Автореферат и диссертация по медицине (14.01.30) на тему:Влияние аминокислот на морфо-функциональные характеристики тканей молодых и старых крыс

КОНЦЕВАЯ Елизавета Александровна

ВЛИЯНИЕ АМИНОКИСЛОТ НА МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ТКАНЕЙ МОЛОДЫХ И СТАРЫХ КРЫС

14.01.30 - геронтология и гериатрия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 5 [;:ДР Ш

Санкт-Петербург - 2012

005013985

Работа выполнена в отделе клеточной биологии и патологии Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Чалисова Наталья Иосифовна

доктор биологических наук, профессор Козина Людмила Семеновна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Кветная Татьяна Викторовна

доктор биологических наук, профессор Розенгарт Евгений Викторович

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет» Федерального агентства по образованию РФ.

Защита диссертации состоится «26» марта 2012г. в 12.00 часов на заседании Диссертационного Совета Д 601.001.01 в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН по адресу: 197119, Санкт-Петербург, пр. Динамо, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.

Автореферат разослан «24» февраля 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного Совета

доктор биологических наук, профессор

Козина Л.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Изучение механизмов, лежащих в основе регуляции важнейших гомеостатических функций организма, представляет собой одно из приоритетных направлений современной биологии и медицины. Проявление жизни - постоянный процесс обмена веществ и воспроизведения генетической информации с помощью различных регулирующих факторов. Исследование регуляторных механизмов многоклеточных систем дает возможность понять генез индивидуального развития организмов, механизмы дифференцировки и специализации клеток, принципы регуляции специализированных тканей и воспроизведения генетической информации. В процессе формирования многоклеточных систем регуляторные механизмы координировали соотношение клеток различных популяций, контролировали дифференцировку, пролиферацию [Ашмарин И.П., Обухова М.Ф., 1986; Хавинсон В.Х. и соавт., 1999, 2002, 2003]. Биорегуляторные пептиды, влияющие на процессы роста и развития, широко распространены в тканях многоклеточного организма. Таким образом, одним из наиболее приоритетных направлений в современной биологии и медицине является изучение механизмов регуляции многоклеточных систем. Уже сейчас результаты, полученные в этой области исследований, позволяют не только понять сложные процессы развития клеток, обмена и воспроизведения генетической информации, но и использовать эти принципы для создания новых подходов в профилактике и лечении заболеваний, к увеличению продолжительности жизни и замедлению процессов старения [Хавинсон В.Х. и соавт., 2002; Анисимов В.Н., 2003; Рыжак Г.А., Коновалов С.С., 2004].

В состав полипептидных регуляторов входят аминокислоты в различных сочетаниях. Поэтому можно полагать, что аминокислоты сами могут обладать некоторыми регуляторными свойствами в отношении основных физиологических процессов, происходящих в клетках. В настоящее время накапливаются данные о регулирующем влиянии не только пептидов, но и отдельных аминокислот на клетки нервной, иммунной и эндокринной систем [Barbul A. et al., 1981; Белокрылов Г.А. и др., 1995; Chen R. et al., 2003; Lansola M. et al., 2003], a также на экспрессию ряда генов [Kim К.Y. et al., 2002; Suschek C.V. et al., 2003]. Показано, что сами аминокислоты могут оказывать влияние на основные процессы в клетках - пролиферацию и апоптоз [Чалисова Н.И. и соавт., 2002, 2003, 2010]. Поэтому изучение на тканевом уровне регулирующего влияния всех 20-ти аминокислот, кодируемых генетическим кодом и составляющих основу биологических процессов, является актуальной задачей. Однако до сих пор проводилось не достаточно систематических скрининговых исследований влияния, каждой из 20 аминокислот на ткани, различные по генезу, функциям и возрасту.

Для изучения непосредственного влияния биологически активных веществ на клетки одной из наиболее адекватных моделей является метод органотипической культуры ткани [Levi-Montalchin R., 1968; Калюнов В.Н., 1986; Чалисова Н.И. и соавт., 1990, 2008]. В отсутствие нервных, гуморальных и других влияний, которые имеются в целостном организме, создаются условия для строгого дозирования испытуемых веществ по типу управляемого эксперимента.

В то же время способность влиять на скорость основных клеточных процессов - пролиферацию и апоптоз, - и, как следствие, вызывать изменение количества клеток по сравнению с контролем является одним из общих свойств регуляторных пептидов млекопитающих. Изменение количества клеток в культуре ткани может служить критерием первичной интегральной оценки биологической активности пептида и являться основанием для поиска других его эффектов [Хавинсон В.Х., Чалисова Н.И. и соавт., 1997].

Изучение в культуре ткани действия стандартных аминокислот на процессы пролиферации, апоптоза, выживаемости и дифференцировки в тканях в молодом возрасте и при старении, позволит более глубоко понять механизмы регулирования основных клеточных процессов в организме. При этом создается база для синтеза новых пептидных биорегуляторов с учетом их влияния на ткани организмов в различном возрасте.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы было изучение влияния 20 стандартных аминокислот в органотипических культурах на развитие процессов пролиферации, выживаемости и клеточной дифференцировки в эксплантатах тканей, различных по генезу и функциям, полученных от молодых и старых крыс.

Для достижения цели исследования поставлены и последовательно решены следующие задачи:

1. Исследовать влияние 20 стандартных аминокислот на развитие процессов пролиферации в эксплантатах тканей от молодых и старых крыс в органотипической культуре.

2. Изучить действие сочетаний различных аминокислот на клеточные процессы в культуре тканей.

3. Исследовать влияние 20 стандартных аминокислот на выживаемость в диссоциированной культре клеток РС12.

4. Изучить влияние аминокислот на дифференцировку иммунных клеток.

5. Исследовать влияние сочетанного действия аминокислот и антител к рецепторам фактора роста нервов в культуре ткани.

Научная новизна работы

Впервые проведено подробное изучение действия 20 стандартных аминокислот в органотипических культурах тканей, различных по генезу и функциям, взятых от молодых и старых животных. Впервые установлено, что в проявлении стимулирующего пролиферацию действия аминокислот важную роль играет не только генезис тканей (происхождение из какого-либо из зародышевых листков), но и функциональная характеристика ткани, а также ее регенерационные способности.

Показано, что спектр аминокислот, проявляющих активность в отношении клеточной пролиферации, уменьшается во всех тканях от старых животных.

Впервые выявлено, что сочетание двух стимулирующей и ингибирующей клеточную пролиферацию аминокислот может вызывать в различных тканях от молодых и старых крыс стимуляцию пролиферации, превосходящую активность изолированной аминокислоты. Однако активность коротких пептидов, синтезированных из данных аминокислот всегда выше, чем активность смеси этих аминокислот, особенно на культурах тканей старых животных.

Впервые показано стимулирующее влияние аргинина, гистидина, аспарагина, глутамина и метионина на выживаемость клеток РС12. Установлено, что ингибирующее пролиферацию влияние группы гидрофобных аминокислот устраняется под действием антител к низкоаффинным рецепторам фактора роста нервов.

Специфичность действия на клеточные процессы изученных аминокислот и их сочетаний, особенно в органотипических культурах от старых животных, создает базу для целенаправленного синтеза новых пептидных биорегуляторов.

Практическая значимость работы

Впервые получены экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что при старении уменьшается спектр аминокислот, активно действующих на пролиферативные процессы в тканях. С учетом того, что при старении кроме того нарушается всасывание ряда аминокислот в желудочно-кишечном тракте, подчеркивается необходимость целенаправленного синтеза коротких пептидов из наиболее активных для данной ткани аминокислот для последующей разработки лекарственных средств, предназначенных для профилактики и лечения возрастной патологии.

Положения, выносимые на защиту

1. 20 стандартных Ь-аминокислот обладают способностью стимулировать или ингибировать пролиферативные процессы в тканях различных по генезу, регенерационным способностям и функциям.

2. Спектр аминокислот, проявляющих активность в отношении клеточной пролиферации, во всех тканях от старых животных уменьшается, по сравнению с тканями от молодых крыс.

3. Сочетание двух стимулирующей и ингибирующей клеточную пролиферацию аминокислот может вызывать в различных тканях молодых и старых животных стимуляцию пролиферации, превосходящую активность изолированной аминокислоты.

4. Ингибирующее пролиферацию влияние группы гидрофобных аминокислот устраняется под действием антител к низкоаффинным рецепторам фактора роста нервов.

5. Специфичность действия изученных аминокислот и их сочетаний на клеточные процессы в органотипических культурах от старых животных создает базу для целенаправленного синтеза новых пептидных биорегуляторов.

Связь с планом НИР

Диссертационная работа выполнена в рамках основного плана НИР Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 24 печатные работы: 10 статей и 14 тезисов, среди них 10 статей в журналах, включенных в Перечень Высшей аттестационной комиссии Минобрнауки Российской Федерации и рекомендованных для опубликования материалов диссертационных исследований.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов, главы собственных исследований, главы обсуждения результатов, выводов и указателя литературы. Текст диссертации изложен на 134 страницах, содержит 14 таблиц, иллюстрирован 35 рисунками. Список литературы содержит 187 источников, из них отечественных - 36, зарубежных - 151.

Апробация и реализация диссертации

Материалы диссертации доложены: на IV международной научной конференции молодых ученых-медиков «Российский союз молодых ученых» (Курск, 2010); студенческой научной конференции (Санкт-Петербург, 2010); VI научно-практической геронтологической конференции с международным участием «Пушковские чтения» (Санкт-Петербург, 2010); 6 международной научной конференции «Донозология - 2010. Здоровый образ жизни и полезные для здоровья факторы» (Санкт-Петербург, 2010); 7 международной научной конференции «Донозология - 2010. Здоровый образ жизни и полезные для здоровья факторы» (Санкт-Петербург, 2011); I Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Сибирский медико-биологический конгресс» (Барнаул, 2011); VI международном научном конгрессе валеологов «Здоровье человека - 6» (Санкт-Петербург, 2011); юбилейной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы геронтологии и гериатрии» (Санкт-Петербург, 2011); Российской научной конференции с международным участием «Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии» (Санкт-Петербург, 2011); Всероссийской молодежной научной конференции-школы «Нейробиология интегративных функций мозга» (Санкт-Петербург, 2011); XVI международной научно-практической конференции «Пожилой больной. Качество жизни» (Москва, 2011); 4 Всероссийской научной конференции с международным участием «Метромед - 2011» (Санкт-Петербург, 2011).

Результаты диссертации используются в научно-практической работе Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии, а также Института физиологии им. И.П. Павлова РАН.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Препараты, исследованные в работе Аминокислоты В работе использовали 20 стандартных L-аминокислот: глицин, аланин, аспарагин, гистидин, лизин, серии, глютамин, аргинин, пролин, аспарагиновая и глютаминовая кислоты, тирозин, цистеин, валин, треонин, метионин, лейцин, изолейцин, фенилаланин, триптофан; в качестве препаратов сравнения - 20 аналогичных D-аминокислот.

Антитела к фактору роста нервов NGFRp75 (ФРН) Все препараты производства «Sigma», США.

Органотипическое культивирование тканей

Органотипическое культивирование тканей проводилось по описанной ранее методике [Чалисова Н.И. и др., 1999, 2003, 2009].

Состав питательной среды

Используемая культуральная среда (рН 7,2) содержала 35% раствора Хенкса, 35% среды Игла, 25% фетальной сыворотки теленка, глюкозу (0,6%), гентамицин (ЮОЕД/мл).

Выделение тканей

В работе использовали органотипические культуры селезенки, миокарда, кожи, хряща, предстательной железы, семенников, коры и подкорковых образований головного мозга, мозжечка, печени, поджелудочной железы молодых (3-месячных) и старых (24-месячных) крыс линии Вистар, всего 5500 эксплантатов тканей.

Для взятия материала и его препаровки применяли набор инструментов для микрохирургии глаза. Ткани извлекали в стерильных условиях, разделяли на фрагменты величиной около 1 мм3 и затем 20-25 таких фрагментов помещали на дно чашки Петри, предварительно покрытое коллагеновой пленкой, на расстоянии 3 мм друг от друга. Для того чтобы эксплантаты прикрепились к коллагеновой подложке, закрытые чашки Петри помещали в термостат при температуре 37±0,1°С на 30 минут.

После чего чашки Петри заливали 3 мл питательной среды. В культуральную среду добавляли исследуемые аминокислоты в различных концентрациях, и чашки снова помещали в термостат. Культивирование эксплантатов тканей осуществляли при температуре 37±0,1°С, в присутствии 5% СО2 в течение 3 суток.

Контрольными считали эксплантаты, культивируемые только в условиях питательной среды.

Морфологические и морфометрические методы исследования развития эксплантатов в органотипической культуре тканей

Рост эксплантатов ткани в органотипической культуре исследовали прижизненно с помощью фазово-контрастного микроскопа через 3 суток после начала культивирования.

В 1-е сутки культивирования происходило распластывание эксплантатов на коллагеновой подложке, выселение пролиферирующих и мигрирующих клеток, составляющих зону роста от края эксплантата. Среди мигрирующих и пролиферирующих клеток типируются клетки, специфичные для данной ткани, а также макрофаги, фибробласты, встречаются фигуры митозов. За счет этих клеток и формируется периферическая зона роста эксплантатов, при измерении которой определялся индекс площади (ИП). Через 3 суток, если в эксперименте имела место стимуляция развития зоны роста, индекс площади экспериментальных эксплантатов увеличивался по сравнению с индексом площади контрольных. В случае замедления или угнетения развития зоны роста индекс площади эксплантатов понижался по сравнению с контрольными значениями.

Для визуализации эксплантатов использовали микротеленасадку для микроскопа (серия 10, МТН-13 «Альфа-Телеком», Россия). Количественную оценку роста эксплантатов осуществляли с помощью пакета программ PhotoM 1.2.

Для количественной оценки влияния тестируемых веществ на развитие эксплантатов применяли морфометрический метод. Учитывая неоднородность морфологической картины эксплантатов, с целью унификации конечных показателей использовали относительный критерий - индекс площади (ИП), который рассчитывали как отношение площади всего эксплантата, включая зону роста (Ц+ЗР), к площади центральной зоны (Ц).

Ц

За условную единицу площади принимали квадрат окуляр-сетки микроскопа. Сторона квадрата при увеличении 3.5x10 равнялась 150 мкм.

Значения ИП выражали в процентах по сравнению со значениями ИП контрольных эксплантатов, которые принимали за 100%.

Достоверность различий сравниваемых средних значений ИП контрольных и экспериментальных образцов оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.

Определение эффективной концентрации аминокислот в органотипической культуре ткани

При раститровке каждой из исследуемых аминокислот в концентрациях 0,01; 0,05; 0,1; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0; 20,0; 50,0; 100,0; 200,0 нг/мл выявлено, что эффективные концентрации, дающие максимальный эффект стимуляции или угнетения зоны роста эксплантатов, составляли 0,05-1,0 нг/мл, т.е. были в диапазоне нанограммовых концентраций (0,05 нг/мл или 10'u-10'12 М). При использовании более высоких или более низких (подпороговых) концентраций либо не наблюдалось статистически достоверного эффекта стимуляции или угнетения, либо аминокислоты не оказывали никакого действия, и значения ИП оставались на уровне значений ИП в контроле.

Иммуноцитохимические методы исследования эксплантатов

В периферической зоне роста на 3-й сутки определяли экспрессию сигнальных молекул CD4, CD5, CD8, CD20, CD68. Иммуноцитохимическое исследование проводили с использованием моноклональных мышиных антител. В качестве вторичных антител применяли универсальный набор, содержащий биотинилированные анти-мышиные и анти-кроличьи иммуноглобулины. Визуализацию окрасок осуществляли с применением комплекса авидина с биотинилированной пероксидазой (ABC-kit) с последующим проявлением пероксидазы хрена диаминобензидином (все реагенты от Novocastra). Для визуализации экспрессии маркеров использовали одноэтапный протокол для мазков с фиксацией спиртом [Кветной И.М., Пальцев М.А., 2006]. Исследование проведено в отделе клеточной биологии и патологии Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН совместно с отделом патоморфологии НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отто СЗО РАМН.

Морфометрические исследования и компьютерный анализ микроскопических изображений

После иммуноцитохимической окраски морфометрическое исследование проводили с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений, состоящей из микроскопа Nikon Eclipse Е400, цифровой камеры

Nikon DXM1200, персонального компьютера на базе Intel Pentium 4 и программного обеспечения «Видеотест-Морфология 4.0». В каждом случае анализировали как минимум 10 полей зрения при увеличении х400. Определяли площадь экспрессии маркеров, представляющую собой отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения. Значения площади экспрессии выражали в процентах. Результаты исследований обрабатывали с помощью компьютерных программ EXCEL и STATISTICA 5.0.

Метод оценки жизнеспособности клеток в культуре феохромоцитомы крысы PC 12

Наибольшую быстроту широкомасштабных исследований для определения выживаемости клеток обеспечивают флуоресцентные и хромогенные индикаторы, к которым относится стандартизированный способ МТТ-тест (или метод Моссмана).

Кулыура клеток феохромоцитомы крысы PC 12 получена из трансплантированной феохромоцитомы надпочечников крысы. МТТ (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолий бромид) - водорастворимая соль тетразолия желтого цвета хорошо проникала в клетки, в которых превращалась в нерастворимые в воде кристаллы формазана фиолетового цвета. По окончании реакции клетки лизировали в органическом растворителе (диметилформамиде) и на спектрофотометре измеряли поглощение при длинах волн 570 и 640 нм.

Статистическая обработка экспериментальных данных

Математическое обеспечение исследования осуществлялось в соответствии со стандартными методиками, принятыми для обработки результатов медико-биологических исследований [Гланц С., 1999; Григорьев С.Г. и др., 2002] с использованием параметрического метода - t-критерия Стьюдента. Статистическую обработку полученных экспериментальных данных производили с использованием программы "Microsoft Office Excel 2003". Вероятность ошибки цифровых данных закладывалась в пределах 5%, что отвечает стандартам, принятым для медико-биологических исследований. Для многомерного статистического анализа данных применялся кластерный анализ с использованием программы Statistica v.7.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Влияние аминокислот на ткани различного геиеза у молодых и старых крыс

При культивировании тканей мезодермального геиеза вокруг эксплантатов наблюдалось образование зоны роста, состоящей из клеток типичных для данной ткани, а также фибробластов и макрофагов (рис. 1).

а б

Рис. 1. Микрофотографии эксплантата органотипической культуры селезенки (а) и зоны роста (б). Окраска гематоксилин-эозином. Ув. хЮО (а), х400 (б).

В культуре ткани селезенки молодых крыс 4 аминокислоты вызывали выраженную стимуляцию зоны роста (табл. 1).

Таблтр 1

Влияние 20 аминокислот на эксплантаты селезенки молодых и старых крыс

Изменение индекса площади (% по отношению к

Аминокислота контролю)

Молодые крысы Старые крысы

Gly +10±5 +6+2

Ala -9±3 -5 ±2

Asn +35 ±2* +6+2

His -38 ± 9* +9+2

Lys +49 ± 5* -10 ± 5

Ser -8 + 3 -16 + 4*

Gin -26 ±4* +9 + 2

Arg +32 + 7* +21 ±5*

Pro -30 ±8* +11 ±4

Glu +27 ±3* +15+3*

Asp -25 ±7* +5+2

_Çys__ -38 ±13* +9+2

Туг -35 ±11* +15+9

Val -30+12* -5 ±2

Tb- -38 + 10* -26+4*

Met -37+13* -12 + 5

Leu -28 + 11* -10 + 5

lie -8 + 2 -5 + 2

Phe -25 ±5* -5 + 2

Jm_ -38 + 10* -31 ±3*

Примечание: *р<0,05 по сравнению с индексом площади контрольных эксплантатов.

При действии 0,05 нг/мл лизина ИП увеличивался на 49±5% (п=20, р<0,05) по сравнению с контролем (п=21). При введении в культуральную среду аспарагина и аргинина зона роста увеличивалась на 32-35%. При действии глутаминовой кислоты ИП увеличивался на 27±3% (п=22, р<0,05) по сравнению с контролем (п=19). Выраженное уменьшение ИП на 25-38% отмечалось при действии гистидина, глутамина. пролина, аспарагиновой кислоты, валина, тирозина, треонина, метионина, лейцина, фенилаланина, триптофана, цистеина. Ингибируюгцее влияние остальных аминокислот было статистически не

достоверным (аланин, серии, изолейцин). При добавлении аминокислот в культуру ткани селезенки старых крыс получены другие результаты. Стимулирующим статистически достоверным влиянием на ИП обладали только аргинин и глутаминовая кислота. Ингибирующее действие на ИП выявилось у серина -16±4% (п=19, р<0,05) по сранению с контролем (п=21), треонина -26±4% (п=20, р<0,05) по сравнению с контролем (п=20) и триптофана -31 ±3% (п=20, р<0,05) по сравнению с контролем (п=19).

Статистически достоверная стимуляция развития эксплантатов миокарда у молодых крыс происходила при введении в культуральную среду аспарагина, гистидина, лизина, серина, аргинина, глутаминовой кислоты, изолейцина в концентрации 0,05 нг/мл, при этом ИП повышался на 19±2%, 31±5%, 46±6%, 18±2%, 29±5%, 39±6%, 19±2%, соответственно, (п=22 в каждом эксперименте, р<0,05) по сравнению с кош-рольными эксплантатами (п=24). Недостоверное ингибирующее действие на рост эксплантатов сердца молодых крыс выявлено лишь при добавлении триптофана. В культуре миокарда старых животных наблюдалась другая картина. Достоверная стимуляция зоны роста эксплантатов выявлялась лишь при добавлении лизина и аргинина, при этом ИП увеличивался на 21±2% и 24±3%, соответственно, (п=22 в каждом эксперименте, р<0,05) по сравнению с контрольными эксплантатами (п=23). Аспарагин, валин, фенилаланин, триптофан недостоверно ингибировали зону роста эксплантатов. В культуре ткани хряща молодых крыс при действии эффективных концентраций всех исследуемых аминокислот стимулирующее клеточную пролиферацию влияние выявлялось у 6 аминокислот: гистидина, глутамина, лейцина, изолейцина, тирозина, аргинина. В эксплантатах от старых крыс только лейцин оказывал стимулирующее воздействие. Достоверно влияли на развитие органотипической культуры семенников молодых крыс 6 аминокислот: изолейцин, лейцин, аргинин, лизин, пролин, гистидин. При добавлении изолейцина в эффективной концентрации ИП увеличился на 31±6% (п=22, р<0,05) по сравнению с ИП контрольной культуры. При изучении органотпической культуры семенников старых крыс активность продемонстрировали 3 аминокислоты: лизин, аргинин и гистидин. У молодых крыс при действии аминокислот на эксплантаты предстательной железы достоверное стимулирующее влияние оказывали глутамин, аргинин, серин, цистеин, тирозин, валин и пролин, индекс площади увеличивался на 17- 48%, по сравнению с контролем. Глицин оказывал статистически достоверное ингибирующее рост эксплантатов действие. В эксплантатах простаты от старых крыс стимулирующее влияние сохраняли только аргинин, серин и цистеин. Показано, что в культуре ткани кожи молодых крыс стимулирующее клеточную пролиферацию влияние выявляется у 5 аминокислот: лизина, аргинина, пролина, триптофана, глютаминовой кислоты. В эксплантатах от старых крыс выявлялось выраженное ингибирующее воздействие на клеточную пролиферацию у 7 аминокислот - ИП статистически достоверно уменьшался на 21-34%, по сравнению с контролем. Таким образом, аминокислоты вызывают в коже старых крыс угнетение, а в коже молодых -стимуляцию клеточной пролиферации.

В серии опытов с тканью эктодермального генсза при культивировании эксплантатов мозжечка молодых крыс 8 аминокислот (глицин, аспарагин, лизин, аргинин, пролин, валин, глутаминовая и аспарагиновая кислоты) стимулировали пролиферацию клеток, и ни одна из аминокислот не оказывала ингибирующего

влияния. В эксплантатах мозжечка от старых крыс только одна аминокислота стимулировала пролиферацию, в то время как 2 аминокислоты (цистеин и лейцин) оказывали угнетающее воздействие на зону роста. Клеточную пролиферацию в эксплантатах подкорковых структур головного мозга молодых крыс стимулировали глугамин, аргинин, триптофан, глутаминовая и аспарагиновая кислоты, при этом ИП увеличивался на +27±4%, 24%±4%, 37%±6%, 32±5%, 35%±6%, соответственно, (п=22 в каждом эксперименте, р<0,05) по сравнению с контрольными значениями (п=25). Статистически достоверное ингибирование развития эксплантатов подкорковых структур головного мозга происходило при добавлении в культуральную среду глицина, пролина, тирозина и треонина, индекс площади снижался на 12±2%, 28±4%, 20±3%, 18±2%, соответственно. В эксплантатах от старых крыс под действием гистидина, глутамина, аргинина, цистеина, изолейцина и триптофана индекс площади достоверно увеличивался на 11±2%, 36±6%, 39±7%, 18±2%, 26±5%, 18±2%, соответственно. Статистически достоверная стимуляция развития эксплантатов коры головного мозга молодых крыс выявилась при действии гидрофобных аминокислот: аспарагиновой кислоты, валина, треонина, метионина, лейцина, изолейцина (табл. 2).

Таблица 2

Влияние аминокислот на эксплантаты коры головного мозга молодых и

старых крыс

Аминокислота Изменение индекса площади (% по отношению к контролю)

Молодые крысы Старые крысы

Gly -31 ±5* +8±3

Ala -3±2 +7±2

Asn +3±2 +4 ±2

His +10 ±2 +18 ±5*

Lys +8±3 -4± 1

Ser -9±2 +6 ±2

Gin -2± 1 +6±2

Arg +3±2 -3±2

Pro -24 ±4* +20 ±2*

Glu -3±1 +5 ±2

Asp +56 ±11* +5±2

Cys +6±2 +7±2

Туг -9±2 +3±2

Val +55 ±9*

Thr +42 ±6* -7±2

Met +57 ±9* +3±2

Leu +50 ±7* +20 ±4*

lie +42 ±6* -3±2

Phe +3±2 +7±2

Trp -20 ±5* +3±2

Примечание: * р<0,05 по сравнению с индексом площади контрольных эксплантатов.

Ингибирующее влияние оказывали только глицин, пролин, триптофан, при введении которых в культуральную среду зона роста статистически достоверно

уменьшалась на 20-37% по сравнению с контрольными эксплантатами. Стимулирующее действие на кору головного мозга старых крыс проявили 3 аминокислоты (гистидин. пролин, лейцин).

Исследовано влияние аминокислот и на ткани энтодермального генсза у молодых и старых крыс. При культивировании эксплантатов поджелудочной железы найдено, что достоверную стимуляцию роста эксплантатов ткани молодых крыс вызывали только 4 аминокислоты - аспарагин, пролин, треонин, лейцин. При добавлении аминокислот в культуральную среду эксплантатов поджелудочной железы старых крыс обнаружено, что статистически достоверную стимуляцию зоны роста вызывали только аспарагин и треонин, при этом индекс площади увеличивался на 20±3%, (п=22 в каждом эксперименте, р<0,05) по сравнению с контрольными значениями (п=24). При введении в культуральную среду эксплантатов печени молодых крыс 0.05 нг/мл аспарагина и аргинина зона роста эксплантатов статистически достоверно увеличивалась на 18-33% по сравнению с контролем. При введении 0,05 нг/мл глутаминовой кислоты ИП статистически достоверно увеличивался на 17±3% (п=23, р<0.05) по сравнению с контролем (п=21). При действии 0.05 нг/мл лизина ИП увеличивался на 12±5% (п=22, р<0,05) по сравнению с контролем (п=23). Выраженное снижение ИП (на 20-30% по сравнению с контролем) наблюдалось при действии глицина, гистидина, пролина. аспарагиновой кислоты, валина. треонина, метионина, лейцина, изолейцина. фенилаланина. цистеина. При введении аминокислот в культуру печени старых крыс стимуляция ИП отмечались у аргинина - на 20±5% (п=20, р<0,05) по сравнению с контролем (п=20), фенилаланина - на 25±4% (п=19, р<0.05) по сравнению с контролем (п=20), а угнетающий эффект выявлялся у лизина, при этом ИП уменьшался на 18±3% (п=18. р<0.05) по сравгению с контролем.

Суммируя частоту эффективности (как стимулирующей, так и ингибирующей) аминокислот в тканях от лабораторных животных различного возраста, можно заметить, что в эксплантатах тканей от молодых крыс действует в 4 раза больше активных аминокислот - 70%, чем в тканях от старых животных -лишь 18% (рис. 2).

18%

а б

Рис. 2. Соотношение активных, стимулирующих пролиферацию или апоптоз, (светлые сектора) и не активных (темные сектора) аминокислот в тканях у молодых (а) и старых (б) крыс.

Для выявления зависимости действия аминокислот от генеза и функции тканей был применен метод многомерного статистического анализа полученных данных - кластерный анализ. Кластер это группа элементов, характеризуемых

общим свойством, а главная цель кластерного анализа - нахождение групп схожих объектов в выборке.

На рисунке 3 показана дендрограмма, полученная путем кластерного анализа. На дендрограмме видны две главные ветви, одна из которых представлена тканями энтодермального и мезодермального генеза. Другая разветвляется на подветвь мозговых структур и подветвь миокарда (эктодерма и мезодерма соответственно). То, что в этой ветви находятся ткани коры и подкорковых структур головного мозга (эктодермальный генез), а также миокарда (мезодермальный генез) может объясняться тем, что эти ткани относятся к так называемым постмитотическим, т.е. их клетки, в отличие от других тканей, практически не делятся в период постнатального онтогенеза. В то же время ткани с высоким регенерационным потенциалом, проявляющимся в течение всего онтогенетического развития организма, - печень (энтодермапьный генез) и ткань селезенки (мезодермальный генез) - находятся на одной подветви, другой ветви. Ткани мезодермального генеза (семенники и предстательная железа) находятся в одной подветви, и в этой же подветви находится ткань поджелудочной железы (энтодермальный генез). Это можно объяснить тем, что все эти три ткани обладают внешнесекреторной и внутрисекреторной функциями.

Кора головного мозга Подкорковые структуры мозга Миокард Семенники Предстательная железа Поджелудочная железа Печень Селезенка

90 100 110 Мера расстояния

Рис. 3. Дендрограмма построенная на основании специфичности действия аминокислот в отношении различных органов (метод Уорда, мера сходства - Эвклидово расстояние).

На основании полученных данных можно заключить, что в проявлении стимулирующего пролиферацию действия аминокислот важную роль играет не только генезис тканей (происхождение из какого-либо из зародышевых листков), но и функциональная характеристика ткани, а также ее регенерационные способности.

Сравнительное влияние Iи О-аминокислот на клеточную пролиферацию

В органотипической культуре селезенки крыс исследовано влияние на пролиферационные процессы 20 не кодируемых О-аминокислот. в концентрации 0.05 нг/мл (рис. 4). Установлено, что ни одна из О-аминокислот, в отличие от I,-аминокислот, не оказывала влияния на эксплантаты - значения ИП оставались на уровне контрольных значений.

Таким образом, только стандартные аминокислоты способны оказывать влияние на клеточные процессы пролиферации в тканях, т.е. влиять на экспрессию генов, обеспечивающих клеточный цикл.

Рис. 4. Влияние L- и D-аминокислот на изменение индекса площади (ИП, %) в органотипической культуре селезенки. (Контроль - нулевая линия, * р<0,05 по сравнению с контролем).

Влияние аминокислот на дифференцировку иммунных клеток в органотипической культуре селезенки

Пролиферация и дифференцировка иммунных клеток (рис. 5) в органотипической культуре селезенки при воздействии 20 исследуемых аминокислот происходила по-разному.

Две аминокислоты с отрицательно заряженным боковым радикалом (глутаминовая и аспарагиновая кислоты) не оказывали выраженного влияния на экспрессию маркеров С04. CD5 и CD8, однако их влияние на маркеры CD20 и CD68 было диаметрально противоположным (рис. 6). Аспарагиновая кислота в 2 раза снижала экспрессию маркера CD20, по сравнению с контролем, в то время как под влиянием глутаминовой кислоты синтез мембранного гликопротеина CD20 увеличивался в 20 раз. В то же время аспарагиновая кислота в 6 раз увеличивала экспрессию маркера CD68. а глутаминовая кислота снижала ее в 7 раз, по сравнению с контролем. Следовательно, аспарагиновая кислота стимулирует пролиферацию покоящихся макрофагов, тогда как глутаминовая кислота снижает численность субпопуляции CD68+ клеток.

' ' J

Л . Г -' , '« /.<

а б

Рис. 5. Микрофотографии, отображающие экспрессию маркера С020 органотипической культуре селезенки, хЮО: а - в контроле, б - при введении культуральную среду глутаминовой кислоты в концентрации 0,05 нг/мл.

о &

с о а

m

-0

g

о

| S а а. о а

ё 2

X

X *

S и

2 о

о 5

В *

2 а о гс

250 200 150 100 50 0 -50 -100

*

* I

^ I та I -Ï- CD8

CD4 CD5 CD2Î3 СЕ >68

*

• Glu

Asp

Рис. 6. Влияние глутаминовой (Glu) и аспарагиновой кислот (Asp) на площадь экспрессии маркеров иммунокомпетентных клеток в органотипической культуре селезенки. (Контроль - нулевая линия, * р<0,05 по сравнению с контролем).

При введении в культуральную среду гидрофильной аминокислоты с положительно заряженным боковым радикалом - лизина, только экспрессия маркера CD4 оставалась на уровне контроля, а экспрессия всех остальных маркеров - CD5, CD8, CD20 и CD68 снижалась в 2.5-3 раза, по сравнению с контрольными значениями (рис. 7).

Вероятно, разнонаправленное действие аминокислот на иммунные клетки селезенки связано с различной гидрофобностью их боковых цепей, которая определяет характер межмолекулярных взаимодействий.

s s

'J

о a» a с о ü m

л §

3

о

4 С

10

0

-10

X -20

-D I N? -30

н х У. -40

о (- о -50

■и с 0 -60

я * -70

-80

-90

-GD4

С 1) г )8

Г

* * і 1

*

»20

CI 168

I :

-ч-

iLys Val *

Рис. 7. Влияние лизина (Lys) и валина (Val) на площадь экспрессии маркеров иммунокомпетентных клеток в оргаиотипической культуре селезенки. (Контроль -нулевая линия, * р<0,05 по сравнению с контролем).

Влияние аминокислот на выживаемость клеток РС12

При исследовании влияния 20 аминокислот на выживаемость клеток PC 12 в диссоциированной культуре с использованием МТТ-теста выявлено, что метионин. аспарагин. глутамин. аргинин и гистидин статистически достоверно стимулировали выживаемость клеток PC 12 (табл. 3).

Таблица 3

Влияние аминокислот на выживаемость клеток PC 12

Аминокислота Значение оптической плотности

Алании 0,2500±0,0141

Глицин 0,2525±0,0247

Валин 0,2800±0,0424

Метиони н 0,4275±0,0318*

Серин 0,2950±0,0141

Цистеин 0,2775±0,0106

Пролин 0,2825±0,0247

Лейцин 0,2725±0,0247

Изолейцин 0,1800±0,0000

Фенилаланин 0,2625±0,1732

Аргинин 0,4325±0,0742*

Тирозин 0,3200±0,0354

Триптофан 0,3025±0.109б

Треонин 0,3350±0,0849

Аспарагин 0,4200±0,0495*

Аспарагиновая кислота 0,2950±0,0283

Глутамин 0,3525±0,1025і

Глутаминовая кислота 0,3150±0,0283

Лизин 0,3150±0,0141

Гистидин 0,3525±0,0106*

контроль 0,2775^0,0524

Примечание: *р<0,05 по сравнению с соответствующим показателем в контроле.

Кроме того выявлена статистически не достоверная тенденция увеличения стимуляции выживаемости клеток при действии тирозина и треонина.

Таким образом, ряд кодируемых аминокислот обладает способностью влиять на выживаемость клеток в диссоциированной культуре. Эти данные вместе с описанными выше данными о стимуляции клеточной пролиферации можно учитывать при синтезе новых биорегуляторных пептидов.

Влияние антител к рецепторам фактора роста нервов NGFRp75 на действие аминокислот в органотипичеекой культуре ткани

В присутствии антител к рецепторам фактора роста нервов ^Р11р75, (которые относятся к семейству фактора некроза опухолей и участвуют в процессах апоптоза), изменялось действие тех аминокислот, при изолированном введении в культуру селезенки которых происходило ингибирование зоны роста. При добавлении в культуральную среду гидрофобных аминокислот (аспарагиновой кислоты, цистеина, тирозина, валина, треонина, метионина, лейцина, фенилапанина, триптофана) в сочетании с антителами к 1^0РЯр75 происходило снятие их угнетающего влияния - зона роста эксплантатов становилась сопоставима с зоной роста в контроле и значения ИП не отличались от контрольных значений (рис. 8).

Рис. 8. Влияние изолированных аминокислот (синяя линия) и сочетаний аминокислот с антителами к рецепторам фактора роста нервов ЫСРИ.р75 (красная линия) на индекс площади (ИП,%) эксплантатов селезенки. (Контроль - нулевая линия, * р<0,05 по сравнению с контролем).

Можно предположить, что эта группа аминокислот, находящихся на конце спектра возрастающей гидрофобности (5,3-7,5 кДж/моль), может опосредовать апоптозное действие через низкоаффинные рецепторы фактора роста нервов, так как при блокаде рецепторов антителами устраняется ингибирующее влияние данных аминокислот на ткани.

Влнянне сочетаний аминокислот на процессы клеточной пролиферации у молодых и старых крыс

В культуре ткани селезенки исследованы такие сочетания аминокислот, в которых одна из аминокислот оказывала стимулирующее, а другая угнетающее воздействие на рост эксплантатов. Обнаружено, что эти сочетания всегда вызывали стимуляцию зоны роста, часто превосходящую стимуляцию, которую вызывала изолированно одна стимулирующая аминокислота.

Выявлено, что стимулирующее влияние на показатели ИП в эксплантатах селезенки оказывали следующие сочетания аминокислот: лизин (стимулирующий ИП на 28%) совместно с лейцином (угнетающим ИП на 38%), при этом сочетании ИП увеличивался на 37±5% (п=20, р<0,05) по сравнению с контролем (п=22); лизин (стимулирующий ИП на 28%) совместно с триптофаном (угнетающим ИП на 31%), при этом сочетании ИП увеличивался на 55±3% (п=21, р<0,05) по сравнению с контролем (п=23) (рис. 9); аспарагин (стимулирующий ИП на 29%) совместно с аспарагиновой кислотой (угнетающей ИП на 29%), при этом сочетании ИП увеличивался на 61±3% (п=23, р<0,05) по сравнению с контролем (п=20).

70 60 50 40 30

^о 20

Й"! -10 -20 -30 -40

Рис. 9. Влияние сочетаний аминокислот на индекс площади (ИП,%) эксплантатов селезенки в органотипической культуре. (Контроль - нулевая линия, * р<0,05 по сравнению с контролем).

В другой ткани мезодермального генеза клеточную пролиферацию стимулировали не только гидрофильные аминокислоты с заряженными боковыми радикалами - аспарагин, лизин, аргинин, глутаминовая аминокислота, но еще и три аминокислоты - гистидин, серин и изолейцин. В отличие от ткани селезенки с высоким регенерационным потенциалом, в постмитотической ткани миокарда ни одна из кодируемых аминокислот не обладала выраженным ингибирующим действием на развитие эксплантатов. Однако сочетание аминокислоты, обладающей стимулирующим действием с аминокислотой, которая не оказывала существенного влияния на пролиферацию в миокарде, приводило к значительному увеличению эффекта стимулирующей аминокислоты. Так было установлено, что лизин увеличивает индекс площади на 30%, триптофан статистически не достоверно уменьшает ИП на 8%. Однако совместное их введение в культуральную среду приводило к значительной стимуляции зоны роста и

увеличению ИП на 58%, что превосходит на 28% увеличение ИП при изолированном введении лизина. Установлено, что стимулирующее влияние на показатели ИП в эксплантатах миокарда также оказывали сочетания стимулирующей аминокислоты с кислотой, не оказывающей существенного влияния на развитие эксплантатов. Выявлены следующие эффективные сочетания: глутаминовая кислота с валином, ИП увеличивался на 58%; аспарагин с валином (ИП на уровне контроля), ИП увеличивался на 46%; аргинин с валином ИП увеличивался на 47%; изолейцин с валином (ИП - на уровне контроля), ИП увеличивался на 38%, а также сочетания лизина с лейцином, аспарагина с лейцином. Таким образом, в ткани миокарда сочетания аминокислоты, вызывающей усиление пролиферации и аминокислоты, не вызывающей достоверных изменений ИП, приводило к увеличению клеточной пролиферации на 16-40%, по сравнению с изолированным действием стимулирующей аминокислоты. Аналогичные результаты получены при действии сочетаний стимулирующей и ингибирующей аминокислот на эксплантаты печени, коры головного мозга и поджелудочной железы.

При исследовании влияния сочетаний аминокислот на эксплантаты старых крыс также найдено, что смеси стимулирующей и ингибирующей клеточную пролиферацию аминокислот приводят к увеличению стимулирующего эффекта по сравнению с изолированно действующей стимулирующей аминокислотой. Очевидно, в таком случае происходит поддержание динамического баланса клеточных процессов, необходимых для развития тканей. Однако, в связи с уменьшением количества активно действующих аминокислот в тканях от старых животных, и количество эффективных сочетаний аминокислот в этих тканях было меньше, чем в тканях от молодых крыс.

Необходимо подчеркнуть, что сочетания аминокислот всегда давали эффект меньший, чем пептид, синтезированный из этих же аминокислот. Так смесь аланина, пролина, глутаминовой и аспарагиновой кислот увеличивала ИП на 16-18%, в то время как кортаген, состоящий из этих же аминокислот, увеличивал ИП на 28-32%, по сравнению с контролем (рис. 10).

35 30 . 25 , 20 1 15 10 ? 0 с? *

*

1есь аминокислот А1а, Рго, С1ц, Авр тетрапептнд кортаген

Рис. 10. Действие смеси отдельных аминокислот и тетрапептида кортагена, состоящего из этих же аминокислот, на эксплантаты коры головного мозга. (Контроль -нулевая линия, по вертикали - изменения индекса площади (ИП, %) по отношению к контролю, * р<0,05).

Заключение

В нашей работе впервые исследовано действие 20 Ь-аминокислот на процессы пролиферации, выживаемости и дифференцировки клеток в культуре тканей различного генеза и функционального статуса. Обнаружено, что в различных тканях эксплантатов от молодых и старых крыс эффективные концентрации разных аминокислот вызывают стимуляцию или ингибирование клеточной пролиферации. Причем использованные в качестве препаратов сравнения О-аминокислоты, не являющиеся кодируемыми генетическим кодом, не оказали никакого влияния на развитие пролиферационных процессов. В эксплантатах зрелой ткани селезенки и ткани печени от молодых крыс под влиянием 4 аминокислот - аспарагина, лизина, аргинина и глутаминовой кислоты -наблюдался процесс стимуляции клеточной пролиферации. Механизмы действия вышеупомянутых аминокислот на клетки могут иметь универсальные черты, что согласуется с предположением об участии электростатических и гидрофобных взаимодействий в этих процессах. Стимулирующее влияние группы гидрофобных аминокислот (аспарагиновой кислоты, валина, треонина, метионина, лейцина, изолейцина) обнаруживалось только в культуре нервной ткани - коре головного мозга крыс. Эти аминокислоты высокомолекулярны (117-149 Да), не обладают положительно заряженной боковой группой и находятся на конце спектра возрастающей гидрофобности. Следует отметить, что если в зрелой ткани селезенки и печени эти аминокислоты вызывали выраженное ингибирование зоны роста эксплантатов, то в зрелой нервной ткани они оказывали стимулирующее действие. Это может указывать на принципиально иную, чем в тканях мезо- и энтодермального происхождения, зависимость нервной ткани от сигналов, которые поддерживают сложное равновесное состояние между интегративными физиологическими процессами: пролиферацией, дифференцировкой и физиологической клеточной гибелью. Возможно, одной из причин низкой регенерационной способности зрелой нервной ткани является то, что ее стимулируют не аргинин, аспарагин, лизин, глутаминовая кислота (оказывающие влияние на мезо- и энтодермальные зрелые ткани), а иная группа высоко гидрофобных аминокислот - аспарагиновая кислота, валин, треонин, метионин, лейцин, изолейцин и гистидин. Эти данные подтверждаются при статистическом кластерном анализе полученных данных о стимулирующих и ингибирующих влияниях аминокислот в тканях. На основании этого можно заключить, что в проявлении стимулирующего пролиферацию действия аминокислот важную роль играет не только генезис тканей (происхождение из какого-либо из зародышевых листков), но и функциональная характеристика ткани, а также ее регенерационные способности.

Совершенно другие явления, по сравнению с молодыми животными, обнаруживаются при исследовании процессов пролиферации в эксплантатах тканей, взятых от старых животных - 18-месячных крыс. В этих тканях реже выявляются как стимулирующие, так и ингибирующие влияния аминокислот по сравнению с тканями от новорожденных и молодых животных. Суммарная частота эффективности аминокислот в тканях молодых животных почти в 4 раза выше, чем в тканях старых. С учетом того, что при старении ухудшается процесс всасывания аминокислот в желудочно-кишечном тракте, можно полагать, что организм испытывает дефицит аминокислот, необходимых для поддержания регенерационного потенциала и клеточного баланса во многих тканях. Хотя 5

аминокислот (глутаминовая кислота, метионин, цистеин, гистидин, глицин) включены в Фармакопею и используются в лечебной практике, они, как показали наши исследования, не действуют на регенерационные процессы в большинстве старых тканей. В то же время в предыдущих работах [Хавинсон В.Х. и соавт., 2005, 2008; Чалисова Н.И. и соавт., 2005, 2009,2010] было показано, что короткие пептиды оказывают активное воздействие в культуре тканей, как молодых, так и старых животных. Поэтому обнаружение наиболее активных для данной ткани старых животных аминокислот позволит осуществить синтез коротких пептидов, которые будут эффективно влиять на ткани при старении.

При иммуноцитохимическом исследовании эксплантатов селезенки выявлено разнонаправленное действие аминокислот на процессы дифференцировки иммунных клеток. Глутаминовая кислота (с отрицательно заряженным боковым радикалом) и аргинин (с положительно заряженным боковым радикалом) способствуют усилению пролиферативной активности зрелых В-лимфоцитов. Эти данные согласуются с описанными выше результатами, свидетельствующими о стимулирующем влиянии указанных аминокислот на пролиферацию разных клеточных популяций.

Особо следует подчеркнуть возможность использования ультрамалых доз аминокислот. Одной из самых характерных черт действия ультрамалых доз веществ является то, что они часто действуют на фоне большого количества того же вещества присутствующего эндогенно (ростовые факторы, аминокислоты, пептиды), обеспечивая клеточный ответ в виде пролиферации или апоптоза в результате очень малых концентрационных сдвигов [ВагЬи1 А. й а1., 1981; Западнюк В.И. и др., 1982; РасМ АЛ. е1 а1„ 1992; Ка\уапо М.М. е1 а1„ 1995; Морозов В.Г. и др., 2000; Коркушко и др., 2002]. Эти особенности действия веществ в ультрамалых концентрациях позволяют при терапевтическом применении снижать лекарственную нагрузку на организм, особенно в гериатрической практике.

В результате экспериментов найдено, что в присутствии антител к рецепторам фактора роста нервов ЫОРГф75 в культуре селезенки устранялось ингибирующее пролиферацию действие, вызванное группой гидрофобных аминокислот. Можно предположить, что эта группа аминокислот, не обладающих положительно заряженной боковой группой и находящихся на конце спектра возрастающей гидрофобности (5,3-7,5 кДж/моль) может опосредовать апоптозное действие через низкоаффинные рецепторы фактора роста нервов, так как при блокаде рецепторов антителами устраняется ингибирующее влияние данных аминокислот на ткани.

В серии опытов исследовалось влияние смесей аминокислот на пролиферационные процессы в органотипической культуре различных тканей. Найдено, что в эксплантатах тканей от молодых и старых крыс для достижения лучшего стимулирующего эффекта необходимо сочетание аминокислот, осуществляющих разнонаправленную регуляцию основных клеточных процессов. Важно отметить, что сочетания аминокислот всегда давали эффект меньше того, который оказывал пептид, синтезированный из этих аминокислот. Так смесь аланина, пролина, глутаминовой и аспарагиновой кислот увеличивала ИП на 20-22%, в то время как кортаген, состоящий из этих же аминокислот, увеличивал ИП на 2834%, по сравнению с контролем. Поэтому стимулирующие свойства изученных сочетаний аминокислот, которые обнаружены в нашей работе, могут быть учтены при синтезе новых эффективных биорегуляторных пептидов, включающих эти аминокислоты.

Таким образом, полученные результаты подтверждают складывающуюся в настоящее время концепцию о том, что в организме существуют относительно независимые регуляторные системы как пептидная, так и аминокислотная, причем последняя зависит от возраста организма. Принимая во внимание то, что короткие биорегуляторные пептиды сохраняют свою активность и в тканях от старых организмов [Хавинсон В.Х. и др., 1985, 2002], полученные результаты о стимулирующем действии ряда аминокислот на клеточную пролиферацию и дифференцировку в различных тканях создают базу для синтеза новых коротких биорегуляторных пептидов, для изучения их в качестве лекарственных препаратов, в том числе при болезнях, ассоциированных с возрастом.

ВЫВОДЫ

1. 20 стандартных Ь-аминокислот обладают способностью стимулировать или ингибировать пролиферативные процессы в тканях молодых и старых крыс. В проявлении действия аминокислот играет роль генезис, функциональный статус и регенерационные способности тканей.

2. Спектр аминокислот, проявляющих активность в отношении клеточной пролиферации, уменьшается во всех тканях от старых животных.

3. Сочетание двух стимулирующей и ингибирующей клеточную пролиферацию аминокислот может вызывать в тканях от молодых и старых животных стимуляцию пролиферации, однако, не превосходящую активность синтезированного из данных аминокислот короткого пептида.

4. Выживаемость клеток в культуре РС12 увеличивается под влиянием метионина, аспарагина, глутамина, гистидина и аргинина.

5. Глутаминовая кислота и аргинин индуцирует дифференцировку зрелых В-лимфоцитов; гистидин и лейцин - цитотоксических Т-лимфоцитов; метионин -Т-лимфоцитов и В-клеток в культуре иммунной ткани.

6. Ингибирующее пролиферацию влияние группы гидрофобных аминокислот устраняется под действием антител к низкоаффинным рецепторам фактора роста нервов

7. Специфичность действия Ь-аминокислот и их сочетаний на клеточные процессы в тканях от молодых и старых животных - пролиферацию, выживаемость, дифференцировку - создает базу для целенаправленного синтеза новых пептидных биорегуляторов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что в тканях от старых крыс уменьшается спектр аминокислот, действующих активно на пролиферативные процессы, указывают на необходимость при старении восполнения факторов, регулирующих основные клеточные процессы.

2. С учетом того, что при старении нарушается всасывание ряда аминокислот в желудочно-кишечном тракте, выявляется необходимость целенаправленного синтеза коротких пептидов из наиболее активных для данной ткани аминокислот, для последующей разработки лекарственных средств, предназначенных для профилактики и лечения возрастной патологии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах, включенных в Перечень ВАКМинобрнауки РФ

1. Влияние биорегуляторных пептидов на культуру клеток кожи молодых и старых крыс/М.А. Войцеховская, Н.И. Чалисова, Е.А. Концевая, Г.А. Рыжак // Бюлл. экспер. биол. мед. - м2011. - Т. 152, № 9. - С.327-330.

2. Влияние кодируемых аминокислот на развитие органотипической культуры тканей различного генеза молодых и старых крыс/А.В. Смирнов, Н.И. Чалисова, Г.А. Рыжак, Е.А. Концевая //Успехи геронтологии. - 2010. - Т. 23, №3. - С. 447-452.

3. Влияние коротких пептидов на развитие органотипической культуры ткани кожи молодых и старых крыс/М.А. Войцеховская, Н.И. Чалисова, Е.А. Концевая // Профилактическая и клиническая медицина. - 2011. - Т. 2, №2. - С. 110-113.

4. Влияние коротких пептидов на экспрессию сигнальных молекул в органотипической культуре клеток эпифиза/ В.Х. Хавинсон, Н.С. Линькова, Н.И. Чалисова, A.B. Дудков, Е.А. Концевая//Клеточные технологии в биологии и медицине. -2011. -№ 3. - С. 151-154.

5. Влияние аминокислот на экспрессию сигнальных молекул в органотипической культуре селезенки//Е.А. Концевая, Н.С. Линькова, Н.И. Чалисова, A.B. Дудков, Л.С.Козина, В.Х. Хавинсон//Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2012. - № 1. -С. 111-114.

6. Геропротекторное действие аминокислот и трипептидов в культуре ткани хряща крыс/А.В. Смирнов, Н.И. Чалисова, Г.А. Рыжак, Е.А. Концевая, М.А. Войцеховская //Успехи геронтологии. - 2011. - Т. 24, №1. - С. 139-142.

7. Геропротекторное действие препарата на основе экстракта из хрящевой ткани в органотипической культуре ткани хряща молодых и старых крыс/А.В. Смирнов, Н.И. Чалисова, Г.А. Рыжак, Е.А. Концевая, М.А. Войцеховская// Научные Ведомости Белгородского государственного университета. Серия Медицина. Фармация. Геронтология и гериатрия. - 2011. - Вып. 13/1, №4. - С. 75-80.

8. Пептидергическая стимуляция дифференцировки иммунных клеток эпифиза/ Н.С. Линькова, В.Х. Хавинсон, Н.И. Чалисова, A.C. Катанугина, Е.А. Концевая//Клеточные технологии в биологии и медицине. -2011. - № 3. - С. 143-147.

9. Протекторное влияние аминокислот при действии цитостатика в культуре лимфоидной ткани молодых и старых крыс/Н.И. Чалисова, A.B. Смирнов, С.А. Уртьева, Т.А. Уртьева, A.A. Бунина, Е.А. Концевая//Успехи геронтологии. - 2010. - Т. 23, №2. -С. 228-232.

10. Регуляторное влияние кодируемых аминокислот на основные клеточные процессы у молодых и старых животных/Н.И. Чалисова, Е.А. Концевая, М.А. Войцеховская, A.B. Комашня//Успехи геронтологии. - 2011. - Т. 24, № 2. -С. 189-197.

Тезисы докладов

11. Влияние аминокислот на клеточную пролиферацию в органотипической культуре тканей молодых и старых крыс/Е.А. Концевая, Н.И. Чалисова, Л.С. Козина//Матер. 5-ой юбилейной международной научно-практической конференции «Геронтологические чтения -2012». - 6-10 февраля 2012 г., БелГУ, Белгород. -Геронтологический журнал им. В.Ф. Купревича. - 2012. - Т. 3, № 1-2. - С. 21-22.

12. Влияние аминокислот на культуру ткани кожи у крыс разного возраста/ Н.И. Чалисова, М.А. Войцеховская, Е.А. Концевая // Сб. трудов юбилейной научн.-практ. конф. с междунар. участием «Актуальные проблемы геронтологии и гериатрии». Санкт-Петербург, 2011. - С. 282-283.

13. Влияние аминокислот на пролиферацию и апоптоз клеток в культуре ткани головного мозга крыс/С.А. Уртьева, Т.А. Уртьева, A.A. Бунина, Е.А. Концевая, А.Ю. Морозова//Матер. IV междунар. научн. конф. молодых ученых-медиков «Российский союз молодых ученых». Курск, 2010. - Т. III. - С. 3-4.

14. Влияние аргинина и его метаболитов на органотипическую культуру миокарда крыс/П.Ю. Морозова, С.А. Уртьева, Т.А. Уртьева, A.A. Бунина, А.Ю. Морозова, A.B. Смирнов, Е.А. Концевая//Вестник Педиатрической академии. Матер, студенческой науч. конф. Санкт-Петербург. - 2010. - С. 136.

15. Влияние кодируемых аминокислот на развитие органотипической культуры кожи/Н.И. Чалисова, М.А. Войцеховская, Е.А. Концевая//Матер. 7 междунар. научн. конф. «Донозология - 2010. Здоровый образ жизни и полезные для здоровья факторы». Санкт-Петербург, 2011. - С. 617-619.

16. Влияние комплексных пептидов на культуру ткани кожи молодых и старых крыс/М.А. Войцеховская, Е.А. Концевая//Матер. I всероссийской научн.-практ. конф. молодых ученых «Сибирский медико-биологический конгресс». Барнаул. - 2011. - С. 1415.

17. Влияние пептидов на пролиферацию и дифференцировку В-лимфоцитов селезенки/Н.С. Линькова, Е.П. Кузнецова, Е.А. Концевая//Матер. I всероссийской научн.-практ. конф. молодых ученых «Сибирский медико-биологический конгресс». Барнаул, 2011.-С. 34.

18. Геропротекторное влияние аминокислот на культуру ткани миокарда / Н.И. Чалисова, A.B. Смирнов, Е.А. Концевая//Сб. научн. работ VI научн.-практ. геронтологической конф. с междунар. участием «Пушковские чтения». Санкт-Петербург,

2010.-С. 295-296.

19. Геропротекторное влияние коротких пептидов на развитие органотипической культуры ткани кожи/М.А. Войцеховская, Н.И. Чалисова, Е.А. Концевая//Матер. XVI междунар. науч.-практ. конференции «Пожилой больной. Качество жизни». - Москва,

2011.-С. 32-33.

20. Морфометрическая оценка развития эксплантатов кожи в органотипической культуре/М.А. Войцеховская, Е.А. Концевая//Матер. 4-ой Всероссийской с междунар. участием научн. конф. «Метромед - 2011». - Санкт-Петербург, 2011.-С. 81-83.

21. Протекторное влияние аминокислот и пептидов при токсическом действии цитостатиков/Н.И. Чалисова, A.B. Смирнов, Е.А. Концевая, В.В. Белокопытова, А.Н. Жекалов, H.A. Ткачук, Б.Л. Гаврилюк, Б.А. Демин// Российская научн. конф. с междунар. участием «Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии». Санкт-Петербург, 2011.- С. 209.

22. Протекторное влияние биорегуляторных пептидов на культуру ткани кожи/М.А. Войцеховская, Е.А. Концевая//Матер. Всероссийской молодежной науч. конф.-школы «Нейробиология интегративных функций мозга». Медицинсксй академический журнал. -2011. - Т. 11, спецвыпуск. - С. 16.

23. Протекторное влияние биорегуляторных пептидов на кожу в культуре ткани/М.А. Войцеховская, Е.А. Концевая//Матер. VI междунар. научн. конгресса валеологов «Здоровье человека - 6». Санкт-Петербург, 2011. - С. 176-177.

24. Сочетанное влияние аминокислот при действии на культуру ткани миокарда/Н.И. Чалисова, A.B. Смирнов, Е.А. Концевая//Матер. 6 междунар. научн. конф. «Донозология - 2010. Здоровый образ жизни и полезные для здоровья факторы». Санкт-Петербург, 2010. - С. 379-381.

КОНЦЕВАЯ Елизавета Александровна ВЛИЯНИЕ АМИНОКИСЛОТ НА МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ТКАНЕЙ МОЛОДЫХ И СТАРЫХ КРЫС // Автореф. дис. канд. биол. наук: 14.01.30. - СПб.,

2012.-25 с._

Подписано в печать «21» февраля 2012 г. Формат 60484 1/16.

Бумага офсетная. Печать офсетная. Печ. л. 1,0.

Тираж 100 экз. Заказ 54.

Отпечатано с готового оригинал-макета.

ЗАО «Принт-Экспресс»

197101, С.-Петербург, ул. Большая Монетная, 5 лит. А.