Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Иммунофармакологические свойства глицин- и пролинсодержащих дипептидов

На правах рукописи

ии^452117

Шалаева Елена Владимировна

ИММУНОФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ГЛИЦИН- И ПРОЛИНСОДЕРЖАЩИХ ДИПЕПТИДОВ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА-2008

003452117

Работа выполнена в ГУ НИИ фармакологии имепи В. В. Закусова РАМН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, Коваленко Лариса Петровна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Ковалев Георгий Иванович

доктор биологических наук, профессор Давыдова Татьяна Викторовна

Ведущая организация: университет» Росздрава

ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский

Защита состоится «

2008 г в «

_» часов на заседании дис-

сертационного совета Д 001.024.01 при ГУ НИИ фармакологии имени В. В. Закусова РАМН по адресу: 125315, г. Москва, ул. Балтийская, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в Ученой части ГУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН по адресу: 125315, г. Москва, ул. Балтийская, д. 8.

Автореферат разослан «_»_2008 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Е.А. Вальдман

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Согласно современной концепции интегративного функционирования регуляторных систем гомеостаза, взаимодействие между нейроэндокрин-ной и иммунной системами является двусторонним (Besedovsky И.О. et al., 2007). Нервная и эндокринная системы модулируют функции иммунной системы посредством ней-ротрансмиттеров, нейропептидов и гормонов, а иммунная система взаимодействует с нейроэндокринной с помощью цитокинов и других иммунотрансмиттеров (Blalock J.E., 2005).

Ряд патологий нервной системы, таких как инсульт, рассеянный склероз, депрессия сопровождаются различными иммунологическими отклонениями: иммунодефицитом либо гиперактивацией иммунной системы, цитокиновым дисбалансом, воспалительными реакциями (Leonard В.Е., Song С., 2002; Prass К. et al., 2003; Гусев Е.И., Бойко А Н., 2007). Это делает актуальным поиск и изучение новых препаратов, сочетающих нейро-тропные свойства с иммунокорригирующей и противовоспалительной активностями.

Известно, что олигопептиды и препараты, созданные на их основе, обладают регулирующим действием в отношении нейроэндокринной и иммунной систем (Воронина О Л., Замятнин А. А., 2001). Перспективность использования пептидных препаратов для коррекции нейроиммунопатологий обусловлена их полифункциональной эффективностью при применении в малых дозах, низкой токсичностью и отсутствием выраженного побочного действия (Гривенников И.А., 2006). Изучение свойств и механизмов действия регуляторных олигопептидов представляет существенный научный и практический интерес.

В ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН созданы оригинальные нейро-тропные глицин- и пролинсодержащие дипептидные соединения: ноопепт, ГБ-115 и ди-лепт.

Ноопепт, пептидный аналог пирацетама, обладает ноогропным, нейропротективным, анксиолитическим и противовоспалительным действием (Seredenin S.B., et al., Patent USA 5,439,930,1995, Патент РФ 2119496, 1998; Коваленко Л.П. и соавт., 2002; Ostrovskaya R. et al., 2006). Дипептидное соединение ГБ-115, созданное на основе структуры эндогенного анксиогенного тетрапептида холецистокинина-4, обладает анксиоли-тическими свойствами (Колик Л.Г. и соавт., 2002; Гудашева Т.А. и соавт., 2006). Ди-лепт, пептидомиметик p-поворотной структуры биоактивного фрагмента нейротензина (НТиз), проявляет антипсихотическую, нейропротекторую, мнемотропную активность (Gudasheva Т.А. et al., 1998; Островская Р.У. и соавт., 2005).

По данным литературы, короткие глицин- и пролинсодержащие олигопептиды обладают различными иммунофармакологическими свойствами, в частности глипролины, да- и трипептиды, содержащие остатки глицина и пролина, проявляют противоязвенное,

антистрессорное, нейропротекторное, иммунокорригирующее действие (Ашмарин И.П, 2007) В цикле работ A.A. Михайловой и соавторов было показано, что глицин- и про-линсодержащие миелопептиды выполняют функцию иммунокорректоров, восстанавливая иммунный ответ у мышей, сниженный под влиянием облучения, вирусов, антибиотиков и цитостатиков (Михайлова A.A., 2001; Mikhailova A.A. et al., 2006).

В связи с вышеизложенным, актуальным является изучение иммунокорригирукяцей и противовоспалительной активности глицин- и пролинсодержащих пептидных соединений с анксиолитическими и нейропротективными свойствами, созданных в ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН.

Цель исследования. Целью данного исследования явилось изучение иммунокорри-гирующих и противовоспалительных свойств глицин- и пролинсодержащих дипепти-дов: ноопепта, ГБ-115 и дилепта.

Основные задачи исследования.

1. Оценка аллергизирующих свойств ГБ-115 и дилепта.

2. Изучение влияния ноопепта, ГБ-П5 и дилепта на иммунологические показатели у интактных мышей.

3. Исследование иммунокорригирующего действия ноопепта и ГБ-115 с использованием модели вторичного иммунодефицита, вызванного введением циклофосфамида и при повторной плавательной нагрузке у мышей.

4. Оценка противовоспалительных свойств ГБ-115 и дилепта на моделях острого экссудативного воспаления у крыс и мышей.

5 Исследование влияния ГБ-115 и дилепта на продукцию свободных радикалов активированными нейтрофилами крови мышей.

б. Изучение иммунофармакологического действия ноопепта и ГБ-115 при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите у мышей.

Научная новизна работы. Установлено, что под действием ноопепта и ГБ-115 происходит увеличение фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов и гуморального иммунного ответа у мышей. Ноопепт также стимулирует клеточный иммунный ответ у мышей. Дилепт не оказывает действия на функциональную активность иммунной системы мышей.

Впервые показано, что ноопепт и ГБ-115 проявляют иммунокорригирующие свойства, восстанавливая клеточный, гуморальный иммунный ответ, количество CD4+-лимфоцитов и массу тимуса при вторичном иммунодефиците, вызванном введением циклофосфамида и при повторной плавательной нагрузке у мышей. Ноопепт снижает уровень ИЛ-Iß в плазме мышей линии BALB/c после повторной плавательной нагрузки.

Установлено, что ГБ-115 и дилепт обладают противовоспалительным действием

На основании полученных данных было сформулировано предположение о том, что существенную роль в механизмах иммунокорригирующего и противовоспалительного действия изученных дипептидов играет их антиоксидантная активность. Установлено, что ГБ-115 и дилепт уменьшают продукцию свободных радикалов кислорода активированными нейтрофилами, ГБ-115 снижает чувствительность мононуклеарных лейкоцитов к НгОг-индуцированному апоптозу.

Введение ноопепта при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите приводит к увеличению двигательной активности мышей и нормализации соотношения хел-перной и супрессорной популяций Т-лимфоцитов; ГБ-И5 восстанавливает двигательную активность и массу тимуса у мышей с энцефаломиелитом.

Научно-практическая значимость. Установлено, что ГБ-115 и дилепт не обладают аллергизирующими свойствами. Материалы по изучению аллергизирующих свойств соединений вошли в комплект документов по их доклиническому изучению.

На примере исследования ноопепта и ГБ-115 показана эффективность модели экспериментального энцефаломиелита для изучения иммунофармакологической активности нейротропных соединений.

Наличие у дипептидных глицинсодержащих препаратов ноопепта и ГБ-115 иммуно-коррширующих и противовоспалительных свойств открывает перспективы их изучения в качестве средств коррекции при нейроиммунных расстройствах.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на 2-ом Съезде Российского Научного Общества фармакологов (Москва, 2003); 41st Congress of the European Sociétés of Toxicology, EUROTOX (Флоренция, Италия, 2003); 8th ECNP Regional Meetihg, (Москва, 2005); IV международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2006); III съезде фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007); V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008); Конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, из них 2 статьи в центральных научных, рецензируемых журналах и 10 тезисов.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 114 страницах компьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, описание полученных результатов и их обсуждение, выводы и список литературы, включающий 100 отечественных и 135 зарубежных источника. Работа иллюстрирована 11 таблицами и 18 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали самцов морских свинок альбиносов, массой 250-300 г, самцов нелинейных белых крыс массой 200-250 г, самцов мышей линий СВА, C57BL/6, BALB/c и гибридов Fi (СВА х C57BL/6) массой 18-20 г, самок мышей линии C57BL/6 массой 1416 г из питомников РАМН «Столбовая» и «Центральный». Животных содержали в стандартных условиях со свободным доступом к корму и воде. В качестве основного корма были использованы стандартизованные брикетированные гранулированные корма фирмы «МЭСТ» (Россия).

Изученные соединения: ноопепт (этиловый эфир Ы-фенилацетил-Ъ-пролинглицина, ED5o=0,5 и 5 мг/кг), ПБ-115 (амидК-фенилгексаноил-глицил-Ъ-триптофана, ED5o=0,l; 2; 4 мг/кг) и дилепт (метиловый эфир N-капроил-пролшггирозина, ED5o=0,8; 5; 16 мг/кг) синтезированы в отделе химии ГУ НИИ фармакологии имени В В. Закусова РАМН1.

Выбор доз, режимов и путей введения основывался на данных, полученных при изучении специфической фармакологической активности соединений в ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН (Колик Л.Г. и соавт., 2002; Ostrovskaya R. et al., 2006) и на соответствующих Методических указаниях МЗСР РФ. Соединения применялись в следующих дозах: ноопепт 0,5, 5, 10, 100 мг/кг, ГБ-115 0,1, 1, 10 мг/кг, дилепт 0,8, 3, 5, 16, 160 мг/кг. На основании данных фармакокинетических исследований (Бойко С.С. и соавт., 1997, 2007) соединения вводили внутривенно (в/в), внутрибрюшинно (в/б), перо-рально при курсовых и однократных схемах введения. В качестве препаратов сравнения применяли: диклофенак (Хемофарм, Югославия) 6,75 мг/кг, кларитин (ШерингПлау, Бельгия) 1,3 мг/кг, унитиол (димеркапрол, Sigma, США) 500 мг/кг. Подбор доз основывался на литературных данных (Cao B.J. et al, 1990; Гущин И.С., 1998) и верифицировался в предварительных исследованиях.

Иммунологические методы. При изучении действия ноопепта, ГБ-115 и дилепта на параметры иммунной системы использовали методологические подходы, изложенные в "Методических указаниям по оценке иммунотоксического действия фармакологических средств" и "Методических указаниях по оценке иммунотропной активности фармакологических веществ" (2005).

Фагоцитарную активность перитонеалькых макрофагов мышей Fi(CBAxC57BL/6) оценивали по интенсивности захвата частиц туши, измерения проводили на спектрофотометре Uniscan (Финляндия) при 620 им. Влияние препаратов на гуморальный иммунный ответ мышей линий СВА и C57BL/6 изучали с помощью реакции гемагглютинации (РПГА), поставленной в микротитраторе Такачи (Венгрия). Данные представляли в условных единицах, соответствующих log2 титра антител.

1 EDyj установлены при разных путях введения соединений, с использованием различных экспериментальных моделей. LDSo изученных дипептвдов не определяется, поскольку гибели животных не наблюдается при введении ноопепта в дозе 5000 мг/кг; ГБ-115 в дозе 6000 мг/кг, дилепта в дозе 1000 мг/кг

При изучении действия ноопепта (5 мг/кг, в/в) на продуктивную фазу гуморального иммунного ответа введение препарата осуществляли на 3 или 5 сутки после иммунизации ЭБ при изучении IgM- и IgG-ответа соответственно (забой на 7-й или 10-й день). Наличие IgM и IgG определяли, добавляя в пробы раствор 2-меркаптоэтанола (Алехин Е.К., 1993).

Клеточный иммунный ответ оценивали по степени выраженности реакции тперчув-ствительности замедленного типа (ГЗТ) у мышей гибридов Fi (CBAxC57BL/6)

Исследование субпопуляционного состава Т-лимфоцитов мышей проводили на проточном лазерном цитометре EPICS XL 4 color (Beckman Coulter, США) (Ledbetter J.A. et al„ 1979). Гомогенаты селезенки окрашивали моноклональными антителами по безот-мывочной технологии. Использовали растворы антител, меченных флуоресциннзотао-цианатом, к мышиным CD4 (Clone YTS191.1) и CD8 (Clone КТ15) (Beckman Coulter, США). Учет результатов осуществлялся на основании анализа 5 ООО - 10 ООО событий.

Содержание в плазме крови мышей интерлейкина-lß (ИЛ-lß) определяли твердофазным иммуноферментным методом с помощью коммерческих тест-систем (Bender MedSystems, Австрия) согласно прилагаемой инструкции. Измерение оптической плотности проводили на спектрофотометре Uniscan (Финляндия).

Генерацию активных форм кислорода в суспензии нейтрофильных гранулоцитов крови мышей Fi (СВА х C57BL/6) оценивали методом люминолзависимой клеточной хемилюминесценции Выделение нейтрофилов осуществляли в градиенте плотности (Histopaque 1,077 г/см3 и Histopaque 1,119 г/см3). Хемилюминесценцию регистрировали на хемилюминометре Bioorbit 1251 (Швеция), для стимуляции использовали зимозан, опсонизированный сывороткой мьгшей различных линий (СВА, C57BL/6 и BALB/c).

Исследование апоптоза проводили на культурах мононуклеарных лейкоцитов периферической крови, полученной от здоровых доноров-добровольцев. Клетки выделяли стандартным методом центрифугирования в градиенте плотности Histopaque 1,077 г/см3 и культивировали 24 часа в среде RPMI-1640. Апоптоз индуцировали внесением в культуры клеток Н2О2 (0,1 мМ). ГБ-115 в концентрациях 10'8 М, 10"7 М и 10"6 М добавляли в культуры клеток за 30 минут до внесения Н2О2. После культивирования клетки окрашивали пропидий йодидом. Измерения проводили на проточном лазерном цитометре EPICS XL 4 color (Beckman Coulter, США).

Методы изучения аллергизирующих свойств. Реакцию общей анафилаксии моделировали, иммунизируя морских свинок альбиносов 2% раствором белка куриного яйца (БКЯ) перорально 3-х кратно. Через 12 дней после начала иммунизации животным в течение 4-х дней в/б вводили исследуемые соединения. Затем, через 1 час впутрисердечно инъецировали БКЯ, после чего регистрировали развитие анафилактической реакции и вычисляли анафилактический индекс по Weigle (Адо В.А. и соавт., 1971).

Для оценки реакции ГЗТ морских свинок иммунизировали однократным введением соединений в смеси с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ) в подушечки задних конечностей. Животных контрольной группы иммунизировали ПАФ. На 21-й день морским свинкам вводили внутрикожно разрешающую дозу - 0,05 мл раствора соединения, в концентрации, выбранной в предварительной серии опытов, не оказывающей кожнораз-дражающего действия. В качестве контроля применяли 0,05 мл физиологического раствора. После чего через 24 часа и 48 часов проводили визуальную оценку наличия аллергических реакций замедленного типа.

Модель вторичного иммунодефицита, вызванного введением циклофосфамида (ЦФ). Для получения вторичного иммунодефицита ЦФ вводили в дозе 150 мг/кг в/б. Влияние ноопепта (5 мг/кг, в/в) на индуктивную фазу иммунного ответа исследовали, вводя препарат однократно мышам одновременно с антигеном, на продуктивную фазу -на 3-й или 5-е сутки после иммунизации ЭБ. ГБ-115 (0,1 мг/кг, per os) вводили трехкратно, начиная через 24 часа после введения ЦФ, на 4-е сутки после введения ЦФ животных ЭБ и исследовали гуморальный и клеточный иммунный ответ. Субпопуляцион-ный состав лимфоцитов селезенки мышей линии BALB/c изучали на 8-й день после введения ЦФ.

Повторная плавательная нагрузка. Мышей линий СВА, C57BL/6, BALB/c и гибридов Fi (CBAxC57BL/6) помещали в пластиковую клетку, идентичную жилой, заполненную водой (t°=22-24°C) на 'А объема, ка 20 мип ежедневно в течение 10 дней (Ару-шанян Э.Б. и соавт., 2003). Ноопепт (5 мг/кг) и ГБ-115 (1мг/кг) вводили в/б каждый день опыта через 30 мин после окончания плавания.

Модель экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ). Для моделирования ЭАЭ (Brundula V et al., 2002) на 0 и 7 день опыта мышам самкам линии C57BL/6 в основание хвоста вводили 100 мкг крысиного миелин олигодендроцит глико-протеина (35-55), эмульгированного в 100 мкл ПАФ, содержащего 4 мг/мл убитых Mycobacterium tuberculosis. Также на 0 день каждому животному в/б вводили по 200 мкл физиологического раствора с 300 нг Pertussis toxin; инъекцию повторяли через 48 часов ГБ-115 (1 мг/кг) и ноопепт (0,5 мг/кг) вводили в/б с 8 по 14 день опыта. Для оценки подвижности животных на 14 и 15 день опыта использовали тест «двигательная активность» в актометре Ugo Basile (Италия). На 15 день опыта проводили забой животных, измерение массы тимуса, селезенки и анализ субпопуляционного состава Т-лимфоцитов селезенки.

Методы исследования противовоспалительной активности. Для изучения противовоспалительного действия с использованием модели острого экссудативного воспаления у крыс ГБ-115 и дилепт вводили в/б за 60 мин до введения в подушечку стопы кар-рагенана или конканавалина А (КонА). При каррагенан-индуцированном отеке в тече-

ние 4 часов измеряли отек стопы крыс, микрометром (0,1 мм). При КонА-индуцированном воспалении определяли массу лап мышей СБА и подсчитывали индекс реакции воспаления.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили в пакете статистических программ Statistica 6.0 (StatSoft, Inc) с помощью t-критерия Стьюдента. Данные представлены как MEAN ± SEM (среднее ± стандартная ошибка).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Изучение аллергнзирующих свойств ГБ-115 и дилепта

В рамках доклинического изучения безопасности проводили исследование аллерги-зирующих свойств ГБ-115 и дилепта. Установлено, что введение ГБ-115 (0,1 и 10 мг/кг) и дилепта (16 и 160 мг/кг) не приводило к усилению реакции анафилаксии на БКЯ. Оценка ГЗТ после иммунизации морских свинок изучаемыми соединениями в смеси с ПАФ не выявила положительных реакций в месте внутрикожного введения ГБ-115 и дилепта. Отсутствие у ноопепта аллергизирующего действия показано ранее (Коваленко Л.П. и соавт., 2002).

2. Изучение влияния ноопепта, ГБ-115 и дилепта на функциональную активность иммунной системы у интактных мышей

2.1, Исследование фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов

Результаты исследования фагоцитоза перитонеальных макрофагов представлены на рис.1. Двухнедельное введение ноопепта per os в дозах 10 мг/кг и 100 мг/кг вызывало значимое повышение фагоцитарного индекса в 3,6 раза и в 2,9 раза, соответственно, по сравнению с контролем. ГБ-115 был эффективен лишь при трехкратном в/б введении в дозе 1 мг/кг, стимулируя фагоцитоз в 2,3 раза (р<0,05)2.

¿25

4 30

<и ц

" 25

S 15

I»

Т Ц If т

-Ц— ¡Hi нн

g Контроль Ноопегтг Ноолегтт Ноопеггг

Юыг/кг, per 10Омг/кг, 5мг/кг, в/в,

os, 14 дней per os, 14 однократно дней

Контроль ГБ-115 ГБ-115 ГБ-115 0,1 мг/кг, в/б, 1мг/кг, в/6, Юмг/кг, в/б, Здня Здня Здня

Рис. 1. Фагоцитарная активность перитонеальных макрофагов мышей гибридов (СВА х С57ВЬ/6) после введения ноопепта ГБ-115 и дилепта; п=10; достоверность различий с контролем при * - р<0,05, ** - р<0,01.

2 В этом и последующих опытах по изучению функциональной активности иммунной системы курсовое введение дилепта (per os, 16 мг/кг и 160 мг/кг) не оказывало статистически значимого действия на параметры иммунитета у интактных мышей.

Таким образом, ноопепт и ГБ-115 стимулировали фагоцитарную активность перито-неальных макрофагов, действие ноопепта на этот показатель бьио более выражено, чем у ГБ-115. Установленные результаты согласуются с данными о стимулирующем влиянии на перитонеальные макрофаги глицин- и пролинсодержащих олигопептидов: мие-лопептида МП-3 (Михайлова А.А., 2001) и гептапептида Семакса (Мясоедов Н.Ф., Гривенников И.А., 2004).

2.2. Исследование гуморального иммунного ответа

Данные по изучению влияния ноопепта, ГБ-115 и дилепта на гуморальный иммунитет мышей, оппозитно реагирующих на ЭБ линий, СБА (высокоотвечающая на ЭБ) и С57В176 (низкоотвечающая на ЭБ) представлены в табл. 1. Введение ноопепта и ГБ-115 вызывало стимуляцию антителообразования у мышей линии С57В176, в большей степени, чем у животных линии СВА.

Таблица 1. Влияние ноопепта, ГБ-115 и дилепта на гуморальный иммунный ответ мышей самцов линий СВА и С57В1У6._

Группа Мыши липии СВА Мыши линии C57BL/6

Контроль; ЭБ 5x10" Ноопепт, 0,5 мг/кг, однократно, в/м; ЭБ 5x108 Ноопепт, 5 мг/кг, однократно, в/м; ЭБ 5х108 8,6 ± 0,3, п=8 9.0 ± 0,2, п=9 9.1 ± 0,4, п=9 6,6 ± 0,3, п=10 7,7±0,3*,п=10 8,1 ± 0,4**, п=10

Контроль; ЭБ 5x10' Ноопепт, 10 мг/кг, 14 дней, per os; ЭБ 5x107 Ноопепт, 100 мг/кг, 14 дней, per os; ЭБ 5x107 8,4 ± 0,6, п--8 8,6 ± 0,8, п=8 8,8 ± 0,6, п=8 7,3 ± 0,7, п=9 8,6 ± 0,8*, п=8 8,3 + 0,9, п=8

Контроль; ЭБ 5x10' ГБ-115,0,1 мг/кг, 14 дней, per os, ЭБ 5х107 ГБ-115,10 мг/кг, 14 дней, per os; ЭБ 5х107 7,4 ± 0,3, п=10 8,2 + 0,4,п=10 8,6 ± 0,2**, п=10 6,0 ± 0,3, п=9 7,5 ± 0,4**, п=11 8,8 ±0,4**, п=12

Контроль; ЭБ 5x10' Дилепт, 16 мг/кг, 14 дней, per os; ЭБ 5x107 Дилепт, 160 мг/кг, 14 дней, per os; ЭБ 5х107 6.0 ± 0,6, п=10 6,3 ± 0,4, п=10 6.1 ±0,2, п=10 5,7±0,2, п=10 6,3 ±0,3, п=10 6,3 ±0,3,п=10

Примечание'. В таблице представлены средние величины титра антител в п - количество животных в группе; достоверность различий с контролем при * - р<0,05, ** - р<0,01.

Известно, что существуют генетически обусловленные линейные различия в количественном содержании МНС II (1а-а) у мышей различных линий. Наличие дефекта презентации антигена на макрофагах мышей линии C57BL/6 приводит к снижению иммунного ответа на тимусзависимый антиген (Медуницин Н.В., Алексеев Л.П., 1987). В этой связи, стимуляция гуморального иммунного ответа у мышей линии C57BL/6 после введения ноопепта и ГБ-115, вероятно, указывает на иммунокорригирующее действие ди-пептидов при генетически обусловленном снижении иммунного ответа.

2.3. Исследование клеточного иммунного ответа

При оценке влияния ноопепта, ГБ-115 и дилепта на клеточный иммунный ответ у мышей F[ (CBAxC57BL/6) установлено, что введение ноопепта (в/в, 5 мг/кг) одновременно с антигенной стимуляцией ЭБ приводит к значимому увеличению индекса реакции ГЗТ (54,1±9,1%) по сравнению с данными контроля (37,1±2,8%) в 1,5 раза. Введение ГБ-115 (per os, 0,1 мг/кг и 10 мг/кг) и дилепта (per os, 16 мг/кг и 160 мг/кг) было неэффективно в отношении клеточного иммунного ответа у интактных мышей.

Таким образом, ноопепт и ГБ-115 оказывают увеличение фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов и гуморального иммунного ответа, ноопепт стимулирует также клеточный иммунный ответ. Данные о стимуляции антителообразования у мышей линии C57BL/6 с генетически детерминированной низкой реакцией на ЭБ после введения ноопепта и ГБ-115 позволили предположить наличие у изученных соединений им-мунокорригирующей активности и продолжить исследование этого эффекта.

3. Оценка иммунокорригирующего действия ноопепта и ГБ-115 с использованием модели вторичного иммунодефицита, вызванного введением ЦФ у мышей

3.1. Исследование гуморального иммунного ответа у мышей с вторичным иммунодефицитом

При изучении иммунокорригирующего действия ноопепта на гуморальный иммунный ответ у мышей с вторичным иммунодефицитом, вызванным введением ЦФ, определяли уровень IgM и IgG антител к ЭБ (рис. 2).

Рис. 2. Иммунокорригирующее действие ноопепта (в/в, 5 мг/кг) на индуктивную и продуктивную фазы ^М- и ^й-гуморального иммунного ответа мышей линий СВА и С57ВЬ/6 (средний 1о& титра АТ в РИГА при антигенной нагрузке ЭБ 5x106, введение в день «0») при иммунодефиците, вызванном введением циклофосфамида (ЦФ, введение в день «-1»); п=8-10; *- достоверность различий с контролем при р<0,05; #- достоверность различий с ЦФ при р<0,05.

У животных с иммуносупрессией значимое подавление Iglvi-иммунного ответа составляло 38,0 % по сравнению с контролем. Введение ноопепта (5 мг/кг, в/в) мышам предотвращало развитие вторичного иммунодефицита. Введение ЦФ мышам СВА и C57BL/6 достоверно подавляло выработку IgG-антител на 69,2 % и 59,1 % по сравнению с контролем, ноопелт препятствовал этому эффекту за счет стимуляции антителообра-зования (р<0,05).

При изучении иммунокорригирующего действия ГБ-115 на гуморальный иммунный ответ было установлено, что введение ЦФ приводило к значимому уменьшению титра антител (1,6±0,3, усл.ед.) по сравнению с контролем (3,9±0,3, усл.ед.) в 2,4 раза, при этом введение ГБ-115 (0,1 мг/кг, трехкратно, per os) восстанавливало этот показатель (3,3±0,4, усл.ед.).

Таким образом, ноопепт и ГБ-115 проявляли иммунокорригирующее действие на гуморальный иммунный ответ при вторичном иммунодефиците, вызванном введением ЦФ.

3.2. Исследование клеточного иммунного ответа у мышей с вторичным иммунодефицитом

Изучение влияния ноопепта и ГБ-115 на клеточный иммунный ответ при вторичном иммунодефиците показало, что введение ЦФ за 24 часа до антигенной стимуляции достоверно подавляло клеточный иммунный ответ (рис. 3).

Контроль

ЦФ, 150 мг/кг ЦФ, 150шлг;

ноопепт 5мг/кг

60

* 50 н

со

ж 40

га in <и

о

S 20

et J 10 о

т I кет

1Й

**

met i

¡Sri

ЦФ,150мг/кг ЦФ,150мг(кг;

ГБ-115 0,1 мг/кг

Рис. 3. Иммунокорригирующее действие ноопепта (5 мг/кг, в/в) и ГБ-115 (0,1 мг/кг, per os) на клеточный иммунный ответ мышей с иммунодефицитом, вызванным введением ЦФ; п=10; различия с интактным контролем с уровнем значимости * - р<0,05; ** - р<0,01; " - различия с группой ЦФ с уровнем значимости р<0,01.

Ноопепт, вводимый мышам с вторичным иммунодефицитом, не только устранял иммуносупрессивное действие ЦФ, но и вызывал стимуляцию реакции ГЗТ по сравнению с контрольной группой животных. Введение ГБ-115 в дозе 0,1 мг/кг (3-х кратно, в/б) достоверно восстанавливало показатели клеточного иммунного ответа до контрольных значений.

Таким образом, было установлено иммунокорригирующее действие ноопепта и ГБ-115 на клеточный иммунный ответ при вторичном иммунодефиците, вызванном введением ЦФ.

3.3. Оценка массы тимуса и субпопуляционного состава Т-лимфоцитов у мышей с вторичным иммунодефицитом

В следующей серии опытов проводили оценку массы тимуса и иммунофенотипиро-вание Т-лимфоцитов у мышей ВАЬВ/с при иммунодефиците, вызванном введением ЦФ. На 8-е сутки после введения ЦФ наблюдали значимое уменьшение массы тимуса3 (12,8±1,7) по сравнению с интактными мышами (19,6±0,9). Защитное действие ГБ-115 (3-х кратно, в/б) заключалось в достоверном восстановлении массы тимуса (17,2±1,0). На 8-й день после введения ЦФ было отмечено уменьшение количества Т-лимфоцитов в основном за счет С04+ популяции (р<0,05), введение ноопепта и ГБ-115 приводило к восстановлению количества С04+-лимфоцитов (рис. 4). Снижение количества СБ8+-яимфоцитов после введения ЦФ не носило достоверного характера.

Рис. 4. Влияние введения в/б ноопепта и ГБ-115 на содержание CD4+- и CDS*-лимфоцитов селезенки мышей линии BALB/c с вторичным циклофосфановым иммунодефицитом; п=10; * - р<0,01 по сравнению с группой интактных мышей; * - р<0,05 по сравнение с группой контрольных мышей с циклофосфановым иммунодефицитом.

Известно, что введение ЦФ вызывает нарушение гемопоэза, подавляет гуморальный и клеточный иммунный ответ (Гольдберг Е.Д. и соавт., 2000). Ноопепт и ГБ-115 проявляют иммунокорригирующее действие на клеточный и гуморальный иммунный ответ, массу тимуса и содержание С04+-лимфоцитов у мышей с вторичным иммунодефицитом, вызванным введением ЦФ. Полученные результаты согласуются с данными литературы об иммунокорригирующей активности глицин- и пролинсодержащих пептидов (Михайлова A.A., 2001; Мясоедов Н.Ф. и соавт., 2006).

40

□ Интактные 0ЦФ. 150 мг/кг

НЦФ, 150 мг/кг; ноопепт 5 мг/кг В ЦФ, 150 мг/кг. ГБ-115 1 мг/кг

CD4+

CD8+

3 Здесь и далее масса тимуса в мг на 10 г массы мыши.

4. Изучение иммунокорригирующего действия ноопепта и ГБ-115 при повторной плавательной нагрузке (ППН) у мышей

4.1. Исследование гуморального и клеточного иммунного ответа при ППН Изучение иммунофармакологической активности ноопепта и ГБ-115 на фоне ППН (рис. 5) показало снижение клеточного иммунного ответа на 47,4 % (р<0,05), что устранялось введением ноопепта (5 мг/кг, в/б, 10 дней) и ГБ-115 (1 мг/кг, в/б, 10 дней). Гуморальный иммунный ответ при использовании данной модели достоверно не изменялся. Полученные результаты согласуются с данными литературы о преимущественном влиянии хронического стресса на Т-клеточное звено иммунитета (Hassig А. ег а1., 1996). Но-опепт и ГБ-115 оказывают иммунокорригирующее действие на клеточный иммунный ответ при ППН.

^ 50

I 40

■з

го

£30

о 20

СЕ

# т #

-1- ш

* шя

Я® Ий

¡¡¡В - *': ЩИ!

Н1 ¡¡¡¡¡8 я

Интакгные

ППН

ППН+ноопепт ППН+ГБ-115

Рис. 5. Иммунокорригирующее действие ноопепта и ГЕ-115 на клеточный иммунный ответ у мышей: * - достоверность различий с интактным контролем, р<0,05; # - достоверность различий с группой ППН, р<0,05; п=10.

4.2. Оценка массы тимуса и субпопуляционного состава Т-лимфоцитов при ППН

Согласно данным, представленным на рис. 6, ППН приводила к достоверному уменьшению массы тимуса у мышей линий С57ВЬ/6 на 27,8 %, ВАЬВ/с на 28,3 % и у иммунизированных ЭБ гибридов (СВА х С57ВЫ6) на 28,7 %. Позитивное действие ноопепта (5 мг/кг, в/б, 10 дней) и ГБ-115 (1 мг/кг, в/б, 10 дней) заключалось в восстановлении массы тимуса (р<0,05).

Как следует из результатов по иммунофенотипированию лимфоцитов (рис. 7), при ППН происходило статистически значимое уменьшение количества С04+-лимфоцитов в селезенке мышей линии С57В176, у остальных животных не отмечалось достоверного изменения количества СВ4+-лимфоцитов. СБ8+-клетки были резистентны к воздействию стрессогенного фактора. Введение ноопепта приводило к нормализации количества С04+-клеток.

Рис. 6. Иммунокорригирующее действие ноопепта и ГБ-115 на массу тимуса у мышей различных линий; * - достоверность различий с интактным контролем при р<0,05; # - достоверность различий с группой ППН при р<0,05; п-10.

ВАЬВ/с С04+ С57ВС-/6 С134+ ВАЬВ/с С08+ С57В1./6 С08+

□ Интакгные 0ППН ВППН+ноопепт ПППН+ГБ-115

Рис. 7. Действие ноопепта и ГБ-115 на количество СВ4Т- и С08+-лимфоцитов у мышей линий ВАЬВ/с и С57ВЬ/6 после ППН; п=10; * - достоверность различий с интактным контролем при р<0,05; # - достоверность различий с группой ППН при р<0,05.

ВА1-В/С С57В1_/6 Р1(СВАхС57В1_/6)

□ Интакгные а ППН И ППН +ноопепт □ ППН +ГБ-115

45

40

35

30

1 25

ьс 20

15

10

5

0

ВА1-В/С С57Виб

□ Контроль

а ппн

@ ППН+ноопепт ЕППН+ГБ-115

Рис. 8. Действие ноопепта и ГБ-115 на уровень ИЛ-1Р в плазме мышей линий ВАЬВ/с и С57ВЬ/6 после ГШН; п=10; достоверность различий с интактным контролем при * - р<0,05; ** -р<0,01; достоверность различий с группой ППН при #- р<0,01.

После ППН обнаружено статистически значимое увеличение уровня ИЛ-1 ß в плазме мышей линий BALB/c и C57BL/6 (рис. 8). Введение ноопепта (5 мг/кг, в/б, 10 дней) приводило к уменьшению уровня ИЛ-lß до контрольных значений у мьппей линий BALB/c (р<0,05).

Таким образом, ППН у мышей сопровождалась супрессией Т-клеточного звена иммунитета, уменьшением массы тимуса, увеличением уровня ИЛ-lß, что согласуется с данными литературы (Арушанян Э.Б. и соавт., 2003; Turnbull A.V., River C.L. 1999). Известные своими анксиолитическими свойствами ноопепт и ГБ-115 (Колик Л.Г. и соавт., 2003; Ostrovskaya R. et al., 2006), проявляли иммунокорригирующее действие на клеточный иммунный ответ, массу тимуса и количество Т-хелперных лимфоцитов. Ноопепт обладал нормализующим влиянием на уровень ЙЛ-lß у мышей после ППН.

5. Оценка противовоспалительных свойств ГБ-115 и дилепта

Для изучения противовоспалительного действия ГБ-115 и дилепта были использованы модели острого экссудативного отека стопы на каррагенан у крыс и на Кон А у мышей.

5.1. Модель острого экссудативного воспаления, вызванного введением каррагенана

Результаты изучения противовоспалительного действия ГБ-115 и дилепта с использованием модели каррагенан-индуцированного воспаления у крыс представлены на рис.9.

0

1

з -

§

Рис. 9. Противовоспалительное действие ГБ-115 и дилепта по сравнению с диклофенаком в модели экссудативного отека лапы крыс на каррагенан; п=10.

При введении ГБ-115 (0,1, 1 и 10 мг/кг, в/б) наблюдалось дозозависимое подавление воспалительной реакции, сравнимое с действием диклофенака. Однократное в/б введение дилепта в дозах 0,8 мг/кг, 3 мг/кг и 5 мг/кг крысам также приводило к статистически

%/f "Xi -i

it"" 4г--------

■'01234 ——Контроль чаоы опыта

— •- - ГБ-115 0,1 мг/кг —*—ГБ-115 1 мг/кг

— »--ГБ-115 10 мг/кг ---»-- Диклофенак 6,75 мг/кг

0 12 3 4 Часы опыта

» Контроль — «- - Дилепт, 0,8 мг/кг —ü— Дилепт, 3 мг/кг —♦— Дилепт, 5 мг/кг -■-о—-Диклофенак6,75 мг/кг

значимому подавлению экссудативного отека, вызванного каррагенаном, на 1, 2, 3 и 4 часах опыта. Полученные данные указывают на наличие у ГБ-115 и дилепта выраженного дозозависимого противовоспалительного действия. В работе Коваленко Л.П. и соавторов (2002) установлены противовоспалительные свойства ноопепта (5 мг/кг, в/в) с использованием модели каррагенан-индунированного воспаления у крыс.

5.2. Модель острого экссудативного КонА-индуцированного воспаления у мышей Результаты опытов по изучению противовоспалительного действия ГБ-115 и дилепта с использованием модели КонА-индуцированного воспаления у мышей представлены на рис.10. Введение ГБ-115 в дозах 0,1 мг/кг, 1 мг/кг и 10 мг/кг в/б вызвало значимое уменьшение реакции воспаления на 47,3 %, 41,9 % и 56,7 %, введение кларитина оказывало подавление реакции воспаления в 3,7 раза (р<0,01). Дилепт (0,8 и 5 мг/кг, в/б) дозо-зависимо угнетал воспалительную реакцию на 34,7 % и 39,6 %, соответственно (р<0,05).

18 16

85 14

5 10

£ 10

Контроль

ГБ-115 ГБ-115 0,1 мг/кг, рег оэ Юмг/кг, рег ой

Контроль ГБ-115 ГБ-115 ГБ-115 Кларлтин 0,1мг/кг, 1 мг/кг, Юмг/кг, 1,3 мг/кг, в/б в/б в/б в/б

25

20

1,5 (0

а

^ 10

V

?

з; 5

о

Нл т

- *

Контроль

Дилепт, Дилепт,

16мг/кг, рег о$ 160МГ/КГ, рег о

18

15

12

а

л К. 9

о

* 3

0

т

* .___** _ .

- рйг

ш

Дилепт, 0,8мг/кг, в/б

Дилепт. 5мг/кг, в/б

Рас. 10. Противовоспалительное действие ГБ-115 и дилепта в модели острого экссудативного воспаления на Кон А у мышей; п=10; достоверность различий с контролем при * - р<0,05; " - р<0,01.

При пероральном введении ГБ-115 и дилепт были эффективны в модели Кон А-индуцировапного воспаления только при использовании соединения в максимальных дозах (ГБ-115, 10 мг/кг - подавление воспаления на 76,1 %; дилепт, 160 мг/кг - подавление воспаления на 42,9 %).

□ Контроль

О ГБ-115 0,1 мг/кг О ГБ-115 1 мг/кг с Дилепт 0,8мг/кг

□ Дилепт 5мг/кг

И Унитиол 500мг/кг

Известно, что ноопепт при пероральном и в/в введении обладает выраженным противовоспалительным действием при КонА-индуцированном воспалении, сравнимым с действием ибупрофена (Коваленко Л.П. и соавт., 2002).

Таким образом, установлено, что ГБ-115 и дилепт проявляли противовоспалительные свойства на моделях острого экссудативного воспаления у крыс и мышей.

5.3. Исследование действия ГБ-115 и дилепта на продукцию свободных радикалов активированными нейтрофилами крови мышей.

В настоящее время установлено, что полиморфоядерные лейкоциты могут играть отрицательную роль в патогенезе заболеваний нервной и кардиоваскулярной систем, сопровождающихся воспалительными реакциями. При инсульте нейтрофилы оказывают цито- и органотоксическое действие, увеличивая зону поражения. Как было показано Л.П. Коваленко и соавторами (2002), введение ноопепта в дозе 5 мг/кг в/в вызывает подавление интенсивности стимулированной зимозаном хемилюминесценции нейтро-фильных гранулоцитов в 5,7 раза. Действие ГБ-115 (0,1 мг/кг и 1 мг/кг) и дилепта (0,8 мг/кг и 5 мг/кг) на активность нейтрофилов мышей гибридов (СВАхС57ВЬ/б) в тесте хемилюминесценции изучалось в сравнении с унитиолом. Результаты исследований представлены на рис. 11.

Рис. 11. Подавление свободнорадикальной продукции нейтрофилов мышей после введения ГБ-115 и дилепта в сравнении с унитиолом; достоверность различий с контролем при * - р<0,05; "-р<0,01;п=10.

Как видно из представленных данных, после в/б введения ГБ-115 в дозе 1 мг/кг и дилепта в дозе 5 мг/кг происходит значимое подавление хемилюминесцентного ответа нейтрофилов на 43,2 % и 46,4 %, соответственно. Введение препарата сравнения уни-тиола (500 мг/кг, per os) вызывало подавление интенсивности хемилюминесцентного ответа нейтрофилов на зимозан в 3,9 раза.

Таким образом, ГБ-115 и дилепт при парентеральном введении проявили антиокси-дантные свойства в экспериментах с нейтрофильными гранулоцитами мышей, что может быть одним из механизмов противовоспалительной активности соединений.

6. Иммунофармакологические свойства ноопепта и ГБ-115 при ЭАЭ у мышей

Развитие ЭАЭ приводило к формированию у мышей опытных групп к 10 дню эксперимента нарушений легкой и средней степени тяжести - потери тонуса хвоста, а также парезов задних конечностей. На фоне развившейся патологии у животных с энцефаломиелитом на 15 день опыта наблюдалось достоверное уменьшение в 2,3 раза спонтанной двигательной активности (104,0±26,3, усл. ед.) по сравнению с интактными мышами (239,7±6,4 усл. ед.). При введении ноопепта (239,2 ± 19,3, усл. ед.) и ГБ-115 (167,2±13,0, усл. сд.) происходило увеличение подвижности по сравнению с группой мышей с энцефаломиелитом (р<0,05). При этом у иммунизированных животных выявили статистически значимое уменьшение массы тимуса (13,5±1,4) в 3 раза по сравнению с данными ин-тактных мышей (41,1±0,3). В группах мышей, получавших ГБ-115, отмечалось восстановление массы тимуса (36,1±3,2), введение ноопепта не влияло на массу тимуса при ЭАЭ. Иммунофенотипирование Т-лимфоцитов позволило обнаружить значимое отклонение соотношения СД4+/СД8+-лимфоцитов у мьппей с ЭАЭ (2,8±0,1) от контрольного уровня (2,2±0,2), что предупреждалось введением ноопепта (2,1±0,2; р<0,05), при введении ГБ-115 не обнаружено изменения этого показателя. В ряде экспериментальных работ было показано, что при моделировании ЭАЭ у животных также регистрировалось увеличение соотношения СД4+/СД8+, причем увеличение этого показателя в течение фазы индукции ЭАЭ может быть прогностическим фактором для последующего развития патологии (Van Lambalgen R., Jonker M., 1987; Eralirma J.P. et al, 1994). Устранение дисбаланса в соотношении хелперной и супрессорной субпопуляций Т-лимфоцитов при введении ноопепта вероятно свидетельствует о его корригирующем влиянии на исследуемый патологический процесс.

Таким образом, исследование эффективности ГБ-115 и ноопепта при лечебной схеме введения на фоне ЭАЭ, позволяет отметить их позитивное воздействие на течение патологии вследствие уменьшения выраженности нейроиммунных отклонений, что возможно объясняется наличием у исследуемых соединений противовоспалительных и имму-нокорригирующих свойств.

7. Изучение влияния ГБ-115 на НгОг-индуцированный апоптоз мононуклеарных лейкоцитов человека

Анализ данных по способности ГБ-115 уменьшать атрофию тимуса в различных патологических моделях позволил сформулировать рабочую гипотезу о реализации восстановления массы тимуса посредством влияния на апоптоз иммунокомпетентных клеток. Известно, что ноопепт обладает антиапоптотическим действием: повышает выживаемость в культурах нейронов коры головного мозга, обработанных Н^СЬ, ингибируя накопление свободнорадикальных продуктов (Pelsman A. et al., 2003). С использованием модели глутаматной токсичности in vitro показано, что добавление дилепта в концен-

трации 10 мкМ к культурам клеток-зерен мозжечка во время действия глутамата и в по-стглутаматном периоде снижало индуцированную гибель нейронов на 37% (Ретсонская М.В., 2004). Учитывая способность ГБ-115 предотвращать атрофию тимуса в различных патологических моделях, были проведены опыты по изучению действия препарата на апоптоз в культурах иммунокомпетентных клеток.

Индукцию апоптоза в 24-часовых культурах мононуклеарных лейкоцитов вызывали Н2О2. Было выявлено, что апоптоз уменьшался при добавлении в культуры клеток ГБ-115 в концентрациях 10"8 М (р>0,05) на 13,2 %, 10"7 М (р<0,05) па 16,6 % и !0"6 М (р< 0,05) на 33,3 %.

□ Контроль

□ ДМСО

В ДМС0+Н202 В ДМСО+Н202+ГБ-115 10-8 В ДМССН-Н202+ГБ-115 10-7 И ДМС0+Н202+ГБ-115 10-6

Рис. 12. Действие ГБ-П5 на Н2Ог индуцированный апоптоз в культуре мононуклеарных лейкоцитов; * - р<0,05 по сравнению с контролем;" - р<0,05 по сравнению с ДМСО+ Н2О2.

Полученные результаты позволяют предположить, что способность ГБ-115 увеличивать резистентность мононуклеарных лейкоцитов к НгОг-индуцированному апоптозу, связана с антиоксидантной активностью препарата и является одним из механизмов его иммунокорригирующего действия.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведена комплексная оценка иммунофармакологической активности глицин- и пролинсо держащих дипептидных соединений - ноопепта, ГБ-115 и дилепта. Изучение этих соединений показало наличие у ноопепта и ГБ-115 иммуностимулирующего действия на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов и гуморальный иммунный ответ. Данные о стимуляции антителообразования у мьппей линии C57BL/6 с генетически детерминированной низкой реакцией на тимусзависимый антиген после введения ноопепта и ГБ-115 позволили прогнозировать наличие у них иммунокорригирую-щей активности.

Известно, что хронический эмоциональный стресс приводит к стойкому иммуноде-фицитному состоянию, уменьшая количество СДЗ^-лимфоцитов, нарушая соотношение СД4+/СД8+-лимфоцитов, что может способствовать возникновению аллергических и аутоиммунных заболеваний (Арушанян Э.Б., Бейер Э.Б., 2004; Marshall G.D., 2004), Кроме того, при хронических стрессорных воздействиях атрофия тимуса происходит в результате апоптотического действия кортикостероидов на тимоциты (Sabolsky R.M. et al., 2000; Цейликман О.Б. и соавт., 2005). В основе уменьшения массы тимуса при цикло-

фосфановой иммуносупрессии лежит лимфотоксическое действие метаболитов дикло-фосфамида (Масная Н.В., 2004). В результате проведенных экспериментов на моделях вторичного иммунодефицита различной этиологии, вызванного введением циклофос-фамида и воздействия повторной плавательной нагрузки было обнаружено, что введение ноопепта и ГБ-115 оказывало выраженный иммунокорригирующий эффект в отношении гуморального и клеточного иммунного ответа, количества Т-халперных лимфоцитов и массы тимуса у мышей. Под действием ноопепта происходит снижение уровня ИЛ-lp в плазме мышей линии BALB/c после повторной плавательной нагрузки.

По данным литературы добавление ноопепта и дилепта в культуры клеток головного мозга уменьшают индуцированный апоптоз (Pelsman A. et al., 2003; Ретюнская М.В., 2004). Можно предположить, что в основе способности ГБ-115 предотвращать атрофию тимуса в различных иммунопатологических моделях лежит его антиапоптотическая активность, выявленная в экспериментах на культуре мононукдеарных лейкоцитов человека, обработанных Н2О2.

Согласно данным литературы, при фотоипдуцированном тромбозе сосудов головного мозга у крыс ноопепт и дилепт проявляют нейропротекторное действие, уменьшая размер очага поражения (Романова Г.А., 2003; Ретюнская М.В , 2004). Развитие инсульта сопровождается иммуносупрессией и воспалительными реакциями, что способствует дальнейшему повреждению тканей мозга и расширению зоны ишемии (Wang X.et al, 2000, Prass К. et al., 2003, Ginsberg M D., 2001, 2007). Ранее были установлены противовоспалительные свойства ноопепта (Коваленко Л.П. и соавт., 2002). Полученные данные свидетельствуют, что ГБ-115 и дилепт также проявляют противовоспалительную активность на моделях острого экссудативного воспаления стопы у крыс на каррагенан и у мышей на Кон А, что является важным компонентом полифункционального действия изученных дипептидов.

Нейтрофильные гранулоциты при инсульте оказывают цито- и органотоксическое действие, увеличивая зону поражения. В настоящее время при терапии нейро- и кардио-васкулярных заболеваний активно разрабатывается антилейкоцитарная фармакологическая стратегия (Ginsberg M.D., 2007). Введение ноопепта вызывает выраженное подавление образования свободных радикалов кислорода нейтрофилами (Коваленко Л.П. и соавт., 2002). При введении ГБ-115 и дилепта мышам также обнаружено антиоксидант-ное действие в тесте хемилюминесценции с нейтрофилами. Установленный эффект может рассматриваться как один из механизмов противовоспалительной активности исследованных соединений.

Таким образом, при комплексном исследовании ноопепта, ГБ-115 и дилепта продемонстрированы их иммунокорригирующие свойства и противовоспалительное действие. Полученные данные дополняют понимание поликомпонентного действия этих соединений и открывают перспективы возможного применения ноопепта, ГБ-115 и дилепта при различных нейроиммунных патологиях, сопровождающихся развитием иммунодефи-цитных состояний и воспалительных реакций.

ВЫВОДЫ

1. При введении ГБ-115 в дозах 0,1 и 10 мг/кг и дилепта в дозах 16 и 160 мг/кг не обнаружено аллергических реакций замедленного типа и усиления реакции системной анафилаксии.

2. Ноопепт (0,5, 5, в/м; 10 мг/кг per os) и ГБ-115 (0,1, 1 мг/кг, per os) при курсовом введении стимулируют фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов и анти-телообразование у мышей. Введение ноопепта (5 мг/кг, в/в) увеличивает показатели клеточного иммунного ответа. При курсовом введении дилепта (16 и 160 мг/кг, per os) у мышей не выявлено достоверного изменения функциональной активности иммунной системы.

3. Введение ноопепта в дозе 5 мг/кг и ГБ-115 в дозах 0,1 мг/кг и 1 мг/кг мышам с вторичным иммунодефицитом, вызванным введением циклофосфамида и воздействием повторной плавательной нагрузки, восстанавливает параметры клеточного иммунного ответа, массу тимуса и количество CD44-лимфоцитов. Ноопепт снижает уровень интер-лейкина-ip в плазме мышей линии BALB/c после повторной плавательной нагрузки.

4. ГБ-115 (0,1, 1, 10 мг/кг, в/б) и дилепт (0,8, 3, 5 мг/кг, в/б) обладают противовоспалительным эффектом, сравнимым с действием диклофенака, на моделях острого экс-судативного воспаления на каррагенан у крыс и на Кон А у мышей.

5. С использованием модели люминолзависимой клеточной хемюпоминесценции при в/б введении ГБ-115 в дозе 1 мг/кг и дилепта в дозе 5 мг/кг установлено подавление продукции свободных радикалов кислорода активированными зимозаном нейтрофила-ми крови мышей. ГБ-115 снижает чувствительность мононуклеарных лейкоцитов человека к НгОг-индуцированному апоптозу.

6. При экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите введение ноопепта (0,5 мг/кг, в/б) приводит к увеличению двигательной активности мышей и нормализации соотношения хелперной и супрессорной популяций Т-лимфоцитов, введение ГБ-115 (1 мг/кг, в/б) восстанавливает двигательную активность и массу тимуса у мышей с энцефаломиелитом.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Коваленко, Л.П. Противовоспалительные свойства кардиотропных и психотропных средств [Текст] / Л.П. Коваленко, С.В. Алексеева, Е.В. Шиггаева, В Л. Савельев, Т.А. Гудашева, Р.У. Островская // Материалы 2-го съезда Российски о Общества фармакологов «Фундаментальные проблемы фармакологии». 2003 - Ч. 1. - С. 247.

2. Ретюнская, М.В. Нейропротективные свойства нового дипептидного нейролептика дилепта [Текст] / М.В. Ретюнская, Е.В. Шнпаева, А.Н. Игнашин, Л.П. Коваленко, Т.А Гудашева, Р.У. Островская И Материалы 2-го съезда Российского Общества фармакологов «Фундаментальные проблемы фармакологии». 2003. - Ч. 1. - С. 119.

3. Sorokina, A.V. Role of activated neurotrophic leukocytes in pathogenesis of different diseases [Text] / A.V Sorokina, L.P. Kovalenko, E.V. Shipaeva, T.A. Gudasheva, RU. Ostrovskaya, SB. Seredenin H 41st Congress of the European Societes of Toxicology, EUROTOX 2003, Florence (Italy). - 2003. - P. 317.

4. Kovalenko, L.P. Multicomponent action of psychotropic drugs on activated neutrophilic leucocytes / L.P. Kovalenko, E.V. Shipaeva // 8th ECNP Regional Meeting, Moscow, Russia, April 14-16,2005. - M., 2005. - P. 247-248.

5. Shipaeva, E.V. Effects of dipeptide nootropic noopept on immunity parameters in stressed CBA, C57BL/6 and F,(CBAxC57BL/6) mice // E.V. Shipaeva, L.P. Kovalenko / 8th ECNP Regional Meeting, Moscow, Russia, April 14-16,2005. - M., 2005. - P. 231-232.

6. Шнпаева, Е.В. Иммунотропное и противовоспалительное действие ноопепта в опытах на интактных и стрессированных животных [Текст] / Е.В. Щипаева, Л.П. Коваленко, Т.А Гудашева, Р.У. Островская, А.Д. Дурнев // Тезисы докладов 4-й Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», 13-16 марта, 2006 - М., 2006. - С. 81.

7. Коваленко, Л.П. Иммунофармакологические свойства ноопепта [Текст] / Л.П. Коваленко, Е.В. Шнпаева, С.В. Алексеева, А В. Пронин, А.Д Дурнев, Т.А. Гудашева, Р.У. Островская, С.Б. Середеяин ! Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2007.-Т. 144, № 7. - С. 54-57.

8. Коваленко, Л.П Особенности оценки иммунотоксичности различных групп фармакологических средств [Текст] / Л.П. Коваленко, Е.В. Шипаева, А.Д. Дурнев / Материалы III съезда фармакологов России «Фармакология практическому здравоохранению». Санкт-Петербург, 23-27 сентября 2007 г. // Психофармакология и биологическая наркология. - 2007. - Т. 7 (спец выпуск); ч. 2. - С. 1732.

9. Шипаева, Е.В. Иммунофармакологические свойства глицин- и пролинсодержа-цщх пептидов [Текст] / Е.В. Шипаева, Л.П. Коваленко, Т.А. Гудашева, Р.У. Островская,

А.Д. Дурнев // Материалы III съезда фармакологов России «Фармакология практическому здравоохранению». Санкт-Петербург, 23-27 сентября 2007 г. // Психофармакология и биологическая наркология. - 2007. - Т. 7 (спец. выпуск); ч. 2. - С. 2017.

10. Шипаева, Е.В. Иммунокорригирующие свойства дипептида ГБ-115 [Текст] / Е.В. Шипаева, Л.П. Коваленко, C.B. Хайдуков, Л.Г. Колик, Т.А. Гудашева, А.Д. Дурнев, С.Б. Середенин // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - Т. 145, №5.-С. 548-551.

11. Шипаева, Е.В. Иммунокорригирующие и противовоспалительные свойства ди-пептидного соединения ГБ-115 [Электронный ресурс] / Е.В. Шипаева, И.А. Мирошкина, И.В. Борисова / Материалы V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». Москва, 19-22 мая 2008 г. // Вестник РАМН (приложение к журналу). - 2008. - № 6. - С. 486. - 1 электрон. опт. диск (CD-ROM).

12. Шипаева, Е.В. Ноопепт - нейропротективный препарат с выраженными имму-нокорригирующими свойствами [Текст] / Е.В. Шипаева, Л.П. Коваленко, C.B. Алексеева, Т.А. Гудашева, Р.У. Островская, А.Д. Дурнев // Конференция с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга», Санкт-Петербург, 10-12 сентября 2008 г. / Тезисы докладов. - СПб: Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, 2008. - С. 161-162.

25

Список сокращений

БКЯ - белок куриного яйца В/б - внутрибрюшинно В/в - внутривенно

ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа

ИЛ-1Р - интерлейкин-1Р

Кон А - конканавалин А

ПАФ - полный адьювант Фрейнда

ППН - повторная плавательная нагрузка

РПГА - реакция гемагглютинации

ДФ - циклофосфамид

ЭАЭ - экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит ЭБ - эритроциты барана

Отпечатано в ЗАО «Оперативное тиражирование» Подписано в печать 30.10.08. Тираж 110 экз. Заказ № 110/30