделения афобазола и свидетелей примесей удалось добиться в системе растворителей ацетон - гексан -концентрированный раствор аммиака (20: 20: 0,5).

При определении примесей на пластинку наносили 100 мкг афобазола. Содержание примесей в субстанции и лекарственных формах афобазола оценивали путем сравнения величины и интенсивности зон адсорбции примесей и растворов PCO афобазола, нанесенных на пластинку по 0,2 мкг (0,2%), 0,15 мкг (0,15%) и 0,1 мкг (0,1%). Пригодность хроматографической системы оценивали по величине Rs афобазола (Rf около 0,27) и ЭМБ (Rf около 0,54), которая находилась в пределах 2,0 ± 0,3 и по интенсивности окраски зоны адсорбции свидетеля афобазола, нанесенного в количестве 0,1 мкг (пятно должно быть четко видно).

Методика позволяла разделить афобазол, промежуточные продукты его синтеза на последней стадии - ЭМБ и хлорэтилморфолин (ХЭМ), а также несколько неидентифицированных примесей (табл. 5 и 6).

Примеси ХЭМ ни в одном из образцов субстанции и лекарственных форм обнаружено не было, но в некоторых образцах была обнаружена примесь ЭМБ, а также ряд других примесей, идентифицировать которые не удалось (см. табл. 6).

Таблица 5

Соединение Параметры разделения Пределы и способы обнаружения

Силуфол УФ-254 Kieselgel 60F254

Rf Rs УФ-свет Пары йода УФ-свет Пары йода

Афобазол 0,27 ±0,04 1,00 0,10 мкг 0,03 мкг 0,02 мкг 0,03 мкг

ЭМБ 0,54 ±0,05 2,0 ± 0,2 0,12 мкг 0,05 мкг 0,03 мкг 0,05 мкг

ХЭМ 0,62 ±0,05 2,3 ± 0,2 - 0,8 мкг - 0,8 мкг

Таблица 6

Содержание посторонних примесей в субстанции и препаратах афобазола (ТСХ)

Rf примесей Субстанция Таблетки | Раствор для инъекций

Пределы содержания примесей в различных образцах, %

0,18 менее 0,20 менее 0,20 менее 0,20

0,36 — ... менее 0,20

0,40-0,42 0,10 менее 0,10 менее 0,15

ЭМБ (Rf 0,54) менее 0,15 0,10 менее 0,15

Сумма примесей менее 0,30 менее 0,30 менее 0,45

Нормы содержания примесей Индивидуальной примеси не более 0,2%, суммы - не более 0,4% Индивидуальной примеси не более 0,2%, суммы - не более 0,5%

При изучении хроматографической чистоты субстанции и препаратов афобазола методом ВЭЖХ в качестве свидетелей были использованы промежуточные продукты синтеза, которые могут присутствовать в субстанции и лекарственных формах афобазола как примеси, а также четыре продукта окисления афобазола.

Оптимальное разделение афобазола и веществ-свидетелей наблюдалось на колонке 250 х 4,6 мм, заполненной сорбентом Q8 с размером частиц 5 мкм (Luna С18(2)) в подвижной фазе ацетонитрил - метанол - 0,02М фосфатный буфер (рН 7,3) 100:100:240; режим элюирования изократический, скорость потока- 1 мл/мин, температура колонки комнатная (см. табл. 7).

Таблица 7

Пределы обнаружения и параметры разделения афобазола и примесей

jLA.

ю

10 II 12 U 14 1* 14 И 1» 19 20 31 32 23 34

Соединение Время удерживания (t уд), мин Относительное время удерживания (t отн) Пределы обнаружения, мкг(302 нм)* Rs** соседни х пар

АДК 1087(1) 3,81 ±0,08 0,33 ± 0,005 0,0023 —

АДК 1093(2) 5,23 ±0,10 0,45 ± 0,008 0,0032 4,73

ЭМБ (3) 6,32 ±0,10 0,55 ±0,007 0,0012 3,11

АДК 1090 (4) 7,01 ±0,11 0,61 ±0,008 0,0030 1,73

Фенацетин (5) 7,30 ± 0,07 0,63 ± 0,008 0,0300 1,11

3,4-диаминофенетол (6) 9,20 ± 0,06 0,81 ±0,010 0,0112 7,62

Афобазол (7) 11,51 ±0,23 1,000 0,0030 1,93

АДК 1092 (В) 16,62 ±0,12 1,45 ±0,010 0,0035 3,01

З-нитро-4-аминофенетол (9) 17,53 ±0,10 1,53 ±0,012 0,0070 1,33

ПНА (10) 22,55 ±0,10 1,98 ±0,007 0,0032 6,69

* Пределы обнаружения определены экспериментально

** Степень разделен!« (Яв) рассчитывали по формуле (гяг - гя[)/ С^г + \\'ы)/2, где От - 1щ) - расстояние между максимумами выбранных соседних пиков, в мин; а (\УЬ2 + \Уы)/2 -полусумма их ширин у основания, в мин

Длина волны детектирования соответствовала положению максимумов большинства исследуемых соединений и составляла 302 нм.

Прямолинейная зависимость площади пика от концентрации раствора афобазола наблюдалась в интервале от 0,0001 до 0,4 мг/мл, коэффициент корреляции 0,999. Для примесей линейность была подтверждена в интервале от 0,005 до 0,1 мг/мл (коэффициенты корреляции не менее 0,999).

Рабочая концентрация афобазола - 1 мг/мл, для расчета содержания примесей использован внешний стандарт - раствор афобазола с концентрацией 0,005 мг/мл.

Проверку пригодности хроматографической системы проводили по степени разделения афобазола и ЭМБ в тестовом растворе с концентрацией каждого соединения 0,05 мг/мл (не менее 6,0), а также по числу теоретических тарелок (не менее 4000), коэффициенту асимметрии (не более 1,5) и величине относительного стандартного отклонения (не более 2%), рассчитанных для пика афобазола.

В образцах субстанции и лекарственных форм афобазола были обнаружены примеси некоторых продуктов окисления афобазола, несколько неидентифицированных примесей, а также ЭМБ. Других промежуточных продуктов синтеза обнаружено не было (см. табл. 8).

Таблица 8

Содержание посторонних примесей в препаратах афобазола_

Наименования и относительные времена удерживания примесей Субстанция Таблетки 5 мг Раствор для инъекций 10 мг/мл

Пределы содержания примесей в различных образцах, %

0,27 (неидентифицир.) 0,01 -0,04 0,03-0,08 0,01-0,04

0,33 (АДК 1087) 0,02-0,06 0,02-0,04 0,01-0,07

0,45 (АДК 1093) — — 0,01-0,25

0,55 (ЭМБ) 0,05-0,10 0,01-0,10 0,04-0,30

0,62 (неидентифицир.) — 0-0,09 ...

0,72 (неидентифицир.) 0,01-0,07 0-0,14 0,01-0,11

Сумма примесей 0,05-0,17 0,04-0,34 0,07-0,64

Нормы содержания примесей Индивидуальной примеси не более 0,1%, суммы-не более 0,2% Индивидуальной примеси не более 0,15%, суммы-не более 0,4% Индивидуальной примеси не более 0,3%, суммы - не более 0,7%

Для контроля качества субстанции и препаратов афобазола были использованы обе методики. В проекты ФСП на субстанцию афобазола для производства таблеток и на таблетки афобазола была включена методика ТСХ. Позже, при подготовке проектов ФСП на субстанцию для производства

инъекционной лекарственной формы и раствор для инъекций методика ТСХ была заменена универсальной методикой ВЭЖХ, позволяющей проводить качественный и количественный анализ в одних и тех же условиях.

Ноопепт

Изучение хроматографической подвижности ноопепта и примесей в тонких слоях сорбента проводили на пластинках Kieselgel 60 F254 (Merck). Зоны адсорбции на хроматограммах проявляли в УФ-свете при 254 нм и в парах йода.

Наилучшего разделения ноопепта и свидетелей удалось добиться в двух системах н-бутанол - кислота уксусная ледяная - вода (5:1:2) и хлороформ -этанол (9:1) (табл. 9). Пределы обнаружения в этих системах ноопепта и свидетелей, и в парах йода, и в УФ-свете, были практически одинаковы и составляли около 5 мкг. Оптимальной системой для разделения ноопепта и примесей в субстанции и таблетках является смесь н-бутанол - кислота уксусная ледяная - вода (5:1:2) (система I). Для анализа лиофилизированной лекарственной была выбрана система хлороформ - этанол (9:1) (система II) из-за перекрывания зон адсорбции ФУК и вспомогательных веществ в системе I.

С помощью методик ТСХ примеси были обнаружены только в лиофилизированной лекарственной форме ноопепта (см. табл. 9), однако с помощью метода ВЭЖХ было показано, что отсутствие на хроматограммах зон адсорбции примесей объясняется низкой чувствительностью методик.

Таблица 9

Условия анализа, Rfсоединений и содержание примесей в препаратах ноопепта

Соединение Субстанция Таблетки 10 мг Лиофилизированная лекарственная форма 1 мг

Система I (Rf ноопепта 0,65 ±0,05) Система II (Rf ноопепта 0,60 ±0,07)

Rf и (содержание примесей, %)

ФУК 0,78± 0,06 (нет) 0,78± 0,06 (нет) 1,20 ±0,04 (менее 1%)

ФАПГ 0,50 ± 0,04 (нет) 0,50 ±0,04 (нет) 0,95 ± 0,02 (нет)

ФАП 0,62± 0,04 (нет) 0,62± 0,04 (нет) 0,77 ±0,02 (нет)

Содержание примесей Индивидуальной примеси не более 1%, суммы - не более 2%

Разделение ноопепта и примесей с помощью метода ВЭЖХ было проведено на колонках, заполненных сорбентом С18: стальной колонке Ultra 5 мкм Cis (250 мм х 4,6 мм) с предколонкой Ultra 5 мкм Cis (30 мм х 4,6 мм) и стальной колонке

Luna Cj8 (2) 5 мкм 250 мм x 4,6 мм), температура колонки комнатная. В качестве аналитической была выбрана длина волны, позволяющая максимально повысить чувствительность методики - 205 нм.

Оптимальных результатов удалось добиться в изократическом режиме при комнатной температуре в двух подвижных фазах: ацетонитрил - вода - ледяная уксусная кислота (500:500:1), скорость потока подвижной фазы 0,5 мл/мин (ПФ I) и ацетонитрил - 0,02М фосфатный буфер, доведенный до рН 2,75 фосфорной кислотой (300:800), скорость потока 1 мл/мин (ПФ II) (табл. 10).

Таблица 10

Времена удерживания и параметры разделения ноопепта и примесей

Соединение Время удерживания, t уд, мин Относительное время удерживания, t™ Степень разделения, Rs* Пределы обнаружения, мкг (205 нм) Число теоретических тарелок, N Фактор асимметрии

по пику ноопепта

ацетонитрил - вода - ледяная уксусная кислота (500:500:1), 0,5 мл/мин (ПФ I)

ФАПГ 5,8 ± 0,3 0,64 ±0,01 ... 0,0025 Не менее 6000 не более 1,5

ФАП 7,6 ±0,2 0,84 ± 0,01 1,67 ±0,02 0,0015

Ноопепт 9,0 ±0,3 1,00 1,35 ±0,03 0,0020

ФУК 9,7 ±0,3 1,08 ±0,01 1,00 ±0,02 0,0025

ацетонитрил - 0,02М фосфатный буфер, pH 2,75 (300:800), 1 мл/мин (ПФ II)

ФАПГ 5,7 ±0,2 0,38 ±0,01 ... 0,0045 Не менее 4500 не более 1,5

ФАП 9,7 ±0,2 0,65 ±0,01 2,72 ±0,03 0,0030

ФУК 12,2 ±0,2 0,82 ±0,01 1,85 ±0,02 0,0035

Ноопепт 14,8 ±0,3 1,00 1,93 ±0,02 0,0040

* Степень разделения (Rs) рассчитывали по формуле fe - tR))/ (Wbi + Wb2)/2

В ПФ I зависимость площади пика растворов ноопепта от их концентрации была прямолинейной в интервале от 0,002 до 0,15 мг/мл, а ФУК, ФАП и ФАПГ -от 0,002 до 0,1 мг/мл. В ПФ II зависимость площади пика от концентрации растворов ноопепта была прямолинейной в интервале концентраций от 0,002 до 0,2 мг/мл. Для растворов ФАПГ, ФАП и ФУК прямолинейная зависимость была подтверждена в интервале концентраций от 0,002 мг/мл до 0,1 мг/мл.

Исходя из полученных результатов, нами была выбрана рабочая концентрация ноопепта - 0,4 мг/мл. Содержание посторонних примесей оценивали по внешнему стандарту - раствору PCO ноопепта с концентрацией 0,004 мг/мл. Поправочные коэффициенты для примесей были близки к 1.

Проверку пригодности хроматографических систем проводили по степени разделения ноопепта и ФУК в растворе с концентрацией каждого соединения

0,004 мг/мл (не менее 1 в ПФ I и не менее 1,5 в ПФ 11), а также по числу теоретических тарелок (не менее 6000 в ПФ I и не менее 4500 в ПФ II), коэффициенту асимметрии (не более 1,5) и величине относительного стандартного отклонения (не более 2%), рассчитанных для пика ноопепта.

Результаты определения содержания примесей представлены в таблице 11.

Таблица 11

Результаты определения содержания примесей в субстанции и лекарственных __формах ноопепта__

Препарат ПФ Пределы содержания индивидуальной примеси, % Пределы суммы примесей, %

ФАПГ ФАП ФУК Неидентифициро-ванные примеси

Субстанция тип 1 I 0 0-0,21 0 Оо™ 0,89): 0 - 0,35 (1о™ 0,82): 0 - 0,44 0,11-0,78

II 0 0-0,09 0-0,12 Оото 0,68): 0 - 0,49 (и, 0,55): 0 - 0,37 0,18-0,80

Субстанция тип 11 I 0 0-0,14 0 0 0,04-0,14

II 0 0-0,12 0 0 0,04-0,12

Таблетки, 10 мг I 0 0-0,35 0 (^ 0,89): 0 - 0,48 0,82): 0 - 0,48 ((о™ 0,75): 0-0,35 (1™ 1,31): 0-0,13 0,09- 1,24

II 0-0,14 0-0,21 0-0,11 0,68): 0-0,45 (1отн 0,55): 0-0,44 (1™ 0,27): 0-0,29 0,11-1,06

Лиофилизи-рованная ЛФ, 1 мг/амп I 0,43 - 0,78 0-0,21 0 (и, 0,82): 0 - 0,24 (и, 0,89): 0-0,33 0,64-1,00

II 0,40-0,71 0-0,16 0-0,15 (и, 0,68): 0-0,34 0,40-0,94

Обе разработанные методики достаточно чувствительны, чтобы обнаружить известные примеси ноопепта в пробе при содержании 0,1%. Достоинством ПФ I являлась более высокая чувствительность и меньшее время анализа, а недостатком - невозможность точно оценить содержание ФУК из-за неполного разделения с ноопептом. Кроме того, при анализе чистоты таблеток ноопепта в ПФ I пики, принадлежавшие плацебо, перекрывали пики ФАПГ и ФАП, что мешало определению этих примесей. В ПФ II пики вспомогательных веществ не мешали определению примесей, примесь ФУК полностью отделялась от ноопепта, однако возможность ее обнаружения, также как и других примесей, ограничивалась более низкой чувствительностью методики. Время анализа в ПФ II почти в два раза больше, чем в ПФ I. Однако, несмотря на указанные недостатки, применение ПФ

II представляется более целесообразным, поскольку она может быть использована как для анализа субстанции, так и лекарственных форм ноопепта.

Дилепт

Изучение хроматографической подвижности субстанции и таблеток дилепта в тонких слоях сорбента показало, что разделение дилепта и промежуточных продуктов синтеза наблюдается как в кислых, так и в основных системах. Однако основным недостатком метода тонкослойной хроматографии при анализе субстанции и препаратов дилепта была невозможность добиться высокой чувствительности методик с применением универсальных способов детектирования (см. табл. 12). Ни в одном из образцов субстанции и таблеток дилепта примесей обнаружено не было.

Таблица 12

Параметры разделения и пределы обнаружения дилепта и технологических

примесей (пластинки К1езе^е1 60 система хлороформ: метанол: _концентрированный раствор аммиака (100:24:3)_

Соединение Параметры разделения Пределы и способы обнаружения

Rf Rs УФ-свет Пары йода

Дилепт 0,70 ± 0,05 1,00 0,50 мкг 0,20 мкг

МЭТ 0,56 ±0,05 0,81 ±0,03 2,00 мкг 0,05 мкг

КП 0,14 ±0,03 0,20 ± 0,02 10,00 мкг 1,00 мкг

КПТ 0,06 ±0,01 0,09 ± 0,02 0,75 мкг 0,10 мкг

Хроматографическое разделение дилепта и его примесей с помощью ВЭЖХ проводили на стальной колонке Ultra 5 мкм С18, 250 мм х 4,6 мм с предколонкой Ultra 5 мкм С]8, 30 мм х 4,6 мм. Аналитическая длина волны при анализе субстанции составляла 205 нм, а при анализе таблеток - 230 нм, поскольку при 205 нм определению примесей мешали компоненты плацебо.

Разделение исследуемых веществ (табл. 13) было достигнуто в изократическом режиме в подвижной фазе ацетонитрил - вода - ледяная уксусная кислота (500:500:1), скорость потока подвижной фазы - 0,5 мл/мин, температура колонки комнатная. Пробы растворяли в подвижной фазе, объем пробы 20 мкл.

Прямолинейная зависимость площади пика от концентрации растворов дилепта при 205 нм наблюдалась в интервале от 0,0002 до 0,1 мг/мл (коэффициент корреляции 1), для примесей она была подтверждена в интервале от 0,0002 до 0,02 мг/мл, при коэффициентах корреляции 0,999. Линейная зависимость площадей

пиков от концентрации растворов дилепта, МЭТ и КПТ при 230 нм наблюдалась в интервале от 0,0004 до 0,1 мг/мл, а КП - от 0,002 до 0,1 мг/мл.

Таблица 13

Времена удерживания, параметры разделения и пределы обнаружения дилепта и

примесей

Соединение Время удерживания, 1 уд, мин Относительное время удерживания, ^ Степень разделения, Пределы обнаружения, мкг Число теоретических тарелок, N (по пику ноопепта) Фактор асимметрии (по пику ноопепта)

205 нм 230 нм

дилепт 11,8 ±0,3 1 — 0,0020 0,0070 Не менее 4000 Не более 1,5

КП 9,1 ±0,2 0,77 ± 0,02 1,5 0,0040 0,0170

КПТ 7,5 ±0,3 0,64 ± 0,02 1,9 0,0020 0,0070

МЭТ 5,2 ±0,1 0,44 ±0,01 4,4 0,0015 0,0050

* Степень разделения (Яб) рассчитывали по формуле От - tR.iV (\УМ + \Уы)/2

Рабочая концентрация дилепта в растворах - 0,1 мг/мл, оценку содержания примесей проводили по внешнему стандарту - раствору дилепта 0,001 мг/мл. Поправочные коэффициенты составили 1,22 для МЭТ, 0,96 для КПТ и 1,95 для КП. Поскольку ни в одном из образцов субстанции и таблеток этих соединений обнаружено не было, из расчетной формулы коэффициенты были исключены.

Проверку пригодности хроматографической системы проводили по степени разделения дилепта и МЭТ в тестовом растворе с концентрацией каждого соединения 0,01 мг/мл (не менее 6,1), по числу теоретических тарелок (не менее 4000), коэффициенту асимметрии (не более 1,5) и величине относительного стандартного отклонения (не более 2%), рассчитанных для пика дилепта.

Методики определения посторонних примесей в субстанции и таблетках дилепта с помощью ВЭЖХ позволяли обнаружить примеси в содержании значительно менее 1%. В образцах субстанции и таблеток дилепта были обнаружены только неидентифицированные примеси (см. табл. 14).

Таблица 14

Результаты определения посторонних примесей в субстанции и лекарственных __формах дилепта_

Препарат Относительные времена удерживания и пределы содержания индивидуальной примеси, % Пределы суммы примесей, %

0,63 ±0,03 0,46 ±0,03 0,49 ±0,03 0,70 ±0,03 0,77 ±0,03 1,35 ±0,03 1,59 ±0,03

Субстанция 0-0,10 0-0,12 0-0,13 0-0,13 0-0,12 0-0,16 0-0,49 0,47 - 0,74

Таблетки, 20 мг 0 0 0 0 0 0-0,10 0 - 0,22 0,18-0,30

Определение остаточных растворителей

Определение остаточных растворителей в субстанциях афобазола. ноопепта и дилепта проводили методом газожидкостной хроматографии. Нами были подобраны условия, позволяющие разделить эгилацетат. этиловый спирт, изопропиловый спирт, ацетон и н-бутанол при совместном присутствии в водном растворе (рис. 1).

Анализ был проведен на стеклянной колонке длиной 2,4 м и внутренним диаметром 3 мм, заполненной сорбентом 15% СаНктах 1500 на СЬготаГоп Т^-А\У-ОМСБ (0,200 - 0,250 мм). Газ-носитель - азот, скорость подачи - 40 мл/мин; скорость водорода - 40 мл/мин, воздуха - 400 мл/мин. Температура испарителя -160 °С, детектора - 130 °С. Температура термостата программировалась: ]

поддерживалась на уровне 70 °С в течение 4 мин, затем температуру поднимали до 120 °С со скоростью 20 °С и поддерживали на уровне 120 °С в течение 6 мин. В качестве растворителя использовали воду, объем пробы 1 мкл.

Линейная зависимость отклика детектора от концентрации всех указанных растворителей наблюдалась в диапазоне концентраций от 0,004 до 0,08 мг/мл при коэффициентах корреляции 0,998 и более. Пределы обнаружения составили для н-бутанола - 0,0015 мг/мл (0,0015 мкг), для этанола и этилацетата - 0,003 мг/мл (0,003 мкг). для изопропилового спирта и ацетона - 0,002 мг/мл (0,002 мкг).

При определении остаточных растворителей в субстанциях препаратов в качестве внутреннего стандарта был выбран н-бутанол, расчет производили с

5

3

2

Рис. 1. Хроматограмма модельного раствора ацетона (1), изопропилового спирта (2), этилацетата (3), этилового спирта 95% (4) и н-бутанола (5) в воде (по 0,04 мкг каждого растворителя)

применением поправочных коэффициентов. В образцах субстанции афобазола был обнаружен этанол в содержании от 0 до 0,08%, в субстанции ноопепта -этилацетат в содержании от 0 до 0,07%, а в субстанции дилепта остаточных растворителей обнаружено не было.

Таким образом, изучение хроматографической подвижности афобазола, ноопепта и дилепта в субстанциях и лекарственных формах, а также промежуточных продуктов их синтеза и продуктов деструкции показало, что большей селективностью и чувствительностью обладают методики ВЭЖХ. Из-за этих характеристик, а также из-за универсальности метода, позволяющего одновременно проводить и качественный и количественный анализ, в проекты ФСП на субстанции и лекарственные формы новых лекарственных средств преимущественно включены методики ВЭЖХ. Тонкослойная хроматография, как метод определения посторонних примесей, была включена только в ФСП на субстанцию для изготовления таблеток и таблетки афобазола, поскольку методики ВЭЖХ были на стадии разработки (ФСП 42-0067620605 (субстанция), ФСП 420055622105 (таблетки 5 мг) и ФСП 42-0055708505 (таблетки 10 мг)).

Метод газовой хроматографии был традиционно применен для определения остаточных растворителей в субстанциях афобазола, ноопепта и дилепта. При проведении исследований содержание остаточных растворителей контролировалось во всех образцах субстанций, однако определение самого показателя мы предложили проводить только для субстанции афобазола (поскольку потеря в массе субстанции превышает 0,5%) и для стандартного образца ноопепта. В проектах ФСП на субстанции ноопепта и дилепта был включен только показатель «Потеря в массе при высушивании», значение которого для обеих субстанций не превышало 0,5%.

Спектральные и хроматографические методы в количественном анализе новых нейротропных препаратов

Афобазол

Для количественного анализа афобазола в лекарственных формах были разработаны методики УФ-спектрофотометрии (УФ-СФМ) и ВЭЖХ.

Количественное определение афобазола методом УФ-СФМ было проведено при специфическом максимуме спектра, 302 нм, в растворах и извлечениях в 0.1 М растворе хлористоводородной кислоты. Прямолинейная зависимость оптической плотности от концентрации растворов наблюдалась от 0,002 до 0,02 мг/мл (коэффициент корреляции 0,999), рабочая концентрация 0,015 мг/мл (рис. 2).

% 1 0,9

-0 ь 0,8

о X 0,7

5 0,5

§ 0,5

1 0,4

И 0,3

г X 0,2

Ё 0,1

о

0

У = 4 2.063 X + 0.0012

рг = 0.9999

0005 0,01 0,015

Концентрация, иг/ил

0,02

0,025

Рис. 2. Зависимость оптической плотности от концентрации растворов афобазола в 0,01М хлористоводородной кислоте

При разработке методики количественного определения таблеток нами было показано, что компоненты плацебо практически не вносят вклад в оптическую плотность испытуемых растворов. Результаты количественного определения афобазола в таблетках и растворах для инъекций представлены в таблице 15.

Таблица 15

Результаты количественного определения образцов таблеток афобазола 5 мг и _растворов для инъекций 10мг/мл методом УФ-СФМ _

Номер серии |1|2|3|4|5|6

Таблетки, 5 мг

Содержание, мг 5,29 4,75 5,04 5,40 5,12 5,00

Метрологические характеристики (Р = 95%, п = 5) 5=0,034 \Х =0,042 £•=0,80% 5 = 0,043 ДХ =0,053 ¿>1,13% 5 = 0,042 ДХ =0,052 £=1,03 % 5 = 0,051 \Х =0,063 £=1,17% 5 = 0,058 ДХ=0,072 £=1,41% 5 = 0,019 ДХ =0,024 £=0,47%

Растворы для инъекций, 10 мг/мл

Содержание,мг/мл 10,12 10,53 9,94 10,31 9,83 —

Метрологические характеристики (Р=95%, п=5) 5 = 0,038 ДЛ' = 0,047 £= 0,46% 5 = 0,072 ДХ= 0,090 £= 0,85% 5 = 0,049 ЬХ =0,061 £=0,61% 5=0,053 ДХ = 0,066 £= 0,64 % 5=0,091 дХ = 0Д13 £= 1,15% —

Количественное определение афобазола в лекарственных формах методом ВЭЖХ проводили в условиях определения посторонних примесей, что обеспечивало методике специфичность.

Прямолинейная зависимость площади пика от концентрации растворов афобазола наблюдалась в интервале от 0.00004 до 0.1 мг/мл (рис. 3), рабочая концентрация 0,008 мг/мл, количественное содержание рассчитывали относительно внешнего стандарта - PCO афобазола.

На модельных смесях плацебо таблеток и афобазола было показано, что вспомогательные вещества не мешают проведению анализа. Результаты количественного определения таблеток и инъекционных растворов афобазола методом ВЭЖХ представлены в таблице 16.

Разработанная методика ВЭЖХ обладала большей специфичностью, однако относительная ошибка определения методом УФ-СФМ была несколько ниже, и кроме того, методика УФ-СФМ значительно экономичнее. Поэтому в тех случаях, когда селективность и точность методики являлись критичными показателями (при количественном определении афобазола в препаратах или при количественном анализе раствора афобазола для инъекций, легко подвергающегося деградации на свету) мы предложили использовать ВЭЖХ. Тогда же, когда важна скорость и экономичность анализа (при определении показателя «Растворение» и однородности дозирования стабильных при хранении таблеток афобазола), мы рекомендовали использовать методики УФ-СФМ.

5000 я ■

л 3000

S

3

1Ü I .

ОДОЗД С.ВШ« о

0.1* 12

у - 63Т94Х - 5,4724

0,04 0,06 0,08

Концентрация, мг/мл

Рис. 3. Зависимость площади пика от концентрации растворов афобазола

Таблица 16

Результаты количественного определения препаратов афобазола методом ВЭЖХ

Номер серии | 1 2 | 3 | 4 | 5

3 "аблетки афобазола, 5 мг

Содержание, мг 5,32 4,81 5,11 4,98 5,09

Метрологические характеристики (Р=95%, п=5) 5 = 0,052 ДХ = 0,065 £ = 1,22% 5=0,031 ДХ = 0,039 £= 0,80% 5=0,067 АХ = 0,083 £= 1,63% 5 = 0,059 АХ = 0,073 £= 1,47% 5=0,046 ДХ = 0,057 <£"= 1.12%

Растворы для инъекций, 10 мг/мл

Содержание,мг/мл 10,08 10,13 9,78 10,53 9,77

Метрологические характеристики (Р=95%, 11=5) 5 = 0,050 АХ = 0,061 £"=0,62% 5=0,134 АХ = 0,167 £ = 1,64% 5=0,053 АХ = 0,062 £"=0,64% 5=0,101 АХ = 0,125 £-1,19% 5 = 0,084 iJ( = 0,104 £■=1,09%

Определение однородности дозирования таблеток афобазола проведено в условиях количественного определения методом УФ-СФМ. Ни в одном из серийных образцов отклонения не превышали 7,0%

При определении показателя «Растворение» на приборе «Вращающаяся корзинка» при скорости вращения 100 об/мин, температуре 37±1°С в среде 0,01М раствора кислоты хлористоводородной (объем 500 мл), высвобождение афобазола из всех образцов таблеток за 20 мин составляло не менее 86% (рис. 4).

Время, мин

Рис. 4. Кинетика высвобождения афобазола из таблеток в 0,01M НС1

Ноопепт

Показана возможность количественного определения ноопепта в субстанции методами УФ-СФМ и ВЭЖХ с применением стандартного образца (одного из образцов субстанции ноопепта, кристаллизованной по способу II).

В УФ-спектрах в спирте этиловом 95% наиболее выраженный специфический максимум ноопепта находится в пределах 258 ± 2 нм. При 258 нм

прямолинейная зависимость оптической плотности растворов от концентрации наблюдается в пределах интервала от 0,2 до 1,6 мг/мл, коэффициент корреляции 0,999 (см. рис. 5), рабочая концентрация - 1.0 мг/мл. Результаты количественного определения ноопепта в образцах субстанции (тип 1) представлены в таблице 17.

Концентрация, мг/мл

Рис. 5. Зависимость оптической плотности растворов ноопепта от концентрации

Таблица 17

Результаты количественного определения субстанции ноопепта методом УФ-СФМ

Номер серии 1-05 2-05 3-05 4-05 5-05

Среднее значение, % 99,49 99,49 100,51 101,54 99,56

Метрологические характеристики (п=5, Р=95%) 8=0,35 ДХ =0,44 £=0,44% 8=0,35 ДХ =0,44 £=0,44% 8=0,55 ДХ =0,69 £=0,68% 8=0,42 АХ =0,52 £=0,52% 8=0,37 ДХ =0,46 £=0,47%

При модификации методики для анализа таблеток ноопепта было показано, что вспомогательные вещества при аналитической длине волны вносят вклад в оптическую плотность испытуемого раствора, и при расчете содержания ноопепта это необходимо учитывать. Результаты количественного определения ноопепта в таблетках дозировкой 10 мг представлены в таблице 18.

Таблица 18

Результаты количественного определения таблеток ноопепта методом УФ-СФМ

Номер опыта 1-05 2-05 3-05 4-05 5-05

Содержание (мг/т) 9,4 9,8 9,9 10,7 10,3

Метрологические характеристики (Р=95%, п=5) 5=0,133 ДХ =0,165 £= 1,76% 5=0,092 ДХ =0,114 £ = 1,17% 5 = 0,101 ДХ =0,126 £= 1,27% 5 = 0,058 ДХ =0,072 £=0,67% 5 = 0,126 ДХ =0,157 £= 1,52%

При анализе лиофилизированной лекарственной формы ноопепта для растворения проб использовали воду очищенную. Поскольку маннит, входящий в

состав лекарственной формы очень мало растворим в спирте этиловом 95%, при растворении препарата в спирте необходимо было фильтровать пробы, что приводило к потере ноопепта из-за низкой дозировки. В воде препарат растворялся полностью. Положение максимума УФ-спектров растворов ноопепта в воде соответствовало положению максимумов спиртовых растворов.

Прямолинейная зависимость оптической плотности от концентрации растворов ноопепта наблюдалась в пределах интервала от 0,1 до 1,4 мг/мл, коэффициент корреляции 0,999, рабочая концентрация - 0,4 мг/мл. Вклад плацебо (маннита) учитывался в расчетной формуле. Результаты количественного анализа образцов лиофилизированной лекарственной формы представлены в таблице 19.

Таблица 19

Результаты количественного определения лиофилизированной инъекционной _лекарственной формы ноопепта методом УФ-СФМ _

Номер серии 070606 080606 090606 100607 110608

Содержание (мг/амп) 1,002 1,001 1,007 1,005 1,004

Метрологические характеристики (Р=95%, п=5) 5=0,0111 ДХ =0,0138 £= 1,38% 5= 0,0067 АХ =0,0083 £= 0,83% 5=0,0092 ДХ =0,0114 ~£= 1,14% 5=0,0120 ДХ =0,0149 £= 1,48% 5=0,0076 ДХ =0,0094 £=0,94%

Количественное определение субстанции и лекарственных форм ноопепта методом ВЭЖХ было проведено в условиях определения посторонних примесей (в ПФ I и ПФ 11) при длине волны 258 нм. Прямолинейная зависимость площади пика от концентрации растворов ноопепта в ПФ 1 наблюдалась в интервале от 0,0025 до 0,9 мг/мл, а в ПФ II - от 0,005 до 1,0 мг/мл (коэффициенты корреляции 0,999, рис. 6, 7). В качестве рабочей выбрана концентрация 0,4 мг/мл.

Анализ лекарственных форм ноопепта показал, что при 258 нм пики вспомогательных веществ на хроматограммах отсутствуют.

Относительная ошибка количественного определения субстанции и лекарственных форм ноопепта в ПФ I и II не превышала 2,1% (табл. 20, 21, 22).

<7 ЮОО

я

5 600

-- го

у

к"""*

у — 16 Т 7.5х ♦ 3.9MS R2 =0.9999

0,00? О.ЕСЛ О/ХЖ П.ООЗ О.П1 О.С п

У

_I 0,1 0.2 0.a 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.8

Концентрация, мг/мп

Рис. 6. Зависимость плошади пика от концентрации растворов ноопепта (ПФ I)

900 800 700

к 600

i- •

s _

S 400 -i

I soo -

с; с.

200 -

i ,00------

О ......

I 0

у = а00.45ж » 2,8558

R = о.аэа?

0,2 0,3 0,4 0,Ь 06 0,7 0,8 0.9 Концентрация, иг/мл

Рис.7.3ависимость площади пика от концентрации растворов ноопепта (ПФ II)

Таблица 20

Номер серии I -05 2-05 3-05 4-05 5-05

ПФ I

Содержание (%) Х = 99,\9 X =99,30 X = 100,37 X =99.69 X = 99,79

Метрологические 5 =0,94 5=0,78 5=0,67 5= 1,23 5= 1,45

характеристики АХ = I.17 ДХ = 0,97 АХ = 0,83 АХ = 1,53 ДА' = 1,80

(Р=95%, п=5) £= 1,18% ¿7=0,98% £=0,83% £ = 1,53% £ = 1,81%

ПФ II

Содержание (%) X = 99,79 X =98,85 X = 99,82 X = 99,38 X = 100,26

Метрологические 5= 1,06 5= 1,31 5=0,49 5=0,84 5= 1,12

характеристики АХ = 1,32 АХ= 1.63 АХ = 0,61 ДХ= 1,04 АХ = 1,39

(Р=95%, п=5) £= 1,32% £= 1,65% £=0,61% £= 1,05% £= 1,39%

Таблица 21

Результаты количественного определения таблеток ноопепта 10 мг_

Номерсерии 1-05 2-05 3-05 4-05 5-05

ПФ I

Содержание, мг 9,71 9,95 10,06 10,32 9,58

Метрологические 5=0,063 5=0,109 5=0,143 5=0,087 5 = 0,121

характеристики ДХ =0,078 ДХ = 0,136 ДХ = 0,178 ДХ = 0,108 ДХ = 0,150

(Р=95%, п=5) £■=0,81% £= 1,36% £"=1,78% £=1,05% £= 1,57%

ПФ II

Содержание, мг 9,90 9,79 10,23 10,20 9,44

Метрологические 5 = 0,113 5=0,117 5=0,094 5 = 0,132 5 = 0,158

характеристики ДХ =0,140 ДХ = 0,145 ДХ = 0,117 ДХ = 0,164 ДХ = 0,196

(Р=95%, п=5) £"=1,41% £ = 1.48% £ = 1,14% £ = 1.61% £= 2,08%

Таблица 22

Результаты количественного определения лиофилизированного ноопепта

Номер серии 070606 080606 090606 100607 110608

ПФ I

Содержание (мг) Х= 1,004 X =0,998 X = 1,006 X =1,007 X = 1,002

Метрологические характеристики (Р=95%, п=5) 5=0,0126 ДХ =0,0157 £= 1,56% 5=0,0084 ДХ =0,0104 £= 1,04% 5=0,0131 ДХ =0,0163 £= 1,62% 5 = 0,0148 ДХ =0,0184 £= 1,83% 5=0,0130 ДХ =0,0162 £= 1,62%

ПФ II

Содержание (мг) Х= 1,003 X = 0,993 X = 1,005 X =1,007 X = 1,003

Метрологические характеристики (Р=95%, п=5) 5=0,0077 ДХ =0,0096 £=0,95% 5=0,0104 ДХ =0,0129 £= 1,30% 5=0,0098 ДХ =0,0122 £= 1,21% 5=0,0125 ДХ =0,0155 £= 1,54% 5 = 0,0119 ДХ =0,0148 £= 1,48%

Таким образом, количественное определение ноопепта как в субстанции (с применением стандартного образца), так и в лекарственных формах, можно проводить с помощью УФ-спектрофотометрии и ВЭЖХ. Однако при изучении стабильности нами показано, что ноопепт подвержен гидролизу с образованием примеси ФАПГ, максимумы УФ-спектра которой совпадают с максимумами спектра ноопепта. Поэтому селективные и универсальные методики ВЭЖХ с применением ПФ II рекомендованы нами как для количественного определения ноопепта, так и для определения однородности дозирования его лекарственных форм и показателя «Растворение» для таблеток.

Отклонения в однородности дозирования таблеток ноопепта не превышали 5,5%, а образцов лиофилизированной лекарственной формы - 2%.

Высвобождение ноопепта из таблеток при определении показателя «Растворение» за 45 мин составляло около 80-90% (прибор «Вращающаяся корзинка», скорость вращения - 100 об/мин, температура - 37 ± 1°С, среда растворения - 500 мл воды очищенной, рис. 8). 120

х 80

ч

* 60 о

о 40

ш

2 20 Ш О

1

7

/ У

20

30

40

50

Воемя. мин

Рис. 8. Кинетика высвобождения ноопепта из таблеток в воде очищенной Дилепт

Количественное определение дилепта в таблетках методом УФ-СФМ было проведено в спиртовых растворах при 278 нм. Прямолинейная зависимость оптической плотности растворов дилепта от концентрации наблюдалась в интервале от 0,01 до 0,2 мг/мл, при коэффициенте корреляции 0,999 (рис. 9), рабочая концентрация - 0,1 мг/мл (оптическая плотность 0,45).

ч:

о

/ 0,8

о

г о,б

о с

с 0,4

2 0,2 у

Ё 0

.......... ^

У = 4,3342Х + и,ии4о

^ = 0,9997

0,2

0 0,04 0,08 0,12 0,16 Концентрация, мг/мл

Рис.9. Зависимость оптической плотности от концентрации растворов дилепта в этиловом спирте 95%

На модельных смесях дилепта и плацебо было показано, что компоненты вспомогательных веществ практически не вносят вклад в оптическую плотность испытуемых растворов. Извлечение дилепта из модельных смесей с плацебо происходило достаточно полно, относительная ошибка определения не превышала

2%. Результаты количественного определения дилепта в таблетках представлены в таблице 23.

Таблица 23

Результаты количественного определения таблеток дилепта методом УФ-СФМ

Номер серии 1-07 2-07 3-07 4-07 5-07

Содержание, мг/мл 19,03 19,21 19,38 19,87 19,65

Метрологические характеристики (Р=95%, п=5) в = 0.24 ДХср=0,30 £=1,57% 8 = 0,11 ДХср= 0,14 £ = 0,71% Б = 0,07 ДХср = 0,09 £ = 0,45% 8 = 0,16 ДХср= 0,20 е= 1,00% 8 = 0,14 ДХср = 0,17 £ = 0,82%

Количественное определение таблеток дилепта с помощью ВЭЖХ было проведено в условиях определения посторонних примесей, при 278 нм. Пики вспомогательных веществ на хроматограмме отсутствовали. Прямолинейная зависимость площади пика от концентрации растворов наблюдалась в интервале от 0,004 до 1 мг/мл (см. рис. 10), рабочая концентрация 0,1 мг/мл.

14000

12000——;

2 10000—

к

5 8000

л 6000—~

3

с 4000——

сг

2000

ГоШС-___-_-

I .0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 Конценгрзция. мг/мл

Рис. 10. Зависимость площадей пиков растворов дилепта от их концентрации

На модельных смесях практически полное извлечение дилепта из таблеток в подвижную фазу наблюдалось через 10 мин встряхивания, относительная ошибка не превышала 2% (п=9, Р=95%). Результаты анализа серийных образцов таблеток методом ВЭЖХ представлены в таблице 24.

Определение однородности дозирования таблеток дилепта предложено проводить методом ВЭЖХ в условиях количественного определения. Отклонения по показателю серийных образцов таблеток не превышали ±7%.

___„______

О ] 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0,6 0.7 0.8 0.9 1 1. Концентрация, мг/мл

Таблица 24

Результаты количественного определения таблеток дилепта методом ВЭЖХ

Номер серии 1-07 2-07 3-07 4-07 5-07

Содержание, мг/т 19,08 18,98 18,99 19,12 19,15

Метрологические характеристики (Р=95%, п=5) S=0,08 ДХср=0,1 £=0,52% S=0,02 ДХср=0,02 £=0,13% S=0,05 ДХсР=0,06 £=0,33% S=0,29 ДХср=0,36 £=1,81% S=0,13 ДХср=0,16 £ =0,84%

Для оценки степени высвобождения дилепта из таблеток при определении показателя «Растворение» был выбран метод УФ-СФМ. Анализ проводили на приборе «Вращающаяся корзинка», скорость вращения - 100 об/мин, температура 37 ± ГС. Среда растворения - 500 мл смеси изопропилового спирта и воды (2:8).

Аналитическая длина волны при количественном определении соответствовала максимуму растворов дилепта в среде растворения - 276 нм. Линейная зависимость площади пика от концентрации наблюдалась от 0,01 до 0,5 мг/мл, коэффициент корреляции 0,999. Рабочая концентрация - 0,04 мг/мл.

В выбранных условиях за 45 мин высвобождение дилепта из таблеток происходило на величину порядка 90% (88% и более, рис. 12).

0 10 20 30 40 50 Время, мин

Рис. 12. Кинетика высвобождении дилепта из таблеток

Изучение стабильности новых нейротропных препаратов под влиянием факторов внешней среды

В рамках изучения стабильности афобазола, ноопепта и дилепта изучена гигроскопичность субстанций и их стабильность в условиях 90% влажности, под действием солнечного света, окислителя (3% раствора водорода пероксида), стабильность растворов субстанций в воде и в 0,1М растворах хлористоводородной кислоты (HCl) и натрия гидроксида (NaOH).

Хроматографическую чистоту проб оценивали методом ВЭЖХ.

Исследования показали, что субстанция афобазола гигроскопична и в условиях 90% влажности способна поглощать до 12% влаги от собственного веса без изменения внешнего вида и хроматографической чистоты.

В разбавленных растворах HCl и NaOH наблюдалась деструкция афобазола: в 0,1 М HCl она проходила преимущественно с образованием АДК 1093 и ЭМБ, а в 0,IM NaOH - с образованием АДК 1090. Других примесей обнаружено не было.

Действие 3% перекиси водорода приводило к быстрой деградации афобазола с образованием АДК 1087, АДК 1093, АДК 1090, а также трех неидентифицированных примесей. Суммарное содержание примесей после 4 дней хранения составило около 8%.

При хранении субстанции афобазола на свету в образцах также наблюдалось появление продуктов деградации, основным из которых являлся ЭМБ. После 8 недель хранения суммарное содержание примесей составило 0,77%.

Хранение на свету инъекционных растворов афобазола вызывало его разложение значительно быстрее, через 4 недели суммарное содержание примесей составило около 30%, а через 8 недель - около 43%. При этом среди продуктов деградации в растворах были обнаружены ЭМБ и продукты окисления афобазола - АДК 1090, АДК 1092, АДК 1093 и АДК 1087.

Субстанции ноопепта и дилепта негигроскопичны, устойчивы к действию солнечного света. Однако воздействие на них 3% перекиси водорода в течение 7 суток приводило к появлению дополнительных пиков примесей на хроматограммах, суммарное содержание которых в образцах ноопепта составляло около 4,5%, а в образцах дилепта - около 3%.

Основным путем гидролиза ноопепта и дилепта в водных средах является гидролиз по сложноэфирным связям с образованием соответствующих кислот (ФАПГ и КПТ соответственно). В воде появление этих продуктов происходило через сутки, через месяц в образцах ноопепта содержание их составляло около 1%, а в образцах дилепта - около 4%. В 0,1М HCl содержание кислоты ноопепта уже через сутки составляло около 15%, дилепт за тот же срок гидролизовался по сложноэфирной связи на 5%. В 0,1М NaOH содержание кислот обоих соединений через сутки составляло около 99%. Гидролиз ноопепта и дилепта в 0,1М HCl и

№0Н также проходил и по амидным связям, но суммарное содержание продуктов гидролиза по истечении месяца не превышало 5%.

Сроки годности субстанции и лекарственных форм афобазола, ноопепта и дилепта определены методом ускоренного старения и в естественных условиях.

При хранении субстанции и лекарственных форм учитывалась чувствительность афобазола к действию солнечного света и окислителей.

Хранение раствора афобазола для инъекций в естественных условиях в течение 2 лет приводило к незначительному увеличению содержания посторонних примесей в препарате (до 0,3%), а также, в некоторых случаях, к незначительному изменению интенсивности окраски (до соответствия эталону 66). Хранение лиофилизированной лекарственной формы ноопепта в естественных условиях приводило к незначительному гидролизу с образованием ФАПГ под действием содержащейся в препарате влаги (содержание ФАПГ около 1%). Качество субстанций и таблеток афобазола, ноопепта и дилепта после хранения в течение двух лет практически не изменилось по сравнению с исходными показателями. Сроки годности лекарственных средств составили 2 года.

Установление норм качества новых нейротропных препаратов - Определение показателей и норм качества новых нейротропных препаратов было проведено согласно требованиям ОСТа 91500.05.001.00 «Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения», а также ГФ СССР XI издания.

В таблицах 25-33 представлены показатели, методы и результаты анализа и нормы качества субстанций и лекарственных форм афобазола, ноопепта и дилепта.

Таблица 25

Показатели методы анализа, результаты и нормы качества субстанции афобазола

Показатели Методы Результаты анализа Нормы качества

1 2 3 4

Описание Визуально Белый или белый с кремоватым оттенком кристаллический порошок

Растворимость ГФ XI Легко растворим в воде, растворим в спирте 95%, мало растворим в хлороформе

Подлинность ИК-спектр Соответствие прилагаемому рисунку

УФ-спектр Наличие максимума при 302 ± 2 нм

Реакция на хлориды Образование белого осадка, растворимого в избытке раствора аммиака

1 2 3 4

Темп, плавления ГФ XI,метод 1а От 191,0 до 197,5 °С От 190,0 до 198,0 °С

Прозрачность ГФ XI, 1% раствор в воде Прозрачен или не превышает эталонный раствор I Не должен превышать эталонный раствор I

Цветность Бесцветный или не превышает эталон №76 Должен быть бесцветным или не превышать эт. №76

рН От 2,2 до 2,7 От 2,0 до 3,0

Посторонние примеси тех* Индивидуальной примеси - не более 0,2%; суммы -не более 0,3% Индивидуальной примеси -не более 0,2%; суммы - не более 0,5%

ВЭЖХ** Индивидуальной примеси -не более 0,1%; Суммы - не более 0,17% Индивидуальной примеси - не более 0,2% Суммы - не более 0,4%

Сульфатная зола ГФ XI Менее 0,1 % Не более 0,1%

Тяжелые металлы ГФ XI Менее 0,001% Не более 0,001%

Потеря в массе при высушивании ГФ Х1(130°С) От 0,5 до 4,8% Не более 5,0%

Остаточные органические растворители ГХ Спирт этиловый -менее 0,08% Спирт этиловый -Не более 0,5%

Микробиологическая чистота ГФ XI и Изменение № 3 Категория 2.2*

Категория 1.2.Б**

Пирогенность** ГФ XI Субстанция апирогенна Должна быть апирогенна

Количественное определение Неводное титрование От 99,08 до 100,12% в пересчете на сухое вещество Не менее 98,5% и не более 101,0% в пересчете на сухое вещество

Упаковка По 0,5 и 1,0 кг в банки темного стекла с навинчиваемыми пластмассовыми крышками и прокладками из пергамента или картона

Хранение В сухом, защищенном от света месте, при температуре не выше + 25°С

Срок годности 2 года

' субстанция для изготовления таблеток; '* для изготовления инъекционного раствора

Таблица 26

Показатели Методы Результаты анализа Нормы качества

1 2 3 4

Описание Визуально Белые или почти белые таблетки плоскоциллиндрич. формы

Подлинность УФ-СФМ Совпадение максимумов УФ-спектров испытуемого препарата и PCO афобазола в области от 220 до 330 нм

тех Соответствие зон адсорбции на хроматограммах PCO афобазола и испытуемого препарата по величине Rf

ВЭЖХ Совпадение времен удерживания основных пиков на хроматограмме испытуемого раствора и раствора PCO

Средняя масса и отклонения ГФ XI От 147,0 до 156,0 мг ± 4,5% 150 мг ±7,5%

Распадаемость ГФ XI От 4 до 9 мин Не более 15 мин

Посторонние примеси тех Индивидуальной - не более 0,2%; суммы - не более 0,3% Индивидуальной- не более 0,2%; суммы - не более 0,5%

ВЭЖХ Индивидуальной - не более 0,14%о; суммы - не более 0,34% Индивидуальной - не более 0,2%; суммы - не более 0,4%

Растворение ГФХ1,ОФС 42 0003-04 Более 86%о за 20 минут Не менее 80,0% за 20 минут

1 2 3 1 4

Микробиологическая чистота ГФ XI, Изм. №3 Категория ЗА

Однородность дозирования ГФ XI, УФ-СФМ Менее ± 4,5% 10/10: ±15% или 28/30: ±15%, 0/30: более чем ±25%

Количественное определение УФ-СФМ или ВЭЖХ От 4,7 до 5,4 мг/т От 4,5 до 5,5 мг/т

Упаковка Банки полимерные с навинчивающимися крышками

Хранение В защищенном от света месте, при температуре не выше + 25°С

Срок годности 2 года

Таблица 27

Показатели, методы анализа, результаты и нормы качества раствора афобазола для

инъекций _

Показатели Методы Результаты анализа | Нормы качества

Описание Визуальный Прозрачная, бесцветная или слегка окрашенная жидкость

Подлинность УФ-СФМ Совпадение максимумов УФ-спектров испытуемого препарата и PCO в области от 220 до 330 нм

ВЭЖХ Совпадение времен удерживания основных пиков на хроматограммах испытуемого раствора и раствора PCO

Прозрачность ГФ XI Прозрачный Должен быть прозрачным

Цветность ГФ XI Менее эталонов 76,66,56 Не более эталона 56

РН ГФ XI От 2,3 до 2,5 От 2,0 до 3,0

Механические включения РД 42-501-98 Выдерживал требования Должен выдерживать требования

Посторонние примеси ВЭЖХ Индивидуальной - не более 0,3%; сумма - не более 0,7% Индивидуальной - не более 0,5%;сумма - не более 1,0%

Номинальный объем ГФ XI Выдерживал требования Должен выдерживать требования

Пирогенносгь ГФ XI Апирогенный Должен быть апирогенным

Стерильность ГФХ1 Стерильный Должен быть стерильным

Количественное определение ВЭЖХ От 9,7 до 10,6 мг/мл От 9,0 до 11,0 мг/мл

Упаковка По 1 мл в ампулы светлого стекла, по 10 ампул в картонную коробку

Хранение В защищенном от света месте, при температуре не выше + 25°С

Срок годности 2 года

Таблица 28 Показатели, методы анализа, результаты и нормы качества стандартного образца ноопепта

Показатели Методы Результаты анализа Нормы качества

1 2 3 4

Описание Визуально Белый кристаллический порошок

Растворимость ГФХ1 Легко растворим в хлороформе, растворим в этиловом спирте 95%, мало растворим в воде

Подлинность ИК-спектр Совпадение с прилагаемым рисунком

УФ-спектр Наличие максимумов поглощения при 253 ± 2 нм; 259 ± 2 нм; 265 ± 2 нм (0,04% раствор в спирте)

ЯМР'Н-спектр Совпадение с прилагаемым рисунком спектра

Темп, плавления ГФ XI От 95,5 до 97,5 "С | От 95,5 до 98,0 °С

1 2 3 4

Прозрачность ГФ XI, 0,5% раствор в воде Прозрачный Должен быть прозрачным

Цветность Бесцветный Должен быть бесцветным

рН От 6,1 до 6,7 От 6,0 до 6,8

Удельное ГФ XI От-116,5 до-119,0° От-116,0° до-119,5° (2%

вращение (2% р-р в хлороформе) р-р в хлороформе)

Удельный

показатель УФ-СФМ От 5,94 до 5,98 От 5,86 до 6,06

поглощения

Посторонние примеси ВЭЖХ ФАП менее 0,15% Единичной примеси не более 0,5%

Потеря в массе при высушивании ГФ XI Не более 0,1% Не более 0,5%

Остаточные растворители гх Менее 0,08% (этилацетат) Не более 0,3% (этилацетат)

Сульфатная зола ГФ XI Менее 0,1% Не более 0,1%

Тяжелые металлы ГФ XI Менее 0,001% Не более 0,001%

Количественное определение Метод Къельдаля От 98,79 до 99,21% От 98,5 до 100,5%

Упаковка По 0,5 г в банки с винтовой горловиной с навинчиваемыми крышками

Хранение В сухом месте, при температуре не выше 30 СС

Область применения Для определения показателей «Подлинность», «Посторонние примеси» и «Количественное определение» субстанции ноопепта

Таблица 29

Показатели, методы анализа, результаты и нормы качества субстанции ноопепта

Показатели Методы Результаты анализа Нормы качества

1 2 3 4

Описание Визуально Белый кристаллический порошок

Растворимость ГФ XI Легко растворим в хлороформе, растворим в этиловом спирте 95%, мало растворим в воде

Подлинность ИК-спектр Совпадение полос поглощения ИК-спектра раствора испытуемого образца и ИК-спектра СО

УФ-спектр Наличие максимумов поглощения при 253 ± 2 нм; 259 ± 2 нм; 265 ± 2 нм (0,04% раствор в спирте)

ВЭЖХ Совпадение времен удерживания основных пиков на хроматограммах испытуемого раствора и раствора СО

Темп, плавления ГФ XI От 95,0 до 97,0 °С От 95,0 до 98,0 °С

Прозрачность ГФ XI, 0,5% раствор в воде Прозрачный Должен быть прозрачным

Цветность Бесцветный Должен быть бесцветным

РН От 6,0 до 6,6 5,5 - 7,0

Удельное вращение ГФХ1 От-114,0 до-119,8° (2% раствор в хлороформе) От-113,0° до-120,0° (2% раствор в хлороформе)

Посторонние примеси ВЭЖХ Индивидуальной не более 0,45%; суммы - не более 0,8% Индивидуальной не более 0,5%; суммы - не более 1,0%

Потеря в массе при высушивании ГФ XI Не более 0,1% Не более 0,5%

Сульфатная зола ГФХ1 Не более 0,1% Не более 0,1%

Тяжелые металлы ГФ XI Не более 0,001% Не более 0,001%

1 2 3 | 4

Микробиологическая чистота ГФ XI, Изм. №3 Категория 2.2*

Категория 1.2.Б**

Пирогенность** ГФ XI Апирогенный Должен быть апирогенным

Количественное определение вэжх От 99,1 до 100,4% От 98,0 до 102,0%

Упаковка По 0,2-0,5 кг в банки с винтовой горловиной с пластмассовыми крышками

Хранение В сухом месте, при температуре не выше 30 "С

Срок годности 2 года

* субстанция для изготовления таблеток

** субстанция для изготовления лиофилизированной лекарственной формы

Таблица 30

Показатели, методы анализа, результаты и нормы качества таблеток ноопепта

Показатели Методы Результаты анализа | Нормы качества

Описание Визуально Таблетки белого или почти белого цвета

Подлинность УФ-спектр Совпадение максимумов УФ-спектров испытуемого препарата и PCO ноопепта в области от 220 до 350 нм

ВЭЖХ Совпадение времен удерживания основных пиков на хроматограммах испытуемого раствора и раствора PCO

Средняя масса и отклонения ГФ XI От 94 до 107 мг менее 5% От 90 до 110 г (100 мг ± 10%)

Распадаемость ГФ XI Менее 12 мин Не более 15 мин

Посторонние примеси ВЭЖХ Индивидуальной - менее 0,5%; суммы - менее 1,5% Индивидуальной - не более 1%; суммы - не более 2%

Растворение ГФ XI, ОФС 42 0003-04 Более 82% за 30 минут Не менее 75,0% за 30 минут

Микробиологическая чистота ГФ XI, Изм. №3 Категория ЗА

Однородность дозирования ГФ XI, ВЭЖХ Менее ±5,5% 10/10: ±15% или 28/30: ±15%, 0/30: более чем ±25%

Количественное определение ВЭЖХ От 9,4 г до 10,3 мг в таблетке От 9,0 г до 11,0 мг в таблетке (10 мг ±10%)

Упаковка Банки с винтовой горловиной с пластмассовыми крышками

Хранение В сухом месте при температуре не выше 25 °С

Срок годности 2 года

Таблица 31

Показатели, методы анализа, результаты и нормы качества лиофилизированной __лекарственной формы ноопепта_

Показатели Методы Результаты анализа Нормы качества

1 2 3 4

Описание Визуальный Масса белого цвета в ампулах вместимостью 2 мл

Подлинность ВЭЖХ Совпадение времен удерживания основных пиков на хроматограммах испытуемого раствора и раствора СО

Средняя масса и однородность ГФ XI, вып.2, с 140 От 11,2 до 11,7 мг Не более ± 6,2% От 9,9 до 12,1 мг Не более ± 10%

Прозрачность ГФ XI Прозрачный Должен быть прозрачным

Цветность ГФ XI Бесцветный Должен быть бесцветным

рН ГФ XI От 5,7 до 6,3 От 5,0 до 7,0

I 2 3 4

Механические включения РД 42-50198 Выдерживал требования Должен выдерживать требования

Посторонние примеси ВЭЖХ Индивидуальной - не более 1,0%; сумма - не более 1,5% Индивидуальной - не более 1,0%;сумма- не более 2,0%

Однородность дозирования ВЭЖХ, ГФ XI Не более ± 5% Не более ± 15%

Потеря в массе при высушивании* ГФ XI Не более 0,7% Не более 1,0%

Пирогенность ГФ XI Апирогенный Должен быть апирогенным

Стерильность ГФ XI Стерильный Должен быть стерильным

Количественное определение ВЭЖХ От 0,96 до 1,02 мг/амп От 0,9 до 1,1 мг/амп

Упаковка В ампулы вместимостью 2 мл светлого стекла, по 10 ампул в картонную коробку

Хранение При температуре не выше + 25°С

Срок годности 2 года

показатель включен из-за вероятности гидролиза ноопепта под действием влаги, содержащейся в препарате

Таблица 32

Показатели, методы анализа, результаты и нормы качества субстанции дилепта

Показатели Методы Результаты анализа | Нормы качества

Описание Визуально Белый кристаллический порошок

Растворимость ГФ XI Легко растворим в хлороформе, легко растворим или растворим в спирте этиловом 95%, умеренно растворим в этилацетате, практически нерастворим в воде

Подлинность ИК-спектро-скопия Совпадение полос поглощения ИК-спектра испытуемого образца и прилагаемого рисунка

УФ-спектро-скопия Наличие в области от 250 до 350 нм максимума поглощения при 278 ± 2 нм (0,01% р-р в спирте)

Темп, плавления ГФ XI От 120,0 до 123,5 "С От 119,0 до 124,0 °С

Прозрачность ГФ XI Прозрачный (5 % раствор в спирте этиловом 95%) Прозрачный (5 % раствор в спирте этиловом 95%)

Цветность ГФ XI Бесцветный (5 % раствор в спирте этиловом 95%) Бесцветный (5 % раствор в спирте этиловом 95%)

Удельное вращение ГФ XI От-49,5 до-51,0° (2% раствор в хлороформе) От - 48,00 до - 53,00 (2% раствор в хлороформе)

Посторонние примеси ВЭЖХ Индивидуальной не более 0,5%; суммы - не более 0,8% Индивидуальной не более 0,5%; суммы - не более 1,0%

Потеря в массе при высушивании ГФ XI Менее 0,2% Не более 0,5%

Сульфатная зола ГФ XI Менее 0,1% Не более 0,1%

Тяжелые металлы ГФ XI Менее 0,001% Не более 0,001%

Микробиологическая чистота ГФХ1, Изм. №3 Соответствует требованиям категории 2.2 Должен соответствовать требованиям категории 2.2

Количественное определение Метод Къельдаля От 98,5 до 99,2% От 98,5 до 100,5%

Упаковка По 0,2-0,5 кг в банки с винтовой горловиной с пластмассовыми крышками

Хранение В сухом месте, при температуре от +15 до +25 °С

Срок годности 2 года

Таблица 33

Показатели, методы анализа, результаты и нормы качества таблеток дилепта

Показатели Методы Результаты анализа | Нормы качества

Описание Визуально Таблетки белого или почти белого цвета

Подлинность УФ-спектро-скопия Совпадение максимумов УФ-спектров испытуемого препарата и PCO дилепта в области от 250 до 300 нм

ВЭЖХ Совпадение времен удерживания основных пиков на хроматограммах испытуемого раствора и раствора PCO

Средняя масса и отклонения ГФ XI От 200,9 до 201,6 мг Не более ± 7,5% От 185 до 215 мг Не более ± 7,5%

Распадаемость ГФ XI От 2 до 6 мин Не более 15 мин

Посторонние примеси ВЭЖХ Индивидуальной - менее 0,3%; суммы - менее 0,5% Индивидуальной - не более 0,5%; суммы - не более 1%

Растворение ГФ XI, ОФС 42 0003-04 От 88,0 до 92,1% за 45 мин Не менее 75,0% за 45 минут

Микробиологическая чистота ГФ XI, Изменение №3 Категория ЗА

Однородность дозирования ГФ XI, ВЭЖХ Не более ± 7% 10/10: ±15% или 28/30: ±15%, 0/30: более чем ±25%

Количественное определение ВЭЖХ От 18,98 до 19,25 мгв таблетке От 18,5 до 21,5 мг в таблетке (10 мг ±7,5%)

Упаковка Банки с винтовой горловиной с пластмассовыми крышками

Хранение В сухом месте при температуре не выше 25 °С

Срок годности 2 года

Таким образом, на примере афобазола, ноопепта и дилепта нами экспериментально показана необходимость комплексного подхода к изучению физико-химических свойств и разработке методик контроля качества, использования широкого арсенала методов исследования, способных дать объективную информацию о качестве новых лекарственных средств. Результаты исследований позволили выбрать для каждого лекарственного средства индивидуальный комплекс методов анализа, позволяющий объективно охарактеризовать его качество. Показана необходимость проведения развернутых исследований стабильности новых лекарственных средств.

Практическим результатом выполненных исследований стали методики анализа и экспериментально обоснованные нормы качества субстанций и лекарственных форм новых лекарственных средств - афобазола, ноопепта и дилепта. Полученные данные послужили основой для одиннадцати проектов ФСП. Четыре ФСП и две НД, оформленные с применением полученных результатов, утверждены.

ВЫВОДЫ:

1. Сформулированы теоретически и экспериментально обоснованные подходы к разработке методик контроля качества и изучения стабильности новых, ранее не изученных нейротропных лекарственных средств - афобазола, ноопепта и дилепта.

2. Проведено комплексное изучение физических, химических и физико-химических свойств субстанций и лекарственных форм афобазола, ноопепта и дилепта.

3. Изучены физико-химические свойства и спектральные характеристики афобазола, ноопепта и дилепта. Показана перспективность применения методов ИК-, УФ- и ЯМР'Н-спектроскопии для их идентификации.

4. Экспериментально подтверждена возможность применения химических методов в качественном и количественном анализе афобазола, ноопепта и дилепта. Разработаны методики количественного определения афобазола с помощью неводного титрования, а ноопепта и дилепта с помощью метода Къельдаля.

5. Проведены исследования хроматографического поведения афобазола, ноопепта и дилепта в субстанциях и лекарственных формах, а также исходных и промежуточных продуктов их синтеза и продуктов деструкции методами ТСХ и ВЭЖХ. Разработаны методики определения посторонних примесей в субстанциях и лекарственных формах. Предложена методика определения содержания остаточных растворителей в субстанциях афобазола, ноопепта и дилепта с помощью ГЖХ.

6. Разработаны методики количественного определения афобазола, ноопепта и дилепта в лекарственных формах с помощью УФ-спектрофотометрии и ВЭЖХ. Разработаны методики количественного определения ноопепта в субстанции с применением стандартного образца.

7. Изучена стабильность афобазола, ноопепта и дилепта под действием факторов окружающей среды. Показано, что афобазол достаточно легко окисляется даже в водных растворах, особенно при хранении в условиях повышенной температуры. Ноопепт и дилепт в водных растворах легко

гидролизуются по сложноэфирным связям с образованием соответствующих кислот. Определены условия хранения новых лекарственных средств. Предложена общая схема определения стабильности производных 2-меркаптобензимидазола и препаратов пептидной структуры под действием факторов окружающей среды.

8. Изучена устойчивость субстанций и лекарственных форм новых нейротропных препаратов при хранении методом «ускоренного старения» и в естественных условиях, определены условия хранения и сроки годности.

9. Установлены нормы качества субстанций и лекарственных форм афобазола, ноопепта и дилепта. Разработано одиннадцать проектов ФСП на эти препараты. К настоящему времени с применением полученных результатов утверждены четыре ФСП и две НД: на субстанцию афобазола, таблетки афобазола 5 и 10 мг, Нейрофазол, концентрат для приготовления раствора для инфузий 5 мг/мл, субстанцию ноопепта и таблетки ноопепта 10 мг.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАНЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Зимина И.А., Суслина С.Н., Алексеев К.В., Пятин Б.М., Степаненко О.Б., Грушевская Л.Н., Гусев A.B. Разработка состава, технологии и стандартизация таблетированной лекарственной формы препарата ноотропного и нейропротективного действия // Вестник РУДН. Серия Медицина. 2004. №4(28). С.197-202.

2. Бартенева Е.В., Милкина С.Е., Степаненко О.Б., Авдюнина Н.И., Алексеев К.В., Пятин Б.М., Коночкина М.Е., Грушевская Л.Н. Изучение стабильности инъекционных растворов оригинального отечественного препарата афобазол // Тезисы докладов XII Российского Национального конгресса «Человек и лекарство». Москва, 2005. С. 57.

3. Милкина С.Е., Нечаева Е.Б., Багирова В.Л., Пятин Б.М., Степаненко О.Б., Грушевская Л.Н., Алексеев К.В., Сизяков С.А. Применение метода ВЭЖХ для определения посторонних примесей в лекарственных формах афобазола - таблетках и растворе для инъекций // Материалы II всероссийского съезда фармацевтических работников. Сочи, 2005. С.104-105.

4. Гусев A.B., Пятин Б.М., Авдюнина Н.И., Климова Н.В., Алексеев К.В., Степаненко О.Б., Грушевская Л.Н., Зимина И.А., Гусев М.В. Фармацевтический анализ лиофилизированной лекарственной формы ноопепта для инъекций //Материалы 4 Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам». Москва, 2006. С.25.

5. Гусев М.В., Степаненко О.Б., Пятин Б.М., Грушевская Л.Н., Бартенева Е.В., Коночкина М.Е., Гусев A.B. Изучение физико-химических свойств нового нейролептика пептидной структуры - дилепта //Материалы 4 Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам». Москва, 2006. С.26.

6. Сизяков С.А., Грушевская Л.Н., Милкина С.Е., Пятин Б.М., Авдюнина Н.И., Зимина И.А., Алексеев К.В. Степаненко О.Б. Исследования по созданию и стандартизации таблеток афобазола //Материалы 4 Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам». Москва, 2006. С.67.

7. Гусев A.B., Грушевская Л.Н., Степаненко О.Б., Авдюнина Н.И., Пятин Б.М.,

Прокофьева В.И., Бартенева Е.В., Коночкина М.Е., Гусев М.В. Разработка норм качества субстанции ноопепта для создания государственного стандартного образца // Тезисы докладов XIII Российского Национального конгресса «Человек и лекарство». Москва, 2006. С. 779.

8. Гусев A.B., Грушевская Л.Н., Степаненко О.Б., Авдюнина Н.И., Пятин Б.М., Прокофьева В.И., Бартенева Е.В., Коночкина М.Е., Гусев М.В. Разработка норм качества субстанции ноопепта для инъекционных лекарственных форм //Тезисы докладов XIII Российского Национального конгресса «Человек и лекарство». Москва, 2006. С. 779-780.

9. Милкина С.Е., Багирова В.Л., Нечаева Е.Б., Пятин Б.М., Степаненко О.Б., Грушевская Л.Н., Алексеев К.В., Сизяков С.А. Определение фармацевтической доступности таблеток афобазола с различным составом вспомогательных веществ // Тезисы докладов XIII Российского Национального конгресса «Человек и лекарство». Москва, 2006. С. 792.

Ю.Сизяков С.А., Зимина И.А., Алексеев К.В., Милкина С.Е., Пятин Б.М., Степаненко О.Б., Грушевская JI.H. Разработка состава и контроль качества таблетированной лекарственной формы нового селективного анксиолитика// Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции. Сборник научных трудов. Выпуск 61. Пятигорск, 2006. С. 135.

11.Милкина С.Е., Степаненко О.Б., Грушевская Л.Н., Авдюнина Н.И., Пятин Б.М., Багирова В.Л., Нечаева Е.Б. Анализ и стандартизация нового отечественного анксиолитического средства афобазол // Хим.-фарм. журн. 2006. Т.40. №7. С.55-56.

12.Гусев М.В., Пятин Б.М., Грушевская Л.Н., Степаненко О.Б., Авдюнина Н.И. Разработка методики количественного определения субстанции нового оригинального нейролептика дилепт //Тезисы докладов XIV Российского Национального конгресса «Человек и лекарство». Москва, 2007. С. 815.

13.Гусев М.В., Пятин Б.М., Грушевская Л.Н., Степаненко О.Б., Авдюнина Н.И. Определение остаточных растворителей в субстанции нового оригинального нейролептика дилепт //Тезисы докладов XIV Российского Национального конгресса «Человек и лекарство». Москва, 2007. С. 815.

14.Гусев М.В., Пятин Б.М., Грушевская Л.Н., Гусев A.B., Авдюнина Н.И., Абраменкова Д.А. Стандартизация субстанции оригинального нейролептика

дилепта // Материалы Ш Съезда фармакологов России «Фармакология практическому здравоохранению». С. Петербург. 2007. U.C. 1-1671.

15.Гусев A.B., Грушевская Л.Н., Степаненко О.Б., Авдюнина Н.И., Пятин Б.М., Лезина В.П., Анисимова О.С. Разработка методик анализа субстанции ноопепта для создания государственного стандартного образца (ГСО) // Хим.-фарм. журн. 2007. Т.41, №12. С. 44-47.

16.Сизяков С.А., Грушевская Л.Н., Коночкина М.Е., Пятин Б.М., Алексеев К.В. Разработка состава и технологии таблеток афобазола методом влажного гранулирования // Вестник РУДН. Серия Медицина. 2008. №4. С.20-24.

П.Середенин С.Б., Островская Р.У., Пятин Б.М., Воронина Т.А., Гудашева Т.А., Алексеев К.В., Грушевская Л.Н. Инъекционная лекарственная форма для лечения острого инсульта, способ ее изготовления и применение (Патент РФ №2330680)// Бюллетень «Изобретения, полезные модели» ФГУ «Федеральный институт промышленной собственности федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам», 2008. №22 (III ч.). С.684.

18.Сизяков С.А., Алексеев К.В., Грушевская Л.Н., Пятин Б.М. Разработка состава таблеток афобазола // Фармация. 2009. №1. С. 38-41

19.Гусев М.В., Грушевская Л.Н., Авдюнина Н.И., Пятин Б.М., Прокофьева В.И. Разработка методик анализа и стандартизация субстанции дилепта // Вопр. биол., мед. и фарм. хим. 2009. №2. С.38-41.

20.Грушевская Л.Н., Гусев М.В., Авдюнина Н.И., Алексеев К.В., Пятин Б.М. Разработка методик анализа и норм качества таблеток дилепта. XVI Российский Национальный конгресс «Человек и лекарство», Москва, 2009, Тезисы докладов, С. 646.

21.Грушевская Л.Н., Гусев A.B., Степаненко О.Б., Алексеев К.В., Зимина И.А., Авдюнина Н.И., Пятин Б.М. Разработка методик анализа лиофилизированной лекарственной формы ноопепта для инъекций // Вопр. биол., мед. и фарм. хим. 2010. №4. С. 39-42.

22.Грушевская Л.Н., Авдюнина Н.И., Пятин Б.М. Изучение стабильности субстанции афобазола. 5-я Международная конференция «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», Москва, 2010, Тезисы докладов, С.36.

23.Паевая J1.M., Грушевская Л.H., Авдюнина Н.И., Пятин Б.М. Определение остаточных растворителей в препаратах пептидной структуры. 5-я Международная конференция «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам, Москва. 2010. Тезисы докладов, С. 33.

24.Грушевская Л.Н., Гусев A.B., Авдюнина Н.И., Пятин Б.М. Разработка методик анализа и установление норм качества субстанции ноопепта для инъекционных лекарственных форм // Вопр. биол., мед. и фарм. хим. 2010. №7. С. 35-41.

25.Грушевская Л.Н., Авдюнина Н.И., Милкина С.Е., Степаненко О.Б., Пятин Б.М., Алексеев К.В., Сизяков С.А. Разработка методик анализа инъекционной лекарственной формы афобазола//Хим.-фарм. жури. 2010. T.44. №7. С.49-53.

26.Грушевская Л.Н., Милкина С.Е., Степаненко О.Б., Волкова М.Ю., Пятин Б.М., Авдюнина H.H., Алексеев К.В., Сизяков С.А. Фармацевтический анализ и стандартизация твердой дозированной лекарственной формы афобазола // Хим.-фарм. жури. 2010. Т. 44. №9. С. 49-52.

27. Грушевская Л.Н., Авдюнина Н.И., Пятин Б.М., Алексеев К.В., Гаевая Л.М., Сергеева М.С., Дуденкова М.Е., Клумова B.C., Тихонова Н.В. Фармацевтический анализ и стандартизация таблеток ноопепта // Хим.-фарм. жури. 2011. Т.45. №.6. С.53-56.

28.Середенин С.Б., Пятин Б.М., Авдюнина Н.И., Алексеев К.В., Грушевская Л.Н., Блынская Е.В., Большакова Р.Ф., Гусев М.В., Шендера О.М. Фармацевтическая композиция с антипсихотическим действием. (Патент РФ №2420304)// Бюллетень «Изобретения, полезные модели». 2011. №16 (II ч.). С.630.

29. Грушевская Л.Н., Авдюнина Н.И., Пятин Б.М. Разработка методики определения стабильности афобазола в помощью ВЭЖХ // Хим.-фарм. журн. 2011. Т.45. №.7. С.52-56.

30.Авдюнина Н.И., Пятин Б.М., Грушевская Л.Н., Можаева Т.Я., Большакова Р.Ф., Устинова М.И. Разработка технологии синтеза селективного анксиолитика афобазола. Хим.-фарм. журн. 2011. Т.45. №.9. С.41-44.

Подписано в печать: 30.09.2011 Объем: 1 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ №732 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, Ленинградский пр-к, д.74, корп.1 (495) 790-47-77; www.reglet.ru

В настоящее время в Российской Федерации продолжается рост объемов производства и продаж лекарственных средств - дженериков с изученной фармакологической активностью, эффективностью и безопасностью. Известно, что эти препараты обладают определенными побочными эффектами и противопоказаниями, которые ограничивают их применение у ряда пациентов.

Одним из направлений научной работы НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН является направленный поиск принципиально новых, не имеющих мировых аналогов, лекарственных средств нейротропного действия, отвечающих современным задачам фармакотерапии и лишенных нежелательных эффектов, присущих уже существующим препаратам.

В рамках этого направления в НИИ фармакологии созданы три новых нейротропных лекарственных средства, один из которых принадлежит к группе производных бензимидазола (афобазол), а два других - к соединениям пептидной структуры (ноопепт и дилепт).

Афобазол разработан на основе фармакогенетической концепции анксиолитического эффекта, направленной на поиск селективных анксиолитиков, лишенных побочных эффектов, характерных для бензодиазепинов [108]. Препарат является эффективным анксиолитиком, не обладающим в широком диапазоне доз гипноседативными эффектами, миорелаксантными свойствами и негативным влиянием на показатели памяти [87, 108].

Ноопепт - оригинальный препарат, дипептидный аналог пирацетама, проявляющий ноотропное и нейропротективное действие. Препарат обладает высокой биодоступностью для тканей мозга и эффективен в сравнительно малых дозах [42, 91, 175].

Дилепт - дипептидный аналог нейротензина, принадлежащий к группе атипичных нейролептиков и сочетающий нейролептикоподобное действие с положительным мнемотропным и нейропротективным эффектами [43, 95]. Дилепт не имеет побочных эффектов, характерных для типичных нейролептиков, а кроме того, в отличие от препаратов своей группы, не обладает холинолитическим действием, обуславливающим отрицательное влияние на память [43, 95, 98, 175].

Необходимым условием внедрения лекарственных средств в медицинскую практику является разработка адекватных методов контроля их качества и стандартизация, результатом которой становится установление экспериментально обоснованных норм качества на субстанции и лекарственные формы.

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы заключается в теоретическом и экспериментальном обосновании комплексного подхода к фармацевтической стандартизации новых лекарственных средств - производных 2-меркаптобензимидазола и препаратов пептидной структуры: афобазола, ноопепта и дилепта, разработке научно-обоснованных норм, позволяющих поддерживать качество выпускаемых препаратов на современном уровне эффективности и безопасности.

В задачи исследования входило:

- На основании теоретических и экспериментальных исследований сформулировать подходы к разработке методик контроля качества и изучения стабильности новых нейротропных лекарственных средств -афобазола, ноопепта и дилепта;

- Изучить химические и физико-химические свойства, спектральные характеристики новых нейротропных препаратов, оценить возможность использования особенностей структуры этих препаратов в их качественном и количественном анализе;

- Изучить хроматографическую подвижность новых препаратов, исходных и промежуточных продуктов их синтеза, продуктов деструкции, остаточных органических растворителей и других примесей с помощью методов тонкослойной (ТСХ), высокоэффективной (ВЭЖХ) и газожидкостной (ГЖХ) хроматографии; подобрать условия и разработать методики, позволяющие получить наиболее полную и точную информацию о качестве исследуемых препаратов;

- Изучить стабильность субстанций и лекарственных форм новых нейротропных лекарственных средств под действием факторов окружающей среды; определить условия хранения и сроки годности;

- Установить экспериментально обоснованные нормы качества новых нейротропных препаратов; оформить соответствующую нормативную документацию.

Научная новизна исследования

Впервые проведены комплексные исследования по разработке методик анализа и установлению научно-обоснованных норм качества новых нейротропных лекарственных средств - афобазола, ноопепта и дилепта. Определены теоретически и экспериментально обоснованные подходы к разработке методик контроля качества и изучения стабильности этих новых, ранее не изученных лекарственных средств.

Проведено изучение физико-химических и химических свойств афобазола, ноопепта и дилепта с помощью современных методов анализа. Изучены спектральные характеристики с помощью ИК-, УФ-, ЯМР 'Н- и масс-спектроскопии, хроматографическая подвижность с помощью ТСХ и ВЭЖХ. Подобраны оптимальные условия, позволяющие разделить сами фармакологически активные вещества, исходные и промежуточные продукты их синтеза и продукты деструкции. Подобраны условия разделения наиболее вероятных остаточных растворителей в субстанциях с помощью метода ГЖХ.

Изучена стабильность новых лекарственных средств при хранении и под действием факторов окружающей среды, определены наиболее вероятные условия и пути деструкции, идентифицированы некоторые продукты разложения.

Практическая значимость результатов исследования

Разработаны методики анализа субстанций и лекарственных форм новых нейротропных лекарственных средств - афобазола, ноопепта и дилепта, и установлены научно-обоснованные нормы их качества, которые легли в основу нормативных документов контроля качества -фармакопейных статей предприятия (ФСП). Разработан комплекс аналитических методик для контроля производства субстанций и лекарственных форм новых лекарственных средств.

На основании проведенных исследований разработано одиннадцать проектов ФСП на субстанции и лекарственные формы новых нейротропных лекарственных средств, а также соответствующие разделы лабораторных регламентов на производство субстанций афобазола и ноопепта и лекарственных форм афобазола, ноопепта и дилепта:

- проект ФСП на субстанцию афобазола (для производства таблеток);

- проект ФСП на таблетки афобазола 5 мг;

- проект ФСП на субстанцию афобазола (для производства раствора для инъекций);

- проект ФСП на афобазол, раствор для инъекций, 10 мг/мл;

- проект ФСП на субстанцию ноопепта (для производства таблеток);

- проект ФСП на таблетки ноопепта, 10 мг;

-проект ФСП на субстанцию ноопепта (для изготовления лиофилизированной инъекционной лекарственной формы);

- проект ФСП на ноопепт, лиофилизированный порошок для инъекций,

1 мг в ампуле;

- проект ФС на ноопепт, стандартный образец;

- проект ФСП на субстанцию дилепта (для производства таблеток);

- проект ФСП на таблетки дилепта 20 мг.

В настоящее время с применением полученных результатов утверждены:

- ФСП на субстанцию афобазола (ФСП 42-0067620605, ФГУП «Центр по химии лекарственных средств» (ЦХЛС-ВНИИХФИ));

- ФСП на афобазол, таблетки 5 мг (ФСП 42-0055622105, ОАО «Щелковский витаминный завод»);

- ФСП на афобазол, таблетки 10 мг (ФСП 42-0055708505, ОАО «Щелковский витаминный завод»);

- НД на Нейрофазол, концентрат для приготовления раствора для инфузий 5 мг/мл (ЛСР-002102/10-160310, ЗАО «Фармацевтическая фирма «ЛЕККО»);

- НД на субстанцию ноопепта (НД 42-13988-05, ЗАО «Мастерлек», Россия, производитель Эррегиере С.п.А., Италия);

- ФСП на ноопепт, таблетки 10 мг (ФСП 42-0055699005, ЗАО «Мастерклон», производитель ОАО «Щелковский витаминный завод»).

Внедрение в практику

Методики анализа субстанций и лекарственных форм афобазола, ноопепта и дилепта внедрены в НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН для контроля производства, а также контроля качества при проведении фармакологических и токсикологических исследований на стадии доклинического изучения.

По утвержденным ФСП и НД на субстанцию и таблетки афобазола и ноопепта, а также на Нейрофазол, концентрат для приготовления раствора для инфузий, проводится контроль качества этих лекарственных средств на химико-фармацевтическом предприятии ЗАО «ЛЕККО» (Россия).

Апробация работы

Основные результаты проведенных исследований представлены на XII, XIII, XIV, XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство»

Москва, 2005, 2006, 2007, 2009); на II Всероссийском съезде фармацевтических работников (Сочи, 2005), на 4-й и 5-й Международных конференциях «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2006, 2010); на III Съезде фармакологов России «Фармакология практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007).

Публикации

По результатам исследований опубликовано 30 печатных работ.

Получены патенты РФ на изобретение «Инъекционная лекарственная форма для лечения острого инсульта, способ ее изготовления и применение» (патент РФ №2330680, Бюл. №22, 2008) и «Фармацевтическая композиция с антипсихотическим действием» (патент РФ №2420304, Бюл. №16, 2011).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук

Диссертационная работа выполнена в соответствии с научным планом НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН в рамках комплексной темы исследований: «Изучение механизмов эндо- и экзогенной регуляции функций центральной нервной системы. Разработка новых оригинальных нейропсихотропных средств», номер государственной регистрации 01.2.006.06601.

Основные положения, выносимые на защиту: теоретическое и экспериментальное обоснование подходов к разработке методик контроля качества и изучения стабильности новых, ранее не изученных лекарственных средств пептидной структуры и производных 2-меркаптобензимидазола;

- экспериментальное обоснование показателей и норм качества субстанций и лекарственных форм афобазола, ноопепта и дилепта на основе комплексного изучения их физико-химических, химических свойств, спектральных и хроматографических характеристик;

- методики качественного и количественного анализа субстанций и лекарственных форм афобазола, ноопепта и дилепта и их валидационные характеристики;

- оценка стабильности афобазола, ноопепта и дилепта под действием факторов окружающей среды и результаты определения сроков годности методом «ускоренного старения» и при хранении в естественных условиях.

ВЫВОДЫ:

1. Сформулированы теоретически и экспериментально обоснованные подходы к разработке методик контроля качества и изучения стабильности новых, ранее не изученных нейротропных лекарственных средств - афобазола, ноопепта и дилепта.

2. Проведено комплексное изучение физических, химических и физико-химических свойств субстанций и лекарственных форм афобазола, ноопепта и дилепта.

3. Изучены физико-химические свойства и спектральные характеристики афобазола, ноопепта и дилепта. Показана перспективность применения методов ИК-, УФ- и -спектроскопии для их идентификации.

4. Экспериментально подтверждена возможность применения химических методов в качественном и количественном анализе афобазола, ноопепта и дилепта. Разработаны методики количественного определения афобазола с помощью неводного титрования, а ноопепта и дилепта с помощью метода Къельдаля.

5. Проведены исследования хроматографического поведения афобазола, ноопепта и дилепта в субстанциях и лекарственных формах, а также исходных и промежуточных продуктов их синтеза и продуктов деструкции методами ТСХ и ВЭЖХ. Разработаны методики определения посторонних примесей в субстанциях и лекарственных формах. Предложена методика определения содержания остаточных растворителей в субстанциях афобазола, ноопепта и дилепта с помощью ГЖХ.

6. Разработаны методики количественного определения афобазола, ноопепта и дилепта в лекарственных формах с помощью УФ-спектрофотометрии и ВЭЖХ. Разработаны методики количественного определения ноопепта в субстанции с применением стандартного образца.

7. Изучена стабильность афобазола, ноопепта и дилепта под действием факторов окружающей среды. Показано, что афобазол достаточно легко окисляется даже в водных растворах, особенно при хранении в условиях повышенной температуры. Ноопепт и дилепт в водных растворах легко гидролизуются по сложноэфирным связям с образованием соответствующих кислот. Определены условия хранения новых лекарственных средств. Предложена общая схема определения стабильности производных 2-меркаптобензимидазола и препаратов пептидной структуры под действием факторов окружающей среды.

8. Изучена устойчивость субстанций и лекарственных форм новых нейротропных препаратов при хранении методом «ускоренного старения» и в естественных условиях, определены условия хранения и сроки годности.

9. Установлены нормы качества субстанций и лекарственных форм афобазола, ноопепта и дилепта. Разработано одиннадцать проектов ФСП на эти препараты. К настоящему времени с применением полученных результатов утверждены четыре ФСП и две НД: на субстанцию афобазола, таблетки афобазола 5 и 10 мг, Нейрофазол, концентрат для приготовления раствора для инфузий 5 мг/мл, субстанцию ноопепта и таблетки ноопепта 10 мг.