Автореферат и диссертация по медицине (14.01.30) на тему:Влияние аминокислот, природных и синтетических пептидов на культуру ткани кожи молодых и старых крыс

На правах рукописи

ВОЙЦЕХОВСКАЯ Марина Александровна

ВЛИЯНИЕ АМИНОКИСЛОТ, ПРИРОДНЫХ И СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ НА КУЛЬТУРУ ТКАНИ КОЖИ МОЛОДЫХ И СТАРЫХ КРЫС

14.01.30 - геронтология и гериатрия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

-1 ДЕК 2011

Санкт-Петербург - 2011

005004455

Работа выполнена в лаборатории возрастной клинической патологии Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН

Научные руководители:

заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Рыжак Галина Анатольевна

доктор биологических наук, профессор Чалисова Наталья Иосифовна

Официальные оппоненты:

заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Кветной Игорь Моисеевич

доктор медицинских наук, профессор Смирнова Ирина Олеговна

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития РФ

Защита диссертации состоится «12» декабря 2011 г. в 12.00 часов на заседании Диссертационного Совета Д 601.001.01 в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН по адресу: 197119, Санкт-Петербург, пр. Динамо, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.

Автореферат разослан «11» ноября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор Козина Л.С.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Прогрессирующее увеличение доли пожилых и старых людей в общей численности населения вместе с сокращением рождаемости в последнее время становится всё более актуальной медицинской, социальной и экономической проблемой развитых стран [Анисимов В.Н., 2007]. Одними из первых проявлений процесса старения являются дегенеративные изменения в коже, которая, выполняя барьерную функции, подвергается не только возрастным изменениям, но и испытывает локальный стресс, обусловленный повреждающими факторами внешней среды. В результате запущенной программы старения в клетках кожи (как и в клетках всего организма) неотвратимо происходят существенные изменения: уменьшается их митотическая активность, постепенно нарушаются синтетические процессы, накапливаются модифицированные белки, происходит повреждение мембран клеток, ДНК и ферментов. В организме поддержание биологической целостности регулируется на клеточном уровне сигналами, которые позволяют сохранять равновесное состояние между основными физиологическими процессами - пролиферацией и апоптозом. Многие пептиды принимают участие в сигнальной трансдукции между различными типами клеток. Кроме того, биорегуляторные пептиды, содержащиеся практически во всех тканях организма, выполняют не только сигнальную роль, но и непосредственно участвуют в регуляции физиологических процессов, начиная от отдельных функций специализированных клеток и заканчивая сложными поведенческими актами [Хавинсон В.Х. и др., 2002]. Биорегуляторные пептиды впервые были выделены В.Г.Морозовым и В.Х. Хавинсоном в 1971 г. из гипоталамической области мозга и тимуса [Хавинсон В.Х., Морозов В.Г., 1982; Морозов В.Г. и др., 2000; Коркушко О.В. и др., 2002; Хавинсон В.Х. и др., 2002; Рыжак Г.А. и др., 2004]. Затем в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии были синтезированы новые ди-, три- и тетрапептиды, являющиеся аналогами эндогенных пептидных биорегуляторов и содержащие наиболее часто встречающиеся в соответствующих тканях аминокислоты. Недавние исследования [Чалисова Н.И. и др., 2000, 2003, 2006] показали, что не только короткие пептиды, но и сами аминокислоты обладают некоторыми регуляторными свойствами в отношении клеточной пролиферации и апоптоза в различных тканях.

Несмотря на наличие большого количества методов воздействия на стареющую кожу, поиск эффективных физиологических методов и средств профилактики и коррекции возрастных изменений кожи, не оказывающих нежелательного побочного действия, остается актуальной проблемой современной медицины. До последнего времени в медицинской косметологии при коррекции возрастных изменений кожи не принимались во внимание процессы, происходящие на клеточном уровне. Одной из наиболее адекватных моделей для изучения влияния различных препаратов

на структуру и функцию клеток являются органотипические культуры [Калюнов В.П., 1986; Чалисова Н.И. и др., 1998,2006]. Изменение количества клеток в культуре ткани под воздействием различных веществ служит критерием первичной интегральной оценки биологической активности вещества. Поэтому сравнительное изучение действия природных и синтетических пептидов и аминокислот в культуре ткани кожи, как у молодых, так и у старых животных, позволит выяснить некоторые механизмы регулирования клеточных процессов в коже, а также создать базу для синтеза новых пептидных биорегуляторов для гериатрической практики и геронтокосметологии.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы было исследование действия природных полипептидов, выделенных из различных тканей, а также синтезированных коротких пептидов и аминокислот на развитие органотипической культуры фрагментов ткани кожи от молодых и старых крыс.

Для достижения цели исследования поставлены и последовательно решены следующие задачи:

1. Исследовать влияние 20 стандартных аминокислот на клеточную пролиферацию в эксплантатах кожи от молодых и старых крыс в органотипической культуре ткани.

2. Исследовать влияние синтезированных ди-, три- и тетрапептидов на развитие эксплантатов кожи от молодых и старых крыс в органотипической культуре ткани.

3. Исследовать действие полипептидов, выделенных из тканей хряща, яичников, тимуса, сосудов, мышц, на клеточную пролиферацию в эксплантатах кожи от молодых и старых крыс в органотипической культуре ткани.

4. Исследовать влияние стандартных аминокислот, полипептидов и коротких пептидов на развитие процессов пролиферации и апоптоза в органотипической культуре кожи от молодых и старых крыс.

Научная новизна работы

Впервые проведено изучение действия 20 стандартных аминокислот, полипептидов, выделенных из различных тканей, и коротких пептидов в органотипических культурах тканей кожи, взятых от молодых и старых животных. Впервые установлено стимулирующее влияние аминокислот пролина, лизина, глутаминовой кислоты, аргинина, триптофана и тирозина на процессы пролиферации в культуре ткани кожи от молодых животных и всего 3 аминокислот (тирозина, изолейцина, триптофана) - в эксплантатах кожи от старых животных. Напротив, в культуре ткани кожи от старых животных 7 аминокислот - глицин, лизин, пролин, глутаминовая и аспарагиновая кислоты, аргинин и валин - вызывали выраженный апоптоз.

Впервые установлено стимулирующее влияние полипептидов, выделенных из тканей хряща, яичников, тимуса, сосудов, мышц, на клеточную пролиферацию в эксплантатах кожи от молодых и старых крыс в органотипической культуре ткани. Впервые установлено, что эффективными

в отношении стимуляции пролиферации эксплантатов кожи от молодых животных были дипептиды АВ-17 и АВ-А, а также трипептиды Т-32, Т-33, Т-36, Т-38, а эксплантатов кожи от старых крыс - только трипептид Т-38 и дипептиды АВ-17 и АВ-А. Впервые установлено, что тетрапептиды кортаген, эпиталон, кардиоген, ливаген, простамакс стимулируют развитие эксплантатов кожи молодых крыс, а в эксплантатах кожи старых крыс активным в отношении пролиферации является только простамакс.

Впервые проведено иммуноцитохимическое исследование эксплантатов кожи и выявлено уменьшение развития процессов апоптоза при стимуляции пролиферации под влиянием вышеуказанных препаратов. При этом показано, что увеличение индекса площади эксплантатов кожи находится в положительной корреляции с увеличением площади экспрессии маркера пролиферации РСЫА и в отрицательной корреляции с уменьшением площади экспрессии проапоптозного белка р53.

Практическая значимость работы

Впервые получены экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что при старении уменьшается спектр аминокислот, активно действующих на пролиферативные процессы в коже. Напротив, полипептиды, выделенные из различных тканей, и короткие пептиды проявляют стимулирующие пролиферацию свойства в отношении кожи у животных как молодого, так и старого возраста. Выявленное стимулирующее действие природных и синтезированных пептидов на кожу создает основу для их дальнейшего изучения в качестве средств, предназначенных для коррекции возрастных изменений кожи. Установленное стимулирующее действие коротких пептидов в отношении клеточной пролиферации в тканях кожи создает базу для целенаправленного синтеза коротких пептидов, предназначенных для использования в геронтокосметологии и в гериатрической практике.

Положения, выносимые на защиту

1. Аминокислоты - пролин, лизин, глугаминовая кислота, аргинин, триптофан и тирозин обладают способностью стимулировать пролиферативные процессы в ткани кожи молодых крыс. В ткани кожи от старых животных только 3 аминокислоты - тирозин, изолейцин, триптофан -проявляют активность в отношении клеточной пролиферации.

2. Дипептиды АВ-17 и АВ-А стимулируют пролиферацию в эксплантатах кожи молодых и старых крыс. В органотипической культуре кожи молодых животных пролиферативные процессы стимулируют трипептиды Т-32, Т-33, Т-36, Т-38, в органотипической культуре кожи старых животных - только трипептид Т-38.

3. Тетрапептиды кортаген, эпиталон, кардиоген, ливаген, простамакс, панкраген стимулируют развитие эксплантатов кожи молодых крыс, а в органотипической культуре кожи старых крыс активным в отношении пролиферации является только тетрапептид простамакс.

4. Полипептиды, экстрагированные из тканей хряща, яичников, тимуса, сосудов, мышц, стимулируют клеточную пролиферацию в эксплантатах кожи как молодых, так и старых животных.

5. Площадь экспрессии маркера пролиферации PCNA находится в положительной, а площадь экспрессии проапоптозного белка р53 - в отрицательной корреляции с изменением индекса площади эксплантатов в органотипической культуре кожи молодых и старых крыс в присутствии аминокислот, дипептидов, трипептидов, тетрапептидов и полипептидов, экстрагированных из тканей хряща, яичников, тимуса, сосудов, мышц.

6. Полипептиды, экстрагированные из тканей хряща, яичников, тимуса, сосудов, мышц, тетрапептид простамакс, трипептид Т-38, дипептиды АВ-17 и АВ-А являются перспективными веществами для создания средств, предназначенных для коррекции возрастных изменений кожи.

Связь с планом НИР

Диссертационная работа выполнена в рамках основного плана НИР Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 7 статей, включая 5 статей в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Минобрнауки Российской Федерации для опубликования материалов диссертационных исследований.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора- литературы, главы с описанием материалов и методов, главы собственных исследований, главы обсуждения результатов, выводов и указателя литературы. Текст диссертации изложен на 110 страницах, содержит б таблиц, иллюстрирован 28 рисунками. Список литературы содержит 158 источников, из них 94 отечественных и 64 зарубежных авторов.

Апробация и реализация диссертации

Материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых, посвященной 85-летию со дня основания Института физиологии им. И.П. Павлова РАН (Санкт-Петербург - Колтуши, 2010), I всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Сибирский медико-биологический конгресс» (Барнаул, 2011), VI международном научном конгрессе валеологов «Здоровье человека» (Санкт-Петербург, 2011), юбилейной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы геронтологии и гериатрии» (Санкт-Петербург, 2011), XVI международной научно-практической конференции "Пожилой больной. Качество жизни" (Москва, 2011), Всероссийской молодежной конференции-школы «Нейробиология интегративных функций мозга» (Санкт-Петербург, 2011), 4 Всероссийской с международным участием научной конференции «Метромед-2011» (Санкт-Петербург, 2011).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Органотипические культуры тканей являются удобным объектом для тестирования биологически активных веществ, так как в них отсутствуют нервные, гуморальные и другие воздействия на исследуемые клетки. Органотипическое культивирование тканей проводилось по описанной ранее методике [Чалисова Н.И. и др., 1999; 2003].

Состав питательной среды

Для успешного развития ткани вне организма необходимо подобрать адекватную питательную среду. Используемая культуральная среда (рН 7,2) содержала 35 % раствора Хенкса, 35 % среды Игла, 25% фетальной сыворотки теленка, глюкозу (0,6%), гентамицин (100 ЕД/мл).

Получение коллагена и коллагеновой подложки

Коллаген широко применяется в качестве биологического субстрата, на котором растет и развивается культивируемая ткань. Для поставленных задач использовали коллаген, полученный из сухожилий хвостов крыс по методу Бернстайна.

Хвост помещали в чашку Петри со спиртом и выдерживали при температуре минус 10°С в течение не менее 15 минут, затем освобождали от кожи и при помощи двух зажимов разламывали на кусочки (по 1-1,5 см от кончика к центральной части), затем из него вытягивали сухожильные нити. Эти нити помещали в чашку Петри со стерильной дистиллированной водой и расщепляли на отдельные волокна при помощи тонких пинцетов. Затем волокна опускали в колбу, наполненную 150 мл 0,1% раствора ледяной уксусной кислоты, и оставляли в холодильнике на 48 часов. Затем содержимое колбы центрифугировали в течение 1 часа при скорости 6000 об/мин, получали до 80 мл вязкого раствора. К остатку добавляли 30 мл раствора уксусной кислоты, через 24 часа снова центрифугировали и в результате получали до 40 мл раствора коллагена. Приготовленный таким способом коллаген может храниться в холодильнике до года. Перед использованием коллаген подвергали диализу и испытывали на стерильность. Диализированный коллаген наносили на обезжиренную пластиковую поверхность чашки Петри (d=40 мм). Через 1 час коллаген сливали, и поверхность высыхала на воздухе при комнатной температуре. Коллаген на дне чашки Петри образует тонкую пленку. Перед использованием поверхность несколько раз промывали раствором Хенкса.

Выделение тканей

В работе использовали органотипические культуры кожи с нижней части живота молодых (3-месячных) и старых (24-месячных) крыс линии Вистар, всего 2500 эксплантатов.

Для взятия материала и его препаровки использовали набор инструментов для микрохирургии глаза. Ткани извлекали в стерильных условиях, разделяли на фрагменты величиной около 1 мм3 и затем 20-25

таких фрагментов помещали на дно чашки Петри, предварительно покрытое коллагеновой пленкой, на расстоянии 3 мм друг от друга. Для того, чтобы эксплантаты прикрепились к коллагеновой подложке, герметично закрытые чашки Петри помещали в термостат при температуре 37±0,1°С на 30 минут.

Далее чашки Петри с прикрепленными эксплантатами заливали 3 мл питательной среды. В культуральную среду добавляли исследуемые пептиды и аминокислоты в различных концентрациях. Затем чашки помещали в термостат. Культивирование эксплантатов тканей осуществляли при температуре 37±0,1°С и в присутствии 5% С02в течение 3 суток.

Контрольными считали эксплантаты, культивируемые только в условиях питательной среды того же состава, без добавления пептидов или аминокислот.

Морфологические и морфометрические методы исследования развития эксплантатов в органотипической культуре тканей

Рост эксплантатов ткани в органотипической культуре исследовали прижизненно с помощью фазово-контрастного микроскопа через 3 суток после начала культивирования.

В 1-е сутки культивирования происходило распластывание эксплантатов на коллагеновой подложке, выселение пролиферирующих и мигрирующих клеток, составляющих зону роста от края эксплантата. В структурной организации периферической зоны эксплантатов выделяется прежде всего периферическая зона роста, а также капсула эксплантата, представленная 1-2 слоями фибробластов [Чалисова Н.И. и др., 2002,2005].

С поверхности капсула покрыта мезотелием, который не образует сплошного пласта. Клетки мезотелия часто отходят друг от друга, округляются и отрываются от базальной мембраны. В результате на месте отпавших клеток образуются обширные просветы, через которые часть клеток мигрирует за пределы эксплантата. Среди мигрирующих и пролиферирующих клеток типируются макрофаги, фибробласты, встречаются фигуры митозов. За счет этих клеток и формируется периферическая зона роста эксплантатов, при измерении которой определялся индекс площади (ИП). Через 3 сут, если в эксперименте имела место стимуляция развития зоны роста, индекс площади экспериментальных эксплантатов увеличивался по сравнению с индексом площади контрольных эксплантатов. В случае замедления или угнетения развития зоны роста индекс площади эксплантатов понижался по сравнению с контрольными эксплантатами.

Для визуализации эксплантатов использовали микротеленасадку для микроскопа (серия 10, МТН-13 «Альфа-Телеком», Россия). Количественную оценку роста эксплантатов осуществляли с помощью пакета программ РЬоЮМ 1.2.

Для количественной оценки влияния тестируемых веществ на развитие эксплантатов применяли морфометрический метод. Учитывая неоднородность морфологической картины эксплантатов, с целью

унификации конечных показателей использовали относительный критерий -индекс площади (ИП).

ИП в процентах рассчитывали по формуле как отношение площади всего эксплантата, включая периферическую зону роста (Ц+ЗР), к площади центральной зоны (Ц):

За условную единицу площади принимали квадрат окуляр-сетки микроскопа. Сторона квадрата при увеличении 3.5x10 равнялась 150 мкм.

Значения ИП выражали в процентах по сравнению с ИП контрольных эксплантатов, который принимали за 100%.

Достоверность различий сравниваемых средних значений ИП контрольных и экспериментальных образцов оценивали с помощью t-критерия Стьюдента

Статистическую обработку полученных данных производили с использованием пакета программ «Microsoft Excell».

Препараты, исследованные в культуре ткани

Аминокислоты. В работе использовали 20 стандартных L-аминокислот производства «Sigma» (США).

Короткие пептиды. В органотипических культурах исследовали ди-, три- и тетрапептиды, синтезированные в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии. Характеристика пептидов представлена в таблице 1.

Таблица I

Характеристика исследуемых коротких пептидов_

№№ пп. Условное наименование Химическая формула Молекулярная масса

Дипептиды

1. вилон Lys-Glu 275,30

2 АВ-17 Lys(H-Glu-OH) 275,30

3 АВ-А Lys-Gin 274,32

Т рипептиды

1. Т-32 Glu-Asp-Ala 382,67

2. Т-33 Glu-Asp- Arg 418,40

3. Т-36 Glu-Asp-Pro 359,33

4. Т-38 Lys-Glu-Asp 390,39

Тетрапептиды

1. кортаген Ala -Glu-Asp- Pro 430,41

2. эпиталон Ala-Glu-Asp- Gly 390,35

3. кардиоген Ala -Glu-Asp-Arg 489,48

4. ливаген Lys-Glu-Asp- Ala 461,48

5. простамакс Lys-Glu-Asp- Pro 487,51

6. панкраген Lys-Glu-Asp-Trp 575,62

Природные полипептиды

Использованы полипептиды, выделенные из тканей вилочковой железы (тималин), из хрящевой ткани (хондролюкс), из тканей яичников, сосудов, мышц.

Тималин® - лекарственный препарат, получаемый методом экстрагирования из тканей вилочковой железы, является иммуномодулятором.

Хондролюкс® получен по технологии, защищенной патентом РФ № 2302872 от 20.07.07 «Средство, нормализующее функции хрящевой ткани, и способ его получения».

Хондролюкс - препарат полипептидной природы, получаемый путем экстракции из хрящей крупного рогатого скота не старше 12-месячного возраста. В состав Хондролюкса входят полипептиды с молекулярной массой от 75 до 846 Да. В медицинской практике используется в виде прозрачного бесцветного раствора для инъекций в ампулах и представляет собой прозрачный раствор рН 5,6-6,6, содержащий пептиды в количестве 0,25% (5 мг) и глицин в количестве 18-22 мг в ампуле, а также в виде таблеток, содержащих 50 мг активной субстанции.

Экстракт из яичников получен по технологии, защищенной патентом РФ № 2303454 от 27.07.2007 «Средство, нормализующее репродуктивную функцию у женщин, и способ его получения». В состав препарата, выделенного из яичников телят, входят полипептиды с молекулярной массой от 70 до 712 Да.

Экстракт из сосудов получен по технологии, защищенной патентом РФ № 2301072 от 20.06.2007 «Средство, нормализующее функции кровеносных сосудов, и способ его получения». В состав препарата, выделенного из аорты телят, входят полипептиды с молекулярной массой от 72 до 678 Да.

Экстракт из мышц получен по аналогичной технологии. В состав препарата, выделенного из трехглавой мышцы телят, входят полипептиды с молекулярной массой от 75 до 783 Да.

Определение эффективной концентрации аминокислот и пептидов в органотипической культуре ткани

При раститровке каждого из коротких пептидов и аминокислот в концентрациях 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0, 10,0, 20,0, 50,0, 100,0, 200,0 нг/мл выявлено, что эффективные концентрации, дающие максимальный эффект стимуляции или угнетения зоны роста эксплантатов, составляли 0,0510,0 нг/мл, т.е. были в диапазоне пикограммовых концентраций (50 пг/мл, или 10~" - 10~12 М). При раститровке природных полипептидов установлено, что эффективной концентрацией является 20 нг/мл. При использовании более высоких или более низких (подпороговых) концентраций либо не наблюдалось статистически достоверного эффекта стимуляции или

угнетения, либо аминокислоты и пептиды не оказывали никакого действия, и значения ИП оставались на уровне значений ИП в контроле.

Под термином «сверхмалая доза» подразумевают такую дозу вещества, которая создает концентрацию на несколько порядков ниже равновесной константы взаимодействия вещества со своим эффектором. Использование сверхмалых доз аминокислот и пептидов связано с тем, что в последнее двадцатилетие опубликован ряд работ о чувствительности тканей организма к сверхмалым концентрациям биологически активных веществ [Чалисова Н.И. и др., 2002, 2005; Шевченко И.Н., 2003].

Иммуноцитохимические методы исследования эксплантатов

В периферической зоне роста на 3-й сутки определяли экспрессию проапоптозного белка р53 и маркера пролиферации PCNA. Иммуноцитохимическое исследование проводили с использованием моноклональных мышиных антител к проапоптозному белку р53 и маркеру PCNA (1:75, Novocastra). В качестве вторичных антител использовали универсальный набор, содержащий биотинилированные анти-мышиные и анти-кроличьи иммуноглобулины. Визуализацию окрасок проводили с применением комплекса авидина с биотинилированной пероксидазой (ABCkit) с последующим проявлением пероксидазы хрена диаминобензидином (все реагенты от Novocastra). Для визуализации экспрессии маркеров р53 и PCNA использовали стандартный одноэтапный протокол для мазков с фиксацией спиртом [Кветной И.М., Пальцев М.А., 2006].

Морфометрические исследования и компьютерный анализ микроскопических изображений

После иммуноцитохимической окраски морфометрическое исследование проводили с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений, состоящей из микроскопа Nikon Eclipse Е400, цифровой камеры Nikon DXM1200, персонального компьютера на базе Intel Pentium 4 и программного обеспечения «Видеотест-Морфология 4.0». В каждом случае анализировали как минимум 10 полей зрения при увеличении х400. Определяли площадь экспрессии р53 и PCNA, которая представляла собой отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения, выражаемое в процентах. Указанные параметры отражают интенсивность синтеза или накопления исследуемых маркеров. Результаты исследований обрабатывали с помощью компьютерных программ EXCEL и STATISTICA 5.0 (Statsoft). Для оценки межгрупповых различий (сравнения средних контрольных и экспериментальных значений) применяли t-критерий Стьюдента.

Статистическая обработка экспериментальных данных

Математическое обеспечение исследования осуществлялось в соответствии со стандартными методиками, принятыми для обработки результатов медико-биологических исследований [Гланц С., 1999; Григорьев

С.Г. и др., 2002] с использованием параметрического метода - t-критерия Стьюдента. Статистическую обработку полученных экспериментальных данных производили с использованием программы "Microsoft Office Excel 2003". При тестировании каждого вещества использовали 20-25 эксплантатов ткани. Индекс площади выражали в процентах относительно контроля. Достоверность различий в индексах площади оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Вероятность ошибки цифровых данных закладывалась в пределах 5%, что отвечает стандартам, принятым для медико-биологических исследований.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Влияние аминокислот на культуру ткани кожи молодых и старых крыс

При раститровке аминокислот от 0,01 до 100 нг/мл было показано, что аминокислоты обладают максимальной стимулирующей пролиферацию активностью при концентрации 0,05 нг/мл, эта концентрация была принята как эффективная.

Таблица I

Влияние аминокислот на развитие эксплантатов кожи _молодых и старых крыс_

Аминокислота Изменение ИП (% по отношению к контролю)

молодые крысы старые крысы

Gly +2+1 -28±6*

Ala -3+1 +5+1

Asn +13±3 + 11+5

His +12+5 +5±1

Lys +30+5* -24±3*

Ser +4±3 -7+3

Gin +±3 -12±3

Arg +30±7* -34±7*

Pro +21+3* -21±3*

Glu +29±5* -29±6*

Asp + 15+2 -21+2*

Cys -3±1 +5±2

Туг +16±3* +18+2*

Val 4+1 -28±5*

Thr -2+1 -4+2

Met +6+1 -5+2

Leu +5±1 -34+9*

Ile +8±2 +24±2*

Phe +5±1 +4+2

Trp 30±5* +23±3*

* р<0,05 по сравнению с ИП контрольных эксплантатов.

В таблице I представлены данные о влиянии аминокислот на ИП экспериментальных эксплантатов по сравнению с ИП контрольных эксплантатов. Показано, что в культуре ткани кожи молодых крыс стимулирующее клеточную пролиферацию действие выявляется у 6 аминокислот. Так, при введении в культурапьную среду глутаминовой кислоты ИП увеличивался на 29+5% (п=24, р<0,05) по сравнению с контролем (п=22); при действии лизина ИП увеличивался на 30±7% (п=22, р<0,05) по сравнению с контролем (п=21); под влиянием аргинина ИП увеличивался на 30±5% (п=25, р<0,05) по сравнению с контролем (п=23); при действии пролина ИП увеличивался на 21 ±5% (п=21, р<0,05); по сравнению с контролем (п=24); при действии триптофана ИП увеличивался на 30+4% (п=20, р<0,05) по сравнению с контролем (п=23) и при действии тирозина ИП увеличивался на 16±3% (п=21, р<0,05) по сравнению с контролем (п=24).

При действии этих же аминокислот на эксплантаты кожи от старых крыс не наблюдалось усиления клеточной пролиферации, однако она происходила под влиянием гидрофобных аминокислот - тирозина, изолейцина, триптофана (рис. 1), при этом происходило увеличение ИП в среднем на 1823%, по сравнению с ИП контрольных эксплантатов. В эксплантатах кожи от старых животных выявлялось выраженное ингибирующее воздействие на клеточную пролиферацию у 7 аминокислот - ИП статистически достоверно уменьшался в среднем на 21-34% по сравнению с контролем. Таким образом, в основном аминокислоты вызывают в коже старых крыс апоптоз, а в коже молодых крыс - стимуляцию клеточной пролиферации.

а б

Рис. 1. Прижизненные фотографии эксплантатов кожи в органотипической культуре ткани старых крыс на 3-й день культивирования, а - контроль, б — добавление в питательную среду триптофана (0,05 нг/мл). Ув. х70.

Исследование процессов пролиферации и апоптоза при действии аминокислот в эксплантатах кожи молодых и старых крыс

При иммуноцитохимическом исследовании экспрессии маркера пролиферации РСЫА и проапоптозного белка р53 в зоне роста эксплантатов кожи крыс при действии стимулирующих пролиферацию аминокислот выявлено достоверное увеличение площади экспрессии маркера

пролиферации РСКА и уменьшение площади экспрессии белка р53. Эти изменения находились, соответственно, в положительной и отрицательной корреляции с увеличением зоны роста эксплантата под действием аминокислоты. Так, например, ИП эксплантата кожи старых крыс под действием изолейцина достоверно увеличивался на 25±3% (п=24, р<0,05) по сравнению с контролем (п=24, р<0,05), площадь экспрессии маркера клеточной пролиферации РСКА достоверно увеличивалась на 25±3%, а площадь экспрессии белка р53 статистически достоверно снижалась на 23±1% (п=24, р<0,05) по сравнению с контролем (рис. 2).

Рис. 2. Влияние изолейцина на индекс площади и площадь экспрессии р53 и РСЫА в эксплантатах кожи старых крыс.

Контроль ~ нулевая линия, по вертикат - изменение ПП. экспрессии Р('<\'Л и площади экспрессии р53. *р<0,05 по сравнению с соответствующим показателем в контроле.

Таким образом, результаты иммуноцитохимического исследования подтверждают данные, полученные при изучении влияния аминокислот на рост эксплантатов в органотипической культуре тканей хряща молодых и старых животных.

Исследование влияния дипептидов на развитие эксплантатов кожи молодых и старых крыс

При введении в культуральную среду эксплантатов кожи молодых крыс эффективных концентраций дипептидов ИП увеличивался в среднем на 1622%, по сравнению с ИП контрольных эксплантатов.

Так, при введении в культуральную среду АВ-17 ИП увеличивался на 16+3% (п=23, р<0,05), по сравнению с контролем (п=21), а под влиянием дипептида АВ-А ИП увеличивался на 22±3% (п=20, р<0,05) по сравнению с

контролем (п=24). Вилон не оказывал влияния на эксплантаты кожи молодых крыс.

Рис. 3. Влияние дипептида АВ-А на рост эксплантатов кожи молодых и старых крыс. Контроль - нулевая линия, по вертикали - изменение ПП в %, *р<0,05 по сравнению с ПП в контроле.

При введении в культуральную среду эксплантатов кожи старых крыс эффективных концентраций дипептидов ИП увеличивался также при действии пептида АВ-17 - на 31 ±7% (п=20, р<0,05) по сравнению с контролем (п=24) и при действии пептида АВ-А ИП увеличивался на 44±8% (п=25, р<0,05) по сравнению с контролем (п=22) (рис. 3).

Таким образом, дипептиды были особенно активны в отношении стимуляции пролиферации в эксплантатах кожи от старых животных.

Исследование влияния трииептидов на развитие эксплантатов кожи молодых и старых крыс

При введении в культуральную среду эксплантатов кожи молодых крыс эффективных концентраций трипептидов ИП увеличивался в среднем на 1662%, по сравнению с ИП контрольных эксплантатов. Так, при введении в культуральную среду трипептида Т-32 ИП увеличивался на 16±3% (п=23, р<0,05) по сравнению с контролем (п=21); при действии трипептида Т-33 ИП увеличивался на 18±3% (п=24, р<0,05) по сравнению с контролем (п=21); под влиянием трипептида Т-36 ИП увеличивался на 18±3% (п=20, р<0,05) по сравнению с контролем (п=23); при действии трипептида Т-38 ИП увеличивался на 62±9% (п=23, р<0,05) по сравнению с контролем (п=22).

При введении в культуральную среду эксплантатов кожи старых крыс эффективных концентраций трипептидов ИП увеличивался только при действии пептида Т-38 (рис. 4).

62

60

58

54

52

50

Рис. 4 . Влияние трипептида Т-38 на рост эксплантатов кожи молодых и старых крыс. Контроль - нулевая линия, по вертикали - изменение ПП в %, *р<0,05 по сравнению с ПП в контроле.

Исследование влияния тетрапептидов на развитие эксплантатов кожи молодых и старых крыс

При введении в культуральную среду эксплантатов кожи молодых крыс эффективных концентраций тетрапептидов ИП увеличивался в среднем на 22-40% по сравнению с ИП контрольных эксплантатов.

Так, при введении в культуральную среду эксплантатов кожи молодых крыс кортагена ИП увеличивался на 22±3% (п=20, р<0,05) по сравнению с контролем (п=22); при действии эпиталона ИП увеличивался на 34±5% (п=25, р<0,05) по сравнению с контролем (п=24); под влиянием кардиогена ИП увеличивался на 20±3% (п=22, р<0,05) по сравнению с контролем (п=23); при действии ливагена ИП увеличивался на 20±4% (п=24, р<0,05) по сравнению с контролем (п=23); под влиянием простамакса ИП увеличивался на 40±11% (п=22, р<0,05) по сравнению с контролем (п=23); при действии панкрагена ИП оставался на уровне контрольных значений.

При введении в культуральную среду эксплантатов кожи старых крыс эффективных концентраций тетрапептидов ИП увеличивался только при действии простамакса (рис. 5) - на 3819% (п=20, р<0,05) по сравнению с контролем (п=21). Остальные тетрапептиды не были активны в отношении стимуляции пролиферации в эксплантатах кожи старых крыс, и ИП оставался на уровне контрольных значений.

--

ШШШШИЖ

ь

■Мододые крысы ■ Старые крысы

Рис. 5. Влияние простамакса на рост эксплантатов кожи молодых и старых крыс. Контроль - нулевая линия, по вертикали - изменение 11П в %, *р<0,05 по сравнению с ПП в контроле.

Рис. 6. Изменение индекса площади, площади экспрессии р53 и РС^ в эксплантатах кожи старых крыс под действием простамакса.

Контроль - нулевая линия, по вертикали - изменение ЦП и площади экспрессии р53 в %, *р<0,05 по сравнению с соответствующим показателем в контроле.

Параллельно проводили иммуноцитохимическое исследование экспрессии маркера пролиферации белка РС^ и маркера апоптоза белка р53. Было выявлено, что увеличение площади экспрессии белка PCNA

коррелировало с увеличением ИП зоны роста эксплантатов (рис. 6), а экспрессия проапоптозного белка р53 в зоне роста эксплантатов кожи крыс при действии тетрапептидов находилась в отрицательной корреляции с увеличением зоны роста эксплантата под действием тетрапептидов (рис. 7).

а б

Рис. 7. Микрофотографии зоны роста эксплантатов в органотипической культуре кожи старых крыс на 3-й день культивирования после окраски на экспрессию РСИА. а - контроль, б - добавление в питательную среду простамакса (0,05 нг/мл). } в. х400.

Так, результаты исследования показали, что под действием простамакса площадь экспрессии маркера пролиферации РСЫА в эксплантатах кожи старых крыс увеличилась достоверно на 29+3% (р<0,05), а площадь экспрессии проапоптозного маркера р53 снизилась на 33+3% (р<0,05), при этом индекс площади зоны роста эксплантатов увеличился на 37±2% по сравнению с ИП в контроле (р<0,05).

Исследование влияния природных полипептидов на развитие эксплантатов кожи молодых и старых крыс

Результаты исследования действия природных полипептидов на пролиферативные процессы в органотипических культурах кожи молодых и старых крыс свидетельствует о наиболее эффективном их воздействии по сравнению с синтезированными пептидами и аминокислотами. Так, при введении эффективной концентрации полипептидов, выделенных из тканей яичников, ИП зоны роста эксплантатов кожи молодых крыс увеличивался на 49±11% (п=22, р<0,05) по сравнению с контролем (п=24) (рис. 8); при действии полипептидов, выделенных из тканей мышц, ИП увеличивался на 39±7% (п=25, р<0,05) по сравнению с контролем (п=24); полипептиды, выделенные из тканей сосудов, также вызывали стимуляцию зоны роста эксплантатов на 30+7% (п=20, р<0,05) по сравнению с контролем (п=22).

При введении в культуральную среду эксплантатов кожи старых крыс эффективных концентраций исследованных полипептидов ИП увеличивался при действии экстракта из тканей яичников на 28±5% (п=24, р<0,05) по сравнению с контролем (п=22); при действии полипептидов, выделенных из тканей мышц, ИП увеличивался статистически достоверно на 19+4% (п=20,

р<0,05) по сравнению с контролем (п=21); при действии полипептидов, выделенных из тканей сосудов, ИП увеличивался на 20±3% (п=23, р<0,05) по сравнению с контролем (п=22).

Рис. 8. Влияние полипептидов, выделенных из тканей яичника, на рост эксплантатов кожи молодых и старых крыс.

Контроль - нулевая линия, по вертикали - изменение ПП в %, *р<0,05 по сравнению с ИП в контроле.

Рис. 9. Влияние полипептидов, выделенных из тканей вилочковой железы,

на рост эксплантатов кожи молодых и старых крыс.

Контроль - нулевая линия, по вертикали - изменение ПП в %, *р<0,05

по сравнению с ПП в контроле.

Активными в отношении стимуляции пролиферации в эксплантатах кожи оказались также полипептиды, выделенные из тканей вилочковой железы - тималин (рис. 9) и из хрящевой ткани - хондролюкс. Так, при введении эффективной концентрации тималина в культуральную среду эксплантатов кожи молодых крыс ИП увеличивался статистически достоверно на 23±3% (п=20, р<0,05) по сравнению с контролем (п=21); при действии хондролюкса ИП увеличивался на 31+5% (п=22, р<0,05) по сравнению с контролем (п=24). При введении в культуральную среду эксплантатов кожи старых крыс эффективных концентраций полипептидов ИП увеличивался при действии тималина на 18+3% (п=23, р<0,05) по сравнению с контролем (п=21) и при действии хондролюкса - на 25±5% (п=21, р<0,05) по сравнению с контролем (п=23).

Таким образом, в эксплантатах от старых крыс наблюдалось некоторое уменьшение величины ИП по сравнению с эксплантатами от молодых крыс, однако эти величины были статистически достоверно выше контрольных.

Исследование процессов пролиферации и апоптоза при действии природных полипептидов в эксплантатах кожи молодых и старых крыс

При иммуноцитохимическом исследовании экспрессии проапоптозного белка р53 и маркера клеточной пролиферации РСЫА в зоне роста эксплантатов кожи молодых и старых крыс при действии природных полипептидов выявлено достоверное уменьшение площади экспрессии р53 (рис. 10) и увеличение площади экспрессии маркера клеточной пролиферации РСИА. Уменьшение площади экспрессии проапоптозного белка р53 находилось в отрицательной корреляции, а увеличение площади экспрессии маркера клеточной пролиферации РСЫА - в положительной корреляции с увеличением ИП зоны роста эксплантата под действием полипептидов.

' «г

Рис. 10. Микрофотографии зоны роста эксплантатов в органотипической культуре кожи старых крыс на 3-й день культивирования после окраски на экспрессию р53. а - контро ль, б - добавление в питательную среду тималина (20 нг/мл). ) в. х400.

Так, например, ИП эксплантата кожи старых крыс под действием тималина увеличивался на 18±3% (п=23, р<0,05), по сравнению с контролем (п=21), площадь экспрессии маркера клеточной пролиферации РСЫА увеличивалась на 20±3% по сравнению с контролем, а площадь экспрессии белка р53 статистически достоверно снижалась на 25±1% по сравнению с контролем .

Заключение

Полученные в нашей работе данные свидетельствуют о том, что природные полипептиды, выделенные из различных тканей, и синтезированные короткие пептиды обладают пролиферативной активностью в отношении клеток кожи, что является весьма важным фактом и позволит в будущем проводить коррекцию, направленную на замедление процессов старения кожи.

Ранее было показано, что в тканях мезодермального генеза стимулируют клеточную пролиферацию гидрофильные аминокислоты с заряженной боковой цепью - гистидин, лизин, аргинин, глутаминовая кислота, а также тирозин, в то время как в тканях эктодермального генеза (кора головного мозга) клеточная пролиферация стимулируется группой нейтральных гидрофобных аминокислот [Чалисова Н.И. и др., 2003, 20056, 2006]. Кожа развивается из экто- и мезодермальных зародышевых листков. Результаты проведенного в данной работе исследования свидетельствуют о том, что, так же, как и в других тканях этого генеза, при введении в культуральную среду эффективных концентраций глутаминовой кислоты, лизина, аргинина (аминокислоты активные в отношении тканей мезодермального генеза) и пролина, триптофана и тирозина (аминокислоты активные в отношении тканей эктодермального генеза) зона регенерирующих клеток в эксплантатах кожи молодых крыс увеличивалась на 16-30% по сравнению с контролем. С применением иммуноцитохимических методов показано, что при стимуляции клеточной пролиферации под влиянием аминокислот происходит уменьшение экспрессии проапоптозного белка р53, что свидетельствует об ослаблении процессов апоптоза под влиянием аминокислот. Остальные исследованные аминокислоты не вызывали статистически достоверных изменений ИП зоны роста в эксплантатах кожи. Ни одна из аминокислот не индуцировала в коже молодых животных угнетения роста.

В эксплантатах, полученных от старых крыс, наблюдалась совершенно иная картина. Выявлено угнетающее воздействие 10 аминокислот на клеточную пролиферацию - ИП статистически достоверно уменьшался на 18-35% по сравнению с контролем. Усиление роста клеток происходило под влиянием только трех аминокислоты - тирозина, изолейцина и триптофана. Таким образом, в коже молодых крыс многие аминокислоты стимулируют клеточную пролиферацию, а в коже старых крыс - вызывают апоптоз. С учетом того, что при старении вообще уменьшается как степень

всасываемости аминокислот из желудочно-кишечного тракта, так и степёнь кровоснабжения тканей, можно полагать, что в кожу по кровеносным сосудам поступает очень малое количество аминокислот, способного усилить регенерационные процессы в коже. Поэтому особенно актуальной становится задача поиска препаратов, способствующих клеточной пролиферации в тканях кожи.

В органотипической культуре кожи были также исследованы синтезированные дипептиды - вилон (Lys-Glu) и его структурные аналоги АВ-17 и АВ-А. При введении в культуральную среду эксплантатов кожи молодых крыс эффективных концентраций дипептидов ИП увеличивался на 16-22% в эксплантатах кожи от молодых животных, в эксплантатах от старых животных наблюдались даже более выраженные процессы стимуляции клеточной пролиферации, и ИП увеличивался на 31-44% по сравнению с ИП контрольных эксплантатов. Вилон не оказывал влияния на эксплантаты кожи как молодых, так и старых крыс

Исследован также в культуре ткани кожи крыс разного возраста эффект ряда трипептидов. Было проанализировано действие синтезированных трипептидов - Т-32 (Glu-Asp-Ala), Т-33 (Glu-Asp-Arg), Т-36 (Glu-Asp-Рго), Т-38 (Lys-Glu-Asp). Установлено, что все они обладают стимулирующей пролиферацию активностью в эксплантатах кожи от молодых крыс, в концентрации 0,05 нг/мл, т.е. эта концентрация является эффективной как и при действии отдельных аминокислот. Так, при действии трипептида Т-38 на эксплантаты кожи молодых крыс ИП увеличивался на 62±9% по сравнению с контролем, на эксплантаты кожи старых крыс - на 54±5%. При действии других трипептидов ИП оставался на уровне контрольных значений.

При проведении сравнительного исследования действия синтезированных тетрапептидов на развитие органотипической культуры фрагментов ткани кожи от молодых и старых крыс обнаружено, что при введении в культуральную среду кортагена, эпиталона, кардиогена, ливагена, простамакса в эффективных концентрациях ИП зоны регенерирующих клеток в эксплантатах кожи молодых крыс увеличивался на 22-40% по сравнению с контролем. При введении в культуральную среду эксплантатов кожи старых крыс эффективных концентраций тетрапептидов ИП зоны регенерирующих клеток эксплантатов увеличивался на 38,9% по сравнению с контролем под влиянием только одного тетрапептида -простамакса. Таким образом, несмотря на то, что по сравнению с эксплантатами от молодых крыс, количество стимулирующих пептидов уменьшалось, они эффективно стимулировали регенерацию фрагментов старой кожи.

При иммуноцитохимическом исследовании во всех случаях стимуляции клеточной пролиферации под влиянием да-, три- и тетрапептидов обнаружено снижение площади экспрессии проапоптозного белка р53 на 23-47% и повышение площади экспрессии маркера клеточной пролиферации белка PCNA. Это свидетельствует о положительной корреляции между

величиной ИП и площадью экспрессии маркера клеточной пролиферации белка РСЫА, а также об отрицательной корреляции между величиной ИП и площадью экспрессии р53, т.е. усиление клеточной пролиферации происходит за счет снижения интенсивности процессов апоптоза. Таким образом, синтезированные пептиды регулируют основные клеточные процессы — пролиферацию и программированную клеточную гибель в коже.

При исследовании влияния природных полипептидов, выделенных из различных тканей, выявлено, что наиболее эффективны в отношении пролиферации клеток кожи были полипептиды из тканей яичников, мышц и сосудов. Так, при введении полипептидов, выделенных из тканей яичников, в эффективной концентрации ИП эксплантатов от молодых животных увеличивался на 49±11%, а ИП эксплантатов от старых животных - на 28±5%; при действии полипептидов, выделенных из тканей мышц, ИП увеличивался на 39±7% и 19±4% в эксплантатах от молодых и старых животных соответственно. Активными в отношении стимуляции пролиферации в эксплантатах кожи оказались также полипептиды, выделенные из тканей вилочковой железы (тималин) и из хрящевой ткани (хондролюкс).

Таким образом, в эксплантатах от старых крыс, по сравнению с эксплантатами от молодых крыс, при введении полипептидов, выделенных из различных тканей, наблюдалось некоторое уменьшение величины ИП, однако эти величины были статистически достоверно выше контрольных. Поэтому данные природные полипептиды М01ут создать базу для разработки на их основе геропротекторов - препаратов, способствующих коррекции возрастных изменений кожи.

Полученные результаты, свидетельствующие о способности исследованных пептидов стимулировать процессы пролиферации в коже старых животных, создали базу для создания косметических средств и парафармацевтических препаратов, обладающих геропротекторными свойствами и способствующих достижению геронтокосметологической коррекции при развитии изменений в коже, ассоциированных с возрастом.

Следует подчеркнуть эффективность действия очень малых концентраций исследованных коротких пептидов - 0,05 нг/мл, при которых стимулировались процессы пролиферации в коже, что приближается к действию ультрамалых доз биологически активных веществ. Это открывает широкие перспективы применения малых доз этих пептидов в геронтокосметологической практике для коррекции возрастных изменений кожи, когда особенно важно использовать небольшие дозировки биологически активных веществ во избежание появления аллергических и других побочных реакций. Эти данные могут служить основанием для поиска и синтеза новых регуляторных пептидов для ткани кожи.

выводы

1 .Аминокислоты глутаминовая кислота, лизин, аргинин, пролин, триптофан и тирозин обладают способностью стимулировать пролиферативные процессы в ткани кожи молодых животных, ни одна из аминокислот не вызывает усиление процессов апоптоза.

2. Спектр аминокислот, активных в отношении клеточной пролиферации уменьшается в коже от старых животных, активными аминокислотами остаются только тирозин, триптофан и изолейцин, остальные аминокислоты вызывают выраженные процессы апоптоза.

3. Трипептиды Т-32 , Т-33, Т-36 и Т-38, дипептиды АВ-17 и АВ-А стимулируют пролиферативные процессы в органотипической культуре ткани кожи от молодых животных, а трипептид Т-38, дипептиды АВ-17 и АВ-А - у старых животных.

4. Тетрапептиды кортаген, эпиталон, кардиоген, ливаген, простамакс стимулируют клеточную пролиферацию в эксплантатах кожи молодых животных; в эксплантатах кожи старых животных - только простамакс.

5. Полипептиды, выделенные из тканей яичников, мышц, сосудов, вилочковой железы и хряща, стимулируют клеточную пролиферацию в эксплантатах ткани кожи как молодых, так и старых животных.

6. Экспрессия маркера пролиферации РСИА находится в положительной, а экспрессия проапоптозного белка р53 - в отрицательной корреляции с увеличением индекса площади зоны роста эксплантата кожи молодых и старых крыс под действием аминокислот, ди-, три- и тетрапептидов, а также природных полипептидов, выделенных из тканей яичников, мышц, сосудов, хряща, вилочковой железы.

7. Стимуляция пролиферации клеток кожи молодых и старых животных при действии экстрагированных из различных тканей полипептидов и синтезированных коротких пептидов свидетельствует о перспективности разработки на их основе лекарственных и косметических средств для применения в гериатрии и геронтокосметологии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1.Выявленное действие экстрагированных из тканей яичников, мышц, сосудов, тимуса, хрящей полипептидов на ткань кожи создает основу для их дальнейшего изучения в качестве лекарственных средств, предназначенных для профилактики и лечения патологических состояний кожи, ассоциированных с возрастом.

2. Установленное стимулирующее действие тетра-, три- и дипептидов в отношении клеточной пролиферации в тканях кожи создает базу для целенаправленного синтеза коротких пептидов, предназначенных для лечения патологии кожи в гериатрической практике и для целей геронтокосметологии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах, включенных в Перечень ВАКМинобрнауки РФ

1. Влияние биорегуляторных трипептидов на культуру клеток кожи молодых и старых крыс/ М.А. Войцеховская, Н.И.Чалисова, Е.А. Концевая, Г.А. Рыжак // Бюлл. эксн. биол. мед. - 2011. - Т. 152, № 9. - С. 327-330.

2. Влияние коротких пептидов на развитие органотипической культуры ткани кожи молодых и старых крыс / М.А. Войцеховская, Н.И. Чалисова, Е.А. Концевая // Профилактическая и клиническая медицина. — 2011. - Т. 2, № 1.-С. 110-113.

3. Геропротекторное действие аминокислот и трипептидов в культуре ткани хряща крыс / A.B. Смирнов, Н.И. Чалисова, Г.А. Рыжак, Е.А. Концевая, М.А. Войцеховская // Успехи геронтологии. - 2011. - Т. 24, № 1. -С. 139-142.

4. Геропротекторное действие препарата на основе экстракта из хрящевой ткани в органотипической культуре ткани хряща молодых и старых крыс / A.B. Смирнов, Н.И. Чалисова, Г.А. Рыжак, Е.А. Концевая, М.А. Войцеховская // Научные Ведомости Белгородского государственного университета. Серия Медицина. Фармация. Геронтология и гериатрия. -2011.-Вып. 13/1,№4.-С. 75-80.

5. Регуляторное влияние кодируемых аминокислот на основные клеточные процессы у молодых и старых животных / Н.И. Чалисова, Е.А. Концевая, М.А. Войцеховская, A.B. Комашня // Успехи геронтологии. -2011.-Т. 24,№2.-С. 189-197.

Статьи в журналах

6. Перспективы применения пептидных биорегуляторов в геронтокосметологии / Г.А. Рыжак, Н.И. Чалисова, М.А. Войцеховская, Е.А. Концевая // Наука для красоты и здоровья. - 2011. - № 3. - С. 2-6.

7. Селезенка: онтогенез и старение/ Е.П. Кузнецова, Н.С. Линькова, A.B. Дудков, М.А. Войцеховская // Геронтологический журнал им. В.Ф. Купревича. - 2011. - Т. 2, № 2. - С. 9-16.

Тезисы докладов

8. Войцеховская М.А. Влияние комплексных пептидов на культуру ткани кожи молодых и старых крыс/ М.А. Войцеховская, Е.А. Концевая // Матер. I всероссийской научн.-практ. конф. молодых ученых «Сибирский медико-биологический конгресс». — Барнаул, 2011. - С. 14-15.

9. Войцеховская М.А. Геропротекторное влияние биорегуляторных пептидов на кожу в культуре тканей / М.А. Войцеховская, Е.А. Концевая // Матер. Всероссийской молодежной конф.-школы «Нейробиология интегративных функций мозга», посвященной 120-летию со дня основания Физиологического отдела под руководством И.П. Павлова в Императорском институте экспериментальной медицины. - Санкт-Петербург, 2011. - С. 16.

10. Войцеховская М.А. Геропротекторное влияние коротких пептидов на развитие органотипической культуры ткани кожи / М.А. Войцеховская, Н.И. Чалисова, Е.А. Концевая. // Матер. XVI междунар. науч.-пралст. Конференции "Пожилой больной. Качество жизни",- Москва, 2011. — С. 32-33.

11. Войцеховская М.А. Морфометрическая оценка развития экспланта!ов кожи в органотипической культуре / М.А. Войцеховская, Е.А. Концевая // Матер. 4-ой Всероссйской с междунар. участием научн. конф. "Метромед -2011". - Санкт-Петербург, 2011. - С. 81-83.

12. Войцеховская М.А. Протекторное влияние биорегуляторных пептидов на кожу в культуре ткани/ М.А. Войцеховская, Е.А. Концевая // Матер. VI междунар. научн. конгресса валеологов «Здоровье человека - 6». Санкт-Петербург, 2011. - С. 176-177.

13. Смирнов A.B. Влияние кодируемых аминокислот на клеточную пролиферацию и апоптоз в культуре тканей различного генеза/ А.В.Смирнов, М.А. Войцеховская // Тезисы докладов конф. мол. ученых, поев. 85-летию со дня основания Института физиологии им. И.П. Павлова РАН. Санкт-Петербург - Колтуши, 2010. - С. 97-98.

14. Чалисова Н.И. Влияние аминокислот на культуру ткани кожи у крыс разного возраста/ Н.И. Чалисова, М.А. Войцеховская, Е.А. Концевая // Сб. трудов юбилейной научн.-практ. конф. с междунар. участием. «Актуальные проблемы геронтологии и гериатрии». - Санкт-Петербург, 2011. - С. 282-283.

ВОЙЦЕХОВСКАЯ Марина Александровна ВЛИЯНИЕ АМИНОКИСЛОТ, ПРИРОДНЫХ И СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ НА КУЛЬТУРУ ТКАНИ КОЖИ МОЛОДЫХ И СТАРЫХ КРЫС //Автореф. дис. канд. мед. наук: 14.01.30 -СПб., 2011. 26 с.

Подписано в печать «26» октября 2011. Формат 60*84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. ЗаказЗГГ Отпечатано с готового оригинал-макета. ЗАО "Принт - Экспресс" 197376, С.-Петербург, ул. Большая Монетная, 5 лит. А

Актуальность исследования

Прогрессирующее увеличение доли пожилых и старых людей в общей численности населения вместе с сокращением рождаемости в последнее время становится всё более актуальной медицинской, социальной и экономической проблемой развитых стран [Анисимов В.Н., 2008а]. Одними из первых проявлений процесса старения являются дегенеративные изменения в коже, которая, выполняя барьерную функции, подвергается не только возрастным изменениям, но и испытывает локальный стресс, обусловленный повреждающими факторами внешней среды. В результате запущенной программы старения в клетках кожи (как и в клетках всего организма) неотвратимо происходят существенные изменения: уменьшается их митотическая активность, постепенно нарушаются синтетические процессы, накапливаются модифицированные белки, происходит повреждение мембран клеток, ДНК и ферментов. В организме поддержание биологической целостности регулируется на клеточном уровне сигналами, которые позволяют сохранять равновесное состояние между основными физиологическими процессами пролиферацией и апоптозом [Анисимов В.Н., 20086]. Многие пептиды принимают участие в сигнальной трансдукции между различными типами клеток. Кроме того, биорегуляторные пептиды, содержащиеся практически во всех тканях организма, выполняют не только сигнальную роль, но и непосредственно участвуют в регуляции физиологических процессов, начиная от отдельных функций специализированных клеток и заканчивая сложными поведенческими актами [Хавинсон В.Х., Морозов В.Г., 1992, 2000а, 20006, 2001]. Биорегуляторные пептиды впервые были выделены В.Г.Морозовым и В.Х. Хавинсоном в 1971 г. из гипоталамической области мозга и тимуса [Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., 1981, 1983; Хавинсон В.Х., Морозов В.Г., 1991; Коркушко О.В. и др., 2002; Хавинсон В.Х., Морозов В.Г., 2002; Рыжак Г.А., Коновалов С.С., 2004]. Затем В Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии были синтезированы новые ди-, три- и тетрапептиды, являющиеся аналогами эндогенных пептидных биорегуляторов и содержащие наиболее часто встречающиеся в соответствующих тканях аминокислоты. Недавние исследования [Чалисова Н.И. и др., 19996, 2000, 2003] показали, что не только короткие пептиды, но и сами аминокислоты обладают некоторыми регуляторными свойствами в отношении клеточной пролиферации и апоптоза в различных тканях.

Несмотря на наличие большого количества методов воздействия на стареющую кожу, поиск эффективных физиологических методов и средств профилактики и коррекции возрастных изменений кожи, не оказывающих нежелательного побочного действия, остается актуальной проблемой современной медицины. До последнего времени в медицинской косметологии при коррекции возрастных изменений кожи не принимались во внимание процессы, происходящие на клеточном уровне. Одной из наиболее адекватных моделей для изучения влияния различных препаратов на структуру и функцию клеток являются органотипические культуры [Чалисова Н.И. и др., 1999а, 2002]. Изменение количества клеток в культуре ткани под воздействием различных веществ служит критерием первичной интегральной оценки биологической активности вещества. Поэтому сравнительное изучение действия природных и синтетических пептидов и аминокислот в культуре ткани кожи, как у молодых, так и у старых животных, позволит выяснить некоторые механизмы регулирования клеточных процессов в коже, а также создать базу для синтеза новых пептидных биорегуляторов для гериатрической практики и геронтокосметологии.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы было исследование действия природных полипептидов, выделенных из различных тканей, а также синтезированных коротких пептидов и аминокислот на развитие органотипической культуры фрагментов ткани кожи от молодых и старых крыс.

Для достижения цели исследования поставлены и последовательно решены следующие задачи:

1. Исследовать влияние 20 стандартных аминокислот на клеточную пролиферацию в эксплантатах кожи от молодых и старых крыс в органотипической культуре ткани.

2. Исследовать влияние синтезированных ди-, три- и тетрапептидов на развитие эксплантатов кожи от молодых и старых крыс в органотипической культуре ткани.

3. Исследовать действие полипептидов, выделенных из тканей хряща, яичников, тимуса, сосудов, мышц, на клеточную пролиферацию в эксплантатах кожи от молодых и старых крыс в органотипической культуре ткани.

4. Исследовать влияние стандартных аминокислот, полипептидов и коротких пептидов на развитие процессов пролиферации и апоптоза в органотипической культуре кожи от молодых и старых крыс.

Научная новизна работы

Впервые проведено изучение действия 20 стандартных аминокислот, полипептидов, выделенных из различных тканей, и коротких пептидов в органотипических культурах тканей кожи, взятых от молодых и старых животных. Впервые установлено стимулирующее влияние аминокислот пролина, лизина, глутаминовой кислоты, аргинина, триптофана и тирозина на процессы пролиферации в культуре ткани кожи от молодых животных и всего 3 аминокислот (тирозина, изолейцина, триптофана) - в эксплантатах кожи от старых животных. Напротив, в культуре ткани кожи от старых животных 7 аминокислот - глицин, лизин, пролин, глутаминовая и аспарагиновая кислоты, аргинин и валин - вызывали выраженный апоптоз.

Впервые установлено стимулирующее влияние полипептидов, выделенных из тканей хряща, яичников, тимуса, сосудов, мышц, на клеточную пролиферацию в эксплантатах кожи от молодых и старых крыс в органотипической культуре ткани. Впервые установлено, что эффективными в отношении стимуляции пролиферации эксплантатов кожи от молодых животных были дипептиды АВ-17 и АВ-А, а также трипептиды Т-32, Т-33, Т-36, Т-38, а эксплантатов кожи от старых крыс -только трипептид Т-38 и дипептиды АВ-17 и АВ-А. Впервые установлено, что тетрапептиды кортаген, эпиталон, кардиоген, ливаген, простамакс стимулируют развитие эксплантатов кожи молодых крыс, а в эксплантатах кожи старых крыс активным в отношении пролиферации является только простамакс.

Впервые проведено иммуноцитохимическое исследование эксплантатов кожи и выявлено уменьшение развития процессов апоптоза при стимуляции пролиферации под влиянием вышеуказанных препаратов. При этом показано, что увеличение индекса площади эксплантатов кожи находится в положительной корреляции с увеличением площади экспрессии маркера пролиферации РСЫА и в отрицательной корреляции с уменьшением площади экспрессии проапоптозного белка р53.

Практическая значимость работы

Впервые получены экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что при старении уменьшается спектр аминокислот, активно действующих на пролиферативные процессы в коже. Напротив, полипептиды, выделенные из различных тканей, и короткие пептиды проявляют стимулирующие пролиферацию свойства в отношении кожи у животных как молодого, так и старого возраста. Выявленное стимулирующее действие природных и синтезированных пептидов на кожу создает основу для их дальнейшего изучения в качестве средств, предназначенных для коррекции возрастных изменений кожи. Установленное стимулирующее действие коротких пептидов в отношении клеточной пролиферации в тканях кожи создает базу для целенаправленного синтеза коротких пептидов, предназначенных для использования в геронтокосметологии и гериатрической практике.

Положения, выносимые на защиту

1. Аминокислоты - пролин, лизин, глутаминовая кислота, аргинин, триптофан и тирозин обладают способностью стимулировать пролиферативные процессы в ткани кожи молодых крыс. В ткани кожи от старых животных только 3 аминокислоты - тирозин, изолейцин, триптофан - проявляют активность в отношении клеточной пролиферации.

2. Дипептиды АВ-17 и АВ-А стимулируют пролиферацию в эксплантатах кожи молодых и старых крыс. В органотипической культуре кожи молодых животных пролиферативные процессы стимулируют трипептиды Т-32, Т-33, Т-36, Т-38, в органотипической культуре кожи старых животных - только трипептид Т-38.

3. Тетрапептиды кортаген, эпиталон, кардиоген, ливаген, простамакс, панкраген стимулируют развитие эксплантатов кожи молодых крыс, а в органотипической культуре кожи старых крыс активным в отношении пролиферации является только тетрапептид простамакс.

4. Полипептиды, экстрагированные из тканей хряща, яичников, тимуса, сосудов, мышц, стимулируют клеточную пролиферацию в эксплантатах кожи как молодых, так и старых животных.

5. Площадь экспрессии маркера пролиферации РСЫА находится в положительной, а площадь экспрессии проапоптозного белка р53 - в отрицательной корреляции с изменением индекса площади эксплантатов в органотипической культуре кожи молодых и старых крыс в присутствии аминокислот, дипептидов, трипептидов, тетрапептидов и полипептидов, экстрагированных из тканей хряща, яичников, тимуса, сосудов, мышц.

6. Полипептиды, экстрагированные из тканей хряща, яичников, тимуса, сосудов, мышц, тетрапептид простамакс, трипептид Т-38, дипептиды АВ-17 и АВ-А являются перспективными веществами для создания средств, предназначенных для коррекции возрастных изменений кожи.

Связь с планом НИР

Диссертационная работа выполнена в рамках основного плана НИР Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 7 статей, включая 5 статей в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Минобрнауки Российской Федерации для опубликования материалов диссертационных исследований.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов, главы собственных исследований, главы обсуждения результатов, выводов и указателя литературы. Текст диссертации изложен на 110 страницах, содержит 6 таблиц,

выводы

1 .Аминокислоты глутаминовая кислота, лизин, аргинин, пролин, триптофан и тирозин обладают способностью стимулировать пролиферативные процессы в ткани кожи молодых животных, ни одна из аминокислот не вызывает усиление процессов апоптоза.

2. Спектр аминокислот, активных в отношении клеточной пролиферации уменьшается в коже от старых животных, активными аминокислотами остаются только тирозин, триптофан и изолейцин, остальные аминокислоты вызывают выраженные процессы апоптоза.

3. Трипептиды Т-32 , Т-33, Т-36 и Т-38, дипептиды АВ-17 и АВ-А стимулируют пролиферативные процессы в органотипической культуре ткани кожи от молодых животных, а трипептид Т-38, дипептиды АВ-17 и АВ-А - у старых животных.

4. Тетрапептиды кортаген, эпиталон, кардиоген, ливаген, простамакс стимулируют клеточную пролиферацию в эксплантатах кожи молодых животных; в эксплантатах кожи старых животных - только простамакс.

5. Полипептиды, выделенные из тканей яичников, мышц, сосудов, вилочковой железы и хряща, стимулируют клеточную пролиферацию в эксплантатах ткани кожи как молодых, так и старых животных.

6. Экспрессия маркера пролиферации РСЫА находится в положительной, а экспрессия проапоптозного белка р53 - в отрицательной корреляции с увеличением индекса площади зоны роста эксплантата кожи молодых и старых крыс под действием аминокислот, ди-, три- и тетрапептидов, а также природных полипептидов, выделенных из тканей яичников, мышц, сосудов, хряща, вилочковой железы.

7. Стимуляция пролиферации клеток кожи молодых и старых животных при действии экстрагированных из различных тканей полипептидов и синтезированных коротких пептидов свидетельствует о перспективности разработки на их основе лекарственных и косметических средств для применения в гериатрии и геронтокосметологии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1.Выявленное действие экстрагированных из тканей яичников, мышц, сосудов, тимуса, хрящей полипептидов на ткань кожи создает основу для их дальнейшего изучения в качестве лекарственных средств, предназначенных для профилактики и лечения патологических состояний кожи, ассоциированных с возрастом.

2. Установленное стимулирующее действие тетра-, три- и дипептидов в отношении клеточной пролиферации в тканях кожи создает базу для целенаправленного синтеза коротких пептидов, предназначенных для лечения патологии кожи в гериатрической практике и для целей геронтокосметологии.