Автореферат и диссертация по медицине (14.00.53) на тему:Влияние олигопептидов и аминокислот на культуры тканей молодых и старых крыс

На правах рукописи ии^448914

АНИСКИНА Анна Игоревна

ВЛИЯНИЕ ОЛИГОПЕПТИДОВ И АМИНОКИСЛОТ НА КУЛЬТУРЫ ТКАНЕЙ МОЛОДЫХ И СТАРЫХ КРЫС

14.00.53 - геронтология и гериатрия

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

1 6 ОКТ 2008

Санкт-Петербург -2008

003448914

Работа выполнена в отделе клеточной биологии и патологии Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, доцент Чалисова Наталья Иосифовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Кветная Татьяня Викторовна

доктор биологических наук Вахитов Тимур Яшэрович

Ведущее учреждение:

Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Санкт-Петербургский государственный университет"

Защита диссертация состоится « . 2008 года в « IС* » часов на

заседании диссертационного Совета Д 601.001.01 при Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН по адресу: 197110 г. Санкт-Петербург, пр. Динамо, д 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.

Автореферат разослан ——2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Изучение механизмов, лежащих в основе регуляции важнейших гомеостатических функций организма, представляет собой одно из приоритетных направлений современной биологии и медицины. Поддержание биологической целостности организма на клеточном уровне регулируется сигналами, которые позволяют сохранять сложное равновесное состояние между двумя основными физиологическими процессами - пролиферацией и программированной клеточной гибелью (апоптозом). Функцию медиаторных межклеточных сигналов на пара- и аутокринном уровнях выполняют различные цитокины, поддерживающие структурный и функциональный гомеостаз клеточных популяций [Пальцев М А., 1996; Ярилин А А, 1999],. На основании многочисленных экспериментальных и клинических данных стало известно, что пептидные биорегуляторы имеют большое значение в поддержании и координации различных функций организма [Морозов В.Г и соавт, 2000; Коркушко О В. и соавт, 2002; Хавинсон В.Х. и соавт , 2002; Рыжак Г А, Коновалов С С , 2004]. В Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН синтезированы три- и тетрапептиды, являющиеся аналогами эндогенных пептидных биорегуляторов и содержащие наиболее часто встречающиеся в соответствующих тканях аминокислоты

Недавние исследования [Чалисова Н И. и соавт, 2000, 2003, 2006] показали, что не только олигопептиды, но и сами аминокислоты обладают разными регуляторными свойствами в отношении клеточной пролиферации и апоптоза в различных тканях Достаточно сложно определить роль пептидов и аминокислот в регуляции клеточных популяций без учета и анализа межклеточных взаимоотношений, интегрирующих системный ответ. Помощь в решении такой задачи может дать методология комплексного морфофункционального анализа, способная объективно изучать клеточную патологию и регенерацию тканей, верифицировать пролиферативную активность и программируемую гибель клеток (апоптоз), а также оценивать деятельность клеточных структур и межклеточных коммуникаций. Одной из наиболее адекватных моделей для изучения влияния различных препаратов на структурный и функциональный гомеостаз клеточных популяций являются органотипические культуры, которые используются для тестирования биологической активности различных препаратов [Калюнов В П., 1986; Чалисова Н.И. и соавт., 1998, 2006]. В отсутствие нервных, гуморальных и других влияний, которые имеются в целостном организме, создаются условия для строгого дозирования испытуемых веществ по типу управляемого эксперимента. В то же время способность влиять на скорость основных клеточных процессов - пролиферацию и апоптоз, - и, как следствие, вызывать изменение количества клеток по сравнению с контролем является одним из общих свойств

пептидов. Изменение количества клеток в культуре ткани может служить критерием первичной интегральной оценки биологической активности пептида и являться основанием для поиска других его эффектов. Сравнительное изучение в культуре ткани действия тетра-, трипептидов и аминокислот на ткани мезо-, энто- и зктодермалыюго происхождения, как у животных в молодом возрасте, так и при старении, позволит более глубоко понять механизмы регулирования основных клеточных процессов в организме При этом создается база для синтеза новых пептидных биорегуляторов с учетом их влияния на ткани организма у животных молодого и старого возраста.

Цель и задачи исследования. Целью работы было изучение влияния тетрапептидов, трипептидов и аминокислот на развитие эксплантатов тканей мезодермального, энтодермального и эктодермального происхождения в органотипических культурах тканей молодых и старых крыс.

Для достижения цели исследования поставлены и последовательно решены следующие задачи.

1 Исследовать влияние тетрапептидов, трипептидов и 20 стандартных аминокислот на развитие эксплантатов миокарда (ткань мезодермального генеза) от молодых и старых крыс в органотипической культуре ткани

2. Исследовать влияние тетрапептидов, трипептидов и 20 стандартных аминокислот на развитие эксплантатов подкорковых структур головного мозга (ткань эктодермального генеза) от молодых и старых крыс в органотипической культуре ткани.

3 Исследовать влияние тетрапептидов, трипептидов и 20 стандартных аминокислот на развитие эксплантатов поджелудочной железы (ткань энтодермального генеза) от молодых и старых крыс в органотипической культуре ткани

4 Провести сравнительный анализ влияния тетрапептидов, трипептидов и аминокислот, их составляющих, на развитие эксплантатов тканей мезо-, энто- и эктодермального происхождения

Научная новизна работы. Впервые проведено подробное изучение действия тетрапептидов, трипептидов и 20 стандартных аминокислот в органотипических культурах тканей мезо-, энто- и эктодермального происхождения, взятых от молодых и старых животных. Впервые установлено влияние трипептидов на процессы пролиферации и апоптоза в культуре ткани. Показано, что трипептид Т-31 стимулирует развитие эксплантатов подкорковых образований и миокарда молодых и старых крыс. Трипептид Т-33 стимулирует развитие эксплантатов коры головного мозга и селезенки молодых и старых животных, но ингибирует зону роста в эксплантатах миокарда Трипептид Т-34 обладает стимулирующим влиянием на эксплантаты подкорковых структур головного мозга и печени

молодых и старых животных. Трипептид Т-35 стимулирует развитие только эксплантатов печени от молодых и старых животных. Трипептид Т-36 оказывает выраженное стимулирующее влияние на развитие эксплантатов подкорковых структур головного мозга, селезенки, предстательной железы и коры головного мозга. Такое же распространенное влияние выявлено у трипептида Т-38, который стимулирует пролиферацию в эксплантатах селезенки, печени, предстательной железы и вызывает апоптоз в эксплантатах миокарда

Результаты исследования влияния данных трипептидов на органотипическую культуру тканей молодых и старых крыс создают основу для их дальнейшего изучения в качестве лекарственных средств, предназначенных для профилактики и лечения патологических процессов, в том числе ассоциированных с возрастом, в различных тканях.

Показано, что аминокислоты не обладают такой специфичностью действия на пролиферацию и апоптоз, которая наблюдается у три- и тетрапептидов

Установлено, что наибольшей тканеспецифичностью обладают тетрапептиды. Трипептиды занимают промежуточное положение между аминокислотами и тетрапептидами по степени их влияния на основные клеточные процессы Специфичность действия на клеточные процессы пролиферации и апоптоза изученных биологически активных веществ усиливается по мере усложнения их структуры.

Практическая значимость работы. Впервые получены экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что при старении уменьшается спектр аминокислот, активно действующих на пролиферативные процессы в тканях Напротив, тетрапептиды проявляют тканеспецифические свойства в отношении отдельных органов и тканей, причем как у животных молодого, так и старого возраста Трипептиды Т-31,Т-38, Т-32, Т-33, Т-34, Т-35, Т-36 также сохраняют тканеспецифические свойства в органотипической культуре ткани старых животных. Это открывает перспективы целенаправленного изучения три- и тетрапептидов для разработки лекарственных средств, предназначенных для профилактики и лечения возрастной патологии.

Положения, выносимые на защиту

1. Тетрапептиды панкраген, кардиоген и эпиталон стимулируют рост эксплантатов поджелудочной железы, миокарда, подкорковых структур головного мозга при органотипическом культивировании тканей, как молодых, так и старых животных.

2. Трипептиды стимулируют пролиферативные процессы в органотипической культуре тканей молодых и старых животных, однако не обладают той специфичностью стимулирующего действия на ткани, которой обладают тетрапептиды.

3 Аминокислоты обладают способностью стимулировать или ингибировать пролиферативные процессы в различных тканях. В тканях экто- и энтодермального генеза

аспарагиновая кислота вызывает выраженную стимуляцию клеточной пролиферации, а в тканях энтодермального генеза эта же аминокислота проявляет ингибирующую активность Пролин влияет на ткали так же, как аспарагиновая кислота, за исключением его угнетающего действия на ткани эктодермального происхождения. Аргинин обладает стимулирующей активностью во всех типах тканей.

4. Специфичность действия аминокислот, трипептидов, тетрапептидов в органотипической культуре тканей молодых и старых животных возрастает по мере усложнения структуры этих веществ: аминокислоты влияют на основные клеточные процессы в тканях экто-, мезо- и энтодермального генеза, в то время как тетрапептиды демонстрируют тканеспецифическое действие.

5. Спектр аминокислот, проявляющих активность в отношении клеточной пролиферации или апоптоза в органотипической культуре миокарда, подкорковых структур головного мозга, поджелудочной железы уменьшается в тканях от старых животных.

Связь с планом НИР. Диссертационная работа является темой, выполняемой по основному плану НИР Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 23 печатные работы: 8 статей и 15 тезисов, среди них 7 статей в журналах, включенных в перечень Высшей аттестационной комиссии Минобрнауки Российской Федерации и рекомендованных для опубликования материалов диссертационных исследований.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов, главы собственных исследований, главы обсуждения результатов, выводов и указателя литературы. Текст диссертации изложен на 124 страницах, содержит 14 таблиц, иллюстрирован 22 рисунками. Список литературы содержит 135 источников, из них отечественных - 65, зарубежных - 70.

Апробация и реализация диссертации. Материалы диссертации доложены на конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург), 2004; на конференции, посвященной 50-летию Института физиологии БАН (Минск), 2004; на International Symposium "Calcium in health and disease" (Rovaniemi), 2004; на симпозиуме «Императивы экологии человека XXI века», посвященном 100-летию со дня рождения акад. АМН СССР Д.А Бирюкова (Санкт-Петербург), 2005; на II Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Санкт-Петербург), 2005; на международном симпозиуме, посвященном 80-летию организации Института физиологии им И.П Павлова РАН «Механизмы адаптивного поведения» (Санкт-Петербург), 2005; на "Политехническом симпозиуме" (Санкт-Петербург), 2006; на Всероссийской конференции "Перспективы

фундаментальной геронтологии" (Санкт-Петербург), 2006, на First workshop on the immune response against dying tumor cells (Paris), 2006; на Мешшститутской конференции молодых ученых "Механизмы регуляции и взаимодействия физиологических систем организма человека и животных в процессах приспособления к условиям среды" (Санкт-Петербург), 2007; на V Всероссийской конференции с международным участием имени В.Н. Черниговского "Механизмы функционирования висцеральных систем" (Санкт-Петербург), 2007; на Death, Danger and Immunity (Paris), 2007; на ASDMA . XII Applied Stochastic models and data analysis (Greece, Crete), 2007. Результаты диссертации используются в научно-практической работе Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН и Института физиологии им. И П Павлова РАН.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Органотипическое культивирование тканей Органотипическое культивирование тканей проводилось по описанной ранее методике [Чалисова НИ. и соавт., 1999, 2003]. В экспериментах использовано 2300 эксплантатов коры, подкорковых структур головного мозга, миокарда, предстательной железы, печени, поджелудочной железы молодых (3-месячных) и старых (24-месячных) крыс линии Вистар. Отпрепарированные в стерильных условиях фрагменты тканей крыс разделяли на более мелкие части величиной около 1 мм. На дпо чашки Петри с коллагеновой подложкой помещали эксплантаты, заливали культуральной средой (3 мл) и вводили исследуемые пептиды или аминокислоты в различных концентрациях. Питательная среда с рН 7,2 имела состав: 35% - раствора Хенкса, 35% - среды Игла, 25% - сыворотки крови плодов коровы, глюкоза (60 мг%), инсулин (0,5 ед/мл), гентамицин (100 ед/мл). Чашки Петри помещали в термостат при температуре 37±0,1°С и через 3 сут просматривали под фазово-контрастным микроскопом Для визуализации эксплантатов применяли микротеленасадку для микроскопа (серия 10, МТН-13 "Альфа-Телеком", Россия)

Для расчета индекса площади (ИП) эксплантатов использовали программу PhotoM 1.2. Для каждого исследуемого вещества анализировали по 20-25 экспериментальных и контрольных эксплантатов. Значения ИП выражали в процентах, принимая контрольное значение за 100%. В 1-е сутки культивирования происходило распластывание эксплантатов на коллагеновой подложке, выселение пролиферирующих и мигрирующих клеток, составляющих зону роста от края эксплантата.

В структурной организации периферической зоны эксплантатов выделяется прежде всего периферическая зона роста, а также капсула эксплантата, представленная одним -двумя слоями фибробластов. С поверхности капсула покрыта мезотелием, который не образует сплошного пласта. Клетки мезотелия часто отходят друг от друга, округляются и

отрываются от базальной мембраны. В результате на месте отпавших клеток образуются обширные просветы, через которые часть клеток мигрирует за пределы эксплантата Среди мигрирующих и пролиферирующих клеток типируются глия, макрофаги, фибробласты и специализированные клетки, те. нейробласты, кардиобласты, гепатобласты в незрелых тканях и нейроциты, кардиоциты, гепатоциты - в зрелых, встречаются фигуры митозов. За счет этих клеток и формируется периферическая зона роста эксплантатов, при измерении которой определяется ИП. Через 3 сут, если в эксперименте имела место стимуляция развития зоны роста, индекс площади экспериментальных эксплантатов увеличивался по сравнению с индексом площади контрольных эксплантатов. В случае замедления или угнетения развития зоны роста индекс площади эксплантатов понижался по сравнению с контрольными значениями.

Препараты, исследованные в культуре тканей молодых и старых крыс

1. Тетрапептиды: кортаген (Ala-Glu-Asp-Pro), эпиталон (Ala-Glu-Asp-Gly), кардиоген (Ala-Glu-Asp-Arg), простамакс (Lys-Glu-Asp-Pro), ливаген (Lys-Glu-Asp-Ala), панкраген (Lys-Glu-Asp-Trp)

2. Трипептиды: Т-31 (Ala-Glu-Asp), Т-38 (Lys-Glu-Asp), Т-32 (Glu-Asp- Ala), Т-33 (Glu-Asp- Arg), Т-34 (Glu-Asp-Gly), Т-35 (Glu-Asp-Leu), Т-Зб (Glu-Asp-Рго).

3. L-аминокислоты: глицин (Gly), аланин (Ala), аспарагин (Asn), гистидин (His), лизин (Lys), серии (Ser), глутамин (Gin), аргинин (Arg), пролин (Pro), глутаминовая кислота (Glu), аспарагиновая кислота (Asp), цистеин (Cys), тирозин (Туг), валин (Val), треонин (Thr), метионин (Met), лейцин (Leu), изолейцин (Не), фенилаланин (Phe), триптофан (Тгр).

Определение эффективной концентрации пептидов и аминокислот

При раститровке каждого из пептидов и аминокислот в концентрациях 0,01, 0,05, 0,1, 0,5,1,0, 2,0,5,0,10,0,20,0,50,0,100,0, 200,0 нг/мл выявлено, что эффективные концентрации, дающие максимальный эффект стимуляции или угнетения зоны роста эксплантатов, составляли 0.05-10 нг/мл, т.е. были в диапазоне пикограммовых концентраций (10"12-10"13М). При использовании более высоких или более низких (подпороговых) концентраций либо не наблюдалось статистически достоверного эффекта стимуляции или угнетения, либо препараты не оказывали никакого действия на процессы пролиферации и ИП оставался на уровне значений ИП в контроле. В дальнейших исследованиях использовали эффективную концентрацию биологически активных веществ (0,05 нг/мл) Концентрации Ю-10 - 10~14 моль/л относятся к диапазону сверхмалых доз. Под термином "сверхмалая доза" подразумевают такую дозу вещества, которая создает концентрацию на несколько порядков ниже равновесной константы взаимодействия вещества со своим эффектором

Использование сверхмалых доз аминокислот и олигопептидов связано с тем, что в последнее двадцатилетие опубликован ряд работ о чувствительности организмов к сверхмалым концентрациям биологически активных веществ [Шевченко ИН, 2003, Чалисова Н.И и соавт, 2002, 2005].

Иммуногистохимическое исследование эксплантатов

В периферической зоне роста эксплантатов на 3-й сутки определяли экспрессию проапоптозного белка р53 и маркера пролиферации PCNA. Иммуногистохимическое исследование проводили с использованием моноклональных мышиных антител к проапоптозному белку р53 (1.75, Novocastra). В качестве вторых антител использовали универсальный набор, содержащий биотинилированиые анти-мышиные и анти-кроличьи иммуноглобулины. Визуализацию окрасок проводили с применением комплекса авидина с биотипилированной пероксидазой (ABC-kit) с последующим проявлением пероксидазы хрена диаминобензидином (все реагенты от Novocastra) Для визуализации экспрессии р53 и и PCNA использовали одноэтапный протокол для мазков с фиксацией спиртом Морфометрическое исследование проводили с использованием микроскопа Nikon Eclipse Е400, цифровой камеры Nikon DXM1200, персонального компьютера на базе Intel Pentium 4 и программного обеспечения «Видеотест-Морфология 4 0» В каждом случае измерения проводили в 10 полях зрения при увеличении 400х. Измеряли (в условных единицах) площадь экспрессии белка, которая представляла собой отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в исследуемой области, выражаемое в процентах Указанные параметры отражают интенсивность синтеза или накопления исследуемого белка

Статистическая обработка экспериментальных данных

Математическое обеспечение исследования осуществлялось в соответствии со стандартными методиками [Гланц С., 1999] с использованием параметрического метода - t-критерия Стьюдента. Статистическая обработка полученных экспериментальных данных производилась с использованием программы "Microsoft Office Excel 2003". При тестировании каждого вещества использовались 20-25 эксплантатов каждой ткани Индекс площади выражался в процентах относительно контроля. Достоверность различий в индексах площади оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Вероятность ошибки цифровых данных закладывалась в пределах 5%, что отвечает стандартам, принятым для медикобиологических исследований.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние олигопептидов и аминокислот на эксплантаты миокарда молодых и старых крыс

Полученные данные показывают, что статистически достоверная стимуляция развития эксплантатов миокарда при добавлении тетрапептидов в культуральную среду происходила только при действии кардиогена (Рис.1). Индекс площади эксплантатов миокарда молодых крыс при этом был на 24±3% (п=25, р<0,05) выше ИП контрольных эксплантатов (п=23), а ИГ1 эксплантатов миокарда старых крыс - на 21±1% (п=20, р<0,05) выше ИП в контроле (п=22). Трипептиды Т-38 и Т-33 вызывали угнетение зоны роста эксплантатов за счет развития апоптоза, как у молодых, так и у старых крыс, на 24-15% и на 15-16%, соответственно.

30% --

-30% J-

Рис. 1. Влияние пептидов кардиогена, Т-38 и Т-33 на рост эксплантатов миокарда молодых и старых крыс. Контроль - нулевая линия, по вертикали - изменение ИП в %, *р<0,05 по сравнению с индексом площади в контроле.

При исследовании аминокислот установлено, что статистически достоверная стимуляция развития эксплантатов миокарда молодых крыс происходила при введении в культуральную среду аспарагина, гистидина, лизина, серина, аргинина, глутаминовой кислоты, изолейцина в концентрации 0,05 нг/мл, при этом ИП повышался (табл. 1) на 19±2%, 31 ±5%, 46±6%, 18±2%, 29±5%, 39±6%, 19±2%, соответственно, (п=22 в каждом эксперименте, р<0,05), по сравнению с контрольными эксплантатами (п=24). Остальные аминокислоты при добавлении в культуральную среду либо не оказывали действия на зону

роста эксплантатов (ИП оставался на уровне контрольных значений), либо недостоверно стимулировали рост эксплантатов

В культуре миокарда старых крыс наблюдалась другая картина Достоверная стимуляция зоны роста эксплантатов выявлялась лишь при добавлении лизина и аргинина на 21 ±2% и 24±3% (табл. 1).

Таблица 1

Влияние аминокислот на развитие эксплантатов миокарда

Аминокислота Изменение индекса площадп, %

Молодые крысы Старые крысы

Gly - -

Ala - -

Asn +19+2 * -9±1

His +31±5 * -

Lys +46±6 * +21±2*

Ser +18±2* -

Gin - +8+1

Arg +29+5 * +24+3 *

Pro - +6±0,5

Glu +39±6* +7±0,5

Asp +6+0,5 -

Cys +9±1 -

Туг - +14+2

Val - -10±1

Thr - -

Met - -

Leu +10±1 -

Ile +19±2* -

Phe - -9+1

Trp -8+1 -8±1

Примечание. *р<0,05 по сравнению с индексом площади в контроле, «-» - уровень контроля.

Влияние олигопептидов и аминокислот на органотипическую культуру тканн подкорковых структур головного мозга молодых и старых крыс

Достоверная стимуляция развития эксплантатов подкорковых структур головного мозга молодых крыс происходила под влиянием эпиталона и Т-31 (табл. 2), когда ИП повышался на 24±3% и 20+2% (п=22 в каждом эксперименте, р<0,05), соответственно, по сравнению с ИП контрольных эксплантатов (п=28). Простамакс угнетал развитие эксплантатов подкорковых структур молодых крыс, при этом ИП уменьшался на 28+5% (п=22, р<0,05) по сравнению с контролем (п=28).

При исследовании действия пептидов в культуре подкорковых структур головного мозга старых животных достоверную стимуляцию роста вызывали эпиталон, Т-31 и Т-34. При этом ИП увеличивался на +18±2%, +19+2% и +18±2% (п=22 в каждом эксперименте, р<0,05, соответственно, по сравнению с ИП контрольных эксплантатов (п=28) (табл 2). Простамакс угнетал развитие эксплантатов подкорковых структур молодых крыс, при этом ИП уменьшался на 23+3% (п=22, р<0,05) по сравнению с контролем (п=28).

Таблица 2

Влияние пептидов на рост эксплантатов подкорковых структур молодых и старых крыс

Пептид Изменение индекса площади, %

Молодые крысы Старые крысы

Эпиталон +24+3 * +18±2 *

Т-38 +16+2 +10±1

Т-31 +20+2 * +19+2 *

Т-34 +16±2 +18±2*

Простамакс -28±5 * -23 ±3 *

Примечание. *р<0,05 по сравнению с индексом площади в контроле.

Табчица 3

Влияние аминокислот на развитие эксплантатов подкорковых структур головного мозга молодых и старых крыс

Аминокислота Изменение индекса площади, %

Молодые крысы Старые крысы

Gly -12 ±2* -

Ala - -24% + 3*

Asn - +6 +0,5

His - +11 ±2 *

Lys +15 ±2 -

Ser -7 ±0,5 -15 ±2 *

Gin +27 +4 * +36 +6 *

Arg +24 +4 * +39 ±7 *

Pro -28 ±4 * -14 ±2

Glu +37 ±6 * -

Asp +32 ±5 * +11 +2

Cys - +18+2 *

Туг -20 ±3 * -

Val +8 ±1 -

Thr -18 ±2 * +13 ±2

Met - -

Leu - +13 ±2

Ile +9+1 +26 +5 *

Phe +12 ±2 -

Trp +35 +6 * +18 ±2 *

Примечание. *р<0,05 по сравнению с индексом площади в контроле, «-» - уровень контроля.

Статистически достоверная стимуляция развития эксплантатов подкорковых структур головного мозга молодых крыс выявлялась при действии аминокислот глутамина, аргинина, глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты и триптофана (табл. 3), при этом ИП увеличивался на +27+4%, 24%±4%, 37%±6%, 32±5%, 35%±6%, соответственно, (п=22 в каждом эксперименте, р<0,05), по сравнению с контрольными эксплантатами (п=25).

Выявлено статистически достоверное ингибирование развития эксплантатов подкорковых структур головного мозга при добавлении в культуральную среду глицина, пролина, тирозина и треонина когда индекс площади экспериментальных эксплантатов снижался на 12±2%, 28±4%, 20±3%, 18±2%, соответственно. При добавлении аминокислот в культуральную среду эксплантатов подкорковых структур головного мозга старых крыс наблюдались другие явления (табл. 3). Под действием гистидина, глутамина, аргинина, цистеина, изолейцина и триптофана индекс площади экспланататов статистически достоверно увеличивался на 11±2%, 36±6%, 39±7%, 18±2%, 26±5%, 18±2%, соответственно. Достоверно ингибировали рост экспланататов только аланин и серии, при этом ИП снижался на24±3% и 15±2%, соответственно.

Влияние олигоиептидов и аминокислот на культуру ткани поджелудочной железы молодых и старых крыс

Выраженная стимуляция зоны роста эксплантатов поджелудочной железы молодых и старых крыс при действии тетрапептидов наблюдалась только под влиянием панкрагена. ИП по сравнению.с контролем увеличивался на 18±3% (п=25, р<0 05%) и на 20±3% (п=24, р<0.05), соответственно Трипептид Т-34 стимулировал развитие эксплантатов поджелудочной железы молодых крыс (ИП увеличивался на 20±3% по сравнению с контролем), и старых крыс - ИП увеличивался на 15±2% по сравнению с контролем. Достоверную стимуляцию эксплантатов поджелудочной железы молодых крыс вызывали только четыре аминокислоты - при добавлении аспарагина, пролина, треонина, лейцина ИП эксплантатов статистически достоверно увеличивался на 33±5%, 19±3%, 19±3%, 33±б%, соответственно, (п=22 в каждом эксперименте, р<0,05), по сравнению с контрольными эксплантатами (п=25). Под действием тирозина и метиопина ИП эксплантатов поджелудочной железы молодых крыс достоверно снижался на 18±3% и 24+4%, соответственно, (п=22 в каждом эксперименте, р<0,05), по сравнению с контрольными эксплантатами (п=25). При добавлении аминокислот в культуральную среду эксплантатов поджелудочной железы старых крыс обнаружено, что статистически достоверную стимуляцию роста эксплантатов вызывали только аспарагин и треонин, при добавлении этих аминокислот в культуральную среду индекс площади эксплантатов увеличивался на 20±3%,

(п=22 в каждом эксперименте, р<0,05), по сравнению с контрольными эксплантатами (п=24). Статистически достоверно угнетали рост эксплантатов лизин и глутамин - ИП достоверно снижался на 18±3% и 20±3%, соответственно, (п=22 в каждом эксперименте, р<0,05), по сравнению с контролем (п=24).

□ ИП г р53

Экспрессия маркеров р53 и PCNA в эксплантатах миокарда и поджелудочной железы

При иммуногистохимическом исследовании экспрессии проапоптозного белка р53 в зоне роста эксплантатов миокарда молодых крыс при действии кардиогена выявлено достоверное уменьшение площади экспрессии р53, которое находилось в отрицательной корреляции с увеличением зоны роста эксплантата под действием кардиогена (Рис. 2). ИП эксплантатов увеличивался на 24+3% (п=23, р<0,05) по сравнению с контролем (п=24), а площадь экспрессии белка р53 статистически достоверно снижалась на 23±1% (р<0,05).

30% т--

20%

10%

-10%

-20%

В то же время, при исследовании иммуногистохимическим методом эксплантатов поджелудочной железы молодых крыс, на развитие которых кардиоген оказывал угнетающее влияние, было обнаружено значительное увеличение площади экспрессии р53 - на 64±8% (р<0,05) (Рис. 3). Паикраген, который стимулировал зону роста эксплантатов поджелудочной железы на 18+3% (п=21, р<0,05), по сравнению с контролем (гг=20), вызывал снижение экспрессии р53 на 27±5% (р<0,05). Экспрессия РСЫА положительно коррелировала

-30%

Рис. 2. Изменение ИП и площади экспрессии р53 в эксплантатах миокарда молодых крыс под действием кардиогена. Контроль - нулевая линия, по вертикали - изменение ИП и площади экспрессии в %, *р<0,05 по сравнению с индексом площади в контроле.

с площадью экспрессии р53, что совпадает с данными других авторов [Южаков В.В. и соавт. 2002. Комашня A.B., 2005] 80%

-40%

Рис.3. Изменение индекса площади и площади экспрессии р53 в эксплантатах поджелудочной железы молодых крыс под действием панкрагена и кардиогена. Контроль -нулевая линия, по вертикали - изменение ИП и площади экспрессии в %, *р<0,05 по сравнению с индексом площади в контроле.

исследование действия пептидов и аминокислот, их составляющих, в культуре тканей различного генеза

При культивировании эксплантатов коры головного мозга (ткань эктодермального генеза) молодых крыс выявлено, что из тетрапептидов только кортаген оказывал статистически достоверное стимулирующее действие на рост эксплантатов. При его добавлении в культуральную среду индекс площади эксплантатов увеличивался на 22±4% (п=22, р<0,05), по сравнению с контрольными эксплантатами (п=24). Из трипептидов только Т-33 и Т-36 вызывали достоверную стимуляцию роста эксплантатов при их добавлении в культуральную среду, при этом ИГ1 увеличивался на 18±3% и 21±4%, соответственно. Аминокислоты лейцин и аспарагиновая кислота достоверно стимулировали рост эксплантатов коры головного мозга молодых крыс на +22±4% и 28%, соответственно (рис. 4). Остальные аминокислоты, входящие в состав этих пептидов, либо вызывали достоверное

ингибирование роста эксплантатов, либо ИП эксплантатов оставался на уровне контрольных значений.

40% ................................................................................................г..........-.............................—.......—.............--.........................................................-—...............-......-......_.....

30%

-30% -1 ..........................................................................-..................................................—................................................................-.......-.............-.......—...........

Рис.4. Влияние тетра-, трипептидов и аминокислот, их составляющих, на рост эксплантатов коры головного мозга молодых крыс. Контроль - нулевая линия, по вертикали - изменение ИП в %, *р<0.05 по сравнению с индексом площади в контроле.

При культивировании эксплантатов печени (ткань энтодермального генеза) молодых крыс выявлено, что из тетрапептидов лишь ливаген оказывал статистически достоверное стимулирующее действие на рост эксплантатов (рис. 5). При его добавлении в культуральную среду индекс площади эксплантатов увеличивался на 18±3% (п=22, р<0,05), по сравнению с контрольными эксплантатами (п=24). Трипептиды Г-38 и Т-35 вызывали достоверную стимуляцию роста эксплантатов печени при добавлении в культуральную среду, ИП увеличивался на 20±3% и 21±3%, соответственно. При добавлении в культуральную среду тех аминокислот, из которых состояли исследованные пептиды, достоверное стимулирующее влияние на рост эксплантатов печени оказывали только две аминокислоты: глутаминовая кислота и аргинин, при этом ИП увеличивался на 21±3% и 22±3%, соответственно. Три аминокислоты (аспарагиновая кислота, пролин и триптофан) оказывали статистически достоверное ингибирующее действие на зону роста эксплантатов печени, при этом ИП эксплантатов снижался на 25±4%, 19±3% и 31±6%, соответственно.

-10%

рш ^ р^

* / / / / 4

* У / ^ У

А*

Рис. 5. Влияние тетра- и трипептидов и аминокислот, их составляющих, на развитие эксплантатов печени зрелых крыс (Контроль - нулевая линия, по вертикали - изменение ИП в %, *р<0,05) по сравнению с индексом площади в контроле.

Суммарные данные о действии олигопептидов и аминокислот, их составляющих, на ИП эксплантатов различных тканей молодых крыс представлены в таблице 4. К исследованным эктодермальным тканям относились кора и подкорковые структуры головного мозга, к мезодермальным тканям —миокард и предстательная железа, к энтодермальным тканям - печень и поджелудочная железа. При анализе частоты активного действия олигопептидов и аминокислот в тканях различного генеза отчетливо видно строго специфичное действие теграпептидов только на ткани соответствующих им органов. Также прослеживается увеличение частоты действия трипептидов и, наконец, наибольшая частота активных воздействий на эксплантаты отмечается при введении в культуральную среду отдельных аминокислот.

Отчетливо проявляется преимущественно стимулирующее влияние аспарагиновой кислоты на ткани эктодермального происхождения (кора и подкорковые структуры головного мозга), в то время как в тканях энтодермального генеза (печень и поджелудочная железа) выявлялось угнетающее действие аспарагиновой кислоты за счет усиления апоптоза.

Таблица 4

Влияние олигопептидов и аминокислот на индекс площади тканей различного генеза

Исследуемое вещество Изменение индекса площади, %

Эктодермальные ткани Мезодермальные ткани Энтодермальные ткани

Кора головно-го мозга Подкорковые структуры головного мозга Миокард Предстательная железа Печень Поджелудочная железа

Кортаген +22+4 * - - - - -

Эпиталон -7 ±0,5 +24±3* - - - -

Кардиоген - - +24+3 * - - -32 +5 *

Простамакс -24 ±4 * -28±5* - +25+4* - -

Ливаген - - - - +18±3* -

Панкраген - - - - - +18±3*

Т-31 - +20±2 * +17 ±2 - - -

Т-38 - +16±2 -24 +3 * +27 ±4 * +20±3* -

Т-33 +18±3* - -15 +2 * - - -

Т-34 - +16±2 - - - +20±3*

Т-35 - - - - +21±3 * -

Т-36 +21±4* - - +24 ±3 * - -

Glu-- — _-- -+37 +6*- —+39±6 * - -+18 ±2— -+21±3 * -

Asp +28 ±5 * +32 +5 * +6±0,5 - -25 ±4 * +33±5*

Lys - +15+2 +46±6* - +16 ±2 -

Arg - +24 ±4 * +29±5 * +26 ±4 * +22±3* -

Gly -19 ±3 * -12 ±2 - -21 ±3 * -17 ±2 -

Pro -21 ±3 * -28 ±4 * - +25 +4* -19±3 * +19±3*

Leu +22±4 * - +10+1 - - +33±6 *

Trp - +35 ±6 * -8±1 - -31+6 * -

Ala - - - - - -

Примечание: «-» - уровень контроля, *р<0,05 по сравнению с индексом площади в

контроле

В таблице 4 показаны результаты действия 6 тетрапептидов, 6 трипептидов и 9 аминокислот, их составляющих, на эксплантаты 6 различных тканей (всего 126 воздействий). Из них тетрапептиды проявляли достоверную стимулирующую или угнетающую пролиферацию активность в 9 случаях. Трипептиды проявляли активность в 10 случаях, а аминокислоты в 24 случаях. Таким образом, при исследовании 6 различных тканей у всех 6 тетрапептидов была выявлена стимулирующая или угнетающая пролиферацию активность в 25% случаев, в то же время активность трипептидов была установлена в 32% случаев, а аминокислот в 53% случаев.

При анализе частоты активного действия олигопептидов и аминокислот в тканях различного генеза также отчетливо видно строго специфичное действие тетрапептидов только на ткани соответствующих им органов Также прослеживается увеличение частоты действия трипептидов и, наконец, наибольшая частота активных воздействий на эксплантаты отмечается при введении в культуральную среду отдельных аминокислот.

Результаты проведенного в данной работе исследования свидетельствуют о том, что аминокислоты по-разному влияют на процессы пролиферации и апоптоза в тканях различного генеза молодых и старых крыс В ткани миокарда молодых животных, имеющей мезодермальный генез, стимулируют клеточную пролиферацию гидрофильные аминокислоты с заряженной боковой цепью - гистидин, лизин, аргинин, глутамиповая кислота, что совпадает с данными, полученными на других мезодермальных тканях [Чалисова НИ. и др., 2006]. В ткани миокарда старых животных уменьшается количество активных аминокислот до 2 - аргинин и лизин. В ткани энтодсрмального происхождения -поджелудочной железе - лизин, гистидин, аргинин не оказывают влияния на развитие эксплантатов, и ИП остается на уровне контрольных значений Выявляется стимулирующее влияние аспарагина, пролина, треонина, лейцина на рост эксплантатов поджелудочной железы молодых крыс. У старых животных лишь 2 аминокислоты вызывают достоверную стимуляцию развития эксплантатов поджелудочной железы В подкорковых же структурах головного мозга молодых крыс (ткани эктодермального генеза) стимулирующее влияние преобладает в группе нейтральных гидрофобных аминокислот - глутамин, аргинин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, триптофан У старых животных достоверное стимулирующие влияние на развитие эксплантатов подкорковых структур головного мозга оказывают только 3 аминокислоты глутамин, аргинин и изолейцин. Таким образом, имеющийся в организме пул свободных аминокислот может одновременно оказывать влияние на пролиферацию и апоптоз в самых различных тканях и органах, с преимущественным воздействием каких-либо аминокислот на ткани разного генеза.

Иная картина наблюдается при действии тетрапептидов Результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что тетрапептиды, синтезированные из наиболее часто встречающихся в данной ткани аминокислот, обладают выраженной специфичностью в отношении соответствующих тканей крыс. В эксплантатах каждого типа ткани наблюдался эффект воздействия соответствующего этой ткани тетрапептида. Причем этот эффект был всегда стимулирующим. Уменьшение зоны роста, за счет развития процессов апоптоза, наблюдалось в двух случаях Это было при действии простамакса (тканеспецифичного для предстательной железы) на кору и подкорковые структуры головного мозга и при действии кардиогена (тканеспецифичного для миокарда) на ткань поджелудочной железы, когда

отмечалось ингибирование зоны роста эксплантатов. В проведенных нами также опытах, в которых в культуральную среду эксплантатов вводились изолированно смеси тех аминокислот, которые входили в состав тетрапептидов, стимулирующего пролиферацию эффект получено не было Видимо, биологические эффекты коротких регуляторных пептидов основываются на лиганд-рецепторных взаимодействиях или на непосредственном непосредственном проникновении пептидов в клетку [Морозов В.Г.и др., 2000].

Гораздо меньшей специфичностью обладали трипептиды. Лишь один из них, Т-35 был активен в отношении только одной ткани поджелудочной железы. Остальные трипептиды вызывали изменение клеточной пролиферации в двух типах тканей и более Так трипептиды Т-31, Т-33, Т-34 и Т-36 вызывали изменение клеточной пролиферации в эксплантатах двух различных тканей. Трипептид Т-38 был активен в отношении 4 из 6 исследованных тканей. В большинстве случаев трипептиды стимулировали клеточную пролиферацию, а угнетающее влияние отмечалось только в эксплантатах миокарда под влиянием двух трипептидов Т-38 и Т-33. Данные о высокой активности пептида Т-38 совпадают с данными авторов, наблюдавших усиление под действием пептида Т-38 экспрессии сигнальных факторов дифференцировки тимус-эпителиальных клеток (ТЭК) - протеинов Рах1, НохаЗ, ТЬЛ, синтез которых достоверно снижается в стареющих культурах ТЭК [Полякова В О, Кветной И М, 2004].

Совершенно другие явления обнаруживались при изучении влияния на тканевые эксплантаты тех аминокислот, которые входили в состав исследованных олигопептидов. Ни одна из аминокислот не обладала стимулирующей или ингибирующей пролиферацию активностью только в отношении одной ткани, как это наблюдалось при действии тетрапептидов. Алании не вызывал изменений клеточной активности ни в одной из тканей Глицин был активен уже в отношении трех тканей - коры головного мозга, предстательной железы и печени, причем во всех трех тканях наблюдалось угнетение клеточной пролиферации за счет усиления апоптоза. Глутаминовая кислота была также активна в эксплантатах трех тканей. Аминокислоты лизин, триптофан и лейцин были активны каждая в эксплантатах двух тканей. У лизина и лейцина наблюдались только стимулирующие клеточную пролиферацию влияния, а триптофан в эксплантатах печени вызывал процессы апоптоза (ткани энтодермального генеза), зато в подкорковых структурах головного мозга (ткань эктодермального генеза) оказывал стимулирующее клеточную пролиферацию влияние. На изменения клеточной пролиферации уже в четырех тканях влияли аспарагиновая кислота и аргинин. В тканях эктодермального генеза (кора и подкорковые структуры головного мозга) и поджелудочной железе (энтодермальная ткань) аспарагиновая кислота вызывала выраженную стимуляцию клеточной пролиферации, а в печени (ткань

энтодермального генеза) эта же аминокислота обладала ингибирующей пролиферацию активностью. Аргинин проявлял стимулирующую активность во всех типах тканей (экто-, мезо- и энтодермального генеза) В наибольшем числе тканей - пять из шести,- был активен нролин, который, в отличие от аспарагиновой кислоты, обладал угнетающим влиянием на ткани эктодермального генеза (кора и подкорковые структуры головного мозга) На всех представленных графиках видно, что наиболее частая активность в отношении увеличения или угнетения ИП эксплантатов сосредоточена в правой части графиков, где представлены аминокислоты. Таким образом, свободные аминокислоты, составляя постоянный пул в тканях организма, служат не только пластическим материалом для построения новых белков, но и модулируют основные клеточные процессы - пролиферацию и апоптоз. Появляются данные о том, что аминокислоты могут непосредственно участвовать в экспрессии генов, регулируя факторы инициации при трансляции мРНК

[Jefferson L.S.et al, 2001]. Однако, несмотря на некоторые различия в модулирующем действии аминокислот на ткани различного генеза, ни одна из них не проявляла той высокой тканеспецифичности, которой обладали в культуре ткапи тетрапептиды.

Трипептиды занимают между аминокислотами и тетрапептидами промежуточное положение в отношении активного воздействия на процессы пролиферации и апоптоза.

Можно полагать, что специфичность действия на пролиферацию и апоптоз всех этих биологически активных веществ усиливается по мере усложнения их структуры. Имеются данные о различном влиянии заменимых и незаменимых аминокислот на клеточную активность в период эмбрионального развития и раннего онтогенеза. Возможно, в эмбриогенезе регулирующая клеточную пролиферацию роль, кроме белковых индукторов эмбриогенеза, в большой степени принадлежит аминокислотам, которые способствуют развитию закладок тканей различного происхождения.

У трипептидов не наблюдается какой-либо закономерности при воздействии на ткани различного генеза или отдельные ткапи. И только тетрапептиды проявляли четкое тканеспецифическое влияние на пролиферативные процессы в соответствующих им тканях.

Таким образом, несмотря на возможности аминокислотного пула и трипептидов модулировать процессы клеточной пролиферации и апоптоза в различных тканях, тканеспецифические свойства обнаруживаются только у тетрапептидов, что, как полагают некоторые авторы, может быть связано с их комплементарным взаимодействием с сайт-специфическими блоками ДНК [Шатаева Л.К. и др, 2007] По данным этих авторов, полярные взаимодействия тетрапептидов с двойной спиралью ДНК определяются электростатическими взаимодействиями карбоксильных групп тетрапептида

с аминогруппами аденина и цитозина, а гидрофобные взаимодействия определяются боковыми группами пептида и метальными группами тимина.

Важным фактом, обнаруженным в данном исследовании, является то, что гораздо меньшее количество аминокислот проявляет активность в отношении клеточной пролиферации или апоптоза в эксплантатах тканей старых животных, по сравнению с эксплантатами тканей молодых животных. В тканях миокарда старых животных стимулирующее влияние сохраняется только у 2 аминокислот - лизина и аргинина, - вместо 7 стимулирующих аминокислот в миокарде молодых крыс. В эксплантатах поджелудочной железы старых животных активны 3 аминокислоты, вместо 8 активных в эксплантатах молодых крыс. В подкорковых образованиях головного мозга эти показатели составляют 5 аминокислот у старых животных и 10 - у молодых. Таким образом, количество аминокислот, проявляющих активность в отношении пролиферации и апоптоза в тканях старых животных, в 2-3 раза меньше, чем в тканях молодых. В то же время, четко выявляется стимулирующее действие тетрапептида кардиогена на эксплантаты миокарда как молодых, так и старых животных. То же самое свойство обнаруживается у панкрагена при действии на эксплантаты поджелудочной железы молодых и старых животных, и у эпиталона в отношении подкорковых структур головного мозга молодых и старых животных. Это свидетельствует о перспективности дальнейшего изучения тетрапептидов, которые оказывают активное воздействие на эксплантаты как от молодых, так и от старых животных. Учитывая тот факт, что старение сопровождается изменением экспрессии тканеспецифических генов, пептиды могут являться информационными регуляторами генетической стабильности в различных органах и тканях при старении организма

Установленное специфичное для каждой ткани действие тетрапептидов создает основу использования их для профилактики и лечения патологии различных органов и тканей. Выявление высокой тканеспецифичности тетрапептидов, по сравнению с трипептидами и аминокислотами, их составляющими, подтверждает также представления о нарастании специализации функций по мере усложнения структурной организации живой материи.

выводы

1. Тетрапептиды панкраген, кардиоген и эпиталон стимулируют рост эксплантатов поджелудочной железы, миокарда, подкорковых структур головного мозга при органотипическом культивировании тканей как молодых, так и старых животных

2. Трипептиды Т-31,Т-38, Т-32, Т-33, Т-34, Т-35, Т-36 влияют на пролиферативные процессы в органотипической культуре тканей, однако не обладают такой специфичностью действия, как тетрапептиды, стимулируя каждый развитие нескольких тканей, что происходит в эксплантатах тканей и молодых, и старых животных.

3. Аминокислоты стимулируют или ингибируют пролиферативные процессы в различньи тканях, однако не обладают, в отличие от олигопептидов, специфическим действием в отношении какой-либо одной ткани. В тканях экто- и энтодермального генеза аспарагиновая кислота вызывает выраженную стимуляцию клеточной пролиферации, а в тканях энтодермального генеза эта же аминокислота проявляет ингибирующую активность. Пролин влияет на ткани так же, как аспарагиновая кисло га, за исключением его угнетающего действия на ткани эктодермального происхождения. Аргинин обладает стимулирующей активностью во всех типах тканей.

4. При сравнительном анализе влияния тетра-, трипептидов и аминокислот, их составляющих, на развитие эксплантатов тканей различного генеза показано, что специфичность действия этих биологически активных веществ возрастает по мере усложнения структуры этих веществ: наименьшую тканеспецифическую активность демонстрируют аминокислоты, а наибольшую - тетрапептиды в эксплантатах тканей как молодых, так и старых животных

5. Спектр аминокислот, проявляющих активность в отношении клеточной пролиферации и апоптоза, значительно уменьшается в органотипической культуре тканей старых крыс по сравнению с эксплантатами тканей молодых животных. Это свидетельствует о перспективности разработки на основе олигопептидов, которые оказывают активное воздействие на эксплантаты тканей молодых и старых животных, лекарственных средств для применения в гериатрии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Установленное специфичное действие трипептидов (Т-31, Т-33, Т-34, Т-35, Т-36 и Т-38), а также тетрапептидов (кортагена, эпиталона, кардиогена, простамакса, ливагена, панкрагена) создает основу для их дальнейшего изучения в качестве лекарственньгх средств, предназначенных для профилактики и лечения патологических состояний различных органов и систем, в том числе ассоциированных с возрастом.

2. Выявленная активность 20 аминокислот в отношении клеточной пролиферации и апоптоза в тканях разного генеза создает базу для целенаправленного синтеза олигопептидов, содержащих наиболее активные для данной ткани аминокислоты.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние аминокислот и антител к рецепторам фактора роста нервов на развитие органотипической культуры лимфоидной ткани / Чалисова Н.И., Закуцкий А.Н, Анискина А.И., Полякова В О., Филиппов С В, Зезюлин ПН // Медицинский

-академический журнал. - 2006.-- Тг 6, № 3. - С -57-63.--------------

2. Влияние аминокислот и их метаболитов на развитие органотипической культуры ткани семенников крыс / Аль-Шукри С.Х., Чалисова Н.И., Закуцкий АН., Боровец С.Ю., Анискина А И // Нефрология. - 2007. - Т 11, № 2. - С. 86- 92.

3. Влияние аминокислот на клеточную пролиферацию и апоптоз в культуре ткани висцеральных органов / Чалисова Н.И., Закуцкий А.Н., Анискина А.И. // V Всероссийская конференция с международным участием имени В Н. Черниговского "Механизмы функционирования висцеральных систем" - СПб , Институт физиологии им. И.П.Павлова РАН.-2007.-С. 341-342.

4. Влияние аминокислот на клеточную пролиферацию и апоптоз в органотипической культуре тканей молодых и старых крыс / Анискина А.И., Чалисова Н И, Закуцкий А.Н., Комошня A.B., Филиппов С.В, Зезюлин П.Н. // Успехи геронтологии. - 2006. - Выл. 19. - С. 55-59

5. Влияние аминокислот на нервную и лимфоидную ткани в органотипической культуре. / Чалисова Н И., Пеннияйнен В.А., Г. Хаазе, Анискина А.И., Коновалова Ю.В., Комашня A.B. // Тез. конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины». - СПб. - 2004. - С. 52-54.

6. Влияние аминокислот на ткани различного периода онтогенетического развития в органотипической культуре / Чалисова Н И , Анискина А И , Закуцкий АН, Комашня

A.В // Механизмы адаптивного поведения. Международный симпозиум, посвященный 80-лстию организации Института физиологии им И П. Павлова (сборник тезисов). - СПб. - 2005 - С. 100-101.

7. Влияние аргинина и его метаболитов на миокард крыс в органотипической культуре ткани / Чалисова Н И, Закуцкий А.Н, Анискина А.И., Филиппов С.В, академик Ноздрачев А.Д.//Доклады академии наук. - 2007. - Т 415, №2 - С. 273-276

8. Влияние аргинина и его метаболитов на органотипическую культуру тканей молодых и старых крыс / Чалисова Н И., Закуцкий А Н , Анискина А И , Полякова В О , Филиппов С В , Зезюлин П.Н //Успехи Геронтологии -2006.-Т 20, № 1 -С 52-55.

9. Действие аминокислот на развитие культуры ткани мозжечка / Закуцкий А.Н., Анискина А.И, Чалисова Н.И // Межинститутская конференция молодых ученых: "Механизмы регуляции и взаимодействия физиологических систем организма человека и животных в процессах приспособления к условиям среды". - СПб , Институт физиологии им. И.П Павлова РАН. - 2007. - С 35.

10. Действие сверхмалых доз биологически активных веществ на нервную и лимфоидную ткани, исследование методом органотипической культуры. / Чалисова Н И , Крылов Б В , Пеннияйнен В А, Анискина А.И , Коновалова Ю В , Комашня А В. // Клиническая патофизиология - 2004. - № 1. - С. 25 - 28.

11. Исследование биологически активных веществ с ингибирующим действием в органотипической культуре нервной и лимфоидиой ткани / Чалисова Н И., Пеннияйнен

B.А., Анискина А.И., Коновалова Ю.В, Комашня А В. // Тез. докл. симпозиума «Императивы экологии человека XXI века», посвященного 100-летию со дня рождения акад. АМН СССР Д.А. Бирюкова. - 2005. - С. 59-60.

12 Модулирующая роль аминокислот в органотипической культуре коры головного мозга крыс различного возраста / Анискина А И. // "Политехнический симпозиум" - СПб, Издательство Политехнического университета. - 2006 - С. 180

13. Модулирующее влияние аминокислот на мозжечок крыс разного возраста в органотипической культуре ткани / Комашня А.В , Чалисова Н.И , Пеннияйнен В А, Анискина А И., Коновалова Ю В. // Успехи геронтологии - 2005. - вып 16. - С. 65-69.

14. Модулирующее действие аминокислот в культуре лимфоидной ткани различной степени зрелости / Чалисова Н И , Пеннияйнен В.А , Комашня А.В , Анискина А.И., Коновалова Ю.В. // Тез. II Российского симпозиума по химии и биологии пептидов - СПб. - 2005. -

C.126

15 Нейротрофическое влияние пептида семакса на рост нейритов в органотипической культуре спиномозговых ганглиев. / Комашня А.В., Чалисова Н И, Анискина А.И., Коновалова Ю В., Мясоедов Н.Ф. // Тез. докл. II Российского симпозиума по химии и биологии пептидов. - СПб. - 2005. - С. 68.

16. Стимулирующее влияние биорегуляторных пептидов на различные ткани при культивировании / Чалисова Н.И, Закуцкий А.Н., Анискина А И., Филиппов С В., Зезюлин П.Н. // Всероссийская конференция "Перспективы фундаментальной геронтологии". - 2006. - С. 153-154.

17. Тканеспецифическое влияние синтетических биорегуляторных пептидов в органотипической культуре тканей молодых и старых крыс / Закуцкий А.Н., Чалисова Н.И , Рыжак Г.А., Анискина А.И., Филиппов С В , Зезюлин П.Н // Успехи геронтологии. -2006.-Вып. 19.-С. 93-96.

18. Effect of amino acids on cell proliferation and protein p53 expression in organotypical culture of lymphoid tissue / Chalisova N I., Zakutskii A.N, Aniskina A., Haase G. // Death, Danger and Immunity. - 2007. - P. 10.

19. Effect of amino acid on cell proliferation and protein p53 expression in organotypic culture of lymphoid tissue / Chalisova N.I., Zakutskii A.N., Aniskina A.I., Haase G. // ASDMA : XII Applied Stochastic models and data analysis. - Greece, Crete. - 2007. - P 38.

20. Modulatory effect of ammo acids on spleen tissue culture of rats of various age. / N.I.Chalisova, V.A. Pennijainen, G. Haase, A.I. Aniskina, Ju.V. Konovalova, A V. Komashnya. // Тез. конференции, посвященной 50-летию Института физиологии БАН - Минск. -2004. - С. 34-35.

21 Regulatory effect of amino acids on tissue culture of rats of various age. / N.I. Chalisova, V.A. Pennijainen, A.I. Aniskina, Ju.V. Konovalova, A.V. Komashnya. // Abstract. International Symposium "Calcium in health and disease". - Rovaniemi. - 2004. - P. 40.

22. The amino acids effect on the apoptosis in the lymphoid tissue culture / Chalisova N.I., Haase G., Zakutskii A.N., Aniskina A., Filippov S. // First workshop on the immune response against dying tumor cells. - 2006. - P. 26.

АНИСКИНА Анна Игоревна ВЛИЯНИЕ ОЛИГОПЕПТИДОВ И АМИНОКИСЛОТ НА КУЛЬТУРЫ ТКАНЕЙ МОЛОДЫХ И СТАРЫХ КРЫС// Автореф. дис. канд. биол. наук: 14.00.53 - - СПб., 2008. -26с.

Подписано в печать 15 09 2008. Формат 60*84 1/16 Бумага офсетная Печать офсетная Печ л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ 93 .

Отпечатано с готового оригинал-макета. ЗАО "Принт - Экспресс" 197101, С.-Петербург, ул. Большая Монетная, 5 лит. А

Актуальность исследования

Изучение механизмов, лежащих в основе регуляции важнейших гомеостатических функций организма, представляет собой одно из приоритетных направлений современной биологии и медицины.

Поддержание биологической целостности организма на клеточном уровне регулируется сигналами, которые позволяют сохранять сложное равновесное состояние между двумя основными физиологическими процессами - пролиферацией и программируемой клеточной гибелью (апоптозом). Функцию медиаторных межклеточных сигналов на пара- и аутокринном уровнях выполняют секреторные белки - цитокины [Пальцев М.А., 1996; Ярилин А.А., 1999], а также цитомедины - пептидные биорегуляторы, поддерживающие структурный и функциональный гомеостаз клеточных популяций, которые содержат и продуцируют этот фактор [Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., 1981; Хавинсон В.Х., Морозов В.Г., Чалисова Н.И., Окулов В.Б., 1997]. На основании многочисленных экспериментальных и клинических данных стало известно, что пептидные биорегуляторы имеют большое значение в поддержании и координации различных функций организма [Морозов В.Г.и соавт., 2000; Хавинсон В.Х. и соавт., 2002; Коркушко О.В. и соавт., 2002; Рыжак Г.А., Коновалов С.С., 2004].

В Санкт-Петербургском Институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, синтезированы тетрапептиды, являющиеся аналогами цитомединов и содержащие наиболее часто встречающиеся в соответствующих тканях аминокислоты. Из начальных или концевых частей этих тетрапептидов синтезированы также трипептиды. Недавние исследования [Чалисова Н.И. с соавт., 2000, 2003, 2006] показали, что не только олигопептиды, но и сами аминокислоты обладают разными регуляторными свойствами в отношении клеточной пролиферации и апоптоза в различных тканях.

Достаточно сложно определить роль пептидов и аминокислот в регуляции клеточных популяций без учета и анализа межклеточных взаимоотношений, интегрирующих системный ответ. Помощь в решении такой задачи может дать методология комплексного морфофункционального анализа, способная объективно изучать клеточную патологию и регенерацию тканей, верифицировать пролиферативную активность и программируемую гибель клеток (апоптоз), а также оценивать деятельность клеточных структур и межклеточных коммуникаций.

Одной из наиболее адекватных моделей для изучения влияния различных препаратов на структурный и функциональный гомеостаз клеточных популяций являются органотипические культуры, которые используются для тестирования биологической активности различных препаратов [Акоев Г.Н., Чалисова Н.И., 1990; Хавинсон В.Х., Чалисова Н.И., Морозов В.Г., Малинин В.В., 1999; Хавинсон В.Х., Чалисова Н.И., Окулов В.Б., 1998; Levi-Montalchini R, 1982]. В отсутствие нервных, гуморальных и других влияний, которые имеются в целостном организме, создаются условия для строгого дозирования испытуемых веществ по типу управляемого эксперимента.

В то же время способность влиять на скорость основных клеточных процессов - пролиферацию и апоптоз, - и, как следствие, вызывать изменение количества клеток по сравнению с контролем является одним из общих свойств пептидов млекопитающих. Изменение количества клеток в культуре ткани может служить критерием первичной интегральной оценки биологической активности пептида и являться основанием для поиска других его эффектов.

Сравнительное изучение в культуре ткани действия тетра-, трипептидов и аминокислот на ткани мезо-, энто- и эктодермального происхождения, как в молодом возрасте, так и при старении, позволит более глубоко понять механизмы регулирования основных клеточных процессов в организме. При этом создается база для синтеза новых пептидных биорегуляторов с учетом их влияния на ткани организмов в молодом и старом возрасте.

Цель и задачи исследования.

Целью работы было изучение влияния тетрапептидов, трипептидов и аминокислот на развитие эксплантатов тканей мезодермального, энтодермального и эктодермального происхождения в органотипических культурах тканей молодых и старых крыс.

Для достижения цели исследования поставлены и последовательно решены следующие задачи:

1. Исследовать влияние тетрапептидов, трипептидов и 20 стандартных аминокислот на развитие эксплантатов миокарда (ткань мезодермального генеза) от молодых и старых крыс в органотипической культуре ткани.

2. Исследовать влияние тетрапептидов, трипептидов и 20 стандартных аминокислот на развитие эксплантатов подкорковых структур головного мозга (ткань эктодермального генеза) от молодых и старых крыс в органотипической культуре ткани.

3. Исследовать влияние тетрапептидов, трипептидов и 20 стандартных аминокислот на развитие эксплантатов поджелудочной железы (ткань энтодермального генеза) от молодых и старых крыс в органотипической культуре ткани.

4. Провести сравнительный анализ влияния тетрапептидов, трипептидов и аминокислот, их составляющих, на развитие эксплантатов тканей мезо-, энто- и эктодермального происхождения.

Научная новизна работы.

Впервые проведено подробное изучение действия тетрапептидов, трипептидов и 20 стандартных аминокислот в органотипических культурах тканей мезо-, энто- и эктодермального происхождения, взятых от молодых и старых животных. Впервые установлено влияние трипептидов на процессы пролиферации и апоптоза в культуре ткани. Показано, что трипептид Т-31 стимулирует развитие эксплантатов подкорковых образований и миокарда молодых и старых крыс. Трипептид Т-33 стимулирует развитие эксплантатов коры головного мозга и селезенки молодых и старых животных, но ингибирует зону роста в эксплантатах миокарда. Трипептид Т-34 обладает стимулирующим влиянием на эксплантаты подкорковых структур головного мозга и печени молодых и старых животных. Трипептид Т-3 5 стимулирует развитие только эксплантатов печени от молодых и старых животных. Трипептид Т-3 6 оказывает выраженное стимулирующее влияние на развитие эксплантатов подкорковых структур головного мозга, селезенки, предстательной железы и коры головного мозга. Такое же распространенное влияние выявлено у трипептида Т-38, который стимулирует пролиферацию в эксплантатах селезенки, печени, предстательной железы и вызывает апоптоз в эксплантатах миокарда.

Результаты исследования влияния данных трипептидов на органотипическую культуру тканей молодых и старых крыс создают основу для их дальнейшего изучения в качестве лекарственных средств, предназначенных для профилактики и лечения патологических процессов, в том числе ассоциированных с возрастом, в различных тканях.

Показано, что аминокислоты не обладают такой специфичностью действия на пролиферацию и апоптоз, которая наблюдается у три- и тетрапептидов.

Установлено, что наибольшей тканеспецифичностью обладают тетрапептиды. Трипептиды занимают промежуточное положение между аминокислотами и тетрапептидами по степени их влияния на основные клеточные процессы. Специфичность действия на клеточные процессы пролиферации и апоптоза изученных биологически активных веществ усиливается по мере усложнения их структуры.

Практическая значимость работы

Впервые получены экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что при старении уменьшается спектр аминокислот, активно действующих на пролиферативные процессы в тканях. Напротив, тетрапептиды проявляют тканеспецифические свойства в отношении отдельных органов и тканей, причем как у животных молодого, так и старого возраста. Трипептиды Т-31,Т-38, Т-32, Т-33, Т-34, Т-35, Т-36 также сохраняют тканеспецифические свойства в органотипической культуре ткани старых животных. Это открывает перспективы целенаправленного изучения три- и тетрапептидов для разработки лекарственных средств, предназначенных для профилактики и лечения возрастной патологии.

Положения, выносимые на защиту.

1. Тетрапептиды панкраген, кардиоген и эпиталон стимулируют рост эксплантатов поджелудочной железы, миокарда, подкорковых структур головного мозга при органотипическом культивировании тканей, как молодых, так и старых животных.

2. Трипептиды стимулируют пролиферативные процессы в органотипической культуре тканей молодых и старых животных, однако не обладают той специфичностью стимулирующего действия на ткани, которой обладают тетрапептиды.

3. Аминокислоты обладают способностью стимулировать или ингибировать пролиферативные процессы в различных тканях. В тканях экто- и мезодермального генеза аспарагиновая кислота вызывает выраженную стимуляцию клеточной пролиферации, а в тканях энтодермального генеза эта же аминокислота проявляет ингибирующую активность. Пролин влияет на ткани так же, как аспарагиновая кислота, за исключением его угнетающего действия на ткани эктодермального происхождения. Аргинин обладает стимулирующей активностью во всех типах тканей.

4. Специфичность действия аминокислот, трипептидов, тетрапептидов в органотипической культуре тканей молодых и старых животных возрастает по мере усложнения структуры этих веществ: аминокислоты влияют на основные клеточные процессы в тканях экто-, мезо- и энтодермального генеза, в то время как тетрапептиды демонстрируют тканеспецифическое действие.

5. Спектр аминокислот, проявляющих активность в отношении клеточной пролиферации или апоптоза в органотипической культуре миокарда, подкорковых структур головного мозга, поджелудочной железы уменьшается в тканях от старых животных.

Связь с планом НИР.

Диссертационная работа является темой, выполняемой по основному плану НИР Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 22 печатные работы: 8 статей и 14 тезисов, среди них 7 статей в журналах, включенных в перечень Высшей аттестационной комиссии Минобрнауки Российской Федерации и рекомендованных для опубликования материалов диссертационных исследований.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов, главы собственных исследований, главы обсуждения результатов, выводов и указателя литературы. Текст диссертации изложен на 124 страницах, содержит 14 таблиц, иллюстрирован 22 рисунками. Список литературы содержит 135 источников, из них отечественных - 65, зарубежных — 70.

выводы

1. Тетрапептиды панкраген, кардиоген и эпиталон стимулируют рост эксплантатов поджелудочной железы, миокарда, подкорковых структур головного мозга при органотипическом культивировании, как у молодых, так и старых животных.

2. Трипептиды Т-31,Т-38, Т-32, Т-33, Т-34, Т-35, Т-36 влияют на пролиферативные процессы в органотипической культуре тканей, однако не обладают такой специфичностью действия, как тетрапептиды, стимулируя каждый развитие нескольких тканей, что происходит в эксплантатах и от молодых, и от старых животных.

3. Аминокислоты обладают способностью стимулировать или ингибировать пролиферативные процессы в различных тканях, однако не обладают, в отличие от олигопептидов, специфическим действием в отношении какой-либо одной ткани. В тканях экто- и мезодермального генеза аспарагиновая кислота вызывает выраженную стимуляцию клеточной пролиферации, а в тканях энтодермального генеза эта же аминокислота проявляет ингибирующую активность. Пролин влияет на ткани так же, как аспарагиновая кислота, за исключением его угнетающего действия на ткани эктодермального происхождения. Аргинин обладает стимулирующей активностью во всех типах тканей.

4. При сравнительном анализе влияния тетра-, трипептидов и аминокислот, их составляющих, на развитие эксплантатов тканей различного генеза показано, что специфичность действия этих биологически активных веществ возрастает по мере усложнения структуры этих веществ, т.е. наименьшую специфичность демонстрируют аминокислоты, а наибольшую - тетрапептиды, как у молодых, так и старых животных.

5. Спектр аминокислот, проявляющих активность в отношении клеточной пролиферации и апоптоза, значительно уменьшается в органотипической культуре тканей старых крыс, по сравнению с эксплантатами тканей молодых крыс. Это свидетельствует о перспективности применения в гериатрии олигопептидов, которые оказывают активное воздействие на эксплантаты как от молодых, так и от старых животных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Установленное специфичное действие синтезированных трипептидов (Т-31, Т-33, Т-34, Т-35, Т-36 и Т-38), а также тетрапептидов (кортагена, эпиталона, кардиогена, простамакса, ливагена, панкрагена) создает основу для их дальнейшего изучения в качестве лекарственных средств, предназначенных для профилактики и лечения патологических состояний различных органов и систем, в том числе ассоциированных с возрастом.

2. Выявленная активность 20 аминокислот в отношении клеточной пролиферации и апоптоза в тканях разного генеза создает базу для целенаправленного синтеза олигопептидов, влияющих на процессы развития различных тканей.