Автореферат и диссертация по медицине (14.00.40) на тему:Влияние аминокислот на органотипическую культуру семенников молодых и старых крыс

На правах рукописи

ЗАКУЦКИЙ Александр Николаевич

ВЛИЯНИЕ АМИНОКИСЛОТ НА ОРГАНОТИПИЧЕСКУЮ КУЛЬТУРУ СЕМЕННИКОВ МОЛОДЫХ И СТАРЫХ КРЫС

14.00.53 - геронтология и гериатрия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ио316Э342

Санкт-Петербург - 2008

003169342

Работа выполнена в отделе клеточной биологии и патологии Санкт-Петербургского Института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН

Научный руководитель: доктор биологических наук, кандидат медицинский наук Чалисова Наталья Иосифовна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Кветной Игорь Моисеевич

доктор медицинских наук, профессор Радченко Валерий Григорьевич

Ведущее учреждение:

ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия последипломного образования» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ

Защита состоится » 2008 г в У часов

на заседании диссертационного Совета Д601 001 01 при Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН по адресу 197110 Санкт-Петербург, пр Динамо, д 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН (197110 Санкт-Петербург, пр Динамо, д 3)

Автореферат разослан

2008 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат биологических наук, доцент

Козина Л С

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Аюуалыюсть исследования. Прогрессирующее увеличение доли пожилых и старых людей в общей численности населения вместе с сокращением рождаемости последнее время становится все более актуальной медицинской, социальной и экономической проблемой развитых мран [Ашсимов В Н, 2007] Старение населения в экономически развитых странах ассоциировано с существенным увеличением частоты поздних браков Одним из негативных медицинских последствий позднего брака является бесплодие По данным ВОЗ 16% семейных пар в мире живут с диагнозом "бесплодие" [Овсянникова Т В и соавт, 1998] При этом мужское бесплодие составляет 50% в структуре общего бесплодия Кроме того, опубликовано несколько крупных исследований, свидетельствующих о стойком прогрессирующем снижении показателей сперматогенеза у здоровых мужчин [Быков В JI, 1999] Механизм описанных нарушений до конца не ясен В последнее время все большее количество исследований посвящается изучению изменений ткани семенников при старении, но большинство экспериментальных работ направлено на определение функциональных изменений яичек как основного поставщика тестостерона Сложность изучения возрастных изменений семенников состоит в том, что несмотря на выраженные дегенеративные изменения, семенники даже при старении остаются интенсивно пролифе-рирующим органом, продолжающим выполнять функции стероидогенеза и гаметогенеза [Eshre С, 2005] Таким образом, актуальность разработки методов лечения мужского бесплодия при старении организма не вызывает сомнений

Необходимо отметить, что мужское бесплодие секреторной этиологии представляет собой неоднородную по л иэтио логическую группу заболеваний, объединяемых недостаточным синтезом белка Несмотря на указанный общий патофизиологический признак, до сих пор не проводилось систематизированного исследования по применению разных аминокислот в лечении мужского бесплодия Из всех известных аминокислот в терапии мужского бесплодия использовался только L-аргинин [Боровец С Ю и соавт, 2005]

Одним из препятствий в разработке и внедрении новых препаратов для лечения мужского бесплодия секреторной этиологии является отсутствие адекватной экспериментальной модели Большинство моделей не способны воспроизвести основные этапы патогенеза секреторного мужского бесплодия, поэтому актуальным представляется использование метода органотипического культивирования ткани семенников Органотипическая культура сохраняет основные функции интактных семенников стеровдотенез (синтез тестостерона) и гаметогенез (образование сперматозоидов) на протяжении двух недель с момента начала культивирования [Roulet V et al, 2006, Lambrota R et al, 2006]

Цель и задачи исследования изучить влияния 20 кодируемых аминокислот и их метаболитов на процессы пролиферации и апоптоза в органотипической культуре семенников молодых и старых крыс

Для достижения этой цели были поставлены и последовательно решены задачи.

1 Изучить влияние 20 кодируемых аминокислот, в широком диапазоне концентраций сверхмалых доз, на пролиферацию клеток в органотипической культуре ткани семенников молодых и старых крыс

2 Определить ведущий путь апоптоза, задействованный в реализации эффекта аминокислот, доказавших свою активность в отношении пролиферации клеток органотипической культуры ткани семенников

3 Исследовать структурные аналоги и метаболиты аминокислот, стимулирующих пролиферацию клеток в органотипической культуре ткани семенников Изучить возможные пути увеличения эффективности аминокислот, активно регулирующих пролиферацию клеток в органотипической культуре ткани семенников

4 Установить оптимальное долевое соотношение аминокислот, необходимое для максимальной стимуляции пролиферации в органотипической культуре ткани семенников

Научная новизна работы. Впервые проведено систематизированное исследование влияния 20 кодируемых аминокислот на развитие органотипической культуры ткани семенников крысы При этом изучены эффекты аминокислот в широком диапазоне сверхмалых доз Впервые показано уменьшение числа аминокислот, проявляющих активность в культуре ткани семенников старых крыс и уменьшение диапазона концентраций, при которых аминокислоты демонстрирует свою эффективность, по сравнению с молодыми крысами) С помощью селективных регуляторов апоптоза (2,4-динитрофенол и молочная кислота) определены ведущие пути апоптоза (митохондриальный и рецепторно-опосредованный), задействованные в реализации эффекта аминокислот, регулирующих развитие органотипической культуры ткани семенников Впервые проведено систематизированное исследование влияния основных метаболитов Ь-аргинина на развитие культуры ткапи семенников При этом обоснована возможность использования метода органо-типического культивирования для определения метаболической взаимосвязи между отдельными биологически активными веществами Установлено, что для максимальной стимуляции клеточной пролиферации в органотипической культуре ткапи семенников крыс концентрация Ь-аргинина должна быть в 10 раз больше концентрации Ь-орнитина и креатина, но в 10 раз меньше концентрации Ь-изолейцина, Ь-лизина и Ь-цитруллина

Практическая значимость работы Результаты исследования влияния 20 кодируемых аминокислот на развитие органотипической культуры ткани семенников молодых

и старых крыс создают основу для их дальнейшего изучения в качестве лекарственных средств, предназначенных для лечения мужского бесплодия секреторной этиологии, в том числе ассоциированного со старением организма Наиболее перспективными для дальнейших исследований являются три аминокислоты Ь-изолейцин, Ь-лизин, Ь-аргшшн Изучены доступные пути для увеличения эффективности Ь-аргинина Полученные данные об оптимальном долевом соотношении аминокислот, необходимых для максимальной стимуляции пролиферации клеток в органотипической культуре семенников крысы, могут быть использованы при создании многокомпонентных препаратов с аминокислотами Кроме того, результаты исследования могут быть полезными в экспериментальной работе при использовании органотипической культуре ткани Продемонстрировано, что исследование веществ в широком спектре концентраций позволяет определить особенности метаболической взаимосвязи между отдельными биологически активными веществами Обоснована необходимость оценки возрастных изменений не только с позиций уменьшения количества действующих биологически активных веществ, но и с точки зрения уменьшения диапазона эффективных концентраций

Положения, выносимые на защиту

1 Кодируемые аминокислоты в широком диапазоне концентраций сверхмалых доз либо стимулируют (лейцин, изолеицин, аргинин, пролин, лизин) или ингибируют (гистидин) развитие органотипической культуры ткани семенников крысы Аминокислоты принимают участие в регуляции как митохондриального, так и рецепторно-опосредованного пути алоптоза

2 Каждая из активных в отношении клеточной пролиферации или алоптоза аминокислот обладает различным диапазоном эффективных концентраций в культуре ткани При старении наблюдается уменьшение как количества активных аминокислот, так и диапазона их эффективных концентраций

3 Метаболиты аргинина либо стимулируют (мочевипа, орнитин, цитруллин, креатин), либо ингибируют (оксид азота) развитие органотипической культуры ткани семенников молодых крыс У старых животных орнитин и креатин теряют стимулирующее влияние на пролиферацию клеток семенников, и происходит снижение чувствительности ткани семенников к повреждающему действию оксида азота

4 Для максимальной стимуляции клеточной пролиферации в органотипической культуре ткани семенников крыс концентрация Ь-аргинина должна быть в 10 раз больше концентрации Ь-орнитина и креатина, но в 10 раз меньше концентрации Ь-изолейцина, Ь-лизина и Ь-цитруллина.

Апробация и реализация диссертации. Материалы диссертации доложены на

Международном симпозиуме, посвященном 80-летию организации Института физиологии им И П Павлова (Санкт-Петербург), 2005, на Humboldt-Kolleg Conference "Technologies of the 21st century biological, physical, informational and social aspects" (Санкт-Петербург), 2005, на "Политехническом симпозиуме" (Санкт-Петербур1), 2006, на Всероссийской конференции "Перспективы фундаментальной геронтологии" (Санкт-Петербург), 2006, на Межинститугской конференции молодых ученых "Механизмы регуляции и взаимодействия физиологических систем организма человека и животных в процессах приспособления к условиям среды" (Санкт-Петербург), 2007, на V Всероссийской конференции с международным участием имени В Н Черниговского "Механизмы функционирования висцеральных систем" (Санкт-Петербург), 2007, на LXVIII ежегодной итоговой научно-практическои конференции студентов и молодых ученых (Санкт-Петербург), 2007

Публикации По теме диссертации опубликована 20 научная работа 11 статей и 9 тезисов, среди них 11 статей в журналах, включенных в перечень Высшей аттестационной комиссии Минобрнауки Российской Федерации

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста, включая 17 таблиц и 13 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения, выводов Список литературы содержит 209 источников, из них отечественных - 39, зарубежных - 170

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Органотипическое культивирование ткани семенников крыс проводили по описанной ранее методике [Калюнов В Н , 1986, Чалисова Н И и соавт, 2003, Levi-Montalchim R, 1982] Одним из препятствий в разработке и внедрении новых препаратов для лечения мужского бесплодия секреторной этиологии является отсутствие адекватной экспериментальной модели этого заболевания Большинство моделей не способны воспроизвести основные этапы патогенеза секреторного мужского бесплодия, поэтому актуальным представляется использование метода органотипического культивирования ткани семенников Этот метод позволяет исследовать местное воздействием биологически активных веществ, то есть исключаются системные эффекты нервной и эндокринной систем Кроме того, в органотипической культуре сохраняются нормальные тканевые взаимодействия между отдельными клетками (в отличие от диссоциированной культуры клеток Лейдига или Сертоли) [Roulet V et al, 2006, Lambrota R et al, 2006]

Многочисленные экспериментальные модели старения не позволяют полностью воспроизвести этапы естественного старения, поэтому в качестве биологического объекта нами были выбраны крысы линии Вистар молодые (3-месячные) и старые (24-месячные)

Для выделения и препарирования тканей использовали инструменты глазной хирургии Сразу после извлечения семенников их помещали в стерильную чашку Петри Затем семенники разделяли на фрагменты величиной около 1 мм3 Эксплантаты помещали в чашку Петри с коллагеновым покрытием (20-25 эксплантатов в каждой чашке) и культивировали в 3-х мл питательной среды (раствор Хенкса 41 мл, среда Игла 30 мл, сыворотка крови плодов коровы 25 мл, глюкоза 40% - 1 мл, инсулин 2,5 мл (100 ЕД) и гентамицин 0,5 мл (20 мг) на 100 мл среды) В опытной группе в чашки Петри вводили 15 мкл раствора тестируемых веществ в различной концентрации (от Ю-10 моль/л до 10~н моль/л) В контрольной группе в чашки Петри добавляли 15 мкл питательной среды, таким образом, эксплантаты экспериментальной и контрольной групп развивались в одинаковых объемах питательной среды Эксплантаты культивировались в СОг-инкубаторе при температуре 36,7 °С в среде с 5% содержанием СО2 Продолжительность культивирования составляла трое суток, так как известно, что такой временной интервал является необходимым для формирования полноценной зоны роста [Чалисова H И и соавт, 2005]

Пролиферация клеток в культуре тканей исследовали прижизненно с помощью светового микроскопа В эксплантатах после трех суток культивирования отчетливо определяются две зоны центральная (более плотная) и периферическая (в виде характерного ареола вокруг эксплантата) Центральная зона представлена клетками, исходно размещенными на коллагеновой подстилке Периферическая зона (или зона роста) состоит из выселившихся по окружности и вновь образованных клеток Лейдига и Сертоли [Roulet V et al, 2006, Lambrota R et al, 2006] Для количественной оценки роста эксплантатов определяли индекс площади (ИП) Это отношение площади всего эксплантата к исходной площади или площади центральной зоны

В работе использовали четыре группы химических реактивов L-аминокислоты (аланин (Ala), аргинин (Arg), аспарагин (Asn), аспартат (Asp), валин (Val), цистеин (Cys), глутамат (Glu), глицин (Gly), гистидин (His), изолейцин (Не), лейцин (Leu), лизин (Lys), метионин (Met), фенилаланин (Phe), пролин (Pro), серии (Ser), треонин (Thr), триптофан (Тгр), тирозин (Тут), Sigma, США), метаболиты L-аргинина (L-орнитин, мочевина, L-цитруллин, оксид азота, креатин - Vecton, Россия), вспомогательные вещества (сиддена-фил - Pfizer, США, глутатион - Vecton, Россия), регуляторы апоптоза (2,4-диншрофенол, молочная кислота - Vecton, Россия), L-аргтин-содержащий препарат "Гепасол" (Hemopharm, Югославия) Для получения требуемых концентраций (от 10~'°

моль/л до 10-14 моль/л) проводились последовательные разведения тестируемых веществ в питательной среде Концентрации 1(Г10 - 10"'4 моль/л относятся к диапазону сверхмалых доз Под термином "сверхмалая доза" подразумевают такую дозу вещества, которая создает концентрацию па несколько порядков ниже равновесной константы взаимодействия вещества со своим эффектором Использование сверхмалых доз аминокислот связано с тем, что в последнее двадцатилетие опубликовано много работ о чувствительности организмов к сверхмалым концентрациям биологически активных веществ [Шевченко И Н, 2003, Чалисова Н И и соавт, 2002, 2005] Чаще всего роль эффектора выполняют рецепторы, нижний предел чувствительности которых не опускается ниже Ю-10 М Дальнейшее снижение концентрации вещества приводит к исчезновению эффекта, но в диапазоне сверхмалых концентраций можно зарегистрировать второй пик активности Диапазон неэффективных концентраций между двумя пиками активности получил название "мертвой зоны" Второй пик активности аналогично первому характеризуется дозо-зависнмостью [Бурлакова Е Б , 1999] Сверхмалые дозы могут помочь решить важную для геронтологи-ческой практики проблему уменьшения выраженности побочных эффектов, поэтому актуальным является исследование эффектов аминокислот и их метаболитов в сверхмалых дозах в культуре ткани семенников крыс разного возраста

Визуализацию эксплантатов осуществляли с помощью микротеленасадки для микроскопа (МТН-13 "Альфа-Телеком", серия 10, Россия) Для расчета индекса площади эксплантатов использовали программу "РЬйоМ 1 2", позволяющую определить отношение общей площади эксплантата к площади центральной зоны

Определение ведущего пути апоптоза, задействованного в реализации эффекта исследованных Ь-аминокислот Выделяют два пути реализации апоптоза (программируемой клеточной гибели) митохондриальный и рецепторно-опосредованпый Митохондриальный путь свойственен патологически измененным клеткам и опосредуется цитохромом с разрушенных митохондрий Рецепторно-опосредованный путь типичен для неповрежденных клеток и опосредуется особыми рецепторами цитоплазматической мембраны Для определения ведущего пути апоптоза, задействованного в реализации эффекта исследованных Ь-аминокислот, были использованы химические вещества - селективные регуляторы митохондриального и рецепторно-опосредованного путей апоптоза 2,4-динитрофенол и молочная кислота (О-лактат) 2,4-динифтрофенол разобщает окисление и фосфорилирования, блокирует синтез аденозинтрифосфата в митохондриях и запускает митохондриальный путь апоптоза Для изучения рецепторно-опосредованного пути активации апоптоза был использован О-лактат Показано, что Р-лактат селективно ингибирует рецепторно-опосредованный путь

апоптоза семенников, реализуемый через Fas-рецепторы, и не влияет на митохондриаль-ный путь апоптоза [Erkkila К et al, 2002] Если аминокислота ингибируст митохондри-альный путь апоптоза, то ИП эксплантатов, культивируемых в присутствии смеси аминокислоты с регулятором апоптоза, больше ИП, полученного при изолированном применении этого регулятора Если аминокислота активирует рецепторно-опосредованный путь апоптоза, то ИП культуры, развивающейся в присутствии аминокислоты и регулятора апоптоза, меньше ИП, полученного при изолированном применении регулятора апоптоза

Иммуногистохимическос исследование эксплантатов

В периферической зоне роста эксплантатов на третьи сутки определяли экспрессию проапоптозного белка р53 Иммуногистохимическое исследование проводили иммунопе-роксидазным методом В качестве первых антител были использованы моноклональные мышиные антитела к проапоптозпому белку р53 (1 75, Novocastra) В качестве вторых антител применяли универсальный набор, содержащий биотинилированные аити-мышиные и анти-кроличьи иммуноглобулины Маркировку вторых антител осуществляли комплексом авидина с биотинилированной пероксидазой (ABC-kit) На завершающем этапе эксперимента добавляли диаминобензидин (все реактивы от Novocastra) Пероксидаза в присутствии перекиси водорода окисляет диаминобензидин, что приводит к его полимеризации и выпадению осадка коричневого цвета Для визуализации экспрессии р53 использовали одноэтапный протокол для мазков с фиксацией спиртом [Квстной И М и соавт, 2006]

После иммуногистохимической окраски морфометрическое исследование проводили с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений, состоящей из микроскопа Nikon Eclipse Е400, цифровой камеры Nikon DXM1200, персонального компьютера на базе Intel Pentium 4 и программного обеспечения "Видеотест-Морфология 4 0" В каждом исследуемом эксплантате анализировали 10 полей зрения при увеличении 400х Выраженность экспрессии р53 определяли как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения Изменение экспрессии р53 оценивали в процентах относительно контроля

Статистическая обработка экспериментальных данных

Математическое обеспечение исследования осуществляли в соответствии со стандартными методиками [Гланц С , 1999] с использованием параметрического метода -t-критерия Стьюдента Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью программы "Microsoft Office Excel 2003" При тестировании каждого вещества использовались 10 крыс (по 20 эксплантатов из семенников каждой крысы) ИП выражали в процентах относительно контроля Достоверность различий в ИП оценивали с помощью

^критерия Стьюдента Вероятность ошибки цифровых данных закладывалась в пределах 5%, что отвечает стандартам, принятым для медико-биологических исследований

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние аминокислот на пролиферацию клеток в органотипнческой культуре семенников

Проведено скрининговое исследование влияния 20 кодируемых Ь-аминокислот в концентрации от Ю-10 до Ю-14 моль/л на рост эксплантатов семенников молодых и старых крыс Достоверно влияли на развитие органотипнческой культуры семенников молодых крыс только шесть Ь-аминокислот изолейцин, аргинин, лизин, лейцин, пролин, гистидин Остальные 14 Ь-аминокислот не продемонстрировали достоверного эффекта (рис 1) Причем, Ь-гистидин - единственная аминокислота, которая угнетала развитие органотипнческой культуры ткани семенников молодых крыс Обнаружено, что концентрационная ширина пика активности у разных аминокислот имела существенные отличия Для Ь-изолейцина, Ь-аргинина и Ь-лизина характерен широкий пик активности, так как они стимулировали рост эксплантатов семенников в нескольких смежных концентрациях Ь-изолейцин стимулировал пролиферацию ткани семенников во всех пяти, исследованных концентрациях (Ю-10, 10~", 10~'2, 10~13, 1044 моль/л), Ь-лизин проявлял активность в трех концентрациях (Ю-10, Ю-12, 10~13 моль/л), Ь-аргинин влиял на пролиферацию ткани семенников в двух из пяти концентрациях (Ю-11, 10~12 моль/л) Ь-лейцин, Ь-пролин и Ь-гистидин продемонстрировали свою эффективность только в концентрации Ю-12 моль/л

Таблица 1

Влияние эффективных аминокислот на индекс площади органотипнческой культуры семенников молодых крыс

Аминокислота Индекс площади эксплантатов, %

Концентрация вводимых аминокислот в культуре, моль/л

10 10"" 10" Ю-13 10"14

Ь-изолейцин 22±7%* 26±4%* 31±6%* 19±3%* 25±7%*

Ь-лизин 25±5%* -4±3% 25±4%* 19±6%* 13±7%

Ь-аргшшн 8±2% 19±2%* 26±5%* 12±4% -5±3%

Ь-лейцин 4±7% 8±3% 21±3%* 9±6% 3±2%

Ь-пролин 7±4% -2±5% 16±4%* б±2% 8±3%

Ь-гистидин 0±4% 2±6% -15±4%* -4±6% 3±1°/о

Примечание *Р<0,05 по сравнению с ИП в контроле (0%)

Аргинин выпускают в составе многокомпонентного фармакологического препарата "Гепасола" (Гепасол® , Hemopharm, Югославия), содержащего большие дозы L-аргинина с примесью важнейших витаминов и микроэлементов. Наши опыты показали, что эффективность "Гепасола" превосходит эффективность L-аргинина. Если L-аргинин увеличивал ИП органотипической культуры семенников молодых крыс в двух из пяти тестированных концентраций, то "Гепасол" обладал аналогичным эффектом в четырёх концентрациях. Значения ИП органотипической культуры семенников молодых крыс при добавлении "Гепасола" в разных концентрациях диапазона сверхмалых доз составили 18±4% (п=22, р<0,05) для 10"10 моль/л, 28±7% (п=22, р<0,05) для 10"" моль/л, 32±4% (п=22, р<0,05) для 10"п моль/л, 15±4% (п=22, р<0,05)для 1(Г'Э моль/л, 10±6% (п=22, р<0,05) для 10"14 моль/л по сравнению с контролем. Таким образом, концентрационный диапазон активных концентраций препарата "Гепасол" в два раза больше аналогичного показателя у L-аргинина.

40%

о

О)

Ч 0%

-10%

-20%

Gly Ala Ash Ж Uys Gin Arg Pro Glu Asp (tyb %(r Val ffir Ш Leu He Phe Trp

-15+4%

Рис. 1. Влияние 20 кодируемых аминокислот на ИП органотипической культуры семенников молодых крыс. Черные столбики - аминокислоты, достоверно влияющие на пролиферацию клеток в органотипической культуре ткани семенников. *Р<0,05 по сравнению с ИП контроле (0%).

При изучении органотипической культуры семенников старых крыс достоверную активность продемонстрировали только три Е-аминокислоты из 20 изученных: Е-лизин, L-apгшffiн и Ь-гистидин (рис. 2). Выявлено существенное уменьшение концентрационной ширины пика активности эффективных аминокислот. Обнаружено, что Г-лизин и Е-аргинин проявляют активность только в концентрации Ю-12 моль/л.

30%

20%

г?

5 10% ч №

I 0%

с

о ш

§ -10% х

-20% -30%

Рис. 2. Влияние 20 аминокислот на индекс площади органотипической культуры ткани семенников старых крыс. Черные столбики — аминокислоты, достоверно влияющие на пролиферацию клеток. *Р<0,05 по сравнению с ИП в контроле (0%).

Влияние аминокислот на экспрессию белка р53

Изменение ИП органотипической культуры семенников является интегральным показателем, отражающим процессы пролиферации и апоптоза. Для верификации влияния аминокислот на апоптоз проведено иммуногистохимическое исследование экспрессии проапоптозного белка р53 в зоне роста эксплантатов семенников молодых крыс. Для им-муногистохимического исследования были отобраны Ь-аминокислоты, продемонстрировавшие свою эффективность в органотипической культуре ткани молодых крыс. Установлено, что Ь-аминокислоты, стимулирующие рост эксплантатов семенников (изолейцин, лейцин, лизин), уменьшали экспрессию проапоптозного белка р53 (рис. 3). Наоборот, добавление гистидина, достоверно угнетающего рост эксплантатов семенников, приводило к увеличению экспрессии р53. Таким образом, изолейцин, лизин и лейцин стимулируют рост эксплантатов семенников благодаря уменьшению апоптоза, а гистидин уменьшает рост эксплантатов семенников путём активации апоптоза. Исключением из описанной закономерности были две аминокислоты: пролин и аргинин. Пролин не оказывал достоверного влияния на экспрессию р53. Таким образом, стимулирующий эффект пролина в отношении роста эксплантатов семенников более вероятно связан с активацией пролифера-

25±6%

16±4%

□

£Г

Э1у А1а Аэп || Ьу5 фе!г фп Агд Рго (»

и

J Аэр Су

-I

5 Ту

П

П,

Ч/а! ТИг 5 Ьеи Не рЦ Тгр

-18±3%

ции, миграции и адгезии клеток, чем с угнетением апоптоза. Аргинин, достоверно увеличивающий пролиферацию клеток органотипической культуры семенников, усиливал экспрессию проапоптозного белка р53 в зоне роста эксплантатов. Для установления причины парадоксального влияния Ь-аргинина на экспрессию р53 требуется изучение эффектов основных метаболитов данной аминокислоты, что и было выполнено с последующих сериях опытов.

60

£

~ 40

СП

1/4

Он

§ 20

о

0

и

5 о

(Т)

1 -20

I

| -40

0

а

1 -60

№

к

-80

Рис. 3. Индекс площади и уровень экспрессии белка р53 в органотипической культуре ткани семенников молодых крыс. *Р<0,05 по сравнению с ИП в контроле (0%).

Определение ведущего пути апоптоза, задействованного в реализации эффекта исследованных Ь-аминокислот

Были использованы химические вещества - селективные регуляторы митохондри-ального и рецепторно-опосредованного путей апоптоза: 2,4-динитрофенол (ДНФ) и молочная кислота (В-лактат). Предварительные опыты, проведённые в органотипической культуре семенников молодых крыс, подтвердили проапоптотическую активность 2,4-динитрофенола в концентрации 50мкг/мл и антиапоптотическую активность Б-лактата в концентрации 5 ммоль/л. В соответствии с рабочей гипотезой, основанной на литературных данных о механизме действия использованных регуляторов апоптоза, для оценки механизма действия аминокислот использовали два суждения. Первое: аминокислота ин-гибирует митохондриальный путь апоптоза, если ИП эксплантатов, культивируемых в присутствии смеси аминокислоты с регулятором апоптоза, больше ИП, полученного при

Ь-лизин -60+12%

Ь-изолейцин

Ь-лейцин

3 индекс площади В экспрессия р53!

ЗЫ6%

25±4% 2Ш%

43±7%

16±4%

26±5%

, 18±3%

Г-;

-8±4%_ Ь-пролин

аргинин

-15±4% Ь-гистидин

изолированном применении регулятора апоптоза Второе аминокислот активирует рецепторно-опосредованвый путь апоптоза, если ИП культуры, развивающейся в присутствии аминокислоты и регулятора апоптоза, меньше ИП, полученного при изолированном применении регулятора апоптоза Использование двух разнонаправленных селективных регуляторов апоптоза обеспечивает надежность адекватной интерпретации полученных экспериментальных данных

При введении в органотипическую культуру семенников молодых крыс смеси, состоящей из эффективных аминокислот (Ь-изолейцин, Ь-лизин, Ь-лейцин) и 2,4-динитрофенола, ИП через трое суток культивирования был достоверно больше, чем ИП при изолированном применении 2,4-динитрофенола (табл 2) Таким образом, можно предположить, что антиапоптотический эффект указанных пяти аминокислот связан с ин-гибированием митохондриального пути апоптоза Эксперименты по изучению совместного влияния Ь-гистидина и 2,4-динитрофенола не продемонстрировали статистически достоверного отличия от ИП, полученного при монокомпонентном использовании эффективной концентрации 2,4-динитрофенола Таким образом, антипролиферативный эффект Ь-гистидина, вероятно, связан с активацией митохондриального пути апоптоза

Для получения полной картины влияния эффективных аминокислот на различные пути апоптоза изучены эффекты смеси аминокислот с ингибитором рецепторно-опосредованного пути апоптоза - молочной кислотой (табл 2) ИП органотипической культуры семенников при добавлении в культуральную среду смеси молочной кислоты в концентрации 5 ммоль/л и Ь-изолейцина, Ь-лизина или Ь-лейцина достоверно больше индекса площади, полученного при монокомпонентном применении молочной кислоты Таким образом, Ь-изолейцин, Ь-лизин и Ь-лейцин ингибируют митохондриальный путь апоптоза Наоборот, смеси из молочной кислоты и Ь-аргинина или Ь-гистидина достоверно не влияют на развитие органотипической культуры семенников, в отличие от молочной кислоты, достоверно стимулирующей развитие культуры ткани Таким образом, можно предположить, что антиапоптотический эффект Ь-аргинина отчасти связан с ингибирова-нием рецепторно-опосредованного пути апоптоза семенников, а проапоптотический эффект Ь-гистидина объясняется активацией митохондриального пути апоптоза Ь-пролин не оказывает существенного влияния на митохондриальный путь апоптоза, так как ИП при совместном применении Ь-пролина с молочной кислотой достоверно не отличается от ИП, полученного при изолированном применении молочной кислоты 14±4% (п = 22, р<0,05) и 18±2% (п = 22, р<0,05) соответственно

Таблица 2

Влияние изолированных аминокислот на митохондриальный и рецепторно-опосредованный пути апоптоза в органотипической культуре ткани семенников

Аминокислота, Ю-'2 моль/л Индекс площади эксплантатов, %

Вещества, вводимые в культуру ткани

ДНФ + аминокислота ДНФ Б-лактат + аминокислота О-лактаг

Ь-изолейцип 14±6% -26±6%* 2б±2%* 16±2%*

Ь-лизин 26±2%* -26±6%* 31±7%* 1 6±2%*

Ь-аргинин 18±5%* -2б±6%* б±3% 16±2%*

Ь-лейцин 11±5% -26±6%* 25±1%* 16±2%*

Ь-гистидин -20±4% -26±6%* 3±2% 16±2%*

Примечание *Р<0,05 по сравнению с ИП в контроле (0%)

Изучение эффектов структурных аналогов Ь-изолейцина

Максимальную эффективность в стимуляции роста эксплантатов семенников продемонстрировал Ь-изолейцин, поэтому во второй серии опытов были исследованы структурные аналоги Ь-изолейцина Ь-лейцин, Ыюрлейцин и Ь-валин Результаты опытов показали, что Ь-изолейцин является уникальной аминокислотой, так как все три структурные аналога эффективны только при одной концентрации (табл 3) Представляет интерес, что пик активности всех четырех аминокислот приходится на 10~12 моль/л Необходимо отметить, что в научной литературе до сих пор отсутствовали сведения о роли Ь-изолейцина в функционировании семенников

Таблица 3

Влияние структурных аналогов Ь-изолейцина на пролиферацию клеток в органотипической культуре ткани семенников

Аминокислота Индекс площади эксплантатов, %

Концентрация вводимых аминокислот в культуре, моль/л

1(Г,и ю-" 10"и 1043 ю-14

Ь-изолейцин 22±7%* 26±4%* 31±6%* 19±3%* 25±7%*

Ь-лейцин 4±7% 8±3% 21±3%* 9±6% 3±2%

Ь-норлейцин 4±6% 9±3% 25±3%* 10±1% -4±5%

Ь-валин -5±4% -11±3% 13±3%** -2±3% -8±4%

Примечание *Р<0,05 по сравнению с ИП в контроле (0%)

**Р<0,1 по сравнению с ИП в контроле (0%)

Изучение эффектов метаболитов Ь-аргшшна

В отличие от большинства других аминокислот, Ь-аргинин метаболизируется многочисленными ферментами Причем до сих пор не ясно, с каким конкретно метаболитом этой аминокислоты связан ее выраженный клинический эффект Из литературных данных известно, что в ткани семенников из Ь-аргинина образуется пять основных метаболитов Ь-орнитин, мочевина, Ь-цитруллин, оксид азота (N0) и креатин [Боровец С Ю и соавт , 2005] В наших опытах оказано, что все перечисленные метаболиты, за исключением N0, стимулируют развитие органотипической культуры ткани семенников Фермент аргиназа гидролизует Ь-аргинин до Ь-орнитина и мочевины В органотипической культуре семенников молодых крыс Ь-орнитин обладает необычным двойным пиком активности в концентрации 10~13 моль/л умеренно угнетает рост эксплантатов семенников, а в концентрации 10~14 моль/л существенно стимулирует их рост (табл 4) Ь-орнитин не включается в состав белков, но к его метаболитам относятся такие важные вещества как Ь-пролин, Ь-глутамат и полиамины (спермин и спермидин) Кроме того, из Ь-орнитияа образуется Ь-пролин, который в концентрации 10~12 моль/л достоверно стимулирует развитие органотипической культуры семенников молодых крыс В органотипической культуре семенников старых крыс Ь-орнитин и Ь-пролин в концентрации 10~'° - 10~14 моль/л не продемонстрировали ни угнетающей, ни стимулирующей пролиферацию клеток активности (табл 5)

Таблица 4

Влияние метаболитов Ь-аргинина на пролиферацию клеток в органотипической культуры семенников молодых крыс

Метаболит Ь-аргинина Индекс площади эксплантатов, %

Концентрация метаболитов Ь-аргинина, вводимых в культуру, моль/л

10 КГ" 10 10'" ю-14

Ь-орнитин 4±3% 6±2% 3±4% -15±2%* 26±4%*

мочевина 10±5% 14±4%** 20±3%* 31±4%* 9±3%

Ь-цитруллин 12±5% 22±3%* 3±4% 6±2%

оксид азота (нитроглицерин) -100%* -100%* -29±7%* -13±3%** 4±4%

креатин 9±2% 6±4% 4±2% 20±3%* 0±2%

Примечание *Р<0,05 по сравнению с ИП в контроле

**Р<0,1 по сравнению с ИП в контроле

Второй продукт аргиназы - мочевина - достоверно стимулировал развитие органо-типической культуры семенников в трех из пяти исследованных концентрациях диапазона сверхмалых доз (10"", 10"12, Ю-13 моль/л), что создает предпосылки для ее использования в качестве самостоятельного препарата (табл 4) В норме мочевина, производимая семенниками, выводится в кровь через UT-B (urea transporter - переносчик мочевины) При дефиците этого переносчика локальная концентрация мочевины увеличивается, что приводит к увеличению размеров семенников [Guo L et al, 2007] Экспериментальные данные, полученные в результате опытов на нокаутных животных, свидетельствуют, что для развития семешшков наиболее актуальна локально образуемая мочевина Поэтому маловероятна клиническая эффективность мочевины при лечении секреторной формы бесплодия в качестве самостоятельного препарата С другой стороны, L-аргшшн является одной из удобных транспортных форм для насыщения семенников мочевиной При старении концентрационная ширина пика активности мочевины возрастает мочевина ИП эксплантатов семенников старых крыс во всех пяти исследованных концентрациях диапазона сверхмалых доз 10~'° - 10'14 моль/л (табл 5) Расширение пика активности мочевины у старых крыс можно связать с увеличением актуальности основных биохимических функций данного метаболита L-аргинина Старение ассоциировано с увеличением сво-боднорадикальной активности и смещением баланса синтеза и разрушения белка в сторону протеолиза Мочевина эффективно блокирует оба перечисленных процесса снижает уровень повреждений, производимых окислительным стрессом, и защищает белки от протеолитической деградации

Таблица 5

Влияние метаболитов L-аргинина на пролиферацию клеток _в органотипической культуры семенников старых крыс_

Индекс площади эксплантатов, %

Метаболит Концентрация метаболитов L-аргинина,

L-аргинина вводимых в культуру, моль/л

ю-,и ю-'1 10 ю-3 КГ14

L-орнитин 0±3% 5±3% 2±4% ~6± 4% 0±2%

мочевина 20±3%* 23±6%* 19±5%* 14±2%* 17±4%*

L-цитруллин -3±3% 14±2%* -5±4% 3±2% 2±5%

нитроглицерин (донор NO) -45±9%* -34±10%* -13±6%** -16±2%* -13±2%**

креатин 3±3% 4±1% 6±2% -2±4% 5±4 %

Примечание *Р<0,05 по сравнению с ИП в контроле (0%)

**Р<0,1 по сравнению с ИП в контроле (0%)

Другой фермент метаболизма Ь-аргинина - N0 синтаза - катализирует окисление Ь-аргиника с образованием Ь-цитруллина и N0 Ь-цитруллин стимулирует пролиферацию клеток органотипической культуры семенников молодых крыс в концентрации 10~" моль/л (табл 4) Единственная известная на сегодняшний день метаболическая судьба Ь-цитруллина сводится к превращению в Ь-аргинин [8о1отошоп Ь Р й а1, 2003] Причем семенники характеризуются высокой активность ферментов, обеспечивающих регенерацию Ь-аргинина из Ь-цитруллина [Уи У ег а1, 1995] Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о возможности и целесообразности применения Ь-цитруллина в терапевтической практике в качестве "аргинин-сохраняюгцего" препарата При исследовании органотипической культуры семенников старых крыс установлено, что Ь-цитруллин сохраняет стимулирующую активность в концентрации Ю-" (табл 5) По-видимому, старение существенно не затрагивает активность ферментов регенерации Ь-аргинина

По результатам проведенной серии экспериментов, N0 является единственным метаболитом Ь-аргинина с выраженным антипролиферативным эффектом N0 как высоко реакционноспособное соединение не мог бьггь применен в органотипической культуре, поэтому в качестве независимого от Ь-аргинина донора N0 был исследован эффект нитроглицерина Нитроглицерин значительно угнетал развитие органотипической культуры семенников молодых крыс в четырех из пяти исследованных концентраций диапазона сверхмалых доз (Ю-10 - 10~14 моль/л), вплоть до полного угнетения рост культивируемых эксплантатов в концентрациях 10~'° и 10"" моль/л (табл 4) Нитроглицерин, использованный в качестве экзогенного донора N0, быстро окисляется и аналогично гЫОЭ одномоментно поставляет большие количества N0 При исследовании органотипической культуры семенников старых крыс установлено, что нитроглицерин сохраняет свой антипроли-феративный эффект, но выраженность этого эффекта значительно меньше, чем в культуре ткани молодых крыс В частности, в концентрации Ю-10 и Ю-11 моль/л наблюдается значительное, но не полное угнетение зоны роста эксплантатов (табл 5) Увеличение устойчивости семенников к нитроглицерину у старых крыс по сравнению с молодыми крысами можно объяснить уменьшением активности белков-мишеней N0 при старении (глице-ральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, аконитаза, РеБ-белки и цитохром-с-редуктаза) В целом, старении ассоциировано с увеличением продукции токсичного пероксинитрита за счет индукции ¡N08 [Вегко-кЩг И Е а1, 2003], поэтому можно предположить увеличении устойчивости семенников к действию экзогенных повреждающих агентов, аналогичных эндогенному пероксинитриту С помощью двух ферментов (аргинин-глицин-амидинотрансфераза, гуанидиноацетат-М-метилтрансфераза) Ь-аргинин превращается в

креатин. Креатин увеличивал ИП органотигшческой культуры семенников молодых крыс в концентрации 1(Г13 моль/л (табл. 4). Исследование эффектов креатина в органотипиче-ской культуре старых крыс не выявили его влияния на ИП (табл. 5). Значение креатина в обеспечении поступательного движения сперматозоидов хорошо изучено, тогда как влияние креатина на пролиферативные способности семенников подробно не исследовалось [Аэзео Р.Р. йа1„ 1981].

Исследование путей реализации эффектов оксида азота

По результатам проведённых экспериментов единственным метаболитом Ь-аргинина с выраженным антипролиферативным эффектом является N0. Таким образом, устранение цитостатического эффекта N0 является задачей, решение которой позволит значительно повысить терапевтическую эффективность Ь-аргинина как препарата, предназначенного для лечения мужского бесплодия. Известно, что эффект N0 реализуется через активацию растворимой гуанилатпиклазы и нитрозированис тиоловых 1рупп. При взаимодействии N0 или его производных с тиоловыми группами происходит образование нитрозотиолов. Нитрозшшрование тиоловых групп ряда белков приводит к изменению их активности.

30%

25%

20%

5 15%

4

| 10%

о

5 5%

ЬЙ

0)

ч 0%

х

-5% -10% -15%

Рис. 4. Влияние глутатиона на эффекты нитроглицерина и Ь-аргинина в органоти-пической культуре ткани семенников молодых крыс. Белые столбики - ИП эксплантатов при изолированном применении субпороговых концентраций нитроглицерина, глутатиона или Ь-аргинина. Черные столбики - ИП эксплантатов при совместном инкубировании глутатиона с нитроглицерином и глутатиона с Ь-аргинином. *Р<0,05 по сравнению с ИП в контроле. **Р<0,1 по сравнению с ИП в контроле (0%).

27±4%'

12+5%

| нитроглицерин |

| глутатион

I—.--—

Ц-аргинин

Ьаргинин + глутатион

нитроглицерин + глутатион

13±3%

Опыты в органотипической культуре ткани молодых крыс продемонстрировали увеличение интенсивности роста эксплантатов семенников при добавлении в культураль-ную среду смеси из субпороговых концентраций нитроглицерина и глутатиона (рис. 4). ИП эксплантатов при культивировании в присутствии глутатиона и нитроглицерина, были не просто больше контрольных значений, но и превышали значения ИП эксплантатов при изолированном применении глутатиона. Таким образом, глутатион не только устранял ан-типролиферативное воздействие нитроглицерина, но и взаимодействовал с нитроглицерином с образованием нитрозотиолов, обладающих значительной эффективностью в отношении развития органотипической культуры семенников. Такие же результаты получены при использовании смеси из аргинина и глутатиона: малоэффективные субпороговые концентрации глутатиона и аргинина при совместном применении увеличивали ИП культивируемых эксплантатов (рис. 4). По-видимому, глутатион эффективно устраняет анти-пролиферативные эффекты N0 и облегчает нитрозотиоловый путь реализации антиапоп-тотических эффектов N0, что существенно увеличивает эффективность Ь-аргинина.

Рис. 5. Влияние глутатиона на эффекты нитроглицерина и Ь-аргинина в органотипической культуре ткани семенников старых крыс. Обозначения как на рис. 4.

Так же, как в экспериментах на молодых крысах, глутатион эффективно устранял аятипролиферативное действие нитроглицерина в эксплантатах семенников старых крыс (рис. 5). При этом влияние на ИП смеси, состоящей из глутатиона и аргинина, отличается у молодых и старых животных. Не выявлено преимущества эффектов смеси глутатиона с

аргинином, по сравнению с эффектом изолированного глутатиона (рис 5) Таким образом, глутатион может быть использован как самостоятельный эффективный препарат, стимулирующий развитие семенников при старении, но эффективность аргинина глутатион не увеличивает Сохранение высокой активности глутагиона связано с нарастанием напряженности окислительного стресса при старении

Другой путь реализации эффектов N0 связан с активацией растворимой гуанилат-циклазы Для изучения данного пути метаболизма N0 использован силденафил который является ингибитором фосфодиэстеразы - фермента, нейтрализующего цГМФ, образуемого под действием растворимой гуанилатциклазы, активированной N0 [8а1оша А е1 а1, 2003] Эксперименты показали, что силденафил умеренно стимулировал рост эксплантатов семенников молодых крыс, но комбинация Ь-аргинина с силденафилом не предоставляла никаких дополнительных преимуществ

Изучение эффектов смеси, состоящей из наиболее активных аминокислот и их метаболитов

Доказано, что для максимальной стимуляции пролиферации клеток органотипиче-ской культуры семенников молодых крыс концентрация аргинина должна быть в 10 раз больше концентрации Ь-орнитина и креатина, но в 10 раз меньше концентрации Ь-изолейцина, Ь-лизина и Ь-цитруллина (табл 7) Смесь Ь-аргинина с Ь-цитруллином или Ь-лизином не влияла на рост эксплантатов семенников старых крыс (табл 6) Мочевина стимулировала пролиферацию клеток эксплантатов старых крыс вне зависимости от долевого соотношения с Ь-аргинином

Таблица 6

Влияние на развитие органотипической культуры семенников старых крыс смеси, состоящей из разных концентраций Ь-аргинина и Ь-лизина

Долевое соотношение аминокислот в смеси Концентрация вводимых в культуру аминокислот, моль/л Индекс площади, %

Ь-аргинин Ь-лизин

Одинаковая концентрация 10Г" 1Г12 -6±4%

10'" ю-" 8±3%

Концентрация Ь-лизина в 10 раз больше Ь-лизина 10Г" 10"11 4±6%

10_и ю-2 5±3%

Концентрация Ь-аргинина в 10 раз больше Ь-лизина 10-" ю-" 3±2%

10~и 10"и 9±7%

Таблица 7

Влияние различных смесей, состоящих из аминокислот их метаболитов, эффективно стимулирующих пролиферацию клеток в культуре ткани, на индекс площади эксплантатов семенников молодых крыс

Состав смеси Концентрация компонентов смеси, вводимых в культуру, моль/л Индекс площади, %

Ь-аргинин и Ь-изолейцин Ь-аргинин Ь-лизин

1<Ги 10-" -1±4%

ю~" ю-" -6±3%

10"" ю-" -3±2%

Ю'и 10-"

Ь-аргинин и Ь-орнитин Ь-аргинин Ь-орнитин

ю-" ю-" -12±2%**

ю-" ю-" -32±6%*

10-" 10"" 34±2%*

10~" ю-" 5±4%

Ь-аргинин и Ь-цитруллин Ь-аргинин Ь-цитруллин

10"" ю-12 2±5%

юг" ю-" -5±3%

10-" 10"" -3±6%

10"" ю-" 21±4%*

Ь-аргинин и креатин Ь-аргинин креатин

ю-12 ю-12 -1±5%

ю-13 ю-" -4±2%

10-" 10-" 24±6%*

10-" 10-" 6±4%

Ь-аргинин и мочевина Ь-аргинин мочевина

10'ы ю-" 2б±5%*

ю-13 10-" 32±7%*

ю-12 ю-" 18±3%*

10'" 10-" 16±4%*

Примечание *Р<0,05 по сравнению с ИП в контроле (0%)

Определение долевого соотношения аминокислот, необходимого для максимальной стимуляции семенников представляет актуальную задачу при создании многокомпонентных аминокислотных препаратов Аминокислоты, эффективные в качестве монотерапии, могут терять свою активность при комбинировании с другими эффективными аминокислотами Одна из причин описанного феномена заключается в конкуренции между отдельными аминокислотами за обладание определенными транспортными системами

ВЫВОДЫ

1 Стимулирующее влияние на развитие органотипической культуры ткани семенников молодых крыс оказывают пять из 20 кодируемых Ь-аминокислот - изолейцин, аргинин, лизин, лейцин, пролин Одна аминокислота - гистидин - угнетает рост эксплантатов семенников Антиапоптогический эффект изолейцииа, лизина и лейцина может быть связан с ингибированкеч чцтохсидриального пуш <шоптоза, в том время как эффект гистидина можно связать с активациеи этого пути

2 В культуре ткани семенников старых крыс обнаружено снижение количества аминокислот, проявляющих стимулирующую или ингибирующую активность с шести до трех (аргинин, лизин, гистидин), и уменьшение диапазона концентраций, в котором они проявляют активность

3 Влияние структурных аналогов изолейцина (лейцина, валина, норлейцина) на развитие органотипической культуры ткани семенников молодых и старых крыс значительно менее выражено, чем у самого изолейцина

4 Метаболиты аргинина - Ь-орнитин, мочевина, Ь-цитруллин и креатин - стимулируют развитие органотипической культуры ткани семенников молодых крыс Наиболее широкий диапазон концентраций, вызывающих стимуляцию клеточной пролиферации, имеется у мочевины, а оксид азота является единственным метаболитом, угнетающим развитие органотипической культуры ткани семенников У старых животных орнитин и креатин теряют стимулирующее влияние на пролиферацию клеток семенников и происходит снижение чувствительности ткани семенников к повреждающему действию оксида азота

5 Показаны возможные пути увеличения эффективности аргинина в отношении органотипической культуры ткани семенников Установлено, что глутатион увеличивает эффективность аргинина за счет устранения антипролиферативных эффектов оксида азота Однако у старых крыс глутатион не влияет на эффективность аргинина

6 Определено, что для максимальной стимуляции клеточной пролиферации в органоти-пической культуре ткани семенников крыс концентрация Ь-аргинина должна быть в 10 раз больше концентрации Ь-орнитина и креатина, но в 10 раз меньше концентрации Ь-изолейцина, Ь-лизина и Ь-цитруллина

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Результаты исследования влияния 20 кодируемых аминокислот на развитие органоти-пической культуры ткани семенников молодых и старых крыс создают основу для их дальнейшего изучения в качестве лекарственных средств, предназначенных для лечения мужского бесплодия секреторной этиологии, в том числе ассоциированного со старением организма Наиболее перспективными для дальнейших исследований являются три аминокислоты Ь-изолейцин, Ь-лизип, Ь-аргинин При старении организма Ь-изолейцин теряет эффективность

2 Для увеличения положительного эффекта Ь-аргинина целесообразна его комбинация с глутатионом Вместо Ь-аргинина может быть успешно использован многокомпонентный препарат "Гепасол"

3 Биологические эффекты сверхмалых доз аминокислот в органотипической культуре ткани целесообразно оценивать двумя показателями интенсивность стимуляции и ширина пика активности Для определения ширины пика активности целесообразно исследовать эффекты аминокислот в нескольких смежных концентрациях

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Боровец С Ю Биохимические и клинические аспекты влияния L-аргинина на функциональную активность мужской половой системы Часть I Метаболизм L-аргинина и его влияние на мужскую фертильность/С Ю Боровец, А Н Закуцкий, Т Ф Субботина//Ученые записки - 2005 - Т XII, № 3 -С 12-17

2 Боровец С Ю Биохимические и клинические аспекты влияния L-аргинина на функциональную активность мужской половой системы Часть II Влияние на эректильную функцию/С Ю Боровец, АН Закуцкий, ТФ Субботина//Ученые записки -2005 -Т XII, №4 -С 13-16

3 Влияние аминокислот и антител к рецепторам фактора роста нервов на развитие органотипи-ческой культуры лимфоидной ткани/Н И Чалисова, А Н Закуцкий, А И Анискина, В О Полякова, С В Филиппов, П Н Зезюлин//Медицинский академический журнал - 2006 - Т 6, № 3 - С 57-63

4 Влияние аминокислот на клеточную пролиферацию и апоптоз в органотипической культуре тканей чотодых и старых крыс/А И Анискина, Н И Чалисова, А Н Закуцкий, А В Комашня, С В Филиппов, ПН Зезюлин//Успехи геронтологии -2006 -Выи 19 - С 55-59

5 Влияние аргинина и его метаболитов на миокард крыс в органотипической культуре ткани /Н И Чалисова, А Н Закуцкий, А И Анискина, С В Филиппов, А Д Ноздрачев// Доклады академии наук-2007 -Т 415, №2 - С 273-276

6 Влияние аргинина и его метаболитов на органотипическую культуру тканей молодых и старых крыс/Н И Чалисова, А Н Закуцкий, А И Анискина, В О Полякова, С В Филиппов С В ,П Н Зезюлин//Успехи Геронтологии -2006 -Т 20, № 1 -С 52-55

7 Влияние аминокислот и их метаболитов на развитие органотипической культуры ткани семенников крыс/С X Аль-Шукри, Н И Чалисова, А Н Закуцкий, С Ю Боровец, А И Аниски-на//Нефрология -2007 - Т11,№2 -С 86-92

8 Влияние аминокислот на ткани различного периода онтогенетического развития в органотипической культуре/Н И Чалисова, А И Анискина, А Н Закуцкий, А В Комашня//Механизмы адаптивного поведения Международный симпозиум, посвященный 80-летию организации Института физиологии им И П Павлова (сборник тезисов) СПб, 2005 год - С 100-101

9 Закуцкий А Н Аргинин в эндокринной системе/А Н Закуцкий, Т Ф Субботина// Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии - 2005 -Т XII, №1 -С 7-12

10 Закуцкий А Н Транспорт L-аргшшна/А Н Закуцкий, ТФ Субботина//Ученые записки -2005 Т ХП, № 4 - С 5-8

11 Закуцкий А .//Функциональные аргинин-содержатцие последовательности в пептидах и белках/А Н Закуцкий, НИ Чалисова,ТФ Субботина//Биохимия -2008 -Т 34,№2 - С 1-11

12 Закуцкий А Н Влияние L-аргинина и его метаболитов на миокард крыс в органотипической культуре ткани/А Н Закуцкий// "Политехнический симпозиум" - СПб, Издательство Политехнического университета -2006-С 188-189

13 Закуцкий А Н Действие аминокислот на развитие культуры ткани мозжечка/ А Н Закуцкий, А И Анискина, Н И Чалисова// Межинститутская конференция молодых ученых "Механизмы регуляции и взаимодействия физиологических систем организма человека и животных в процессах приспособления к условиям среды" - СПб, Институт физиологии им И П Павлова РАН -2007 -С 35

14 Стимулирующее влияние биорегуляторных пептидов на различные ткани при культивирова-нии/Н И Чалисова, А Н Закуцкий, А И Анискина, С В Филиппов, П Н Зезюлин // Всеросс конф "Перспективы фундаментальной геронтологии" -2006 -С 153-154

15 Тканеспецифическое влияние синтетических биорегуляторных пептидов в органотипической культуре тканей молодых и старых крыс /А Н Закуцкий, Н И Чалисова, Г А Рыжак, А И Анискина, С В Филиппов,ПН Зезюлин'/Успехигеронтологии -2006 -Вып 19 -С 93-96

16 Чалисова НИ Влияние аминокислот на клеточную пролиферацию и апоптоз в культуре ткани висцеральных органов/ Н И Чалисова, А Н Закуцкий, А И Анискина//У Всеросс конф с международным участием имени В Н Черниговского "Механизмы функционирования висцеральных систем" - СПб, Институт физиологии им И П Павлова РАН -2007 -С 341-342

17 Effect of amino acid on cell proliferation and protein p53 expression in organotypic culture of lymphoid tissue/ NI Chalisova, A N Zakutsku, AI Aniskina, G Haase //ASDMA ХП Applied Stochastic models and data analysis - Greece, Crete -2007 -P 38

18 Komashnya A V Modulatory effect of aminoacids on brain cortex tissue culture of rats / A V Ko-mashnya, N1 Chalisova, AN Zakutskn//"Technologies of the 21st century biological, physical, informational and social aspects" Saint-Petersburg, Russia, 2005 -P 124-125

19 The amino acids effect on the apoptosis in the lymphoid tissue culture/ N1 Chalisova, G Haase, A N Zakutsku, A Aniskina, S Filippov//First workshop on the immune response against dying tumor cells -2006 -P 26

20 The cell proliferation an apoptosis in the presence of amino acids in organotypic culture of tissues of different age/A N Zakutsku, NI Chalisova, A I Aniskina, S V Filippov //Proceedings of the international conference - "Statistical methods for biomedical and technical systems" Nicosia, Cyprus, 2006 -P 461-464

ЗАКУЦКИЙ Александр Николаевич ВЛИЯНИЕ АМИНОКИСЛОТ НА

ОРГАНОТИПИЧЕСКУЮ КУЛЬТУРУ СЕМЕННИКОВ МОЛОДЫХ И СТАРЫХ КРЫС//

Автореф дис канд мед наук 14 00 53 -СПб,2008 -26с

Подписано в печать 19 02 2008 Формат 60*84 1/16 Бумага офсетная Печать офсетная Печ л 1,0 _Тираж 100 зкз Заказ W_

Отпечатано с готового оригинал-макета ЗАО "Принт - Экспресс" 197101, С-Петербург, ул Большая Монетная, 5 лит А

Актуальность исследования. Прогрессирующее увеличение доли пожилых и старых людей в общей численности населения вместе с сокращением рождаемости последнее время становится всё более актуальной медицинской, социальной и экономической проблемой развитых страна [Ани-симов В.Н., 2003]. Старение населения в экономически развитых странах ассоциировано'с существенным увеличением частоты поздних браков. Одним из негативных медицинских последствий позднего брака является бесплодие. По данным ВОЗ 16% семейных пар в мире живут с диагнозом "бесплодие" [Овсянникова Т.В. и соавт., 1998]. При этом мужское бесплодие составляет 50% в структуре общего бесплодия. Кроме того, в последнее время опубликовано несколько крупных исследований, свидетельствующих о стойком прогрессирующем снижении' показателей сперматогенеза у здоровых мужчин [Быков В.JL, 1999]. При обследовании доноров спермы вОЗели-кобритании установлено, что основные показатели сперматогенеза (концентрация сперматозоидов и процент прогрессивно подвижных форм) уменьшаются со скоростью 2% в год [Ivrine S. et al., 1996]. Механизм описанных нарушений до конца не ясен. В последнее время всё большее количество исследований посвящается изучению изменений ткани семенников при старе-нии^ но-болыпинство'экспериментальных работ"направлено на определение функциональных изменений яичек как основного поставщика тестостерона. Сложность изучения возрастных изменений семенников состоит в том, что несмотря на выраженные дегенеративные изменения, семенники даже при старении остаются интенсивно пролиферирующим органом, продолжающим выполнять функции стероидогенеза и гаметогенеза [Eshre С., 2005]. Таким образом, актуальность разработки методов лечения мужского бесплодия при старении организма не вызывает сомнений.

Необходимо отметить, что мужское бесплодие секреторной этиологии представляет собой неоднородную полиэтиологическую группу заболеваний, объединяемых недостаточным синтезом белка. Несмотря на указанный-общий патофизиологический признак, до сих пор не проводилось систематизированного исследования по применению разных аминокислот в лечении мужского бесплодия. Из всех известных аминокислот в терапии мужского бесплодия^ использовался только L-аргинин. Мета-анализ клинических исследований показал, что терапия L-аргинином в дозе 4-8 г/сутки на!, протяжении от 1 до 6 месяцев приводит к существенному увеличению числа прогрессивно-подвижных форм: сперматозоидов у 2/3;- мужчин с бесплодием, секреторной этиологии [Боровец С.Ю. и соавт., 2005]. Первые исследования, посвященные изучению; роли • L-аргинина в терапии, мужского' бесплодия-относятся к 1944 году. Тогда из рациона питания трёх здоровых мужчин с нормальными показателями сперматогенеза полностью исключили: L-аргинин. Через; 9 дней у них отмечалось резкое; снижение подвижности сперматозоидов; Кроме того, были; получены данные об увеличении числа прогрессивно-подвижных форм; сперматозоидов у троих из пяти пациентов, страдавших астеноолигозооспермией, на фоне: приёма L-аргинина [Holt L.E. et al;, 1944]. Однако малое число наблюдений тогда не позволило!* сделать каких-либо достоверных выводов: При использовании больших доз* L-аргинина (10-20 г/сутки) было достигнуто 30% увеличение количества про-грессив1 ю-подвиж:ных форм .сперматозоидов [Giarols A. et al., 1959].В, 19.73 году проведено; крупномасштабное исследование,. в котором приняли /участие 178 мужчине различными формами секреторного бесплодия. После четырёхмесячного приёма L-аргинина в дозе 4 г в сутки отмечалось, значительное увеличение числа и г подвижности сперматозоидов у 111 пациентов (62,4 %), а у 28 из них появились дети [Shachaker А.А., 1973]. Исследование, проведённое в 1994 году в Италии, подтвердило эффективность L-аргинина в терапии мужского бесплодия. Тогда 40 мужчин с нарушением фертильно-сти получали перорально 80 мл 10% раствора L-аргинина гидрохлорида в сутки на протяжении 6 месяцев. Использование в терапии аргининовых; добавок значительно увеличило число прогрессивно-подвижных форм сперматозоидов без каких-либо наблюдаемых побочных эффектов [Scibona М., 1994].

Одним из препятствий в разработке и внедрении новых препаратов для лечения мужского бесплодия секреторной этиологии является отсутствие адекватной экспериментальной модели. Большинство моделей не способны воспроизвести основные этапы патогенеза секреторного мужского бесплодия [Roulet V. et al., 2006; Lambrota R. et al., 2006], поэтому актуальным представляется использование метода органотипического культивирования ткани семенников. Данная модель имеет ряд преимуществ. Прежде всего, этот метод позволяет исследовать местное воздействием биологически активных веществ, то есть исключаются системные эффекты нервной и эндокринной систем. Во-вторых, в органотипической культуре сохраняются нормальные тканевые взаимодействия между отдельными клетками (в отличие от диссоциированной культуры клеток Лейдига или Сертоли). И'наконец, экономические затраты на органотипическое культивирование тканей значительном меньше, чем на длительные эксперименты с участием интакт-ных животных [Чалисова Н.И. и соавт., 2005]. В' 2006 году две группы французских лабораторий независимо друг от друга подробно охарактеризовали данный^ метод. Доказано, что .органотипическая-лсультура. сохраняет основные функции интактных семенников: стероидогенез (синтез тестостерона) и гаметогенез (образование сперматозоидов) на протяжении двух недель с момента начала культивирования [Roulet V. et al., 2006; Lambrota R. et al., 2006]. Необходимо отметить, что несмотря на многогранность изменений, наблюдаемых при развитии органотипической культуры семенников, можно выделить два фундаментальных процесса развития ткани, таких как пролиферация и апоптоз. Многочисленные эксперименты в органотипической культуре разных тканей и органов свидетельствует об эффективности описанного метода для* быстрой количественной оценки процессов пролиферации и апоптоза [Чалисова Н.И., 2002].

В последнее двадцатилетие опубликовано много работ о чувствительности человека и животных к сверхмалым концентрациям биологически активных веществ. Под термином "сверхмалая доза" подразумевают такую дозу вещества, которая создает концентрацию на несколько порядков- ниже равновесной константы взаимодействия вещества со своим эффектором [Шевченко И.Н., 2003; Чалисова Н.И. и соавт., 2002]. Сверхмалые дозы могут помочь решить важную для геронтологической* практики проблему уменьшения выраженности побочных эффектов, поэтому актуальным-является исследование эффектов аминокислот и их метаболитов1 в сверхмалых дозах.

Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в изучении влияния 20 кодируемых-аминокислот и их метаболитов на? процессышроли-ферации и апоптоза в органотипической культуре семенников молодых и старых крыс. Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

1. Изучить влияние 20 кодируемых аминокислот в широком спектре концентраций диапазона сверхмалых доз на развитие органотипической- культуры семенников крыс разного возраста. . . .

2. Определить ведущий путь апоптоза, задействованный в реализации' эффекта аминокислот, доказавших свою активность в органотипической культуре семенников.

3. Исследовать структурные аналоги и метаболиты аминокислот, стимулирующих пролиферацию в органотипической культуре семенников. Изучить возможные пути увеличения эффективности аминокислот, активно регулирующих развитие органотипической культуры семенников.

4. Установить оптимальное долевое соотношение аминокислот, необходимое для максимальной стимуляции органотипической культуры семенников.

Научная новизна работы. Впервые проведено систематизированное исследование влияния 20 кодируемых аминокислот на развитие органоти-пической культуры ткани семенников крысы. При этом изучены эффекты аминокислот в широком диапазоне сверхмалых доз. Впервые показано уменьшение числа аминокислот, проявляющих активность в культуре ткани семенников старых крыс и уменьшение диапазона концентраций, при которых аминокислоты демонстрирует свою эффективность, по сравнению с молодыми крысами). С помощью селективных регуляторов ап о птоз а (2,4-динитрофенол и молочная1 кислота) определены ведущие пути апоптоза (ми-тохондриальный и рецепторно-опосредованный), задействованные в реализации эффекта аминокислот, рующих развитие органотипической культуры ткани семенников. Впервые проведено систематизированное исследование влияния основных метаболитов L-аргинина на развитие культуры тканиь семенников. При этом обоснована возможность использования метода органо-типического культивирования для-определения метаболической взаимосвязи между отдельными биологически активными веществами. Установлено, что для максимальной стимуляции клеточной пролиферации в органотипической культуре ткани семенников крыс концентрация L-аргинина должна быть в 10 раз больше концентрации L-орнитина и креатина, но в* 10* раз меныпе.концентрации Ьтизолейцина, L-лизина и Ьгцитруллина . .

Практическая значимость работы. Результаты исследования влияния 20 кодируемых аминокислот на развитие органотипической культуры ткани семенников молодых и старых крыс создают основу для их дальнейшего изучения в качестве лекарственных средств, предназначенных для лечения мужского бесплодия секреторной этиологии, в том числе ассоциированного со старением организма. Наиболее перспективными для дальнейших исследований являются три аминокислоты: L-изолейцин, L-лизин, L-аргинин. Изучены доступные пути для увеличения эффективности L-аргинина. Полученные данные об оптимальном долевом соотношении <аминокислот, необходимых для максимальной стимуляции органотипической культуры семенников крысы, могут быть использованы при создании многокомпонентных препаратов с аминокислотами. Кроме того, результаты исследования могут быть полезными в экспериментальной работе при использовании органотипической культуре ткани. Продемонстрировано, что исследование веществ в широком спектре концентраций позволяет определить особенности метаболической взаимосвязи между отдельными биологически активными веществами. Обоснована необходимость оценки возрастных, изменений не только с позиций уменьшения количества действующих биологически активных веществ, но и с точки зрения- уменьшения- диапазона их эффективных концентраций.

Положения, выносимые на защиту.

1. Кодируемые аминокислоты в широком диапазоне концентраций4 сверхмалых доз либо стимулируют (лейцин, изолейцин, аргинин, пролин, лизин) или ингибируют (гистидин) развитие органотипической культурьъ семенников крысы. Аминокислоты принимают участие в регуляции как митохондI риального, так и рецепторно-опосредованного пути апоптоза.

2. Эффективные в отношении клеточной пролиферации или апоптоза аминокислоты отличаются не только увеличением амплитуды активности; но и концентрационной- шириной- пика- активности: При* старении- наблюдается уменьшение количества'эффективных аминокислот и ширины пика* активности тех аминокислот, которые сохраняют своё влияние на развитие органотипической культуры семенников.

3. Метаболиты аргинина либо стимулируют (мочевина, орнитин, цитруллин, креатин), либо ингибируют (оксид азота) развитие органотпической культуры ткани семенников зрелых крыс. У старых животных орнитин и креатин теряют стимулирующее влияние на пролиферацию клеток семенников и происходит снижение чувствительности ткани семенников к повреждающему действию оксида азота.

4. Для максимальной стимуляции клеточной пролиферации в органотипиче-ской культуре ткани семенников крыс концентрация L-аргинина должна быть в 10 раз больше концентрации L-орнитина и креатина, но в 10' раз меньше концентрации L-изолейцина, L-лизина и L-цитруллина.

Связь с научно - исследовательской работой Института. Диссертационная работа является темой, выполняемой по основному плану НИР Санкт-Петербургского Института биорегуляции и геронтологии. СЗО РАМН:

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста, включая 17 таблиц и 13 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения, выводов. Список литературы содержит 211 источников, из них отечественных — 41, зарубежных - 170.

1. Результаты исследования влияния 20 кодируемых аминокислот на развитие органотипической культуры ткани семенников молодых и старых крыс создают основу для их дальнейшего изучения в качестве лекарственных средств, предназначенных для лечения мужского бесплодия секреторной этиологии, в том числе ассоциированного со старением организма. Наиболее перспективными для дальнейших исследований являются три аминокислоты: L-изолейцин, L-лизин, L-аргинин. При старении организма L-изолейцин теряет эффективность.

2. Для увеличения положительного эффекта L-аргинина целесообразна его комбинация с глутатионом. Вместо L-аргинина может быть успешно использован многокомпонентный препарат "Гепасол".

3. Биологические эффекты сверхмалых доз аминокислот в органотипической культуре ткани целесообразно оценивать двумя показателями: интенсивность стимуляции и ширина пика активности. Для определения ширины пика активности целесообразно исследовать эффекты аминокислот в нескольких смежных концентрациях.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ