Автореферат и диссертация по медицине (14.01.30) на тему:Модулирующее влияние аминокислот и пептидов на развитие хрящевой ткани в органотипической молодых и старых крыс

СМИРНОВ Андрей Валерьевич

МОДУЛИРУЮЩЕЕ ВЛИЯНИЕ АМИНОКИСЛОТ И ПЕПТИДОВ НА РАЗВИТИЕ ХРЯЩЕВОЙ ТКАНИ В ОРГАНОТИПИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЕ МОЛОДЫХ И СТАРЫХ КРЫС

14.01.30 - геронтология и гериатрия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург - 2011

1 4 ДПР ¿011

4843709

Работа выполнена в лаборатории возрастной клинической патологии Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН

Научные руководители:

заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Рыжак Галина Анатольевна

доктор биологических наук, профессор Чалисова Наталья Иосифовна

Официальные оппоненты:

заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Кветной Игорь Моисеевич

доктор медицинских наук, профессор Соллертинская Татьяна Николаевна

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Защита диссертации состоится «25» апреля 2011 г. в 13.00 часов на заседании Диссертационного Совета Д 601.001.01 в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН по адресу: 197110, Санкт-Петербург, пр. Динамо, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.

Автореферат разослан «24» марта 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета,

доктор биологических наук, профессор Козина Л.С.

ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования

В связи с увеличением средней продолжительности жизни и доли пожилых людей в общей численности населения особое внимание специалистов в области биологии и медицины уделяется исследованию закономерностей развития возрастной патологии и разработке новых геропротекторных препаратов. В последнее время в научной литературе всё чаще встречается информация об увеличении количества заболеваний суставов и позвоночника у лиц старших возрастных групп, что диктует необходимость поиска новых эффективных и безопасных средств для профилактики и лечения заболеваний опорно-двигательного аппарата. Регуляторные пептиды, влияющие на процессы развития тканей, широко распространены в живых организмах и продуцируются различными клетками и тканями как эндокринные и аутокринные носители информации о локальном состоянии органа или ткани [Хавинсон В.Х. и соавт. 1985; Ашмарин И.П., Обухова М.Ф., 1986].

Поддержание биологической целостности организма на клеточном уровне регулируется сигналами, которые позволяют сохранять сложное равновесное состояние между двумя основными физиологическими процессами - пролиферацией и программируемой клеточной гибелью (апоптозом). Функцию медиаторных межклеточных сигналов на пара- и аутокринном уровнях выполняют секреторные белки - цитокины [Пальцев М.А., 1996; Ярилин A.A., 1999]. На основании многочисленных экспериментальных и клинических данных стало известно, что пептидные биорегуляторы имеют большое значение в поддержании и координации различных функций организма [Морозов В.Г.и соавт., 2000; Коркушко О.В. и соавт., 2002; Хавинсон В.Х. и соавт., 2002; Рыжак Г.А., Коновалов С.С., 2004]. Пептиды, в свою очередь, частично гидролизуются до аминокислот, также обладающих, как показано в ряде исследований, регуляторными свойствами в отношении клеточной пролиферации и апоптоза [Чалисова и соавт., 2002, 2005].

В Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН синтезированы трипептиды, являющиеся аналогами активных групп экстрактов из тканей животных.

Достаточно сложно определить роль пептидов и аминокислот в регуляции клеточных популяций без учета и анализа межклеточных взаимоотношений, интегрирующих системный ответ. Помощь в решении такой задачи может дать методология комплексного морфофункционального анализа, способная объективно изучать клеточную патологию и регенерацию тканей, верифицировать пролиферативную активность и программируемую гибель клеток (апоптоз), а также оценивать деятельность клеточных структур и межклеточных коммуникаций.

Одной из наиболее адекватных моделей для изучения влияния различных препаратов на структурный и функциональный гомеостаз

клеточных популяций являются органотипические культуры, которые используются для тестирования биологической активности различных препаратов [Хавинсон В.Х. и соавт., 1998, 1999; ЬеуьМопгакЫт К, 1982]. В отсутствие нервных, гуморальных и других влияний, которые имеются в целостном организме, создаются условия для строгого дозирования испытуемых веществ по типу управляемого эксперимента.

В то же время, способность влиять на скорость основных клеточных процессов - пролиферацию и апоптоз и, как следствие, вызывать изменение количества клеток по сравнению с контролем является одним из общих свойств пептидов млекопитающих. Изменение количества клеток в культуре ткани может служить критерием первичной интегральной оценки биологической активности пептида и являться основанием для поиска других его эффектов.

Сравнительное изучение в культуре ткани действия пептидов и аминокислот на хрящевую ткань как в молодом возрасте, так и при старении, позволяет более глубоко понять механизмы регулирования основных клеточных процессов в организме при старении. При этом создается база для синтеза новых пептидных биорегуляторов с учетом их влияния на хрящевую ткань при ее патологии, в том числе при заболеваниях, ассоциированных с возрастом.

Цель и задачи исследования

Целью работы было изучение влияния аминокислот, трипептидов и комплексного пептида хрящевой ткани на развитие эксплантатов хряща в органотипических культурах тканей молодых и старых крыс.

Для достижения цели исследования были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

1. Исследовать влияние 20 стандартных аминокислот на клеточную пролиферацию в эксплантатах хряща от молодых и старых крыс в органотипической культуре ткани.

2. Исследовать влияние синтезированных трипептидов Т-31, Т-33, Т-34 и Т-38 на развитие эксплантатов хряща от молодых и старых крыс в органотипической культуре ткани.

3. Исследовать действие комплексного пептида хрящевой ткани Хондролюкса на клеточную пролиферацию в эксплантатах хряща от молодых и старых крыс в органотипической культуре ткани.

4. Исследовать иммуноцитохимическими методами влияние стандартных аминокислот, трипептидов и Хондролюкса на развитие процессов пролиферации и апоптоза в органотипической культуре хрящевой ткани от молодых и старых крыс.

Научная новизна работы

Впервые проведено изучение действия 20 стандартных аминокислот, трипептидов и комплексного пептида хрящевой ткани Хондролюкса в органотипических культурах тканей хряща, взятых от молодых и старых

животных. Установлено стимулирующее влияние шести аминокислот (гистидина, глутамина, аргинина, лейцина, изолейцина и тирозина) на процессы пролиферации в культуре ткани хряща от молодых животных и уменьшение в 6 раз количества стимулирующих пролиферацию аминокислот в эксплантатах от старых животных. Впервые установлено, что трипептиды Т-31 и Т-38 стимулируют развитие эксплантатов хрящевой ткани молодых и старых крыс. Показано отсутствие тканеспецифических свойств трипептидов: короткие пептиды стимулируют процессы пролиферации в органотипических культурах нескольких тканей как молодых, так и старых животных.

Впервые показано, что комплексный пептид хрящевой ткани Хондролюкс эффективно стимулирует клеточную пролиферацию в эксплантатах хрящевой ткани, как молодых, так и старых животных. Хондролюкс обладает выраженным тканеспецифическим действием в отношении хрящевой ткани, не влияя на другие ткани. Комплексные пептиды, экстрагированные из тканей тимуса, головного мозга, шишковидной железы, сердца, поджелудочной железы, щитовидной железы, семенников, предстательной железы, почек, мочевого пузыря, сосудов, яичников, печени, сетчатки глаза, не оказывали достоверного влияния на органотипическую культуру хрящевой ткани.

Впервые проведено иммуноцитохимическое исследование эксплантатов хряща и выявлено уменьшение развития процессов апоптоза при стимуляции пролиферации Хондролюксом, трипептидами Т-31 и Т-38 и некоторыми аминокислотами. При этом показано, что увеличение индекса площади эксплантатов хрящей находится в положительной корреляции с увеличением площади экспрессии маркера пролиферации РСИА и в отрицательной корреляции с уменьшением площади экспрессии проапоптозного белка р53.

Практическая значимость работы

Впервые получены экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что при старении уменьшается спектр аминокислот, активно действующих на пролиферативные процессы в хрящевой ткани. Напротив, Хондролюкс и трипептиды Т-31 и Т-38 проявляют стимулирующие пролиферацию свойства в отношении хрящевой ткани у животных как молодого, так и старого возраста. Выявленное тканеспецифическое действие Хондролюкса на хрящевую ткань создает основу для его дальнейшего изучения в качестве лекарственного средства, предназначенного для профилактики и лечения патологических состояний суставного хряща, в том числе при болезнях, ассоциированных с возрастом. Установленное стимулирующее действие трипептидов в отношении клеточной пролиферации в тканях хряща создает базу для целенаправленного синтеза коротких пептидов, предназначенных для лечения патологии суставов в гериатрической практике.

Положения, выносимые на защиту

1. Аминокислоты - гистидин, глутамин, аргинин, лейцин, изолейцин и тирозин обладают способностью стимулировать пролиферативные процессы в хрящевой ткани молодых животных. Спектр аминокислот, проявляющих активность в отношении клеточной пролиферации в хрящевой ткани, уменьшается в тканях от старых животных.

2. Трипептиды Т-31 и Т-38 стимулируют пролиферативные процессы в органотипической культуре хрящевой ткани молодых и старых животных. Трипептиды не проявляют тканеспецифические свойства и стимулируют пролиферативную активность в органотипических культурах нескольких тканей как молодых, так и старых животных.

3. Комплексный пептид хрящевой ткани Хондролюкс стимулирует клеточную пролиферацию в эксплантатах хрящевой ткани как молодых, так и старых животных, обладая выраженным тканеспецифическим действием в отношении хрящевой ткани.

4. Площадь экспрессии маркера пролиферации РСЫА находится в положительной, а площадь экспрессии проапоптозного белка р53 - в отрицательной корреляции с изменением индекса площади эксплантатов в органотипической культуре хрящевой ткани при введении аминокислот, трипептидов и комплексного пептида хрящей Хондролюкса.

5. Трипептиды Т-31 и Т-38 и комплексный пептид из хрящевой ткани Хондролюкс являются перспективными препаратами для изучения в качестве лекарственных средств, предназначенных для лечения возраст-ассоциированной патологии опорно-двигательного аппарата.

Связь с планом НИР

Диссертационная работа выполнена в рамках основного плана НИР Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 5 статей в журналах, включенных в перечень Высшей аттестационной комиссии Минобрнауки РФ и рекомендованных для опубликования материалов диссертационных исследований.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов, 3 глав собственных исследований, главы обсуждения результатов, выводов и указателя литературы. Текст диссертации изложен на 106 страницах, содержит 8 таблиц, иллюстрирован 22 рисунками. Список литературы содержит 122 источника, из них 74 отечественных и 48 зарубежных.

Апробация материалов диссертации

Материалы диссертации доложены на VIII Всероссийской конференции «Нейроэндокринология-2010» (Санкт-Петербург, 2010); Всероссийской научно-практической конференции «Химическая безопасность Российской Федерации в современных условиях» (Санкт-Петербург, 2010); студенческой научной конференции Санкт-Петербургской педиатрической медицинской академии (Санкт-Петербург, 2010); 6 международной научной конференции «Донозология - 2010. Здоровый образ жизни и полезные для здоровья факторы» (Санкт-Петербург, 2010); VI научно-практической геронтологической конференции с международным участием «Пушковские чтения» (Санкт-Петербург, 2010); конференции молодых ученых, посвященной 85-летию со дня основания Института физиологии им. И.П. Павлова РАН «Механизмы адаптации физиологических систем организма к факторам среды» (Санкт-Петербург-Колтуши, 2010).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Культивирование тканей

Органотипические культуры тканей являются удобным объектом для тестирования биологически активных веществ, так как в них отсутствуют нервные, гуморальные и другие воздействия на исследуемые клетки. Органотипическое культивирование тканей проводилось по описанной ранее методике [Чалисова и др., 1999]. Для успешного развития ткани вне организма выбрана адекватная питательная среда, которая содержала 35 % раствора Хенкса, 35 % среды Игла, 25% фетальной сыворотки теленка, 0,6% глюкозы, 100 ЕД/мл гентамицина; рН 7,2.

Получение коллагена и коллагеноеой подложки

Коллаген широко применяется в качестве биологического субстрата, на котором растет и развивается культивируемая ткань. Для поставленных задач использовали коллаген, полученный из сухожилий хвостов крыс по методу Бернстайна, основанному на экстрагировании коллагена 0,1% раствором ледяной уксусной кислоты при температуре минус 10°С и нескольких последовательных инкубациях полученного раствора в течение 48 ч в холодильнике и центрифугировании в течение 1 часа при 6000 об/мин. Приготовленный таким способом коллаген хранили в холодильнике в течение года. Перед использованием коллаген подвергали диализу и испытывали на стерильность. Диализированный коллаген наносили на обезжиренную пластиковую поверхность чашки Петри (d=40 мм). Через час коллаген сливали, и поверхность высыхала на воздухе при комнатной температуре. Коллаген на дне чашки Петри образует тонкую пленку. Перед использованием поверхность необходимо несколько раз промыть раствором Хенкса.

Выделение тканей В работе использовали органотипические культуры хрящевой ткани (всего 1500 эксплантатов) и по 400 эксплантатов тканей тимуса, головного мозга, шишковидной железы (эпифиза), сердца, поджелудочной железы, щитовидной железы, семенников, предстательной железы, почек, мочевого пузыря, сосудов, яичников, печени, сетчатки глаза молодых (3-месячных) и старых (24-месячных) крыс линии Вистар.

В качестве хрящевой ткани использовали ткани мечевидного отростка грудины молодых (3-месячных) и старых (24-месячных) крыс линии Вистар. Для взятия материала и его препаровки использовали набор инструментов для микрохирургии глаза. Ткани извлекали в стерильных условиях, разделяли на фрагменты величиной около 1 мм3 и затем 20-25 таких фрагментов помещали на дно чашки Петри, предварительно покрытое коллагеновой пленкой, на расстоянии 3 мм друг от друга. Чтобы эксплантаты прикрепились к коллагеновой подложке, герметично закрытые чашки Петри помещали в термостат при температуре 37±0,1°С на 30 минут.

Далее чашки Петри с прикрепленными эксплантатами заливали 3 мл питательной среды. В культуральную среду добавляли исследуемые пептиды и аминокислоты в различных концентрациях. Затем чашки помещали в термостат. Культивирование эксплантатов тканей осуществляли при температуре 37±0,1°С и в присутствии 5% С02 в течение 3 суток.

Контрольными считали эксплантаты, культивируемые только в условиях питательной среды, без добавления пептидов или аминокислот.

Морфологические и морфометрические методы исследования развития эксплантатов в органотипической культуре тканей Рост эксплантатов ткани в органотипической культуре исследовали прижизненно с помощью фазово-контрастного микроскопа через 3 суток после начала культивирования.

В 1-е сутки культивирования происходило распластывание эксплантатов на коллагеновой подложке, выселение пролиферирующих и мигрирующих клеток, составляющих зону роста от края эксплантата. В структурной организации периферической зоны эксплантатов выделяется периферическая зона роста, а также капсула эксплантата, представленная 1-2 слоями фибробластов.

С поверхности капсула покрыта мезотелием, который не образует сплошного пласта. Клетки мезотелия часто отходят друг от друга, округляются и отрываются от базальной мембраны. В результате на месте отпавших клеток образуются обширные просветы, через которые часть клеток мигрирует за пределы эксплантата. Среди мигрирующих и пролиферирующих клеток типируются хондроциты, макрофаги, фибробласты, встречаются фигуры митозов. За счет этих клеток и формируется периферическая зона роста эксплантатов, при измерении которой определяется индекс площади (ИП). Через 3 сут, если в

эксперименте имела место стимуляция развития зоны роста, ИП экспериментальных эксплантатов увеличивался по сравнению с ИП онтрольных эксплантатов. В случае замедления или угнетения развития зоны роста ИП эксплантатов понижался по сравнению с контрольными значениями.

Для визуализации эксплантатов использовали микротеленасадку для микроскопа (серия 10, МТН-13 «Альфа-Телеком», Россия). Количественную оценку роста эксплантатов осуществляли с помощью пакета программ PhotoM 1.2.

Для количественной оценки влияния тестируемых веществ на развитие эксплантатов применяли морфометрический метод. Учитывая неоднородность морфологической картины эксплантатов, с целью унификации конечных показателей использовали относительный критерий -индекс площади.

ИП рассчитывали по формуле как отношение площади всего эксплантата, включая периферическую зону роста, к площади центральной зоны. За условную единицу площади принимали квадрат окуляр-сетки микроскопа. Сторона квадрата при увеличении 3,х10 равнялась 150 мкм.

Значения ИП выражали в условных единицах, контрольное значение ИП принимали за 100%.

Достоверность различий сравниваемых средних значений ИП контрольных и экспериментальных образцов оценивали с помощью t-критерия Стьюдента

Статистическую обработку полученных данных производили с использованием пакета программ «Microsoft Excell».

Препараты, исследованные в культуре ткани

Аминокислоты. В работе использовали 20 стандартных L-аминокислот производства «Sigma» (США).

Трипептиды. В органотипических культурах исследовали трипептиды, синтезированные в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН. Характеристика трипептидов представлена в таблице 1.

Таблица 1

Характеристика исследуемых трипептидов_

№№ Условное Химическая формула Молекулярная

пп. наименование масса, Да

1. Т-31 Ala-Glu-Asp 369,32

2. Т-33 Glu-Asp- Arg 454,53

3. Т-34 Glu-Asp-Gly 355,3

4. Т-38 Lys-Glu-Asp 426,42

Комплексные пептиды

Хондролюкс® получен по технологии, защищенной патентом РФ № 2302872 от 20.07.07 «Средство, нормализующее функции хрящевой ткани, и способ его получения».

Хондролюкс - препарат полипептидной природы, получаемый путем экстракции из хрящей крупного рогатого скота не старше 12-месячного возраста. В состав Хондролюкса входят полипептиды с молекулярной массой от 75 до 846 Да. На основании результатов экспериментального изучения предполагается эффективность применения Хондролюкса для лечения дегенеративно-дистрофических заболеваний позвоночника и суставов (остеохондроза, остеоартроза и др.), а также для лечения и профилактики остеопороза.

Контрольные комплексные пептиды

Для исследования тканеспецифических свойств Хондролюкса в органотипическую культуру хрящевой ткани добавляли в качестве контрольных пептидов экстракты из тимуса, головного мозга, шишковидной железы (эпифиза), сердца, поджелудочной железы, щитовидной железы, семенников, предстательной железы, почек, мочевого пузыря, сосудов, яичников, печени, сетчатки глаза, экстрагированные из соответствующих тканей по той же технологии, по которой произведен Хондролюкс.

Определение эффективной концентрации аминокислот и пептидов в органотипической культуре ткани

При раститровке каждого из пептидов и аминокислот в концентрациях 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0, 10,0, 20,0, 50,0, 100,0, 200,0 нг/мл выявлено, что эффективные концентрации, дающие максимальный эффект стимуляции или угнетения зоны роста эксплантатов, составляли 0,05-10,0 нг/мл, или 10~" - 10~12 М, т.е. составляли сверхмалые дозы. При использовании более высоких или более низких (подпороговых) концентраций не наблюдалось статистически достоверного эффекта стимуляции или угнетения зоны роста эксплантатов.

Под термином "сверхмалая доза" подразумевают такую дозу вещества, которая создает концентрацию на несколько порядков ниже равновесной константы взаимодействия вещества со своим эффектором. Использование сверхмалых доз аминокислот и пептидов связано с тем, что в последнее двадцатилетие опубликован ряд работ о чувствительности организмов к сверхмалым концентрациям биологически активных веществ [Чалисова Н.И. и соавт., 2002, 2005].

Иммуноцитохимические методы исследования эксплантатов

В периферической зоне роста на 3-й сутки определяли экспрессию маркера пролиферации РСКА и проапоптозного белка р53. Иммуноцитохимическое исследование проводили с использованием моноклональных мышиных антител к проапоптозному белку р53 и маркеру

PCNA (1:75, Novocastra). В качестве вторичных антител использовали универсальный набор, содержащий биотинилированные анти-мышиные и анти-кроличьи иммуноглобулины. Визуализацию окрасок проводили с применением комплекса авидина с биотинилированной пероксидазой (ABCkit) с последующим проявлением пероксидазы хрена диаминобензидином (все реагенты от Novocastra). Для визуализации экспрессии маркеров р53 и PCNA использовали одноэтапный протокол для мазков с фиксацией спиртом [Кветной И.М., Южаков В.В., 1996; Пальцев М.А., Кветной И.М., 2006].

Методика для визуализации маркеров PCNA и р53 выполнялась по стандартной схеме.

Морфометрические исследования и компьютерный анализ микроскопических изображений

После иммуноцитохимической окраски морфометрическое исследование проводили с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений, состоящей из микроскопа Nikon Eclipse Е400, цифровой камеры Nikon DXM1200, персонального компьютера на базе Intel Pentium 4 и программного обеспечения «Видеотест-Морфология 4.0». В каждом случае анализировали как минимум 10 полей зрения при увеличении х400. Определяли площадь экспрессии PCNA и р53, которая представляла собой отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения, выражаемое в процентах. Указанные параметры отражают интенсивность синтеза или накопления исследуемых маркеров. Результаты исследований обрабатывали с помощью компьютерных программ EXCEL и STATISTICA 5.0 (Statsoft). Для оценки межгрупповых различий (сравнения средних контрольных и экспериментальных значений) применяли t-критерий Стьюдента.

Статистическая обработка экспериментальных данных

Математическое обеспечение исследования осуществлялось в соответствии со стандартными методиками, принятыми для обработки результатов медико-биологических исследований [Гланд С., 1999; Григорьев С.Г. и соавт., 2002] с использованием параметрического метода - t-критерия Стьюдента. Статистическую обработку полученных экспериментальных данных производили с использованием программы "Microsoft Office Excel 2003". При тестировании каждого вещества использовали 20-25 эксплантатов каждой ткани. Индекс площади выражали в процентах относительно контроля. Достоверность различий в индексах площади оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Вероятность ошибки цифровых данных закладывалась в пределах 5%, что отвечает стандартам, принятым для медико-биологических исследований.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Влияние аминокислот на культуру хрящевой ткани молодых и старых крыс

Влияние аминокислот в эффективной концентрации 0,05 нг/мл изучали в органотипических культурах хрящевой ткани молодых и старых крыс.

В таблице 2 представлены статистические данные о влиянии аминокислот на ИП экспериментальных эксплантатов по сравнению с ИП контрольных эксплантатов. Показано, что в культуре ткани хряща молодых крыс при действии эффективных концентраций всех исследуемых аминокислот стимулирующее клеточную пролиферацию влияние выявлялось у 6 аминокислот. Так, при введении в культуральную среду гистидина ИП увеличивался на 19±5% (п=24, р<0,05) по сравнению с контролем (п=22); при действии глутамина ИП увеличивался на 17+2% (п=22, р<0,05) по сравнению с контролем (п=21); под влиянием аргинина - на 16±2% (п=25, р<0,05) по сравнению с контролем (п=23); при действии лейцина - на 25±5%

Таблица 2

Влияние аминокислот на развитие эксплантатов хряща молодых и

Аминокислота Изменение ИП (% по отношению к контролю)

молодые крысы старые крысы

Gly + 2+1 -4+2

Ala -3±1 + 5±1

Asn -13+3 - 11±5

His +19+5* +15±7

Lys + 9±3 + 6±3

Ser + 4+3 + 7±3

Gin + 17+2* +12±3

Arg + 1612* + 9±1

Pro -5+1 + 4±1

Glu -12+3 -3±1

Asp -6+2 + 5±3

Cys -3±1 + 5+2

Туг + 16±3* + 5±2

Val -9±1 + 5±1

Thr - 2±1 -4±2

Met + 6±1 - 5±2

Leu + 25±5* + 17+3*

He +18±4* + 4±2

Phe + 5±1 + 4±2

Trp + 3±1 + 5±2

* р<0,05 по сравнению с ИП контрольных эксплантатов.

(п=21, р<0,05) по сравнению с контролем (п=24); при действии изолейцина -на 18±4% (п=20, р<0,05) по сравнению с контролем (п=23); при действии тирозина - на 16+3% (п=21, р<0,05) по сравнению с контролем (п=24). Остальные исследованные аминокислоты либо вызывали статистически не достоверное уменьшение ИП эксплантатов (аспарагин, глутаминовая кислота), либо ИП оставался на уровне контрольных значений.

В эксплантатах от старых крыс только лейцин оказывал стимулирующее воздействие на клеточную пролиферацию (рис. 1) - ИП статистически достоверно увеличивался на 17±3% (п=2\, р<0,05) по сравнению с контролем (п=24). Таким образом, количество активно действующих аминокислот уменьшалось в 6 раз при старении организма.

а б

Рис. 1. Прижизненная фотография эксплантатов хрящевой ткани в органотипической культуре ткани старых крыс на 3-й день культивирования, а - контроль, б - добавление в питательную среду 0,05 нг/мл лейцина. Ув. х70.

Влияние сочетаний аминокислот на развитие культуры ткани хряща

В следующей серии опытов исследовано влияние сочетаний активных в отношении пролиферации аминокислот на развитие эксплантатов хрящевой ткани. Показано, что в эффективных концентрациях сочетания стимулирующих аминокислот не давали эффекта, и ИП был на уровне контроля или даже снижался. Это можно объяснить, как действие сверхсильного стимула, приводящего к снижению ИП эксплантатов.

Однако подпороговые концентрации - 0,01 нг/мл - приводили к стимулирующему эффекту, иногда даже превосходящему стимулирующий эффект при изолированном действии аминокислот. Так, в эксплантатах от молодых крыс стимулирующее влияние на ИП оказали: аргинин совместно с гистидином, ИП был на 26±5% (п=20, р<0,05) выше, чем в контрольных эксплантатах (п=22); лейцин совместно с глутаминовой кислотой, которая при изолированном применении даже вызывала статистически не достоверное снижение ИП, вызывал повышение ИП на 20±3% (п=25, р<0,05) по сравнению с контролем (п=24); лейцин совместно с гистидином

увеличивал ИП на 22±3% (п=20, р<0,05) по сравнению с контролем (п=21); изолейцин совместно с гистидином увеличивал ИП на 24±3% (п=23, р<0,05) по сравнению с контролем (п=20); лейцин совместно с аргинином увеличивал ИП на 18±2% (п=22, р<0,05) по сравнению с контролем (п=21).

В эксплантатах от старых крыс статистически достоверное стимулирующее влияние на ИП оказало сочетание лейцина, который оставался активным в отношении пролиферации у старых крыс, и гистидина, который не оказывал статистически достоверного влияния на такие эксплантаты: ИП при сочетанном действии лейцина и гистидина повышался на 23±3% (п=20, р<0,05) по сравнению с контролем (п=23) (рис. 2).

25

20

15

10

5

О

Рис. 2. Влияние аминокислот (лейцин, гистидин) и их сочетаний на индекс площади эксплантатов хряща старых крыс.

Контроль - нулевая линия, по вертикали - изменение ИП в %, *р<0,05 по сравнению с ИП в контроле.

Исследование процессов пролиферации и апоптоза при действии аминокислот в эксплантатах хряща молодых и старых крыс

При иммуноцитохимическом исследовании экспрессии маркера пролиферации РСЫА и проапоптозного белка р53 в зоне роста эксплантатов хряща крыс при действии стимулирующих пролиферацию аминокислот выявлено достоверное увеличение площади экспрессии маркера пролиферации РСЫА и уменьшение площади экспрессии белка р53. Эти изменения находились, соответственно, в положительной и отрицательной корреляции с увеличением зоны роста эксплантата под действием аминокислоты. Так, например, ИП эксплантата хряща молодых крыс под действием лейцина увеличивался на 21±3% (п=24, р<0,05) по сравнению с контролем (п=24); при этом площадь экспрессии маркера пролиферации PCNA также статистически достоверно увеличивалась на 20±2% (р<0,05), а площадь экспрессии белка р53 статистически достоверно снижалась на 18±1%(р<0,05).

Ьеи

Н15: Ьеи+Шя

ИП эксплантата хряща старых крыс под действием лейцина увеличивался на 17±3% (п=21, р<0,05) по сравнению с контролем (п=24); при этом площадь экспрессии маркера пролиферации РСИА также статистически достоверно увеличивалась на 18±2% (р<0,05), а площадь экспрессии белка р53 статистически достоверно снижалась на 16±3% (р<0,05). Результаты иммуноцитохимического исследования эксплантатов хряща старых крыс представлены на рисунке 3.

Таким образом, результаты имммуноцитохимического исследования подтверждают данные, полученные при изучении влияния аминокислот на рост эксплантатов в органотипической культуре тканей хряща молодых и старых животных.

20 15 10 5 О -5 -10 -15

Рис. 3. Влияние лейцина на индекс площади эксплантата и площадь экспрессии белков PCNA и р53 в эксплантатах хряща старых крыс.

Контроль - нулевая линия, по вертикали - изменение индекса площади и площади экспрессии белков PCNA и р53; *р<0,05 по сравнению с показателем в контроле.

Исследование влияния трипептидов на развитие эксплантатов хряща молодых и старых крыс

В органотипической культуре тканей хряща были исследованы синтезированные трипептиды - Т-31 (Ala-Glu-Asp), Т-33 (Glu-Asp- Arg), Т-34 (Glu-Asp-Gly), Т-38 (Lys-Glu-Asp). При раститровке трипептидов от 0,01 нг/мл до 100 нг/мл было показано, что они обладают стимулирующей пролиферацию активностью в концентрации 0,05 нг/мл, т.е. эта концентрация является эффективной, как и при действии отдельных аминокислот. При введении в культуральную среду эффективных концентраций трипептидов ИП увеличивался на 18-25%, по сравнению с ИП контрольных эксплантатов.

ИП PCNA р53

Таблица 3

Влияние трипептидов на развитие эксплантатов хряща молодых и __старых крыс_

Трипептид Изменение ИП (% по отношению к контролю)

молодые крысы старые крысы

Т-31 +18±1* +25+5*

т-зз +17+2* +15±1

Т-34 +13±2 + 11±1

Т-38 + 20±3* + 17+2*

* р<0,05 по сравнению с ИП контрольных эксплантатов.

« , •

« , V е-

Ф

1 о

■ с

а б

Рис. 4. Экспрессия РСКА в органотипической культуре хряща крыс на 3-й день культивирования, а - контроль, б - добавление в питательную среду лейцина (0,05 нг/мл). х400.

Однако влияние разных трипептидов на хрящевую ткань от молодых и старых крыс было различным. Результаты исследования приведены в таблице 3.

Параллельно проводили иммуноцитохимическое исследование экспрессии маркера пролиферации белка РСИА (рис. 4) и маркера апоптоза белка р53. Было выявлено, что увеличение площади экспрессии белка РСЫА коррелировало с увеличением ИП зоны роста эксплантатов, а экспрессия проапоптозного белка р53 в зоне роста эксплантатов хряща крыс при действии трипептидов находилось в отрицательной корреляции с увеличением зоны роста эксплантата под действием трипептидов (рис. 5).

Так, при введении в культуральную среду трипептида Т-31 ИП увеличивался в эксплантатах от старых крыс на 25+5% (п=22, р<0,05) по сравнению с контролем (п=21), но в эксплантатах от молодых крыс происходило статистически достоверное, но меньшее по значению увеличение ИП на 18±1% (п=23, р<0,05) по сравнению с контролем. При этом площадь экспрессии маркера пролиферации белка РСЫА достоверно увеличилась на 23±3% (р<0,05), а площадь экспрессии проапоптозного белка р53, напротив, достоверно снизилась на 18±2 % (р<0,05).

Под влиянием трипептида Т-33 ИП увеличивался на 17±2% (п=23, р<0,05) в эксплантатах от молодых крыс и на 15±1% (п=24, р<0,05) в эксплантатах от старых крыс по сравнению с контролем (п=23 и п=22, соответственно). При этом площадь экспрессии маркера пролиферации белка РСИА в эксплантатах от старых крыс увеличилась на 14±1% (р<0,05), а площадь экспрессии проапоптозного белка р53, напротив, достоверно снизилась на 15±2 % (р<0,05).

При введении в культуральную среду трипептида Т-34 происходило недостоверное увеличение ИП на 13±2% (п=20, р>0,05) в эксплантатах от молодых крыс и на 11+1% (п=21, р>0,05) в эксплантатах от старых крыс, по сравнению с контролем (п=25 и п=24 соответственно). При этом площадь экспрессии маркера пролиферации белка PCNA в эксплантатах от старых крыс увеличилась на 10±1% (р>0,05), а площадь экспрессии проапоптозного белка р53 снизилась также на 10±2 % (р>0,05).

% 30 20 10 О -10 -20 -30

Рис. 5. Влияние трипептида Т-31 на индекс площади зоны роста эксплантата и площадь экспрессии белков PCNA и р53 в эксплантатах хряща старых крыс.

Контроль - нулевая линия, по вертикали - изменение индекса площади и площади экспрессии белков РСМА и р53; *р<0,05 по сравнению с показателем в контроле.

Под влиянием трипептида Т-38 ИП увеличивался на 20±3% (п=25, р<0,05) в эксплантатах от молодых крыс и на 17±2% (п=20, р<0,05) в эксплантатах от старых крыс по сравнению с контролем (п=21 и п=22 соответственно). При этом площадь экспрессии маркера пролиферации белка РСИА в эксплантатах от старых крыс увеличилась на 16±2% (р<0,05), а площадь экспрессии проапоптозного белка р53, напротив, достоверно снизилась также на 14±2 % (р<0,05).

Таким образом, наиболее эффективным в отношении стимуляции пролиферации хрящевой ткани от молодых и старых животных оказался трипептид Т-31, который приводил к увеличению ИП зоны роста

--~Я * ь

■

ИП РСЫА р53

эксплантатов на 25% по сравнению с контролем, что коррелировало с увеличением площади экспрессии маркера пролиферации белка РСЫА и маркера апоптоза белка р53.

Введение трипептидов в питательную среду эксплантатов других тканей показало, что короткие пептиды не обладают тканеспецифическим действием и проявляют активность в нескольких тканях. Так, трипептид Т-31 стимулировал пролиферацию в эксплантатах 6 тканей молодых и 5 тканей старых животных. Пептид Т-33 обладал стимулирующей пролиферацию активностью по отношению к 4 тканям молодых животных и 5 тканям старых крыс. Пептид Т-34 усиливал пролиферативные процессы в 4 тканях молодых животных и 2 тканях старых животных. Пептид Т-38 проявлял наибольшую пролиферативную активность из исследованных трипептидов: его введение в культуральную среду способствовало достоверному изменению ИП эксплантатов 8 тканей молодых и 7 тканей старых животных.

Исследование Хондролюкса в органотипической культуре ткани хряща молодых и старых крыс

Для определения биологической активности комплексного пептида, выделенного методом экстрагирования из хрящевой ткани телят, Хондролюкса тестировали его эффективную концентрацию. Хондролюкс в различных концентрациях вводили в питательную среду в чашки Петри, в которых на коллагеновой подложке развивались эксплантаты хряща мечевидного отростка грудины молодых и старых крыс.

Результаты исследования показали, что в эксплантатах как молодых, так и старых крыс Хондролюкс обладает стимулирующей пролиферацию активностью в диапазоне концентраций от 20 до 50 нг/мл, при которых увеличение индекса площади (ИП) было статистически достоверным (по сравнению с контрольными эксплантатами), как это представлено в таблице 4. Следует отметить, что в эксплантатах хрящевой ткани от старых животных Хондролюкс проявлял меньшую пролиферативную активность в указанном диапазоне концентраций по сравнению с эксплантатами от молодых крыс.

Таблица 4

Определение эффективных концентраций Хондролюкса

в органотипической культуре хрящевой ткани_

Возраст Изменение ИП (% по отношению к контролю)

крыс Концентрация Хондролюкса, нг/мл

0,01 0,05 0,1 0,5 1,0 10,0 20,0 50,0 100, 0 200, 0

Молодые 6 7 10 3 -3 15 34* 42* 11 -5

Старые 3 2 17 5 2 12 23* 27* 9 -2

* р<0,05 по сравнению с контролем.

а б

Рис. 6. Фотография эксплантатов хрящей в органотипической культуре ткани старых крыс на 3-й день культивирования, а - контроль, б -добавление в питательную среду Хондролюкса (50 нг/мл). х70.

-30

ИП РСЫА р53

Рис. 7. Влияние Хондролюкса на индекс площади зоны роста эксплантата и площадь экспрессии белков РСИА и р53 в эксплантатах хряща старых крыс.

Контроль - нулевая линия, по вертикали - изменение индекса площади и площади экспрессии белков РСТУА и р53; *р<0,05 по сравнению с показателем в контроле.

Таким образом, выявлено, что эффективная концентрация Хондролюкса составляет 50 нг/мл, а дальнейшее повышение концентрации приводит значения ИП к уровню контроля и последующему ингибированию зоны роста.

При культивировании фрагментов хрящевой ткани, в формировании зоны роста которых участвовали клетки стромы, фолликулов и фибробласты, как видно на рисунке 6, выявлено, что Хондролюкс приводил к статистически достоверному увеличению ИП эксплантатов: у молодых животных на 37,5±3,1% (п=24, р<0,05), у старых крыс - на 32,8±2,4% (п=26, р<0,05) по сравнению с ИП контрольных эксплантатов (п=25). Результаты исследования представлены в таблице 5.

Параллельно проводили иммуноцитохимическое исследование эксплантатов хрящевой ткани молодых и старых крыс.

Результаты исследования показали, что площадь экспрессии маркера пролиферации РСИА в эксплантатах хрящевой ткани молодых крыс увеличилась достоверно на 35,1±1,3% (р<0,05), а площадь экспрессии проапоптозного маркера р53 снизилась на 31,3±2,3% (р<0,05). Площадь экспрессии маркера пролиферации РСЫА в эксплантатах хрящевой ткани старых крыс увеличилась достоверно на 30,4±1,7% (р<0,05), а площадь экспрессии проапоптозного маркера р53 снизилась на 28,6±1,6% (р<0,05, рис. 7).

Таблица 6

Тканеспецифическое действие Хондролюкса в органотипической культуре __различных тканей молодых и старых крыс_

№№ Ткань Кол-во эксплантатов, ИП,%

пп. п

Молодые Старые Молодые Старые

крысы крысы крысы крысы

1. Хрятц 24 26 37,5±3,1* 32,8=2,4*

2. Тимус 23 25 3,6±1,4 2,3±1,0

3. Головной мозг 25 24 7,9±2,1 6,4±2,3

4. Эпифиз 24 26 6,1±1,8 4,9±2,1

5. Сердце 23 24 11,2±3,2 9,6±2,8

6. Поджелудочная железа 26 25 2,6±0,3 1,7±0,5

7. Щитовидная железа 25 26 8,4±2,6 7,2±2,4

8. Предстательная 23 25 5,1±1,8 6,3±1,3

железа

9. Семенники 26 24 7,2±1,5 7,8±1,9

10. Препарат почек 24 23 10,3±3,6 9,5±3,2

11. Препарат мочевого пузыря 23 26 12,1±3,7 11,4±3,5

12. Сосуды 26 24 12,6±2,8 11,6±2,5

13. Яичники 24 25 2,8±0,4 2,1±0,5

14. Почки 24 25 6,4±1,1 6,9±1,0

15. Сетчатка глаза 23 24 3,1±0,9 3,7±0,6

* р<0,05 по сравнению с контролем.

Для сравнения культивировались другие ткани в присутствии Хондролюкса (табл. 6). Так, например, выявлено, что Хондролюкс не оказывал стимулирующего действия на культуру ткани тимуса молодых и старых крыс, ИП при этом оставался на уровне контроля (увеличение на 3,3±1,1% и на 2,7±0,7%, п=23 и п=25, соответственно, р>0,05). В то же

время, экстракт из тимуса телят оказывал стимулирующее действие на культуру ткани тимуса, что выражалось в увеличении индекса площади эксплантатов на 29,8±2,5% и на 24,6±1,7%, п=25 и п=23, соответственно, у молодых и старых животных (р<0,05).

При действии Хондролюкса в культуре ткани предстательной железы молодых и старых крыс зона роста уменьшалась также статистически не достоверно на 5,7±1,2% и 3,8±1,6%, п=31 и п=27, соответственно (р>0,05), по сравнению с ИП контрольных эксплантатов (п=24). При этом введение в культуральную среду экстракта из простаты телят приводило к увеличению ИП зоны роста эксплантатов на 34,2±3,1% и на 29,4±2,4%, п=22 и п=24, соответственно, у молодых и старых животных (р<0,05).

Введение Хондролюкса в культуральную среду вызывало статистически не достоверную стимуляцию развития эксплантатов коры головного мозга молодых и старых животных - ИП повышался на 5,2±1,8% и 4,5±1,7%, п=24 и п=23, соответственно (р>0,05), по сравнению с контрольными эксплантатами (п=24). Добавление экстракта из коры головного мозга в культуральную среду вызывало статистически достоверное увеличение зоны роста эксплантатов молодых и старых животных, соответственно, на 38,5±3,1% и 31,4±2,2%, п=27 и п=24 (р<0,05).

Аналогичные результаты были получены при культивировании других тканей в присутствии экстрактов из различных органов и тканей телят. Выявленные закономерности свидетельствуют о тканеспецифическом действии препаратов на основе экстрактов из органов и тканей молодых животных, выражающемся в стимуляции пролиферации клеток тех тканей молодых и старых животных, из которых препараты были выделены.

Проведенные в данной работе исследования Хондролюкса показали, что при действии пептидного биорегулятора уже в малых дозах эффективно стимулируются процессы пролиферации в хрящевой ткани (мечевидного отростка грудины, включающего частично и костную ткань) молодых и старых крыс. Это открывает широкие перспективы для изучения препарата в качестве лекарственного средства с целью лечения дегенеративно-дистрофических заболеваний суставов и позвоночника.

Заключение

Полученные в нашей работе данные свидетельствуют о том, что аминокислоты, входящие в состав комплексных пептидов в качестве структурных элементов, сами могут обладать некоторыми регуляторными свойствами в отношении тканей-мишеней. В тканях мезодермального генеза стимулируют клеточную пролиферацию гидрофильные аминокислоты с заряженной боковой цепью - гистидин, лизин, аргинин, глутаминовая кислота, а также тирозин, в то время как в тканях коры головного мозга клеточная пролиферация стимулируется совершенно другими аминокислотами - группой нейтральных гидрофобных аминокислот [Чалисова Н.И. и соавт. 2003, 2005]. Хрящевая ткань развивается из мезенхимы. Результаты проведенного в данной работе исследования свидетельствуют о том, что так же, как и в других тканях мезенхимного

генеза, в органотипической культуре хрящевой ткани стимулируют клеточную пролиферацию аминокислоты с заряженной боковой цепью -гистидин, аргинин, глутаминовая кислота, а также тирозин, кроме того, в отличие от других мезенхимных тканей, выраженный стимулирующий эффект оказывают лейцин и изолейцин. Эти данные могут служить основанием для синтеза новых регуляторных пептидов для хрящевой ткани. С применением иммуноцитохимических методов показано, что при стимуляции клеточной пролиферации происходит уменьшение экспрессии проапоптозного белка р53, что свидетельствует об ослаблении процессов апоптоза под влиянием аминокислот. Важно отметить, что при культивировании эксплантатов хрящевой ткани старых животных количество активных аминокислот уменьшается в 6 раз, т.е. стимулирует клеточную пролиферацию статистически достоверно только одна аминокислота -лейцин. Поэтому особенно актуальной становится задача поиска препаратов, способствующих клеточной пролиферации в хрящевой ткани старых животных.

Синтезированные трипептиды - Т-31 (А1а-01и-Азр), Т-33 (СЬ-АБр-Аг§), Т-34 (01и-А8р-01у), Т-38 (ЬуБ-ОШ-Азр) были исследованы в органотипической культуре тканей хрящевой ткани от молодых и старых крыс. Каждый из трипептидов содержал какую-либо из активных в отношении стимуляции пролиферации аминокислот — глутаминовую кислоту, аргинин. При раститровке трипептидов от 0,01 до 100 нг/мл было выявлено, что они обладают стимулирующей пролиферацию активностью в концентрации 0,05 нг/мл, т.е. эта концентрация является эффективной, как и при действии отдельных аминокислот. При введении в культуральную среду эффективных концентраций трипептидов Т-31 и Т-38 ИП увеличивался на 18-25%, по сравнению с ИП контрольных эксплантатов. При иммуноцитохимическом исследовании экспрессии маркера пролиферации РСИА и проапоптозного белка р53 в зоне роста эксплантатов хряща крыс при действии трипептидов Т-31 и Т-38 выявлена положительная корреляция степени увеличения ИП с площадью экспрессии РСНА и отрицательная корреляция увеличения ИП и снижения площади экспрессии р53.

Наибольшую активность в отношении стимуляции пролиферации эксплантатов хрящевой ткани вьивлена у трипептидов Т-31 и Т-38 - они достоверно увеличивали ИП эксплантатов как молодых, так и старых крыс. Трипептид Т-33 менее эффективно, но достоверно стимулировал ИП эксплантатов хрящевой ткани молодых крыс, но не действовал на эксплантаты хряща от старых животных. Пептид Т-34 не оказывал достоверного действия на исследуемые эксплантаты. При этом важно отметить, что трипептиды не проявляли тканеспецифических свойств и способствовали увеличению зоны роста эксплантатов нескольких тканей как молодых, так и старых животных.

Результаты проведенного исследования комплексного пептида из хрящевой ткани Хондролюкса показали, что препарат обладает стимулирующей пролиферацию активностью в диапазоне концентраций от

20 до 50 нг/мл, при которых увеличение индекса площади (ИП) было статистически достоверным (на 33-37%), по сравнению с контрольными эксплантатами. Особенно важным было то, что эта стимулирующая активность проявлялась у Хопдролюкса в культуре хрящевой ткани как от молодых, так и от старых животных.

Важным фактом явилось установление выраженного тканеспецифического действия Хондролюкса. Было показано, что Хондролюкс не оказывает стимулирующего действия на эксплантаты тканей тимуса, головного мозга, шишковидной железы (эпифиза), сердца, поджелудочной железы, щитовидной железы, семенников, предстательной железы, почек, мочевого пузыря, сосудов, яичников, печени, сетчатки глаза. И наоборот, экстракты из перечисленных тканей не обладали пролиферативной активностью на эксплантаты хрящевой ткани.

Можно полагать, что специфичность действия на пролиферацию и апоптоз исследованных биологически активных веществ усиливается по мере усложнения их структуры. Важным фактом, обнаруженным в данном исследовании, является то, что гораздо меньшее количество аминокислот проявляет активность в отношении клеточной пролиферации или апоптоза в эксплантатах тканей старых животных по сравнению с эксплантатами тканей молодых животных.

Установленное стимулирующее действие трипептидов Т-31 и Т-38 в отношении клеточной пролиферации и апоптоза в тканях хряща создает базу для целенаправленного синтеза коротких пептидов, предназначенных для лечения патологии суставов в гериатрической практике. Выявленное тканеспецифичное действие Хондролюкса на хрящевую ткань подтверждает перспективность его дальнейшего изучения в качестве лекарственного средства, предназначенного для профилактики и лечения патологических состояний суставного хряща, в том числе при болезнях, ассоциированных с возрастом.

ВЫВОДЫ

1. Аминокислоты гистидин, глутамин, аргинин, лейцин, изолейцин и тирозин обладают способностью стимулировать пролиферативные процессы в хрящевой ткани молодых животных.

2. Спектр аминокислот, активных в отношении клеточной пролиферации, уменьшается в тканях от старых животных в 6 раз, активной аминокислотой остается только лизин.

3. Трипептиды Т-31 и Т-38 стимулируют пролиферативные процессы в органотипической культуре ткани хряща, как молодых, так и старых животных. Трипептид Т-33 стимулирует пролиферативные процессы в органотипической культуре ткани хряща молодых животных.

Трипептид Т-34 не обладает пролиферативной активностью в отношении органотипической культуры хряща.

4. Трипептиды не обладают тканеспецифическими свойствами и стимулируют пролиферацию в органотипических культурах нескольких тканей как молодых, так и старых животных.

5. Комплексный пептид из хрящевой ткани Хондролюкс оказывает выраженное стимулирующее действие на клеточную пролиферацию в эксплантатах хрящевой ткани как молодых, так и старых животных.

6. Экспрессия маркера пролиферации РСИА находится в положительной, а экспрессия проапоптозного белка р53 - в отрицательной корреляции с увеличением индекса площади эксплантата под действием аминокислот, трипептидов и комплексного пептида хрящевой ткани Хондролюкса.

7. Хондролюкс обладает выраженной тканеспецифичностью в отношении хрящевой ткани. Добавление эффективной концентрации Хондролюкса в культуры других тканей молодых и старых животных не приводило к достоверному увеличению зоны роста эксплантатов. Добавление эффективных концентраций комплексных пептидов, экстрагированных из других тканей животных, в культуру хрящевой ткани молодых и старых крыс не вызывало достоверного увеличения индекса площади эксплантатов.

8. Стимуляция пролиферации клеток хрящевой ткани молодых и старых животных при действии комплексного пептида из хрящевой ткани Хондролюкса и синтезированных пептидов Т-31 и Т-38 свидетельствует о перспективности разработки на их основе лекарственных средств для применения в гериатрической практике.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1.Выявленное тканеспецифичное действие Хондролюкса на хрящевую ткань создает основу для его дальнейшего изучения в качестве лекарственного средства, предназначенного для профилактики и лечения патологических состояний суставного хряща, в том числе при болезнях, ассоциированных с возрастом.

2. Установленное стимулирующее действие трипептидов Т-31 и Т-38 в отношении клеточной пролиферации и апоптоза в тканях хряща создает базу для целенаправленного синтеза коротких пептидов, предназначенных для лечения патологии суставов в гериатрической практике.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах, включенных в Перечень ВАКМинобрнауки РФ

1. Влияние кодируемых аминокислот на развитие органотипической культуры тканей различного генеза молодых и старых крыс/

A.B. Смирнов, Н.И. Чалисова, Г.А. Рыжак, Е.А. Концевая//Успехи геронтологии. - 2010. - Т. 23, № 3. - С. 447-452.

2. Геропротекторное действие аминокислот и трипептидов в культуре ткани хряща крыс/А.В. Смирнов, Н.И. Чалисова, Г.А. Рыжак, Е.А. Концевая//Успехи геронтологии. - 2011. - Т. 24, № 1 - С. 54-57.

3. Геропротекторное действие препарата на основе экстракта из хрящевой ткани в органотипической культуре ткани хряща молодых и старых крыс/А.В. Смирнов, Н.И. Чалисова, Г.А. Рыжак, Е.А. Концевая, М.А. Войцеховская//Научные Ведомости Белгородского государственного университета. Серия Медицина. Фармация. Геронтология и гериатрия. - 2011. - Вып. 13, №1. - С. 68-71.

4. Протекторное влияние аминокислот при действии цитостатика в культуре лимфоидной ткани молодых и старых крыс/Н.И. Чалисова,

B.А. Смирнов, С.А. Уртьева, Т.А. Уртьева, A.A. Бунина, Е.А. Концевая//Успехи геронтологии. - 2010. - Т. 23, № 2. - С.228-232.

5. Протекторное влияние пептидов и аминокислот на развитие культуры лимфоидной ткани в присутствии циклофосфана/Н.И. Чалисова, В.А. Смирнов, М.Б. Иванов, Л.Г. Аржавкина, JI.B. Пикалова// Токсикологический вестник -2010. - Т. 4. - С.135-138.

Тезисы докладов

6. Бунина A.A. Тканеспецифическое влияние тетрапептидов на клеточную пролиферацию в культуре/ A.A. Бунина, A.B. Смирнов//Тез. докл. VIII Всеросс. конф. «Нейроэндокринология-2010». - Санкт-Петербург, 2010.-С. 38-39.

7. Влияние аргинина и его метаболитов на органотипическую культуру миокарда крыс/ П.Ю. Морозова, С.А. Уртьева, Т.А. Уртьева, A.A. Бунина, А.Ю. Морозова, A.B. Смирнов, Е.В. Концевая//Вестник Педиатрической академии. Матер, студенческой науч. конф. Санкт-Петербург, 2010. - С. 136.

8. Перспективы использования мелатонина для профилактики хемоиндуцированного повреждения клеток/JI.B. Пикалова, М.Б. Иванов, C.B. Петленко, Н.И. Чалисова, Е.Г. Богданова, A.B. Смирнов//Сб. трудов Всеросс.научн.-практ. конф. «Химическая безопасность Российской Федерации в современных условиях». Санкт-Петербург, 2010. - С. 222-224.

9. Смирнов A.B. Влияние кодируемых аминокислот на клеточную пролиферацию и апоптоз в культуре тканей различного генеза/ A.B.

Смирнов, М.А. Войцеховская// Тез. Докл. Конф. молодых ученых, посвященной 85-летию со дня основания Института физиологии им. И.П. Павлова РАН. Санкт-Петербург-Колтуши, 2010. - С. 97-98. 10.Чалисова Н.И. Геропротекторное влияние аминокислот на культуру ткани миокарда/ Н.И. Чалисова, A.B. Смирнов, Е.А. Концевая// Сб. научн. работ VI научн.-практ. геронтологической конф. с междунар.участием «Пушковские чтения». Санкт-Петербург, 2010. -С. 295-296.

11 .Чалисова Н.И. Сочетанное влияние аминокислот при действии на культуру ткани миокарда/Н.И. Чалисова, A.B. Смирнов, Е.А. Концевая// Матер. 6 междунар. научн.конф. «Донозология - 2010. Здоровый образ жизни и полезные для здоровья факторы». Санкт-Петербург, 2010. - С. 379-381.

СМИРНОВ Андрей Валерьевич МОДУЛИРУЮЩЕЕ ВЛИЯНИЕ АМИНОКИСЛОТ И ПЕПТИДОВ НА РАЗВИТИЕ ХРЯЩЕВОЙ ТКАНИ В ОРГАНОТИПИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЕ МОЛОДЫХ И СТАРЫХ КРЫС//Автореф. дис. канд. мед. наук: 14.01.30 -СПб., 2011.26 с.

Подписано в печать «16» марта 2011. Формат 60*84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 13. Отпечатано с готового оригинал-макета. ЗАО "Принт - Экспресс" 197376, С.-Петербург, ул. Большая Монетная, 5 лит. А

В связи с увеличением средней продолжительности жизни и доли пожилых людей в общей численности населения особое внимание специалистов в области биологии и медицины уделяется исследованию закономерностей развития возрастной патологии и разработке новых геропротекторных препаратов. В последнее время в научной литературе всё чаще встречается информация о заболеваниях суставов и позвоночника у лиц старших возрастных групп, что особенно актуально для решения тех задач, которые ставит перед собой геронтология. Идет постоянный поиск биологически активных веществ, позволяющих направленно корректировать функциональную активность клеток, снижающуюся при возрастной патологии. Регуляторные пептиды, влияющие на процессы развития тканей, широко распространены в живых организмах и выделяются различными клетками и тканями как эндокринные и аутокринные носители информации о локальном состоянии органа или ткани [Хавинсон В.Х. и соавт. 1985; Ашмарин И.П., Обухова М.Ф., 1986]. Поддержание биологической целостности организма на клеточном уровне регулируется сигналами, которые позволяют сохранять сложное равновесное состояние между двумя основными физиологическими процессами - пролиферацией и программируемой клеточной гибелью (апоптозом). Функцию медиаторных межклеточных сигналов на пара- и аутокринном уровнях выполняют секреторные белки - цитокины [Пальцев М.А., 1996; Ярилин A.A., 1999], а также цитомедины - пептидные биорегуляторы, выделенные из тканей животных и поддерживающие структурный и функциональный гомеостаз клеточных популяций, которые содержат и продуцируют этот фактор [Морозов В .Г., Хавинсон В.Х., 1981; Хавинсон В.Х. и соавт., 1997]. На основании многочисленных экспериментальных и клинических данных стало известно, что пептидные биорегуляторы имеют большое значение в поддержании и координации различных функций организма [Морозов В.Г.и соавт., 2000; Коркушко О.В. и соавт., 2002; Хавинсон В.Х. и соавт., 2002; Рыжак Г.А., Коновалов С.С., 2004]. Пептиды, в свою очередь, гидролизуются до аминокислот, также обладающих, как показано в последнее время, регуляторными свойствами в отношении клеточной пролиферации и апоптоза [Чалисова и соавт., 2002, 2005].

В Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН на основе анализа аминокислотного состава экстрактов из различных органов и тканей животных синтезированы трипептиды.

Достаточно сложно определить роль пептидов и аминокислот в регуляции клеточных популяций без учета и анализа межклеточных взаимоотношений, интегрирующих системный ответ. Помощь в решении такой задачи может дать методология комплексного морфофункционального анализа, способная объективно изучать клеточную патологию и регенерацию тканей, верифицировать пролиферативную активность и программируемую гибель клеток (апоптоз), а также оценивать деятельность клеточных структур и межклеточных коммуникаций.

Одной из наиболее адекватных моделей для изучения влияния различных препаратов на структурный и функциональный гомеостаз клеточных популяций являются органотипические культуры, которые используются для тестирования биологической активности различных препаратов [Хавинсон В.Х. и соавт., 1998, 1999; ЬеуьМопЫсЫш К, 1982]. В отсутствие нервных, гуморальных и других влияний, которые имеются в целостном организме, создаются условия для строгого дозирования испытуемых веществ по типу управляемого эксперимента.

В то же время, способность влиять на скорость основных клеточных процессов - пролиферацию и апоптоз, и, как следствие, вызывать изменение количества клеток по сравнению с контролем является одним из общих свойств пептидов млекопитающих. Изменение количества клеток в культуре ткани может служить критерием первичной интегральной оценки биологической активности пептида и являться основанием для поиска других его эффектов.

Сравнительное изучение в культуре ткани действия пептидов и аминокислот на хрящевую ткань как в молодом возрасте, так и при старении, позволит более глубоко понять механизмы регулирования основных клеточных процессов в организме при старении. При этом создается база для синтеза новых пептидных биорегуляторов с учетом их влияния на хрящевую ткань при ее патологии, в том числе при заболеваниях, ассоциированных с возрастом.

Цель и задачи исследования

Целью работы было изучение влияния аминокислот, трипептидов и комплексного пептида хрящевой ткани на развитие эксплантатов хряща в органотипических культурах тканей молодых и старых крыс.

Для достижения цели исследования были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

1. Исследовать влияние 20 стандартных аминокислот на клеточную пролиферацию в эксплантатах хряща от молодых и старых крыс в органотипической культуре ткани.

2. Исследовать влияние синтезированных трипептидов Т-31, Т-33, Т-34 и Т-38 на развитие эксплантатов хряща от молодых и старых крыс в органотипической культуре ткани.

3. Исследовать действие комплексного пептида хрящевой ткани Хондролюкса на клеточную пролиферацию в эксплантатах хряща от молодых и старых крыс в органотипической культуре ткани.

4. Исследовать иммуноцитохимическими методами влияние стандартных аминокислот, трипептидов и Хондролюкса на развитие процессов пролиферации и апоптоза в органотипической культуре хрящевой ткани от молодых и старых крыс.

Научная новизна работы

Впервые проведено изучение действия 20 стандартных аминокислот, трипептидов и комплексного пептида хрящевой ткани Хондролюкса в органотипических культурах тканей хряща, взятых от молодых и старых животных. Установлено стимулирующее влияние шести аминокислот (гистидина, глутамина, аргинина, лейцина, изолейцина и тирозина) на процессы пролиферации в культуре ткани хряща от молодых животных и уменьшение в 6 раз количества стимулирующих пролиферацию аминокислот в эксплантатах от старых животных. Впервые установлено, что трипептиды Т-31 и Т-38 стимулируют развитие эксплантатов хрящевой ткани молодых и старых крыс. Показано отсутствие тканеспецифических свойств трипептидов: короткие пептиды стимулируют процессы пролиферации в органотипических культурах нескольких тканей как молодых, так и старых животных.

Впервые показано, что комплексный пептид хрящевой ткани Хондролюкс эффективно стимулирует клеточную пролиферацию в эксплантатах хрящевой ткани, как молодых, так и старых животных. Хондролюкс обладает выраженным тканеспецифическим действием в отношении хрящевой ткани, не влияя на другие ткани. Комплексные пептиды, экстрагированные из тканей тимуса, головного мозга, шишковидной железы, сердца, поджелудочной железы, щитовидной железы, семенников, предстательной железы, почек, мочевого пузыря, сосудов, яичников, печени, сетчатки глаза, не оказывали достоверного влияния на органотипическую культуру хрящевой ткани.

Впервые проведено иммуноцитохимическое исследование эксплантатов хряща и выявлено уменьшение развития процессов апоптоза при стимуляции пролиферации Хондролюксом, трипептидами Т-31 и Т-38 и некоторыми аминокислотами. При этом показано, что увеличение индекса площади эксплантатов хрящей находится в положительной корреляции с увеличением площади экспрессии маркера пролиферации РСЫА и в отрицательной корреляции с уменьшением площади экспрессии проапоптозного белка р53.

Практическая значимость работы

Впервые получены экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что при старении уменьшается спектр аминокислот, активно действующих на пролиферативные процессы в хрящевой ткани. Напротив, Хондролюкс и трипептиды Т-31 и Т-38 проявляют стимулирующие пролиферацию свойства в отношении хрящевой ткани у животных как молодого, так и старого возраста. Выявленное тканеспецифическое действие Хондролюкса на хрящевую ткань создает основу для его дальнейшего изучения в качестве лекарственного средства, предназначенного для профилактики и лечения патологических состояний суставного хряща, в том числе при болезнях, ассоциированных с возрастом. Установленное стимулирующее действие трипептидов в отношении клеточной пролиферации в тканях хряща создает базу для целенаправленного синтеза коротких пептидов, предназначенных для лечения патологии суставов в гериатрической практике.

Положения, выносимые на защиту

1. Аминокислоты - гистидин, глутамин, аргинин, лейцин, изолейцин и тирозин обладают способностью стимулировать пролиферативные процессы в хрящевой ткани молодых животных. Спектр аминокислот, проявляющих активность в отношении клеточной пролиферации в хрящевой ткани, уменьшается в тканях от старых животных.

2. Трипептиды Т-31 и Т-38 стимулируют пролиферативные процессы в органотипической культуре хрящевой ткани молодых и старых животных. Трипептиды не проявляют тканеспецифические свойства и стимулируют пролиферативную активность в органотипических культурах нескольких тканей как молодых, так и старых животных.

3. Комплексный пептид хрящевой ткани Хондролюкс стимулирует клеточную пролиферацию в эксплантатах хрящевой ткани как молодых, так и старых животных, обладая выраженным тканеспецифическим действием в отношении хрящевой ткани.

4. Площадь экспрессии маркера пролиферации РСИА находится в положительной, а площадь экспрессии проапоптозного белка р53 - в отрицательной корреляции с изменением индекса площади эксплантатов в органотипической культуре хрящевой ткани при введении аминокислот, трипептидов и комплексного пептида хрящей Хондролюкса.

5. Трипептиды Т-31 и Т-38 и комплексный пептид из хрящевой ткани Хондролюкс являются перспективными препаратами для изучения в качестве лекарственных средств, предназначенных для лечения возраст-ассоциированной патологии опорно-двигательного аппарата.

Связь с планом НИР

Диссертационная работа выполнена в рамках основного плана НИР Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 5 статей в журналах, включенных в перечень Высшей аттестационной комиссии Минобрнауки РФ и рекомендованных для опубликования материалов диссертационных исследований.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов, 3 глав собственных исследований, главы обсуждения результатов, выводов и указателя литературы. Текст диссертации изложен на 106 страницах, содержит 8 таблиц, иллюстрирован

выводы

1. Аминокислоты гистидин, глутамин, аргинин, лейцин, изолейцин и тирозин обладают способностью стимулировать пролиферативные процессы в хрящевой ткани молодых животных.

2. Спектр аминокислот, активных в отношении клеточной пролиферации, уменьшается в тканях от старых животных в 6 раз, активной аминокислотой остается только лизин.

3. Трипептиды Т-31 и Т-38 стимулируют пролиферативные процессы в органотипической культуре ткани хряща, как молодых, так и старых животных. Трипептид Т-33 стимулирует пролиферативные процессы в органотипической культуре ткани хряща молодых животных. Трипептид Т-34 не обладает пролиферативной активностью в отношении органотипической культуры хряща.

4. Трипептиды не обладают тканеспецифическими свойствами и стимулируют пролиферацию в органотипических культурах нескольких тканей как молодых, так и старых животных.

5. Комплексный пептид из хрящевой ткани Хондролюкс оказывает выраженное стимулирующее действие на клеточную пролиферацию в эксплантатах хрящевой ткани как молодых, так и старых животных.

6. Экспрессия маркера пролиферации РСМА находится в положительной, а экспрессия проапоптозного белка р53 — в отрицательной корреляции с увеличением индекса площади эксплантата под действием аминокислот, трипептидов и комплексного пептида хрящевой ткани Хондролюкса.

7. Хондролюкс обладает выраженной тканеспецифичностью в отношении хрящевой ткани. Добавление эффективной концентрации Хондролюкса в культуры других тканей молодых и старых животных не приводило к достоверному увеличению зоны роста эксплантатов. Добавление эффективных концентраций комплексных пептидов, экстрагированных из других тканей животных, в культуру хрящевой ткани молодых и старых крыс не вызывало достоверного увеличения индекса площади эксплантатов.

8. Стимуляция пролиферации клеток хрящевой ткани молодых и старых животных при действии комплексного пептида из хрящевой ткани Хондролюкса и синтезированных пептидов Т-31 и Т-38 свидетельствует о перспективности разработки на их основе лекарственных средств для применения в гериатрической практике.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1.Выявленное тканеспецифичное действие Хондролюкса на хрящевую ткань создает основу для его дальнейшего изучения в качестве лекарственного средства, предназначенного для профилактики и лечения патологических состояний суставного хряща, в том числе при болезнях, ассоциированных с возрастом.

2. Установленное стимулирующее действие трипептидов Т-31 и Т-38 в отношении клеточной пролиферации и апоптоза в тканях хряща создает базу для целенаправленного синтеза коротких пептидов, предназначенных для лечения патологии суставов в гериатрической практике.