Автореферат и диссертация по медицине (14.00.53) на тему:Влияние аминокислот и олигопептидов на лимфоидные ткани молодых и старых крыс

На правах рукописи

ЛЕСНЯК Виктория Владимировна

ВЛИЯНИЕ АМИНОКИСЛОТ И ОЛИГОПЕПТИДОВ НА ЛИМФОИДНЫЕ ТКАНИ МОЛОДЫХ И СТАРЫХ КРЫС

14.00.53 - геронтология и гериатрия

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

з ош>2::э

Санкт-Петербург - 2009

003468356

Работа выполнена в отделе клеточной биологии и патологии Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН

Научные руководители:

доктор биологических наук, кандадат медицинских наук, доцент Чалисова Наталья Иосифовна

кандидат биологических наук, доцент Козина Людмила Семеновна

Официальные оппоненты:

заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Кветной Игорь Моисеевич

доктор медицинских наук, профессор Соллертинская Татьяна Николаевна

Ведущее учреждение:

Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет»

Защита диссертации состоится ¿CCL&-_2009 года в « часов

на заседании диссертационного Совета Д 601.001.01 при Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН по адресу: 197110, г. Санкт-Петербург, пр. Динамо, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.

Автореферат разослан «_

» 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

Козина Л.С.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. В связи с увеличением средней продолжительности жизни и доли пожилых людей в общей численности населения особое внимание специалистов в области физиологии, биохимии и медицины уделяется исследованию закономерностей развития возрастной патологии и разработке новых геропротекторных препаратов. Идет постоянный поиск биологически активных веществ, которые позволят направленно корректировать структурные изменения и функциональную активность клеток, снижающиеся при возрастной патологии. При старении организма происходит замедление регенерации, связанное с нарушениями, как процессов клеточной пролиферации, так и апоптоза. Не менее важной проблемой, чем снижение регенерационных способностей тканей, является развивающаяся при старении организма тканевая гипоксия. Поэтому восстановление органов и тканей организма на клеточном уровне при их геронтологической дисфункции является актуальной задачей.

Регуляторные пептиды, влияющие на процессы клеточного роста и развития, широко распространены в живых организмах и выделяются различными клетками и тканями как эндокринные и аутокринные носители информации о локальном состоянии функций органа или ткани. Кроме того, они образуются в результате ограниченного протеолиза высокомолекулярных белков, находящихся в гуморальной среде. Эти низкомолекулярные олигопептиды (до 10 аминокислотных последовательностей) обладают широким спектром биологического действия и координируют выполнение биологических функций различными органами и тканями. Одной из функций биорегуляторных пептидов является осуществление воздействия на репаративные процессы в тканях организма за счет стимуляции клеточной пролиферации или ее торможения в процессе апоптоза. Пептиды в свою очередь гидролизуются до аминокислот, также обладающих, как показано в последнее время, регуляторными свойствами в отношении клеточной пролиферации и апоптоза [Белокрылов Г.А. и соавт., 1997; Чалисова Н.И. и соавт., 2000,2007]. Кроме того исследования, проведенные в лаборатории биохимии Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН [Козина JI.C. и соавт., 2008], показали, что некоторые короткие регуляторные пептиды, например, вилон, обладают выраженными антигипоксическими свойствами. Поэтому актуальной является проблема поиска пептидных препаратов, способных усиливать процессы регенерации в тканях и обладающих антиоксидантными свойствами, что позволит создать базу для разработки лекарственных средств, предназначенных для профилактики и лечения возрастной патологии. Процесс выделения индивидуальных пептидов и определения их биологической активности является чрезвычайно трудоемким, требует оценки активности многих сотен пептидов, что практически трудно осуществимо в течение короткого периода времени. В связи с этим важной является задача создания синтетических пептидов, что способствует более быстрому получению пептидов с различными свойствами, но без использования дорогостоящего сырья и длительных методов очистки. В Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН для их получения был

применен новый методический подход [Хавинсон В.Х. и соавт., 1999, 2000, 2006]. После аминокислотного анализа комплекса полипептидных фракций какой-либо ткани млекопитающих отбирали аминокислоты, присутствующие в соответствующих препаратах в наибольшем количестве. При конструировании первичной структуры пептида учитывали данные расчетов энергетически выгодных конформаций для ионизированной молекулы. Такой подход позволил разработать технологию получения пептидных регуляторов функциональной активности различных тканей. Были синтезированы дипептиды: вилон (Lys-Glu) и его структурный аналог AB 17, трипептид пинеалон (Lys-Glu-Arg) [Хавинсон В.Х. и соавт., 2006]. Возможность влиять на скорость основных клеточных процессов -пролиферацию и апоптоз - и, как следствие, вызывать изменение количества клеток, по сравнению с контролем, является одним из общих свойств пептидов млекопитающих, а также 20 кодируемых аминокислот. Поэтому исследование способности пептидов AB 17 и пинеалона стимулировать клеточную пролиферацию и антиоксидантную активность является актуальным для поиска препаратов, обладающих геропротекторными свойствами.

Наиболее адекватным методом для быстрой количественной оценки направленности влияния исследуемых биологически активных веществ является органотипическое культивирование фрагментов тканей [Калюнов В.Н, 1986; Чалисова Н.И. и соавт., 2003; Levi-Montalchini R., 1982]. Этот метод обладает рядом преимуществ, связанных с отсутствием в культуре ткани нервных, гуморальных и других влияний, которые присутствуют в целостном организме. Количественное изменение клеток в культуре ткани может служить критерием первичной интегральной оценки биологической активности. При этом становится возможным выяснить, какие пути апоптоза (рецептор-опосредованные или митохондриальные) задействованы при влиянии олигопептидов и аминокислот на клеточную пролиферацию. Можно предположить, что олигопетиды и аминокислоты обладают также протекторными свойствами при действии повреждающих агентов, нарушающих синтез и репарацию ДНК. Использование цитостатиков в онкологии, гериатрии является, к сожалению, недостаточно избирательным методом, т. к. при таком воздействии на организм повреждаются и нормальные клетки, вследствие чего часто наблюдаются побочные эффекты [Барыкина О.М; и соавт., 2004]. Большинство цитостатических веществ прямо или косвенно подавляют удвоение ДНК в S-фазе клеточного цикла, блокируя при этом процессы транскрипции и репликации, поэтому актуальным является исследование возможных протекторных свойств олигопептидов и аминокислот на фоне воздействия цитостатиков на эксплантаты тканей от молодых и старых животных.

Одним из важных факторов возникновения тканевой гипоксии, наблюдающейся при старении организма, является гипергомоцистеинемия. Модель пренатальной гипергомоцистеинемии у крыс, беременность которых протекает в условиях пищевой нагрузки метионином, является инструментом исследования молекулярного действия гомоцистеина и гомоцистеиновой кислоты in vivo [Козина JI.C. и соавт., 2008]. Выявление антиоксидантных свойств олигопептидов в данной модели позволит более глубоко понять механизмы регулирования основных клеточных процессов в организме, что может служить базой для создания новых геропротекторных препаратов.

Цель и задачи исследования

Цель работы заключалась в изучении влияния 20 кодируемых аминокислот и коротких пептидов на процессы пролиферации и апоптоза в органотипической культуре селезенки молодых и старых крыс и на активность антиоксидантных ферментов у крыс in vivo. Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

1. Исследовать влияние 20 кодируемых аминокислот на клеточную пролиферацию и апоптоз в органотипической культуре селезенки молодых и старых крыс.

2. Определить влияние 20 аминокислот в присутствии селективного регулятора митохондриального пути апоптоза 2,4-дишпрофенола, а также в присутствии антител к NGFR 75 на развитие органотипической культуры селезенки крыс разного возраста.

3. Изучить влияние 20 кодируемых аминокислот в присутствии цитостатика циклофосфана на развитие органотипической культуры селезенки молодых и старых крыс.

4. Изучить влияние дипептида АВ-17, трипептида пинеалона при действии цитостатика циклофосфана на развитие органотипической культуры селезенки молодых и старых крыс.

5. Исследовать влияние дипептида АВ-17, трипептида пинеалона на общую антиокислительную активность, антирадикальную активность и активность антиоксидантных ферментов при гипергомоцистеинемии, вызванной метиониновой нагрузкой у крыс.

Научная новизна работы

Впервые проведено систематизированное исследование 20 кодируемых аминокислот на развитие органотипической культуры селезенки молодых и старых крыс и установлено, что 16 аминокислот обладают активностью в отношении процессов клеточной пролиферации и апоптоза в эксплантатах от молодых крыс, в то время как в эксплантатах от старых крыс количество активных аминокислот снижается до пяти.

Установлено с помощью антител к иизкоаффинным рецепторам фактора роста нервов и селективного регулятора митохондриального пути апоптоза 2,4-диншрофенола, что аминокислоты с заряженным радикалом (глутаминовая кислота, лизин) только стимулируют клеточную пролиферацию, не регулируя процессы апоптоза. Гидрофобные аминокислоты могут действовать по рецепторному пути апоптоза, гистидин и аргинин - по митохондриальному пути.

Впервые при исследовании влияния дипептида АВ-17, трипептида пинеалона и кодируемых аминокислот на развитие органотипической культуры селезенки молодых и старых крыс в присутствии циклофосфана установлено, что эти вещества могут отменять ингибирующее действие цитостатика на лимфоидную ткань у молодых и старых крыс.

С помощью моноклональных антител к проапоптозному белку Р53 впервые выявлены пути развития апоптоза в лимфоидной ткани. Впервые показано, что введение пинеалона и пептида АВ-17 крысам оказывает антиоксидантный эффект,

препятствуя снижению активности супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы при экспериментальной гипергомоцистеинемии.

Практическая значимость работы

Выявленная отмена действия цитостатика под влиянием пептидов AB-17, пинеалона и аминокислот в органотипической культуре селезенки молодых и старых крыс может стать основой для исследования их клинической эффективности при лечении пациентов, получающих цитостатическую терапию, в том числе при заболеваниях, ассоциированных с возрастом. Антиоксидантный эффект пептидов AB-17 и пинеалона позволит усилить эффект терапевтических воздействий, что открывает перспективы целенаправленного изучения коротких пептидов для разработки лекарственных средств, предназначенных для профилактики и лечения возрастной патологии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. 20 кодируемых аминокислот влияют различным образом на процессы пролиферации и апоптоза в органотипической культуре лимфоидной ткани селезенки крыс в зависимости от возраста. В эксплантатах от старых крыс количество активных аминокислот снижается с 16 до 5 аминокислот по сравнению с эксплантатами от молодых крыс.

2. Аминокислоты с заряженным радикалом только стимулируют клеточную пролиферацию, не участвуя в регуляции процессов апоптоза, регуляция которых осуществляется в основном гидрофобными аминокислотами.

3. Дипептид АВ-17, трипептид пинеалон и аминокислоты устраняют цитостатическое действие циклофосфана на развитие органотипической культуры селезенки молодых и старых крыс, что создает базу их терапевтического использования для устранения побочных иммунодепрессантных эффектов при применении цитостатиков.

4. Пептиды пинеалон и АВ-17 оказывают антиоксидантный эффект, препятствуя снижению активности супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы в ткани селезенки при гипоксии у крыс, что создает основу для их дальнейшего изучения в качестве лекарственных средств, предназначенных для профилактики и лечения патологических процессов, в том числе ассоциированных с возрастом.

Апробация работы реализация результатов исследования

Материалы диссертации доложены на конгрессе «VI Europen Congr. of Internat. Association of Gerontology and Geriartrics» (Санкт-Петербург, 2007); 2-м Санкт-Петербургском Международном Экофоруме (Санкт-Петербург, 2008); на конференции «Донозология» (Санкт-Петербург, 2008); на IV научно-практической геронтологической конференции с международным участием «Пушковские чтения» (Санкт-Петербург, 2008). Результаты диссертации используются в научно-практической работе Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ: 4 статьи в журналах, включенных в перечень Высшей аттестационной комиссии

Минобрнауки РФ и рекомендованных для опубликования материалов диссертационных исследований, и 6 тезисов.

Связь с научно-исследовательской работой Института

Диссертационная работа выполнена по теме основного плана НИР Санкт-Петербургского Института биорегуляции и геронтологии Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, главы собственных исследований, главы обсуждения результатов исследования, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Текст диссертации изложен на 138 страницах, содержит 7 таблиц, иллюстрирован 33 рисунками. Список литературы содержит 245 источников, из них отечественных - 65, зарубежных -180.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Органотипическое культивирование тканей

Органотипическое культивирование тканей проводили по описанной ранее методике [Чалисова Н.И. и соавт., 1999, 2003]. В экспериментах использовано 2000 эксплантатов селезенки молодых (3-месячных) и старых (24-месячных) крыс линии Wistar. Отпрепарированные в стерильных условиях фрагменты тканей крыс разделяли на более мелкие части величиной около 1 мм. На дно чашки Петри с коллагеновой подложкой помещали эксплантаты, заливали культуралыюй средой (3 мл) и вводили исследуемые пептиды или аминокислоты в различных концентрациях. Питательная среда с рН 7,2 имела состав: 35% - раствора Хенкса, 35% - среды Игла, 25% - сыворотки крови плодов коровы, глюкоза (60 мг%), инсулин (0,5 ед/мл), гентамицин (100 ед/мл). Чашки Петри помещали в термостат при температуре 37±0,ГС и через 3 сут просматривали под фазово-контрастным микроскопом. Для визуализации эксплантатов применяли микротеленасадку для микроскопа (серия 10, МТН-13 "Альфа-Телеком", Россия). Для расчета индекса площади (ИП) эксплантатов использовали программу PhotoM 1.2. Для каждого исследуемого вещества анализировали по 20-25 экспериментальных и контрольных эксплантатов. Значения ИП выражали в процентах, принимая контрольное значение за 100%. В 1-е сутки культивирования происходило распластывание эксплантатов на коллагеновой подложке, выселение пролиферирующих и мигрирующих клеток, составляющих зону роста от края эксплантата.

В структурной организации периферической зоны эксплантатов выделяется, прежде всего, периферическая зона роста, а также капсула эксплантата, представленная 1-2 слоями фибробластов. С поверхности капсула покрыта мезотелием, который не образует сплошного пласта. Клетки мезотелия часто отходят друг от друга, округляются и отрываются от базальной мембраны. В результате на месте отпавших клеток образуются обширные просветы, через которые часть клеток мигрирует за пределы эксплантата. Среди мигрирующих и пролиферирующих клеток типируются макрофаги, фибробласты и специализированные клетки, т.е. лимфоциты, встречаются фигуры митозов. За счет

этих клеток и формируется периферическая зона роста эксплантатов, при измерении которой определяется ИП. Через 3 сут, если в эксперименте имела место стимуляция развития зоны роста, индекс площади экспериментальных эксплантатов увеличивался по сравнению с индексом площади контрольных эксплантатов. В случае замедления или угнетения развития зоны роста индекс площади эксплантатов понижался по сравнению с контрольными значениями.

Препараты

В работе использовали следующие химические реактивы: L-аминокислоты аланин (Ala), аргинин (Arg), аспарагин (Asn), аспартат (Asp), валин (Val), цистеин (Cys), глутамат (Glu), глицин (Gly), гистидин (His), изолейцин (Ile), лейцин (Leu), лизин (Lys), метионин (Met), фенилаланин (Phe), пролин (Pro), серин (Ser), треонин (Thr), триптофан (Тгр), тирозин (Туг) (производства «Sigma», США), регуляторы апоптоза - 2,4-динитрофенол («Vecton», Россия), циклофосфан («Верофарм», Россия), дипептид AB 17(Lys-Glu) и трипептид пинеалон (Lys-Glu -Arg), синтезированные в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.

Определение сочетапного действия циклофосфана с аминокислотами или ол игопепт идам и в культуре ткани селезенки молодых и старых крыс

Для изучения действия циклофосфана (ЦФ) на эксплантаты селезенки в органотипической культуре в питательную среду вводили циклофосфан в концентрациях 0.1-10 мг /мл. В каждой серии исследуемых концентраций эксплантировались также контрольные фрагменты тканей, в культуральную среду которых не добавляли ЦФ. Это позволяло наиболее точно выявить различия в развитии экспериментальных и контрольных эксплантатов.

Определение эффективной концентрации пептидов и аминокислот

При раститровке каждого из пептидов и аминокислот в концентрациях 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0, 10,0, 20,0, 50,0, 100,0, 200,0 нг/мл выявлено, что эффективные концентрации, дающие максимальный эффект стимуляции или угнетения зоны роста эксплантатов, составляли 0.05-10 нг/мл, т.е. были в диапазоне пикограммовых концентраций (10"12-10"13М). При использовании более высоких или более низких (подпороговых) концентраций не наблюдалось статистически достоверного эффекта стимуляции или угнетения роста эксплантатов и ИП оставался на уровне контрольных значений. В дальнейших исследованиях использовали эффективную концентрацию биологически активных веществ (0,05 нг/мл).

Концентрации Ю-10 - 10~14 моль/л относятся к диапазону сверхмалых доз. Под термином "сверхмалая доза" подразумевают такую дозу вещества, которая создает концентрацию на несколько порядков ниже равновесной константы взаимодействия вещества со своим эффектором. Использование сверхмалых доз аминокислот и олигопептидов связано с тем, что в последнее двадцатилетие опубликован ряд работ о чувствительности организмов к сверхмалым концентрациям биологически активных веществ [Чалисова Н.И. и соавт., 2002, 2005; Шевченко И.Н., 2003].

Иммуногистохимическое исследование эксплантатов

В периферической зоне роста эксплантатов на 3-й сутки определяли экспрессию проапоптозного белка Р53 и маркера пролиферации PCNA. Иммуногистохимическое исследование проводили с использованием моноклональных мышиных антител к проапоптозному белку Р53 (1:75, Novocastra). В качестве вторых антител использовали универсальный набор, содержащий биотинилированные анти-мышиные и анти-кроличьи иммуноглобулины. Визуализацию окраски проводили с применением комплекса авидина с биотинилированной пероксидазой (ABC-kit) с последующим проявлением пероксидазы хрена диаминобензидином (все реагенты Novocastra).

Для визуализации экспрессии Р53 и PCNA использовали одноэтапный протокол для мазков с фиксацией спиртом. Морфометрическое исследование проводили с использованием микроскопа Nikon Eclipse Е400, цифровой камеры Nikon DXM1200, персонального компьютера на базе Intel Pentium 4 и программного обеспечения «Видеотест-Морфология 4.0». В каждом случае измерения проводили в 10 полях зрения при. увеличении х400. Измеряли (в условных единицах) площадь экспрессии белка, которая представляла собой отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в исследуемой области, выражаемое в процентах.

Модель экспериментальной пренатальной гомоцистеипемии

Повышенный уровень гомоцистеина создавали в крови самок крыс линии Wistar (180-200 г) в период беременности. Данная модель заключается во введении в питье животных метионина в концентрации (1±0,01) г/кг массы крысы. Метионин добавляли в питьевую воду в концентрации, обеспечивающей указанные дозы с учетом суточного потребления воды животными. Нагрузку метионином начинали после констатации у животных состояния беременности и продолжали после появления потомства, которое продолжало получать метионин, как с молоком матери, так и в питьевом рационе. Беременность у подопытных животных протекала в условиях окислительного стресса, индуцированного повышенным уровнем гомоцистеина в плазме крови, как самки, так и формирующегося плода. Пептиды пинеалон и АВ-17 вводили в дозе 10 мкг/кг массы животных внутрибрюшинно ежедневно в течение 5 суток в первом триместре беременности. Растворы исследуемых веществ готовили на физиологическом растворе. Выбор способа введения веществ и дозы базировался на данных Козиной Л.С. и соавт. [2008], показавших, что пинеалон обладает выраженным антигипоксическим действием. По истечении сроков кормления крысят самок выводили из опыта, извлекали селезенку, которую хранили при температуре - 70°С для проведения биохимических исследований.

Было сформировано 4 экспериментальные группы животных:

1 - контроль (К), - животные с нормальным уровнем гомоцистеина в крови;

2 - метиониновые животные (М)- самки крыс с гипергомоцистеинемией;

3 - метиониновые животные + пинеалон (Ml) - самки крыс, которые получали метионин и пинеалон;

4 - метиониновые животные + АВ-17 (МП) - самки крыс, которые получали метионин и АВ-17.

Биохимические исследования

Для проведения биохимических исследований - определение общей антиокислительной активности, антирадикальной активности, активности антиоксидантных ферментов - супероксиддисмутазы (СОД) и глутатионпероксидазы (ГП) - готовили 10%-ный гомогенат селезенки крыс на 60 мМ растворе КН2Р04 буфера, содержащего 105 мМ КС1, рН 7,4. При получении супернатанта гомогенат, используемый для определения перечисленных показателей, центрифугировали в течение 15 мин. при 12000 об./мин.

Определение общей антиокислительной активности

В основу определения метода общей антиокислительной активности (ОАА) положена регистрация индуцированной хемилюминесценции (XJI) в присутствии перекиси водорода и сульфата железа: происходит каталитическое разложение перекиси ионами металлов переходной валентности (реакция Фентона). Образующиеся при этом НО' радикалы реагируют с ненасыщенными жирными кислотами и переводят их в свободнорадикальное (CP) состояние, тем самым инициируя появление неустойчивые тетраоксидов, распадающихся с выделением кванта света.

Для регистрации XJI в измерительную кювету хемилюминометра БХЛ-06 М (Нижний Новгород, Россия) вносили 490 мкл фосфатного буфера, 10 мкл центрифугата селезенки крыс и 400 мкл раствора FeS04. Все реактивы готовили на деионизированной воде.

Для инициации процесса в пробу быстро вносили 200 мкл раствора перекиси водорода. Сигнал регистрировали в течение 50 с и график о получаемой информации в виде непрерывной кинетической кривой выводили на дисплей компьютера. Интенсивность процесса CP окисления определяли по величине светосуммы за 30 с и измеряли в условных единицах, Антиоксидантный потенциал пробы (ОАА) коррелирует с величиной tg угла наклона кривой на стадии максимального убывания вспышки и измеряется в условных единицах.

Определение антирадикалъной активности

Для определения антирадикальной активности в гомогенатах селезенки крыс использовали безбелковый супернатант, полученный после осаждения белка из 0,25 мл гомогената фосфорно-вольфрамовой кислотой в соотношении 1:1. После отстаивания при температуре 4-8 С0 в течение 3-х часов объем фильтрата доводили до 1,5 мл дистиллированной водой и центрифугировали в течение 5 мин при 3000 об/мин. К супернатанту добавляли 3 мл раствора свободного радикала дифенилпикрилгидразила (ДФПГ) в этаноле с оптической плотностью 0,7 - 0,75 при длине волны 517 нм. Пробы хорошо перемешивали и через 7 мин добавляли

4 мл толуола, встряхивали. Для разделения фаз смесь центрифугировали в течение

5 мин при 3000 об/мин. Оптическую плотность верхнего окрашенного слоя измеряли спекгрофотометрически при длине волны 517 нм против толуола. Контрольная проба содержала 1,5 мл воды. Результаты выражали в эквивалентах мкМ аскорбиновой кислоты, по которой строили калибровочный график.

Определение активности глутатионпероксидазы

Глугатионпероксидаза катализирует расщепление гидроперекиси третбутила, используя в качестве субстрата восстановленный глутатион.

Реактивы:

Трис-HCl буфер, 0,1 М (рН 8.5), содержащий 0,34 мМ ЭДТА;

Трис-HCl буфер, 0,1 М (рН 8.5), содержащий 0,078% азида натрия и 0.01%

глутатиона восстановленного;

гидроперекись третичного бутила, приготовленный ex tempore: 5 мкл трет-бутила добавляют к 2.5 мл дистиллированной воды; ТХУ, 20% раствор;

реагент Эллмана, разведенный метанолом до концентрации 10 мМ.

В опыте использовали 3 пробы: опытную, контрольную и стандартную. Опытная проба содержала 0.1 мл реактива 1, 0,2 мл центрифугата селезенки и 0,73 мл реактива 2. Стандартная проба содержала 0,1 мл реактива 1, 0,2 мл центрифугата селезенки, 0,73 мл реактива 2 и 0,2 мл ТХУ. Контрольная проба содержала 0,83 мл реактива I, 0,2 мл центрифугата ткани и 0,2 мл ТХУ. Все пробы инкубировали на водяной бане при температуре 37 С° в течение 10 минут для подготовки к началу реакции. Реакцию запускали добавлением 0,07 мл гидроперекиси третичного бутила. После 5 минут инкубации при температуре 37 С0 реакцию останавливали 0,2 мл 20% раствора ТХУ, выдерживали 10 минут и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 минут. Для регистрации оставшегося глутатиона использовали реактив Эллмана. К 2,62 мл реактива 1 добавляли 0,1 мл супернатанта и 0,025 мл реактива 4. Образуется окрашенное соединение с максимум поглощения при длине волны 412 нм, которое регистрировали спектрофотометрически. Активность фермента выражали в ммолях GSH/ мин./ мг белка.

Определение активности супероксиддисмутазы

Принцип метода основан на подавлении образцом восстановления нитросинего тетразолия, происходящего в модельной системе, генерирующей супероксидные радикалы. Образец 10% гомогената селезенки крыс, приготовленного на 0,15 М Na-фосфатном буфере (рН 7,8), предварительно обрабатывали смесью хлороформ-этанол (1:2) для освобождения от избытка белка. Осадок центрфугировали в течение 10 мин при 3000 об./мин., в опыт брали 0,05 мл супернатанта. За условную единицу активности СОД принимали то количество образца, которое на 50% тормозит контрольную реакцию. Спектрофотометрическое измерение восстановления нитросинего тетразолия производили при длине волны 540 нм. В кювету помещали 2 мл реагента, содержащего 3,1 мг ЭДТА, 25 мг нитросинего тетразолия, 46 мг феназинметасульфата в 50 мл 0,15 М Na-фосфатного буфера (рН 7,8). В контрольную пробу добавляется буфер, не содержащий остальных компонентов. Реакцию запускали, добавляя в кювету 0,1 мл раствора 0,05 мМ раствора НАДН. Через 3 мин отмечали нарастание оптической плотности, которое регистрировали спектрофотометрически.

Определение белка в гомогенатах селезенки крыс осуществляли микробиуретовым методом при помощи набора фирмы Konelab, концентрация белка в гомогенатах селезенки составляла от 14 до 18 г/л.

Статистическая обработка результатов исследований

Математическое обеспечение исследования осуществляли в соответствии со стандартными методиками [Гланц С., 1999] с использованием параметрического метода - t-критерия Стьюдента. Статистическую обработку полученных экспериментальных данных производили с использованием программы "Microsoft Office Excel 2003". При тестировании каждого вещества в культуре ткани использовали 20-25 эксплантатов каждой ткани. Индекс площади выражали в процентах относительно контроля. Достоверность различий в индексах площади оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Вероятность ошибки цифровых данных закладывали в пределах 5%, что отвечает стандартам, принятым для медико-биологических исследований.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Влияние аминокислот на культуру ткани селезенки молодых и старых крыс

При скрининге кодируемых аминокислот в органотипической кулыуре лимфоидной ткани селезенки молодых и старых крыс найдено, что в культуре ткани селезенки 3-месячных крыс четыре аминокислоты - аспарагин, лизин, аргинин, глутаминовая кислота - вызывали выраженную стимуляцию зоны рост эксплантата. При действии 0,05 нг/мл лизина ИП увеличивался на 49±5% (п=20, р<0,05) по сравнению с контролем (п=21). При введении в культуральную среду 0,05 нг/мл аспарагина и аргинина зона роста увеличивалась на 32-35% по сравнению с контрольными эксплантатами. При действии 0,05 нг/мл глутаминовой кислоты ИП увеличивался на 27±3% (п=22, р<0,05) по сравненшо с контролем (п=19). В то же время, отмечалось выраженное уменьшение ИП при действии группы аминокислот - гистидина, глутамина, пролина, аспарагиновой кислоты, валина, тирозина, треонина, метионина, лейцина, фенилаланина, триптофана, цистеина - на 25-38%. Ингибирующее влияние остальных аминокислот было статистически не достоверным (аланин, серин, изолейцин). При добавлении аминокислот в культуру ткани селезенки старых, 24-месячных, крыс получены следующие результаты. Стимулирующим статистически достоверным влиянием на ИП обладали только аргинин - на 21 ±5% (п=20, р<0,05) по сравнению с контролем (п=20) и глутаминовая кислота -на 15±3% (п=21, р<0,05) по сравнению с контролем (п=18). Ингибирующее статистически достоверное действие на ИП эксплантатов селезенки выявилось у серина - на 16±4% (п=19, р<0,05) по сравнению с контролем (п=2Г), треонина -на 26±4% (п=20, р<0,05) по сравнению с контролем (п=20) и триптофана -на 31±3% (п=20, р<0,05) по сравнению с контролем (п=19). Действие других аминокислот было статистически недостоверным.

При иммуногистохимическом исследовании экспрессии проапоптозного белка Р53 в зоне роста эксплантатов селезенки крыс выявлено достоверное изменение его экспрессии, коррелирующее с воздействием аминокислот на ИП (табл. 1). Аминокислоты, которые достоверно угнетали ИП по сравнению с контролем, выявили высокий уровень экспрессии Р53. К таким аминокислотам относятся триптофан, фенилаланин, лейцин, метионин, треонин, цистеин,

аспарагиновая кислота. Другие аминокислоты, которые достоверно стимулировали ИП по сравнению с контролем (аргинин, аспарагин, лизин, глутаминовая кислота), вызывали низкий уровень экспрессии Р53.

Таблица 1

Влияние аминокислот на индекс площади (%) и экспрессию белка Р53 (%) па рост эксплантатов в культуре ткани селезенки

Аминокислота Изменение ИП по отношению к контролю, % Изменение экспрессии Р53 по отношению к контролю, %

Аспарагин +32±4* +3±1

Лизин +30±5* +8±4

Аргинин +28±3* -5+2

Глутаминовая кислота +35±7* -3+1

Треонин -60±6* +100±10*

Аспарагиновая кислота -40±6 * +55±15*

Цистеин -37±4 * +40±13*

Метионин -38±4 * +91±14 *

Лейцин -35±3* +93±15 *

Фенилаланин -32±3 * +63±12*

Триптофан -30±3 4 +78±13 *

Примечание: - *р<0,05 - по сравнению с контролем.

Исследование путей апоптоза, задействованных в реализации эффектов аминокислот

Выделяют два пути реализации апоптоза: митохондриальный и рецепторно-опосредованный. Митохондриальный путь свойственен патологически изменённым клеткам и опосредуется цитохромом с разрушенных митохондрий, тогда как рецепторно-опосредованный путь типичен для неповреждённых клеток и опосредуется особыми рецепторами цитоплазматической мембраны. Для определения ведущего пути апоптоза, задействованного в реализации эффекта исследованных Ь-аминокислот, были использованы химические вещества - селективные регуляторы митохондриального и рецепторно-опосредованного путей апоптоза: 2,4-динитрофенол и низкоаффинные антитела к фактору роста нервов, соответственно. Результаты экспериментов, проведенных в органотипической культуре селезенки крыс, продемонстрировали выраженный проапоптотический эффект 2,4-динитрофенола в диапазоне концентраций от 10 мкг/мл до 100 мкг/мл. Культуральная среда с концентрацией 2,4-динитрофенола 10 мкг/мл угнетает рост органотипической культуры селезенки на 24±4% (п=23, р<0,05). Индекс площади при использовании 2,4-динитрофенола в концентрациях

50 мкг/мл и 100 мкг/мл составил -26±6% (п=22, р<0,05) и -29±3% (п=22, р<0,05), соответственно.

При введении в органотипическую культуру селезенки смеси, состоящей из эффективных аминокислот (аргинин, глутаминовая кислота) и 2,4-динитрофенола, индекс площади через 3 суток культивирования был достоверно больше, чем индекс площади при изолированном применении 2,4-динитрофенола (табл. 2).

Таблица 2

Влияние 2,4-динитрофенола на индекс площади в присутствии различных

аминокислот

Наименование аминокислоты Изменение индекса площади, %

AK ДНФ+AK

Gly 2±1 29±4*

Ala 3+1 2±1

Asn 25±3* 6±2

Hys -32+6* -20±3*

Lys 30±7* -13±5

Ser -5±1 15+7

Gin -15±5 im

Arg 28±3* 21+3*

Pro -20±5* 8±4

Glu 27±4* 48±7*

Asp -38+7* 2+1

Cys -20±3* 10±3

Туг -37+8* 31±5*

Va! -38±9* 27+4*

Thr -38±7* 57±11*

Met -37±6* 9±3

Leu -28±4* -11+5

Ile -2±1 17±4*

Phe -27± -15±6

Trp -25±5* 55+10*

Примечание: — * р<0,05 по сравнению с контролем.

Например, индекс площади органотипической культуры селезенки при добавлении в культуральную среду смеси из эффективных концентраций Ь-аргинина и 2,4-динитрофенола, составил 21±6% (п=22, р<0,05), что достоверно больше индекса площади, полученного при избирательном добавлении в культуральную среду 2,4-динитрофенола в концентрации 50 мкг/мл (-2б±6%, п=22, р<0,05). Аналогичные эффекты снятия угнетающего эффекта 2,4-динитрофенола и увеличения ИП продемонстрированы для валина, треонина, триптофана, тирозина, а также глицина. Значения индекса площади органотипической культуры селезенки молодых крыс через 3 суток культивирования в присутствии эффективных аминокислот и 2,4-динитрофенола составили: 26±2% для смеси "Ь-валин + 2,4-динитрофенол" (п=23, р<0,05), 57±5% для смеси "Ь-треонин + 2,4-динитрофенол" (п=23, р<0,05), 55±5% для смеси «Ь-триптофан + 2,4-динитрофенол» (п=23, р<0,05), 31±2% для смеси «Ь-тирозин +

2,4-динитрофенол» (п=23, р<0, 05), что достоверно больше индекса площади, полученного при изолированном введении в культуральную среду 2,4-динитрофенола в концентрации 50 мкг/мл (-26±6%, п=23, р<0,05).

Следовательно, можно предположить, что антиапоптотический эффект указанных аминокислот связан с ингибированием митохондриального пути апоптоза. Эксперименты по изучению совместного влияния Ь-гистидина и 2,4-динитрофенола не показали статистически достоверного отличия от индекса площади, полученного при монокомпонентном использовании эффективной концентрации 2,4-динитрофенола. Если индекс площади органотипической культуры селезенки через 3 суток культивирования при добавлении 2,4-динитрофенола равен -26±6% (п=22, р<0,05), то введение в культуральную среду смеси 2,4-динитрофенола с Ь-гистидином уменьшает индекс площади на 20±4% (п = 23, р<0,05). Можно полагать, что антипролиферативный эффект Ь-гистидина, вероятно, связан с активацией митохондриального пути апогггоза.

Таким образом, получены данные, отражающие устранение ингибирующего эффекта ДНФ при действии всех аминокислот, за исключением гистидина. Особенно выражен эффект при действии аминокислот с заряженным радикалом и гидрофобных аминокислот.

При исследовании рецепторно-опосредованного пути апоптоза при действии антител к фактору роста нервов в культуре лимфоидной ткани при введении в культуральную среду каждой из аминокислот наблюдали процессы стимуляции или угнетения ИП. При действии эффективной концентрации лизина ИП увеличивался на 45±5% (п=21, р<0,05) по сравнению с контролем (п=20).

При введении в культуральную среду аргинина зона роста возрастала, что выражалось в увеличении ИП на 33±5% (п=25, р<0,05) по сравнению с контролем (п=23). При действии аспарагина ИП увеличивался на 34±1% (п~21, р<0,05) по сравнению с контролем (п=22), а при действии 0,05 нг/мл глутаминовой кислоты ИП возрастал до 25±3% (п=25, р<0,05) по сравнению с контролем (п=20). Глицин, аланин, изолейцин и серии не оказывали влияния на развитие эксплантатов, и ИП оставался на уровне контрольных значений. Остальные аминокислоты (гистидин, пролин и вся группа гидрофобных аминокислот) вызывали статистически достоверное угнетение развития зоны роста эксплантатов. Так, при действии 0,05 нг/мл тирозина ИП уменьшался на 29±3% (п=21, р<0,05) по сравнению с контролем (п=24).

При введении в культуральную среду 0,05 нг/мл валина, треонина или метионина наблюдалось почти одинаковое статистически достоверное уменьшение площади зоны роста, что выражалось в снижении ИП на 35±5% (п=23, р<0,05), на 35±7% (п=25, р<0,05) и на 35+3% (п=20, р<0,05), соответственно, по сравнению с контролем (п=22, 21 и 20).

Сочетанное введение в культуральную среду каждой из аминокислот с антителами к ЫСГКр75 привело к другим результатам. Так, изолированное введение в культуральную среду только антител к МОРЯр75 в эффективной концентрации приводило к угнетению зоны роста эксплантатов селезенки на 30±3% (п=21, р<0,05) по сравнению с контролем (п=23). Действие аспарагина, лизина и глутаминовой кислоты в присутствии антител к ЫОРЯр75 продолжало оставаться стимулирующим, и ИП увеличивался статистически достоверно на 28-

34% по сравнению с ИП контрольных эксплантатов. Таким образом, действие этих аминокислот в присутствии антител к ЫОР11р75 практически не отличалось от изолированного действия аминокислот. Лишь аргинин, который при изолированном применении статистически достоверно увеличивал ИП эксплантатов, при сочетанием его действии с антителами к ИОРЯр75 снижал ИП на 21±3% (п=20, р<0,05) по сравнению с контролем (п=18). Не отмечалось изменения влияния глицина, аланина, изолейцина и серина в присутствии антител к КОРЯр75 на развитие эксплантатов, и ИП оставался на уровне контрольных значений. Однако в присутствии антител к ЫОРКр75 изменялось действие всех тех аминокислот, у которых при изолированном введении в культуру лимфоидной ткани происходило ингибирование зоны роста. Так, введение в культуральную среду гидрофобных аминокислот (аспарагиновая кислота, цистеин, тирозин, валин, треонин, метионин, лейцин, фенилаланин, триптофан) в сочетании с антителами к ЫОРИр75 приводило к снятию их угнетающего влияния. Зона роста эксплантатов становилась сопоставима с зоной роста в контроле, и значения ИП не отличались от контрольных значений. Введение в культуральную среду гистидина и пролина, которые при изолированном действии также угнетали развитие эксплантатов, привело даже к значительной стимуляции зоны роста и ИП достоверно увеличился на 23-44% (р< 0,05).

Сочетанное действие циклофосфана с аминокислотами или олигопептидами в культуре ткани селезенки молодых и старых крыс

На основе данных биотестирования всех 20 транслируемых аминокислот в культуре лимфоидной ткани были проведены серии экспериментов сочетаний аминокислот с цитостатиком - циклофосфаном на развитие эксплантатов селезенки.

Для изучения действия циклофосфана на эксплантаты селезенки в органотипической культуре в питательную среду вводили ЦФ в концентрациях 0,1-10 мг/мл. В каждой серии исследуемых концентраций эксплантировали также контрольные фрагменты тканей, в культуральную среду которых не добавляли ЦФ. Это позволяло наиболее точно выявлять различия в развитии экспериментальных и контрольных эксплантатов.

Обнаружено, что уже начиная с концентрации 0,1 мг/мл циклофосфана начиналось частичное ингибирование зоны роста, что приводило к статистически достоверному уменьшению индекса площади на 18±3% (п=20, р<0,05) по сравнению с контрольными значениями (п=22). При дальнейших увеличениях концентраций рост эксплантатов затормаживался еще больше. При концентрации циклофосфана 0,5 мг/мл ИП эксплантатов уменьшался уже на 25±5% (п=21, р<0,05) по сравнению с индексом площади в контроле (п=23). При введении циклофосфана в культуральную среду в концентрации 1 мг/мл всегда возникало статистически достоверное угнетение развития эксплантатов селезенки крыс, выражавшееся в снижении индекса площади на 23-30% по сравнению с индексом площади контрольных эксплантатов (р<0,01). Таким образом, ИП эксплантатов при действии ЦФ статистически достоверно отличался от ИП контрольных эксплантатов при концентрациях ЦФ 1 мг/мл, и в этих условиях уровень снижения ИП экспериментальных эксплантатов составлял 20-35%. При

дальнейшем увеличении концентрации ЦФ развитие эксплантатов угнеталось в более сильной степени, так что зона роста не формировалась при концентрации ЦФ 10 мг/мл, и ИП зоны роста эксплантатов селезенки по сравнению с контролем снижался на 100%.

Как видно из полученных данных, ИП эксплантата и концентрация ЦФ находились в отрицательно-корреляционной дозо-зависимости: чем больше увеличивалась концентрация ЦФ, тем меньше становился ИП экспериментальных эксплантатов по сравнению с ИП контрольных эксплантатов.

Однако сочетание ЦФ со всеми аминокислотами, за исключением гистидина и пролина, приводило к статистически достоверному устранению ингибирующего влияния цитостатика (табл. 3). Особенно это явление было выражено у глутаминовой кислоты.

При изолированном введении какой-либо из аминокислот - лизина, аргинина, аспарагина, глутаминовой кислоты в концентрации 10"12 М наблюдали, как и в предыдущих исследованиях, увеличение индекса площади эксплантатов на 25-38%, по сравнению с индексом площади контрольных эксплантатов.

Таблица 3

Влияние циклофосфана на индекс площади эксплантатов селезенки в присутствии амипокнслот

Наименование аминокислоты Изменение индекса площади (%)

AK ЦФ+АК

Gly 2±1 1+1

Ala 3+1 2±1

Asn 25±3* -1+1

Hys -32+7* -18±3*

Lys 30+5* -10+2

Ser -5+2 3±1

Gin -15±6 -4±1

Arg 28±5* -9±5

Pro -20+3* -15+2*

Glu 27±4* 8+3

Asp -38+7* 1±1

Cys -20±4* 2+1

Туг -37+5* -7+2

Val -38+9* -8±5

Thr -38±7* -5±3

Met -37±5* -11±3

Leu -28±4* -8±4

Ile -2±1 2±1

Phe -27±6* -7+2

Trp -25±5* 5+1

Примечание:- *р<0.05 по сравнению с контролем.

Однако при сочетанием действии ингибирующего агента с аминокислотой лизином, аргинином, аспарагином в эффективной концентрации 10"12 М происходило устранение угнетающего эффекта циклофосфана в эксплантатах. Отсутствие ингибирующего влияния циклофосфана выражалось в том, что происходило лишь статистически не достоверное уменьшение зоны роста эксплантатов селезенки на 10±7% (п=24, р>0,05), что сравнимо с контрольными значениями индекса площади (п=22). Сочетанное действие эффективной концентрации ингибирующего агента циклофосфана с глутаминовой кислотой в концентрации 10"12 М приводило уже не только к полному устранению ингибирующего влияния цитосгатика, но и к статистически не достоверному увеличению зоны роста эксплантатов селезенки (рис.1). В эксплантатах от старых крыс снятие ингибирующего эффекта циклофосфана происходило под влиянием аргинина, глутаминовой кислоты, серина, треонина и триптофана.

1 (иклофосфа

&и

Циклофосфан-КЗТи

Рис.1. Действие циклофосфана, глутаминовой кислоты и их сочетаний на эксплантаты селезенки старых крыс.

Нулевая линия - значения индекса площади (ИП) в контроле. Примечание:- *р<0,05 по сравнению с контролем.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что при изолированном действии циклофосфана в лимфоидной ткани эксплантатов селезенки крыс происходит угнетение клеточной пролиферации. Молекулярный механизм токсического действия циклофосфана связан с его алкилирующими свойствами и, вследствие этого, с его способностью вступать в связь с анионами фосфорных и карбоновых кислот, фенолов, а также с аминогруппами. Эти химические радикалы широко представлены в нуклеиновых кислотах, ферментах и структурных белках. В этой связи их цитостатический эффект начинается уже в фазе клетки и содействует торможению в фазе в. Для их действия необходимо наличие в молекуле препарата 2 алкилирующих групп, которые образуют в

молекуле ДНК поперечные связи и, таким образом, блокируют репликацию ДНК и затем прекращают митозы в клетках, с чем связано также цитостатическое действие циклофосфана.

25 -, *

20 - *

15 -

10 5 -

гг о----,---,--

Е -5 - 1 2 3

-10 --15 --20 -

-30 -1

Рис.2. Действие циклофосфана (1), АВ-17 (2) и их сочетаний (3) на эксплантаты селезенки старых крыс. Нулевая линия - значения индекса площади (ИП) в контроле. Примечание:- *р<0,05 по сравнению с контролем.

При сочетанием действии ингибирующего агента с дипептидом АВ-17 в эффективной концентрации 2 нг/мл происходило устранение угнетающего эффекта циклофосфана в эксплантатах селезенки молодых и старых крыс. При этом наблюдалась также статистически достоверная стимуляция роста эксплантатов селезенки на 19±3% (п=25, р<0,05) выше контрольного значения (п=20), (рис. 2).

Таким образом, при изучении совместного влияния повреждающего агента циклофосфана и короткого пептида АВ-17 на развитие эксплантатов лимфоидной ткани получены данные, свидетельствующие о протекторных свойствах пептида при ингибирующем влиянии цитостатиков. Изолированное введение в культуральную среду эксплантатов селезенки молодых крыс трипептида пинеалона приводило к увеличению ИП на 26%±7%, (п=20, р<0,05) по сравнению с контрольными значениями ИП (п=21). При этом экспрессия проапоптозного белка Р53 уменьшалась на 27±5% по сравнению с контрольными эксплантатами. Однако при сочетанном действии ингибирующего агента циклофосфана с пептидом пинеалон в эффективных концентрациях происходило устранение угнетающего эффекта ЦФ в эксплантатах. Отсутствие ингибирующего влияния циклофосфана выражалось в том, что происходило увеличение зоны роста эксплантатов селезенки на 4±1% (п=22, р>0,05), что сравнимо с контрольными значениями индекса площади (п=22) (рис.1). Исчезало также увеличение экспрессии белка Р53, значения площади его экспрессии были на уровне контрольных величин. Введение в культуральную среду эксплантатов селезенки от старых 24-месячных крыс циклофосфана в концентрации 1 мг/мл вызывало статистически достоверное угнетение развития эксплантатов на 24±5% (п=20, р<0,05) ниже контрольного значения (п=21), экспрессия белка Р53 при этом увеличивалась. При

изолированном введении в культуралыгую среду пептида пинеалон наблюдалось увеличение ИП на 23±3%, (п=20, р<0,05) по сравнению с контрольными значениями ИП (п=21), а экспрессия белка Р53 уменьшалась на 24±3, по сравнению с контролем.

При сочетанном действии в культуре ткани селезенки 24-месячных крыс циклофосфана в концентрации 1 мг/мл с пептидом пинеалон в эффективной концентрации происходило устранение угнетающего эффекта цитостатика в эксплантатах. Наблюдали лишь статистически не достоверное уменьшение зоны роста эксплантатов селезенки, сравнимое с контрольными значениями индекса площади. Экспрессии белка Р53 находилась на уровне контрольных значений.

Антиоксидантное действие штеалона и пептида АВ -17 при гипергомоцистеинемии

Результаты исследования показали, что при гипергомоцистеинемии, индуцированной введением животным метионина, наблюдается значительное снижение активности антиоксидантных ферментов - супероксидцисмутазы и глутатионпероксидазы. Как видно из представленных на рис. 3, 4 данных, активность СОД и ГП снижается при этом более чем в 3 раза, что может быть, как считает ряд авторов [Но P.I. et al.,2002; Bayadas G. et al., 2003], причиной усиления токсического действия активных форм кислорода при гипергомоцистеинемии.

з 2 2

1

1

Контроль Метионин Мет+Пин Мет+АВ-17

Рис. 3. Влияние метиониновой нагрузки и пептидных препаратов (пинеалон и AB-17) на активность супероксидцисмутазы в ткани селезенки. Примечание: *р<0, 05 по сравнению с контролем; ** р<0, 001 по сравнению с метионином.

Снижение активности антиоксидантных ферментов при гипергомоцистеинемии, вызванной метиониновой нагрузкой или хроническим введением животным гомоцистеина, ранее было обнаружено в крови [Ventura Р. et al., 2000], сперме [Sonmez М. et al., 2007], печени [Valcinkaya S. et al., 2008] и нервной ткани [Streck et al., 2003]. Гипергомоцистеинемия относится к факторам, индуцирующим окислительный стресс в организме, и одним из наиболее существенных его проявлений при этом является окислительное повреждение ДНК

[Huang R.F.S. et al., 2001; Matte C. et al., 2009]. Установлено, что оно вызвано повышением активности нуклеаз под влиянием активных форм кислорода, прежде всего, гидроксил-радикала [Matte С. et al., 2009], а также супероксидного радикала и перекиси водорода, образующихся при аутоокислении гомоцистеина [Faraci F.M. et al., 2004].

—f-няя

Т

-ч.

* т Ч"

ю

Ь _

Контроль Метионин Мет+Пин Мет+АВ-17

Рис. 4. Влияние метиониновой нагрузки и пептидных препаратов (пинеалон и АВ-17) на активность глутатионпероксидазы в ткани селезенки.

Примечание: *р<0, 05 по сравнению с контролем: **р<0, 001 по сравнению с метионином.

Показано также, что эксайтотоксические эффекты гомоцистеина и его метаболита гомоцистеиновой кислоты осуществляются посредством связывания с ЫМОА-рецепторами, а также метаботропными рецепторами глутамата, причем этот эффект проявляется не только в нейронах, но и клетках иммунной системы. Исследованиями, проведенными Болдыревым А.А. и соавт., доказано, что глутаматные рецепторы лимфоцитов служат мишенью токсического действия гомоцистеина и гомоцистеиновой кислоты при гипергомоцистеинемии [УМусЬепвкауа Е.А й а1., ТуиНпа О.У., ВоИугеу А.А., 2006; МаэЬкта А.Р. е! а1., 2007]. Гипергомоцистеинемия вызывает окислительный стресс и стимулирует иммунные клетки, повышение концентрации свободных радикалов в этих условиях является сигнальным механизмом для активации процессов пролиферации и продуцирования цитокинов.

Проведенные нами исследования показали, что введение коротких пептидов (пинеалона и АВ-17) подопытным животным оказывало антиоксидантный эффект, препятствуя снижению активности СОД и ГП в ткани селезенки. Как видно из представленных на рисунках 3 и 4 данных, активность антиоксидантных ферментов в этих условиях, хотя и не достигала контрольного уровня, но была значительно выше, чем при метиониновой нагрузке крыс, которым исследуемые пептиды не вводили. Не исключено, что исследуемые пептиды уменьшают степень окислительного повреждения ДНК, что предотвращает истощение антиоксидантного потенциала клетки, в том числе угнетение активности антиоксидантных ферментов. До настоящего времени не установлено, осуществляется ли непосредственное взаимодействие коротких пептидов с ядерной

или митохондриальной ДНК. Вероятнее всего они, как и большинство пептидных гормонов и других внешних сигналов нелипофильной природы, реализуют свое регуляторное действие через универсальный для эукариот мембранно-внутриклеточный механизм. Хорошо известно, что функционирование митохондрий и репарация митохондриальной ДНК невозможны без импорта белков, кодируемых ядерным геномом. Ферменты репарации ядерной ДНК синтезируются в цитоплазме и с помощью белков-переносчиков митохондриальной мембраны транспортируются в матрикс митохондрий. По-видимому, таким образом регулируется репаративная и транскрипционная активность митохондриальных генов под влиянием коротких пептидов [Khavinson V.Kh., Malinin V.V., 2005], в том числе используемых нами пинеалона и пептида АВ-17.

Кроме того, исследуемые пептиды могут стимулировать экспрессию генов антиоксидантных ферментов. Подобный механизм описан в отношении влияния мелатонина на активность супероксиддисмутазы и глутатиопероксидазы в различных тканях и клеточных культурах [Rodriguez С. et al., 2004]. Установлено, что мелатонин способствует синтезу de novo антиоксидантных ферментов в культуре недифференцироваш!Ых РС12 клеток и нейробластомы SK-N-SH, повышая уровень соответствующих мРНК, чего не происходит в присутствии в культуральной среде ингибитора синтеза белка циклогексимида [Mayo J.C. et al., 2002]. Экспрессия антиоксидантных ферментов в условиях окислительного стресса является компенсаторным механизмом, позволяющим защитить клетки от повреждающего действия избыточного количества свободных радикалов.

Наряду с этим, были опубликованы данные о том, что гипергомоцистеинемия способствует усилению апоптоза. Впервые это было обнаружено в гиппокампе крыс [Kruman I.I. et al., 2000]. Впоследствии было показано, что обогащенная гомоцистеином диета вызывает фрагментацию ДНК в нейронах гиппокампа крыс, сопровождающуюся повышением уровня содержания в них проаполтического белка Вах и снижением количества антиапоптического белка Вс12 [Bayadas G. et al., 2005]. Белки семейства Вс12 играют ключевую роль в апоптозе, поскольку они уменьшают проницаемость митохондриальных мембран и предотвращают выход цитохрома с в цитоплазму. В последнее время появились данные, свидетельствующие о том, что биологически активные соединения, •обладающие антиоксидантными свойствами, являются цитопротекторами, предохраняющими клеточные структуры от повреждающего действия гипергомоцистеинемии. Было обнаружено, что мелатонин препятствует окислительному повреждению липидов и белков, вызванному гомоцистеином, в гомогенатах мозга крыс [Ortega-Gutirrez S. et al., 2007]. Гипергомоцистеинемия является сопутствующим фактором, усугубляющим течение ряда нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера, сердечнососудистой патологии и атеросклероза.

В связи с этим применение препаратов, обладающих защитным антиапоптотическим действием при гипергомоцистеинемии, при терапии ассоциированных с возрастом заболеваний является исключительно актуальной задачей [McCully K.S. et al., 2005; Boldyrev A.A., Johnson P., 2007]. В этом аспекте весьма перспективными могут оказаться исследованные пептиды пинеалон и АВ-17.

Полученные ранее данные свидетельствуют о том, что механизмы модулирующего влияния на клеточные процессы у различных групп аминокислот не одинаковы [Белокрылов Г.А. и соавт., 1999; Чалисова Н.И. и соавт., 2000; 2006]. В наших предыдущих исследованиях в органотипической культуре лимфоидной ткани было выявлено разнонаправленное (в зависимости от степени зрелости ткани) влияние четырех высокомолекулярных (146 - 174 Да) аминокислот с низкой гидрофобностью (0,8 - 3,9 кДж/моль) - аспарагина, лизина, аргинина и глутаминовой кислоты, обладающих заряженной боковой группой, основной - лизин и аргинин, кислой - глутаминовая кислота. У других аминокислот не наблюдалось такого зеркального соответствия угнетающего эффекта в культуре незрелой ткани и стимулирующего эффекта в культуре зрелой ткани, как это происходило при действии аспарагина, лизина, аргинина и глютаминовой кислоты в эксплантатах селезенки. В литературе имеются данные, что повторяющиеся олигопептидные блоки в составе регуляторных белков наиболее часто содержат аминокислоты с заряженной боковой группой и низкой гидрофобностью [Белокрылов Г.А. и соавт., 1999]. Эти аминокислоты рассматриваются в качестве простейших регуляторов и стимуляторов физиологических функций. Как известно, из всех физико-химических свойств аминокислот именно гидрофобность их боковых групп очень важна для их межмолекулярных взаимодействий. Таким образом, механизмы действия групп аминокислот с различной гидрофобностью на основные клеточные процессы -пролиферацию и апоптоз - могут быть различными, что согласуется с предположением об участии электростатических и гидрофобных взаимодействий в этих процессах.

При исследовании путей, задействованных в регуляции апоптоза, в данной работе было обнаружено, что действие тех аминокислот, которые стимулируют клеточную пролиферацию зрелой лимфоидной ткани - лизин, аспарагин и глутаминовая кислота, за исключением аргинина, происходит независимо от низкоаффинных рецепторов фактора роста нервов (ФРН). Увеличение зоны роста и, соответственно, ИП, происходило в присутствии антител к ЫОИ1р75, блокирующих рецепторы ФРН, так же, как и при изолированном действии аминокислот, как это было показано в первой серии опытов. Аргинин, несмотря на его способность при изолированном действии увеличивать ИП в эксплантатах селезенки, снижал уровень ИП при сочеташюм действии с антителами к КСИ1р75, что, видимо, связано с более сложными путями модулирующего влияния аргинина. Аргинин является субстратом синтазы окиси азота, которая таким образом может участвовать в регуляции пролиферационных процессов. Напротив, у тех аминокислот, которые при изолированном применении вызывали ингибирование зоны роста, происходила отмена угнетающего влияния на развитие эксплантатов в присутствии антител к ЫСРЯр75. Можно заключить, что эта группа аминокислот, не обладающих положительно заряженной боковой группой и находящихся на конце спектра возрастающей гидрофобности (5,3 - 7,5 кДж/моль) может опосредовать проапоптозное действие через низкоаффинные рецепторы ФРН, так как при блокаде рецепторов антителами устраняется ингибирующее влияние данных аминокислот на ткани.

На основании полученных результатов исследования можно заключить, что регуляторные свойства аспарагина, лизина, глутаминовой кислоты опосредуются

без вовлечения рецепторов таких ростовых факторов, как ФРН, в то время как влияние высоко гидрофобных аминокислот зависит от присутствия рецепторов к ростовым факторам.

Проведены исследования возможного протекторного действия олигопептидов и аминокислот на фоне цитостатического действия такого ингибитора синтеза ДНК, как циклофосфан. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при изолированном действии циклофосфана в лимфоидной ткани эксплантатов селезенки крыс происходит угнетение клеточной пролиферации за счет усиления процессов апоптоза. Молекулярный механизм токсического действия циклофосфана связан с его алкилирующими свойствами и, вследствие этого, с его способностью вступать в связь с анионами фосфорных и карбоновых кислот, фенолов, а также с аминогруппами. Эти химические радикалы широко представлены в нуклеиновых кислотах, ферментах и структурных белках. В этой связи их цитостатический эффект начинается уже в фазе 01 клетки и содействует торможению в фазе в. Для их действия необходимо наличие в молекуле препарата 2 алкилирующих групп, которые образуют в молекуле ДНК поперечные связи и, таким образом, блокируют репликацию ДНК и затем прекращают митозы в клетках, с чем связано также цитостатическое действие циклофосфана. Экспериментальные данные показывают, что как сами аминокислоты, так и дипептид АВ-17 и трипептид пинеалон, состоящий из аминокислот с заряженным боковым радикалом - кислым у аспарагиновой и глутаминовой кислоты и основным у лизина, способны устранять ингибирующий эффект циклофосфана в органотипической культуре лимфоидной ткани селезенки молодых и старых крыс, при этом снижается экспрессия проапоптотического белка р53. Можно полагать, что олигопептиды, состоящие из эффективных в отношении лимфоидной ткани аминокислот, оказались способны устранять ингибирующее влияние циклофосфана в культуре лимфоидной ткани за счет уменьшения выраженности процессов апоптоза в эксплантатах селезенки как от молодых, так и от старых крыс.

Полученные в экспериментах данные создают базу для изучения пептидов АВ 17 и пинеалона в качестве лекарственных средств для устранения побочных иммунодепрессантных эффектов при применении цитостатиков, для устранения гипоксии, в том числе при заболеваниях, ассоциированных с возрастом.

Эти данные необходимо учитывать при синтезе новых регуляторных пептидов, которые могут влиять на клеточные процессы пролиферации и апоптоза в тканях организма. Создается основа для целенаправленного создания биорегуляторных пептидов для усиления регенерационных процессов в поврежденных тканях, а также для увеличения апоптоза при опухолевых процессах.

выводы

1. 20 кодируемых аминокислот влияют различным образом на процессы пролиферации и апоптоза в органотипической культуре лимфоидной ткани селезенки крыс в зависимости от возраста. В эксплантатах от молодых крыс 4 аминокислоты вызывают стимуляцию клеточной пролиферации и 12 аминокислот - угнетение пролиферации. В эксплантатах селезенки старых крыс количество активных аминокислот снижается до двух, усиливающих пролиферацию, и трех, угнетающих ее.

2. Аминокислоты с заряженным радикалом (глутаминовая кислота, лизин) только стимулируют клеточную пролиферацию, не регулируя процессы апоптоза. Гидрофобные аминокислоты могут действовать по рецепторному пути апоптоза, гистидин и аргинин - по митохондриальному пути.

3. Аминокислоты, сохраняющие активное действие на клеточную пролиферацию в эксплантатах селезенки от старых крыс, способны устранять угнетающее влияние цитостатика в культурах клеток.

4. Короткие пептиды (дипептид АВ-17 и трипептид пинеалон) устраняют цитостатическое действие циклофосфана на развитие органотипической культуры селезенки молодых и старых крыс, что создает базу для их дальнейшего изучения в качестве лекарственных средств для устранения побочных иммунодепрессантных эффектов при применении цитостатиков, в том числе при патологии, ассоциированной с возрастом.

5. Пептиды пинеалон и АВ-17 оказывают антиоксидантный эффект, препятствуя снижению активности супероксидцисмутазы и глутатионнероксидазы в ткани селезенки, что может быть использовано для дальнейшего изучения их в качестве геропротекторных препаратов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Обнаружение протекторного влияния пептидов пинеалона и АВ-17 при действии цитостатиков создают основу для их дальнейшего изучения в качестве лекарственных средств, предназначенных для устранения побочного действия цитостагической терапии, в том числе при заболеваниях, ассоциированных со старением организма.

2. Выявление антиоксидантной активности пептидов пинеалона и АВ-17 при гипоксических состояниях создает основу для их дальнейшего изучения в качестве геропротекторных средств, предназначенных для профилактики и лечения патологических состояний, ассоциированных с возрастом.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журнале по перечню ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации:

1. Влияние пептидных препаратов эпифиза на пролиферативные процессы

в органотипической культуре преоптической области гипоталамуса/Ю.П. Милютина, JI.C. Козина, А.В. Арутюнян, Н.И. Чалисова., В.В. Лесняк//Успехи геронтологии. 2007. - Т. 20. - № 4. - С. 61-63.

2. Протекторное влияние трипептида в присутствии циклофосфана в культуре лимфоидной ткани крыс/Н.И.Чалисова, В.В. Лесняк, Г.А. Рыжак, Е.В. Оганезова// Бюл. эксперим. биол. мед. - 2008. - Т. 145, №6. - С. 605-608.

3. Чалисова Н.И. Сравнительный анализ действия тетрапептидов и аминокислот

в органотипической культуре тканей молодых и старых крыс/Н.И. Чалисова, В.В. Лесняк, П.Ю. Морозова//Успехи геронтологии-2007 -Т. 21,№2,-С. 246-251.

4. Чалисова Н.И. Протекторное влияние аминокислот и пептидов при сочетанном действии с цитостатиком в культуре лимфоидной ткани/Н.И. Чалисова,

B.В. Лесняк, А.Д. Ноздрачев//Докл. АН.-2009. - Т. 434, №5. - С. 57-61.

Тезисы

5. Козина JI.C. Возрастная динамика показателей свободно-радикальных процессов и антиоксидантной системы/Л.С. Козина, В.В. Лесняк//«Актуальные проблемы геронтологии и гериатрии»// Сб. трудов юбилейной научно-практической конференции «XX лет первой в России кафедре гериатрии» (под ред. проф. А.Л. Арьева) СПб МАЛО, 27-28 апреля 2006 г., СПб. - 2006. - С. 288-289.

6.Лесняк В.В. Иммунномодулирующее и антигипоксическое действие геропротекторного пептида пинеалона в селезенке крыс//В.В. Лесняк, Н.И.Чалисова, Л.С. Козина//Геронтологические чтения,- Белгород. - 2009. -

C.23-24.

7. Чалисова Н.И. Протекторное влияние трипептида в присутствии циклофосфана в культуре лимфоидной ткани/Н.И. Чалисова, В.В. Лесняк//Матер.

П-го Санкт-Петербургского международного экологического форума, 1-4 июля 2008, СПб. Вестник Российской Военно-медицинской академии. - 2008. - №3 (23). - Приложение 2.- Часть I. - С. 47.

8. Чалисова Н.И. Протекторное влияние аминокислот при действии цитостатика

в культуре лимфоидной ткани/Н.И. Чалисова, В.В. Леспяк//Матер. конференции «Донозология». СПб.- 2008. - С. 314-315.

9. Чалисова Н.И. Модулирующее влияние аминокислот на клеточные процессы

в культуре нервной и мезенхимной ткани/ Н.И. Чалисова, В.В. Лесняк// Матер. IV научно-практической геронтологической конф. с международным участием, посвященной памяти Э.С.Пушковой (Пушковские чтения), 20-21 ноября 2008 г., С-Петербург. - 2008. - С. 79.

¡O.Chalisova N.I. Modulatory effect of amino acids on the liver tissue culture of young and old rats/ N. I. Chalisova, L.S. Kozina, V.V. Lesnyak// Abstr. VI European Congress «Healthy and active ageing for all Europeans» International association of gerontology and geriatrics, 5-8 July, 2007. Adv. In Gerontology. 2007. - Vol. 20, №3 - P. 25.

ЛЕСНЯК Виктория Владимировна ВЛИЯНИЕ АМИНОКИСЛОТ И ОЛИГОПЕПТИДОВ НА ЛИМФОИДНЫЕ ТКАНИ МОЛОДЫХ И СТАРЫХ КРЫС// Автореф. дис. канд. мед. наук: 14.00.53 - СПб., 2009. - 26 с.

Подписано в печать «09» апреля 2009. Формат 60*84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 402. Отпечатано с готового оригинал-макета. ЗАО "Принт - Экспресс" 197376, С.-Петербург, ул. Большая Монетная, 5 лит. А

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. В связи с увеличением средней продолжительности жизни и доли пожилых людей в общей численности населения, особое внимание специалистов в области физиологии, биохимии и медицины уделяется исследованию закономерностей развития возрастной патологии и разработке новых геропротекторных препаратов. Идет постоянный поиск биологически активных веществ, которые позволят направленно корректировать структурные изменения и функциональную активность клеток, снижающиеся при возрастной патологии. При старении организма происходит замедление регенерации, связанное с нарушениями, как процессов клеточной пролиферации, так и апоптоза. Не менее важной проблемой, чем снижение регенерационных способностей тканей, является развивающаяся при старении организма тканевая гипоксия. Поэтому восстановление органов и тканей организма на клеточном уровне при их геронтологической дисфункции является актуальной задачей.

Регуляторные пептиды, влияющие на процессы клеточного роста и развития, широко распространены в живых организмах и выделяются различными клетками и тканями как эндокринные и аутокринные носители информации о локальном состоянии функций органа или ткани. Кроме того, они образуются в результате ограниченного протеолиза высокомолекулярных белков, находящихся в гуморальной среде. Эти низкомолекулярные олигопептиды (до 10 аминокислотных последовательностей) обладают широким спектром биологического действия и координируют выполнение биологических функций различными органами и тканями. Одной из функций биорегуляторных пептидов является осуществление воздействия на репаративные процессы в тканях организма за счет стимуляции клеточной пролиферации или ее торможения в процессе апоптоза. Пептиды в свою очередь гидролизуются до аминокислот, также обладающих, как показано в последнее время, регуляторными свойствами в отношении клеточной пролиферации и апоптоза [Белокрылов Г.А. и соавт., 1997; Чалисова Н.И. и соавт., 2000, 2007]. Кроме того, исследования, проведенные JI.C. Козиной и соавт. (2008), показали, что некоторые короткие регуляторные пептиды, например вилон, обладают выраженными антигипоксическими свойствами. Поэтому актуальной является проблема поиска пептидных препаратов, способных усиливать процессы регенерации в тканях и обладать антиоксидантными свойствами, что позволит создать базу для разработки лекарственных средств, предназначенных для профилактики и лечения возрастной патологии.

Процесс выделения индивидуальных пептидов и определения их биологической активности является чрезвычайно трудоемким, требует оценки активности многих сотен пептидов, что практически, трудно осуществимо в течение короткого периода времени. В связи с этим важной является задача создания синтетических пептидов, что способствует более быстрому получению пептидов с различными свойствами, но без использования дорогостоящего сырья и длительных методов очистки. В Санкт-Петербургском Институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН для их получения был применен новый методический подход [Хавинсон В.Х. и др., 1999, 2000, 2006]. После аминокислотного анализа комплекса полипептидных фракций какой-либо ткани млекопитающих отбирали аминокислоты, присутствующие в соответствующих препаратах в наибольшем количестве. При конструировании первичной структуры пептида учитывали данные расчетов энергетически выгодных конформаций для ионизированной молекулы. Такой подход позволил разработать технологию получения пептидных регуляторов функциональной активности различных тканей. Были синтезированы дипептиды: вилон (Lys-Glu) и его аналог АВ17, трипептид пинеалон [Хавинсон В.Х. и др.2006]. Способность влиять на скорость основных клеточных процессов — пролиферацию и апоптоз, - и, как следствие, вызывать изменение количества клеток, по сравнению с контролем, является одним из общих свойств пептидов млекопитающих, а также 20 кодируемых аминокислот. Поэтому исследование способности пептидов АВ-17 и пинеалона стимулировать клеточную пролиферацию и антиоксидантную активность является актуальным для поиска препаратов, обладающих геропротекторными свойствами.

Наиболее адекватным методом для быстрой количественной оценки направленности влияния исследуемых биологически активных веществ является органотипическое культивирование фрагментов тканей [Калюнов В.Н., 1986; Чалисова Н.И. и соавт., 2003; Levi-Montalchini R., 1982].Этот метод обладает рядом преимуществ, связанных с отсутствием в культуре ткани нервных, гуморальных и других влияний, которые присутствуют в целостном организме. Количественное изменение клеток в культуре ткани может служить критерием первичной интегральной оценки биологической активности. При этом становится возможным выяснить, какие пути апоптоза (рецептор-опосредованные или митохондриальные) задействованы при влиянии олигопептидов и аминокислот на клеточную пролиферацию. Можно предположить, что олигопетиды и аминокислоты обладают также протекторными свойствами при действии повреждающих агентов, нарушающих синтез и репарацию ДНК. Использование цитостатиков в онкологии, гериартрии является, к сожалению, недостаточно избирательным методом, т. к. при таком воздействии на организм повреждаются и нормальные клетки, вследствие чего часто наблюдаются побочные эффекты [Барыкина О.М. и соавт., 2004]. Большинство цитостатических веществ прямо или косвенно подавляют удвоение ДНК в S-фазе клеточного цикла, блокируя при этом процессы транскрипции и репликации, поэтому актуальным является исследование возможных протекторных свойств олигопептидов и аминокислот на фоне воздействия цитостатиков на эксплантаты тканей от молодых и старых животных.

Развитие процессов апоптоза, или программированной клеточной гибели, также тесно связано с нарушениями репарации ДНК. В связи с этим представляется чрезвычайно важным выясненить, какие пути апоптоза задействованы при влиянии олигопептидов и аминокислот на клеточную пролиферацию. Известно, что на поверхности субпопуляции лимфоцитов и мононуклеарных клеток селезенки и лимфатических узлов, а таюке на тучных клетках существуют низкоаффинные рецепторы к фактору роста нервов (ФРН) - NGFR р75 , имеющие структурное сходство с рецепторами к фактору некроза опухоли. Ранее рецепторам NGFRp75 отводилась роль модуляторов для высокоафинных тирозин киназных рецепторов ФРН. Однако недавно с помощью моноклональных антител и антисмысловых олигонуклеотидов установлено, что рецепторы NGFRp75 являются индукторами программированной клеточной гибели по митохондриальному пути в нервной и лимфоидной тканях, регулируя экспрессию генов Вс1-2, Bcl-xl, Fas. Блокада этих рецепторов приводит к ослаблению их апоптоз-индуцирующей активности. Исследование сочетанного действия олигопептидов и аминокислот с нейротрофинами в органотипической культуре лимфоидной ткани является чрезвычайно важным для выявления их участия в процессах клеточной пролиферации и апоптоза. Для верификации ведущего пути апоптоза, задействованного в реализации эффекта пептидов и аминокислот, может использоваться такой селективный регулятор митохондриального пути апоптоза как 2,4-динитрофенол, который разобщает окисление и фосфорилирование и блокирует синтез аденозинтрифосфата в митохондриях. Достаточно сложно определить роль олигопептидов и аминокислот в регуляции клеточных популяций без учета и анализа межклеточных взаимоотношений, интегрирующих системный ответ. Помощь в решении такой задачи может дать методология комплексного морфофункционального анализа, способная объективно изучать клеточную патологию и регенерацию тканей, верифицировать пролиферативную активность и программируемую гибель клеток (апоптоз), а также оценивать деятельность клеточных структур и межклеточных коммуникаций.

Одной из важных причин возникновения тканевой гипоксии, наблюдающейся при старении организма, является гипергомоцистеинемия. Поэтому адекватным методом для изучения антиоксидантного действия пинеалона и пептида АВ-17 in vivo является модель пренатальной гипоксии, одним из факторов возникновения и развития которой является гипергомоцистеинемия. Модель пренатальной гипергомоцистеинемии у крыс, беременность которых протекает в условиях пищевой нагрузки метионином, является инструментом исследования молекулярного действия гомоцистеина и гомоцистеиновой кислоты in vivo [Козина JI.C. и соавт.2008]. На поздних стадиях беременности гипергомоцистеинемия является причиной развития хронической фетоплацентарной недостаточности и хронической внутриутробной гипоксии плода. Возможное устранение гипоксической патологии с помощью пептидов АВ-17 и пинеалона имеет большое значение для лечения таких состояний. Выявление антиоксидантных свойств олигопептидов в данной модели позволит более глубоко понять механизмы регулирования основных клеточных процессов в организме, что может служить базой для создания новых геропротекторных препаратов. Цель и задачи исследования

Цель работы заключалась в изучении влияния 20 кодируемых аминокислот и коротких пептидов на процессы пролиферации и апоптоза в органотипической культуре селезенки молодых и старых крыс и на активность антиоксидантных ферментов у крыс in vivo. Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

1. Исследовать влияние 20 кодируемых аминокислот на клеточную пролиферацию и апоптоз в органотипической культуре селезенки молодых и старых крыс.

2. Определить влияние 20 аминокислот в присутствии селективного регулятора митохондриального пути апоптоза 2,4-динитрофенола, а также в присутствии антител к NGFR 75 на развитие органотипической культуры селезенки крыс разного возраста.

3. Изучить влияние 20 кодируемых аминокислот в присутствии цитостатика циклофосфана на развитие органотипической культуры селезенки молодых и старых крыс.

4. Изучить влияние дипептида АВ-17, трипептида пинеалона при действии цитостатика циклофосфана на развитие органотипической культуры селезенки молодых и старых крыс.

5. Исследовать влияние дипептида АВ-17, трипептида пинеалона на общую антиокислительную активность, антирадикальную активность и активность антиоксидантных ферментов при гипергомоцистеинемии, вызванной метиониновой нагрузкой у крыс.

Научная новизна работы

Впервые проведено систематизированное исследование 20 кодируемых аминокислот на развитие органотипической культуры селезенки молодых и старых крыс и установлено, что 16 аминокислот обладают активностью в отношении процессов клеточной пролиферации и апоптоза в эксплантатах от молодых крыс, в то время как в эксплантатах от старых крыс количество активных аминокислот снижается до пяти. Установлено, с помощью антител к низкоаффинным рецепторам фактора роста нервов и селективного регулятора митохондриального пути апоптоза 2,4-динитрофенола, что аминокислоты с заряженным радикалом (глутаминовая кислота, лизин) только стимулируют клеточную пролиферацию, не регулируя процессы апоптоза. Гидрофобные аминокислоты могут действовать по рецепторному пути апоптоза, гистидин и аргинин - по митохондриальному. Впервые при исследовании влияния дипептида АВ-17, трипептида пинеалона и кодируемых аминокислот на развитие органотипической культуры селезенки молодых и старых крыс в присутствии циклофосфана и установлено, что эти вещества могут отменять ингибирующее действие цитостатика у молодых и старых крыс.

С помощью моноклональных антител к проапоптозному белку Р53 впервые выявлены пути развития апоптоза в лимфоидной ткани. Впервые показано, что введение пинеалона и пептида АВ-17 крысам оказывает антиоксидантный эффект, препятствуя снижению активности супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы при экспериментальной гипергомоцистеинемии.

Практическая значимость работы

Выявленная отмена действия цитостатика под влиянием пептидов АВ-17 пинеалона и аминокислот в органотипической культуре селезенки молодых и старых крыс могут стать основой для использования их в клинической практике для лечения пациентов, получающих цитостатическую терапию, в том числе при заболеваниях, ассоциированных с возрастом. Антиоксидантный эффект пептидов АВ-17 и пинеалона, позволит усилить эффект терапевтических воздействий, что открывает перспективы целенаправленного изучения три- и тетрапептидов для разработки лекарственных средств, предназначенных для профилактики и лечения возрастной патологии.

Положения, выносимые на защиту

1. 20 кодируемых аминокислот влияют различным образом на процессы пролиферации и апоптоза в органотипической культуре лимфоидной ткани селезенки крыс в зависимости от возраста.

В эксплантатах от старых крыс количество активных аминокислот снижается с 16 до пяти аминокислот по сравнению с эксплантатами от молодых крыс.

2. Аминокислоты с заряженным радикалом только стимулируют клеточную пролиферацию, не участвуя в регуляции процессов апоптоза, регуляция которых осуществляется в основном гидрофобными аминокислотами.

3. Дипептид АВ-17, трипептид пинеалон и аминокислоты устраняют цитостатическое действие циклофосфана на развитие органотипической культуры селезенки молодых и старых крыс, что создает базу их терапевтического использования для устранения побочных иммунодепрессантных эффектов при применении цитостатиков.

4. Пептиды пинеалон и АВ-17 оказывают антиоксидантный эффект, препятствуя снижению активности супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы в ткани селезенки при гипоксии у крыс, что создает основу для их дальнейшего изучения в качестве лекарственных средств, предназначенных для профилактики и лечения патологических процессов, в том числе ассоциированных с возрастом.

Связь с планом НИР института

Диссертационная работа выполнена по теме основного плана НИР Санкт-Петербургского Института биорегуляции и геронтологии Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ: 4 статьи в журналах, включенных в перечень Высшей аттестационной комиссии Минобрнауки РФ и рекомендованных для опубликования материалов диссертационных исследований, и 6 тезисов.

Апробация и реализация диссертации. Материалы диссертации доложены на конгрессе «VI Europen Congr. of Internat. Association of Gerontology and Geriartrics», С-Петербург, 2007; 2-м Санкт-Петербургском Международном Экофоруме, С-Петербург, 2008; на конференции «Донозология», С-Петербург, 2008; на IV научно-практической геронтологической конференции с международным участием «Пушковские чтения» С-Петербург, 2008.

Результаты диссертации используются в научно-практической работе Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, главы собственных исследований, главы обсуждения результатов исследования, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Текст диссертации изложен на 137 страницах, содержит 5 таблиц, иллюстрирован 29 рисунками. Список литературы содержит 238 источников, из них отечественных - 82, зарубежных -156.

выводы

1. 20 кодируемых аминокислот влияют различным образом на процессы пролиферации и апоптоза в органотипической культуре лимфоидной ткани селезенки крыс в зависимости от возраста. В эксплантатах от молодых крыс 4 аминокислоты вызывают стимуляцию клеточной пролиферации и 12 аминокислот - угнетение пролиферации. В эксплантатах селезенки старых крыс количество активных аминокислот снижается до двух, усиливающих пролиферацию, и трех, угнетающих ее.

2. Аминокислоты с заряженным радикалом (глутаминовая кислота, лизин) только стимулируют клеточную пролиферацию, не регулируя процессы апоптоза. Гидрофобные аминокислоты могут действовать по рецепторному пути апоптоза, гистидин и аргинин - по митохондриальному пути.

3. Аминокислоты, сохраняющие активное действие на клеточную пролиферацию в эксплантатах селезенки от старых крыс, способны устранять угнетающее влияние цитостатика в культурах клеток.

4. Короткие пептиды (дипептид АВ-17 и трипептид пинеалон) устраняют цитостатическое действие циклофосфана на развитие органотипической культуры селезенки молодых и старых крыс, что создает базу для их дальнейшего изучения в качестве лекарственных средств для устранения побочных иммунодепрессантных эффектов при применении цитостатиков, в том числе при патологии, ассоциированной с возрастом.

5. Пептиды пинеалон и АВ-17 оказывают антиоксидантный эффект, препятствуя снижению активности супероксиддисмутазы и глутатионнероксидазы в ткани селезенки, что может быть использовано для дальнейшего изучения их в качестве геропротекторных препаратов.

Ill

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Обнаружение протекторного влияния пептидов пинеалона и АВ-17 при действии цитостатиков создают основу для их дальнейшего изучения в качестве лекарственных средств, предназначенных для устранения побочного действия цитостатической терапии, в том числе при заболеваниях, ассоциированных со старением организма.

2. Выявление антиоксидантной активности пептидов пинеалона и АВ-17 при гипоксических состояниях создает основу для их дальнейшего изучения в качестве геропротекторных средств, предназначенных для профилактики и лечения патологических состояний, ассоциированных с возрастом.