Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Вирус Эпштейна-Барр и рак желудка

На правах рукописи

РГБ ОД

1 8 ФЕВ т?

ГОНЧАРОВА Елена Васильевна

Вирус Эпштейна-Барр и рак желудка: поиск и анализ вирусологических и молекулярно-биологнческих маркеров

14.00.14 - Онкология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2001

Работа выполнена в Российском онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохина РАМН

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Гурцевич В.Э.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Киселев Ф.Л. кандидат медицинских наук Чувиров Г.Н.

Ведущая организация: НИИ Вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН

Диссертационного совета К.001.17.01 Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН по адресу: 115478, Москва, Каширкое ш., д.24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН

Защита состоится

в

на заседании

Автореферат разослан «

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор медицинских наук

Барсуков Ю.А.

Е Ш ч, о

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Изучение роли вирусов в возникновении опухолей человека составляет важный аспект современных исследований в области онкологии. Среди различных онкогенных вирусов существенный интерес представляет вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ), который относится к семейству герпесвирусов, является убнквитариым и персистирует в организме человека в течение всей жизни. С этим вирусом связывают возникновение африканской лимфомы Беркитта (ЛБ), недифференцированного рака носоглотки (нРМГ), В-клеточных лимфом у больных с нммунодефицитами различного происхождения и др. Спектр патологических процессов у человека, в возникновении которых, предположительно, участвует ВЭБ, постоянно расширяется. В настоящее время широко обсуждается вопрос о роли ВЭБ в процессе канцерогенеза эпителиальных клеток желудка. Прямые доказательства ассоциации ВЭБ и рака желудка (РЖ) получены в результате обнаружения в опухолевых клетках ряда вирусных маркеров таких, например, как РНК гена ЕВЕШ, белков ЕВИА1 и ЬМР2. Кроме того, установлено, что опухолевые клетки, несущие геном вируса, моноклональны. Вирусные маркеры находили в опухолевых клетках желудка любой морфологической структуры, но наиболее часто при низкодифференцировапных формах с интенсивной лимфоидной пролиферацией.

Практически 95-100% населения планеты инфицировано ВЭБ, однако, механизм возникновения ассоциированных с этим вирусом заболеваний, включая и РЖ, остается открытым. Возникает вопрос, один и тот же или разные генетические варианты вируса персистируют у здоровых и больных лиц, в опухолевых и морфологически "нормальных" клетках. В этой связи, геп ВЭБ -ВЫЯР1, кодирующий латентный мембранный белок 1 (ЬМР1), представляет особый интерес. Во-первых, это один из немногих генов ВЭБ, который обладает трансформирующим потенциалом; во-вторых, определенные

структурные перестройки этого гена способствуют увеличению трансформирующего потенциала вируса. Возможно, дальнейший глубокий молекулярно-биологический анализ "опухолевых" и "неопухолевых" вариантов ВЭБ позволит, по крайней мере, приблизиться к решению поставленного вопроса.

Рак желудка в России занимает одно из ведущих мест среди наиболее часто встречающихся новообразований человека. В связи с этим, поиск ВЭБ-ассоциированных случаев РЖ (ВЭБ+РЖ) у населения страны, определение их частоты среди всех опухолей этой локализации, а также выяснение роли вируса в их этиопатогенезе, представляется актуальной научной и практической задачей.

Цель и задачи исследования. Целыо настоящей диссертационной работы явилось обнаружение ВЭБ-ассоциированных форм рака желудка в некоторых регионах России с различным уровнем заболеваемости РЖ, определение их удельного веса среди новообразований желудка, серологическая характеристика, а также детальное вирусологическое, молекулярно-биологическое и морфологическое изучение.

В ходе выполнения исследовании предполагалось решить следующие задачи:

создать архив клинического материала от больных РЖ (парафиновые блоки с фрагментами опухолей, операционный материал, сыворотки крови);

исследовать опухолевый материал от больных РЖ из нескольких регионов России и стран бывшего СССР на присутствие вирусной информации в реакции гибридизации in situ (ISH) с использованием в качестве вирусного маркера РНК гена EBERI ВЭБ;

проанализировать морфологическую структуру случаев РЖ, ассоциированных с ВЭБ;

провести скрининг сывороток больных РЖ и здоровых носителей на наличие и титры антител к белкам литического цикла ВЭБ;

определить первичную нуклеотидную структуру одного из генов латентной инфекции ВЭБ - LMP1, амплифпцировапного из образцов опухолевой и морфологически неизмененной тканей желудка, больных ВЭБ-ассоциированной формой РЖ;

субклонировать полученные варианты LMP1 ВЭБ в эукарнотический экспрессирующий вектор и изучить их функциональное поведение.

Научная новизна и практическое значение работы. Научная новизна работы заключается в том, что впервые был проведен поиск ВЭБ-ассоциинрованных случаев РЖ в России, охарактеризована их морфологическая структура, изучен гуморальный ответ больных РЖ к белкам литического цикла инфекции ВЭБ. Кроме того, впервые были определены нуклеотидные последовательности вариантов полноразмерного гена LMP1 ВЭБ, амплифицнрованного из опухолевой и морфологически неизмененной тканей ВЭБ+РЖ; проведен анализ по изучению их экспрессии и биологической активности, в частности, способности активировать транскрипционный фактор NFkB.

Практическое значение полученных результатов исследований состоит в выявлении форм опухолей желудка, ассоциированных с ВЭБ на территории страны. Обнаружение таких случаев РЖ может послужить важной предпосылкой для углубленного изучения их этиопатогеиеза, разработки новых подходов ранней диагностики и, возможно, терапии. Результаты данных исследований будут также способствовать более глубокому пониманию механизмов ВЭБ-ассоциированного канцерогенеза на модели одной из эпителиальных опухолей человека.

Апробация работы. Диссертация апробирована 25 мая на совместной научной конференции лабораторий вирусного канцерогенеза, регуляции клеточных и вирусных онкогенов, молекулярной биологии вирусов и иммунологии онкогенных вирусов НИИ Канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

Основные положения диссертации докладывались на 23 Международной конференции «European Tumor Virus Group» (Франция, Париж, 1999) и 8-ой международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы» (Россия, Санкт-Петербург, 2000).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных статей и 9 тезисов докладов, 1 статья принята в печать.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, четырех разделов (обзор литературы, описание использованных материалов и методов, результаты исследований, обсуждение полученных результатов), выводов и списка использованных источников. Работа изложена на 111 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц, 13 рисунков. Библиография включает 5 источников отечественной и 144 иностранной литературы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Характеристика ВЭБ-ассоцчированиых форм РЖ в некоторых регионах России и бывшего СССР

Целью первого этапа исследований являлось выявление случаев РЖ, ассоциированных с ВЭБ в России, определение их удельного веса среди всех опухолей этой локализации, а также их вирусологическая и морфологическая характеристика. Обнаружение таких вариантов опухоли создало бы

предпосылку для проведения в дальнейшем комплекса исследований, направленных на изучение их патогенеза и клинико-морфологических особенностей, а также способствовало бы выяснению роли вируса в инициации и прогрессии опухолевого процесса.

Нами были проанализированы парафиновые блоки с фиксированными в 10% формалине фрагментами опухолей желудка от больных, оперированных по поводу РЖ в Онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохина РАМН в период с 1992 по 1994 гг. Присутствие в клетках ВЭБ констатировали при обнаружении в них ранних РНК гена ЕВЕШ, определяемых методом 1БН. Данный раздел работы был выполнен совместно с М.Токипаца (отдел патологии госпиталя г. Кагошимы, Япония).

Из 184 случаев РЖ, исследованных в настоящей работе, вирусспецифическин продукт был выявлен в 17 (9,2%). При этом, в ядрах практически всех опухолевых клеток позитивных образцов наблюдали интенсивный гибридизационный сигнал. В тоже время клетки слизистой желудка, находящиеся по периферии опухоли с различными изменениями (атрофический гастрит, кишечная метаплазия и др.), не содержали РНК ЕВЕШ ВЭБ, что позволило считать их свободными от вируса. Не наблюдали гибридизационный сигнал и в инфильтрирующих опухоль лимфоцитах (рис.1).

Рис. 1. Препарат 2489/93. Определение РНК ЕВЕШ ВЭБ методом гибридизации /7/ 5/7;/. Окраска альциановым синим. Увеличение х260.

При клинико-морфологическом исследовании выявлена четкая зависимость между полом больных и присутствием ВЭБ в опухолевых клетках желудка этих же больных (табл. 1). Такие опухоли наблюдались среди мужчин в 7,06 раза чаще, чем среди женщин (р<0,001).

Таблица 1

Распределение ВЭБ-ассоциированных случаев РЖ по полу

Пол Число обследованных Число ВЭБ+РЖ Процент ВЭБ+РЖ

Мужчины 101 15 14,9

Женщины 83 2 2,4

Всего 184 17 9,2

Вместе с тем, статистически достоверных различий между возрастом больных и частотой возникновения ВЭБ-ассоциированных форм РЖ мы не обнаружили, хотя прослеживалась тенденция к увеличению частоты любой формы этой опухоли (ассоциированной и неассоциированной с вирусом) у лиц, относящихся к возрастной группе 50-59 лет.

При анализе частоты обнаружения ВЭБ+РЖ в зависимости от локализации было показано, что из 50 опухолей антральной части желудка только одна была ВЭБ-ассоциированной, в то время как частота ВЭБ+РЖ в кардиалыюй области и в теле желудка оказалась значительно выше (14,6% и 11,3%, соответственно). Что касается глубины инвазии, то за исключением одного случая, когда опухоль локализовалась в подслизистой, все 16 ВЭБ-ассоциированных опухолей прорастали серозную оболочку. Тем не менее, статистически значимых различий по этому критерию для ВЭБ+РЖ не выявлено. Анализ взаимосвязи между присутствием ВЭБ и гистологическим типом опухоли показал, что наиболее часто ВЭБ+РЖ относились к умереноднфференцированным тубулярным аденокарциномам (14,0%) и

низкодифференцированным аденокарциномам с солидным ростом (14,3%). Необходимо отметить, что во всех случаях ВЭБ-положительных опухолей находили лимфоидпую инфильтрацию, варьирующую от выраженной с образованием лимфоидных фолликулов (7 случаев) до диффузной слабовыраженной (10 случаев).

В связи с тем, что стандартизованный уровень заболеваемости РЖ на территории России и стран бывшего СССР значительно варьирует, можно было предположить, что частота вирус-ассоцинрованных форм опухолей будет так же различаться. Для проверки высказанной гипотезы нами был проведен второй этап исследований.

Поиски маркеров ВЭБ проводили методом 18Н у больных РЖ Вологодской обл., занимающей 1-ое место в России по уровню заболеваемости этой формой рака среди женщин и 5-ое - среди мужчин (80 случаев); Сахалинской обл., соответственно 43-е и 37-е места (144 случая) и г. Москвы, соответственно 45-е и 64-е места (83 случая). Кроме того, образцы соответствующих опухолей были исследованы и от больных из Узбекистана (123 случая), где зарегистрирована более низкая заболеваемость РЖ, чем в перечисленных регионах России.

Результаты исследования показали, что информация ВЭБ была обнаружена в общей сложности в 49 из 430 изученных образцов РЖ, т. е. в 11,9% случаев (табл. 2). Однако, количество ВЭБ*РЖ колебалось в разных географических регионах от 7,3% (Узбекистан) до 15,7% (г. Москва). При этом прослеживается прямая корреляция между числом ВЭБ-ассоциированных случаев РЖ и общим уровнем заболеваемости РЖ в данном регионе.

При анализе ВЭБ+РЖ, стандартизованных по возрастным группам, можно отметить, что вирус-ассоциированиые случаи опухоли желудка среди больных г. Москвы чаще встречались в одной из старших возрастных групп (51-60 лет) по сравнению с результатами, полученными для больных из Вологодской и Сахалинской областей, а также из Узбекистана, где аналогичные формы РЖ

были обнаружены уже в возрасте 31-40 лет. Об этом же свидетельствует и средний возраст больных ВЭБ+РЖ, который для больных г. Москвы был, примерно, на 10 лет старше, чем для больных из других регионов.

Таблица 2

Распределение ВЭБ-ассоцнированных случаев РЖ среди мужчин и женщин в некоторых географических регионах

Регион Число обследованных Число ВЭБ+РЖ Мужчины Женщины

Москва 83 13 (15,7%) 10/45' (22,2%)" 3/38 (7,9%)

Вологодская область 80 11 (13,8%) 8/61 (13,1%) 3/19(15,8%)

Сахалинская область 144 16 (11,1%) 14/86(16,3%) 2/58 (3,5%)

Узбекистан 123 9 (7,3%) 8/74(10,8%) 1/49 (2,0%)

Всего 430 49(11,4%) 40/266(15,0%) 9/164 (5,5%)

- числитель - число ВЭБ+РЖ, знаменатель - общее число случаев РЖ; 2 - процент ВЭБ+РЖ.

Анализ данных, касающихся распределения ВЭБ+РЖ по гистологическим типам опухоли, показывает, что подавляющее большинство ВЭБ+РЖ относились к умеренно дифференцированным тубулярным аденокарциномам (20/126; 15,9%) и низко дифференцированным аденокарциномам с солидным ростом (25/130; 19,2%). Вместе с тем, не было обнаружено ни одной вирус-ассоциированной опухоли среди 41 случая низко-дифференцированных карцином без солидного роста. Из четырех ВЭБ+РЖ, не вошедших в указанные выше гистологические варианты, один, выявленный среди больных г. Москвы, относился к высоко дифференцированной тубулярной аденокарциноме (tub 1), другой, обнаруженный среди больных из Вологодской обл., отнесен к перстневидно-клеточной карциноме (sig).

Анализ 299 случаев РЖ из г. Москвы, Вологодском и Сахалинской обл. показал, что в общей сложности ВЭБ+РЖ наиболее часто локализовались в теле желудка (22,6%), его кардпальиой части (17,3%), либо встречались при поражении всего органа (16,0%). Реже всего опухоли локализовались в антральной части желудка (6,5%). Различия статистически значимы при вероятности ошибки р<0,01.

Что касается глубины инвазии, то из 300 изученных случаев РЖ из г.Москвы, Вологодской и Сахалинской обласюй, в 246 случаях (82%) опухоли прорастали все анатомические слои желудка. В эту же группу вошло и большинство ВЭБ'РЖ (35/246; 14,2%).

Таким образом, на примере нескольких географических регионов нами получены данные, свидетельствующие о наличии ВЭБ'РЖ в России и Узбекистане. В общей сложности из 614 исследованных образцов опухолевой ткани желудка гибридизационный сигнал, указывающий на присутствие ВЭБ-специфической РНК, был обнаружен в 66, что составило 10,7% от всех изученных случаев. Выявленная частота ВЭБ-ассоциированных форм РЖ в России занимает промежуточное место между низкой в Японии (6,7%), в регионе с высокой общей заболеваемостью этим новообразованием и более высокой в США (16%), в регионе с относительно низкой заболеваемостью РЖ.

2. Особенности гуморального ответа к антигенам ВЭБу больных ВЭБ-ассоциироштной формой РЖ

Учитывая тот факт, что известные ВЭБ-ассоциировапиые заболевания (нРНГ, ЛБ, нфекционный монопуклеоз) сопровождаются экспрессией различных вирусных белков и характерными спектрами и уровнями вирусспецифических антител, мы посчитали целесообразным провести анализ гуморального ответа к антигенам ВЭБ у больных РЖ.

С этой целью сыворотки 322 первичных больных с гистологически подтвержденным диагнозом РЖ и сыворотки 222 неоикологнческих больных,

составивших контрольную группу (КГ), были исследованы в реакции иммунофлуоресуенции (РИФ) на присутствие и уровни антител к вирусному капсидному (BKA) и раннему (РА) антигенам ВЭБ. Анализ полученных данных показал (табл. 3), что среди больных РЖ процент случаев с повышенными титрами антител к вирусным белкам (BKA <1:640 и РА <1:40) составил 19,3% (62/322) против 8,6% (19/222) в КГ. Эти различия статистически достоверны с вероятностью ошибки р<0,001.

Таблица 3

Уровни антител к белкам ВЭБ

Группа больных Число больных Титры антител к белкам ВЭБ

IgG BKA > 1:640 IgG PA > 1:40 IgA BKA >1:20

Не изученные в гибридизации in situ

Больные РЖ 322 62 (19,3%) 62 (19,3%) Нет данных

Неонкологические больные 222 19 (8,6%) 13 (5,9%) 8 (3,6%)

Изученные в гибридизации in situ

ВЭБ+РЖ 13 9 (69,2%) 9 (69,2%) 9 (69,2%)

ВЭБ-РЖ 70 10 (14,3%) 10 (14,3%) 10 (14,3%)

Наличие высоких титров антител среди лиц КГ могло быть обусловлено неспецифической активацией литической инфекции ВЭБ, отражающей временное снижение активности клеточного иммунитета. Следовательно, у больных РЖ неспецифическая активация вируса могла иметь место, примерно, в таком же проценте случаев. Если наше предположение верно, тогда процент серологически активных случаев РЖ среди обследованных онкологических больных должен составлять 10,7% (19,3%-8,6%). Был проведен сравнительный анализ результатов 1БН и гуморального иммунного ответа к антигенам ВЭБ индивидуально для каждого больного. При этом из 83 образцов РЖ,

обследованных в 1811, в 13 случаях (15,6%) выявлено присутствие в опухолевых клетках РНК ЕВЕЯ! ВЭБ. Сыворотки этих же 83 больных в 19 (22,9%) случаях имели повышенные титры антител к антигенам ВЭБ, выявляемые в РИФ. Совпадение же позитивного результата 1511 с высокой активностью сывороток наблюдалось в 9 из 13 случаев, что составило около 70%.

Таким образом, высокая активность гуморального ответа к белкам ВЭБ в 70% случаев коррелирует с присутствием генетического материала ВЭБ в опухолевых клетках этого же больного, что, по-видимому, может свидетельствовать о принципиальной возможности использования вирусспецифических антител в качестве диагностического маркера для выявления ВЭБ+РЖ.

3. Молекулирно-биологический ап <1:1111 вариантов ЬМР] ВЭБ, амплифицированпых иг тканей желудка Для выяснения роли ВЭБ в этпопатогенезе РЖ представляются важными исследования, направленные на изучение функций отдельных генов вируса в процессе канцерогенеза эпителиальных клеток желудка. Таким образом, цель следующего этапа наших исследований состояла в оценке молекулярно-генетических и функциональных особенностей одного из потенциальных онкогенов ВЭБ - гена ЬМР1, полученного из опухолевой и морфологически неизмененной тканей желудка. Данный раздел работы был проведен совместно с Институтом Вирусологии Университета г.Хомбург Земли Саар, Германия.

В подавляющем большинстве случаев образцы Д11К, выделенные из парафиновых блоков, не могут быть использованы для амплификации полноразмерных генов ЬМР1, так как при фиксации опухолевого материала формалином происходит фрагментация ДНК. В связи с этим, в течение 1998 г. в клинике РОНЦ РАМН, непосредственно после операции, было собрано 29 образцов опухолевой (т) и морфологически "нормальной" (н) тканей желудка. С целью обнаружения генетической информации ВЭБ ДНК из исследуемых

образцов предварительно была тестирована в ПЦР с использованием различных пар праймеров, специфичных для трех регионов ВЭБ. Для образцов А2т, А 13т, А 15т и А43т наблюдали позитивную реакцию с тремя парами праймеров, исходя из чего, вышеназванные случаи были приняты нами как условно позитивные. Однако, осталось неясным, происходит ли зафиксированный позитивный сигнал из опухолевых клеток или же из инфильтрирующих опухоль лимфоцитов.

Для дифференцпровки позитивного сигнала в ПЦР, происходящего из клеток периферической крови от такового из ВЭБ-содержащих опухолевых клеток, мы применяли метод полуколичественной ПЦР. Для образцов опухолевой ткани А 13т, А 15т и А43т позитивный сигнал ПЦР был зафиксирован, по крайней мере, в 10"3 разведении ДНК, тогда как для образца А2т и образцов "нормальной" ткани этих же больных амплификацию наблюдали только на неразведенной ДНК.

В дальнейшем, при тестировании образцов методом ISH было доказано, что 3 из 29 (10,3%) изучаемых случаев РЖ, а именно: А13, А15 и А43 действительно ассоциированны с ВЭБ.

Стратегия получения ПЦР-продукта гена LMP1 была основана на амплификации двух его фрагментов - N-концевого (836 п.н.) и С-концевого (1196 п.н.). При этом З'-коицевая область N-фрагмента и 5'-концевая область С-фрагмента частично перекрывались и имели общий внутренний сайт рестрикции MscI, что позволило в дальнейшем использовать их для реконструкции полноразмерного гена LMP1. Специфичность полученных продуктов ПЦР была подтверждена в блот-гибридизации по Саузерну с использованием дигоксигениновой пробы (рис. 2).

Амплифицированные последовательности N- и С-областей LMP1 далее были клонированы в прокариотический вектор pGEM-T (Promega, USA) и сиквенированы.

А 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

N-члсть С-часть

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1

С-члсть N-часть

Рис. 2. Анализ амплификации N- и С-частей LMP1 на ДНК ВЭБ+РЖ. А -электрофорез продуктов ПЦР в 1,0%-иом агарозиом геле; Б - блот-гибридизация по Саузерну продуктов ПЦР. 1,6- Н20; 2,1 - В95.8 (положительный контроль); 3, 8 - А 13т; 4, 9 - А15т; 5, 10 - А43т. Размеры ПЦР-продуктов указаны слева (п.и.).

Проведенный нами сиквенсный анализ показал (табл. 4), что все исследуемые гены LMP1 должны кодировать функционально активные белки, так как стоп-кодоиов обнаружено не было. Последовательности LMPI, амплифицированные из опухолевой и морфологически "нормальной" ткани желудка одного и того же больного были практически идентичны. Исключение составила лишь одна аминокислотная замена аспарагина па глицин (D—>G) в положении 373 для образца А15н. Поскольку эта мутация обусловлена заменой одного нуклеотида, то наблюдаемое различие может быть связано с одиночной

Таблица 4

Сравнительные данные аминокислотных последовательностей клонов LMP1 от больных ВЭБ+РЖ с прототипами LMP1 В95.8 и LMP1 Сао

10 20 30 40 50 60 70

В95. 8 MEHDLERGPPGPRRPPRGPPLSSSLGIALLLLLIALLFWLYIVMSDWTGGALLVLYSFAIMLIIIILIIF

Сао —R---SA-SAP---L-------1----------------------------------------------

А 13т .------------------------------.----------------N-------—---------L----

А 15т'"-------------—---—*-"-""—-——-------—

А 15н ----------------------------------------------------------------------

!А 43т" —:-----:--------------—'----------------:——■----—-------_-——__

-«---хгг^™___

"80 90 ioÖ * liÖ 120 130 140*

В95. 8 1FRRDLLCPLGALCILLIMITLLLIALWNLHGQALFLGIVLF1FGCLLVLGIW1YLLEMLWRLGATIWQL

Сао -----------G-GL--------------------Y-------------F-----F—I—:-----L---

,A 13t ---------G-GL----------------Y---------------L---F—X—G----,---- . .

¡A. 13h _--—;----,---G-GL——----———---Y--—-_---——--L---F--I—G—--—— . -

А 15т - - - - — - L-*-------- - - ----- - - у - —------------------------------

A 15h ---------------L--------------------Y----------------------------------

1a"'43t" --7——l—-—-----------y——-----^___L-___-_x—-----_—

.....................150 16Ö' 170 ' 180 T90~ 20Ö~ SlÖ~*

B95. 8 LAFFLAFFLDLILLIIALYLQQNWWTLLVDLLWLLLFLAIHWMYYHGQRHSDEHHHDDSLPHPQQATDD

А 15н ----------------------------------------------------------------------

Jä143»".' ------_-_'—_-__-:-_---------------'------r------.------------------—r ' .

' 220* ~ 230 ~ 240 250 260 270 280

B95. 8 SGHESDSHSNEGRHHLLVSGAGDGPPLCSQNLGAPGGGPDNGPQDPDNTDDNGPQDPDNTDDNGPHDPLP

Cao -S---------------------------------------------------------------*****

а 13т --------------------------------------;------'----—-------——-----

A"I 5т - - - ———- -—--------------—----—- - - -—------------------------

А 15н ----------------------------------------------------------------------

¡А' 43т';' —— ■---—-----Т— — —------г—-----А-------;-----—_— ——-— .

Ai - - - -jjy """зоо .......*..........31*6'"" *

В95 . 8 QDPDNTDDNGPQDPDNTDDNGP» »»»**»*»**»»»»*»»*»•****»*»**** »HDPLPHSPSDSAGND

Сао ----------------------QDPDNTDDNGPQDPDNTDDNGPQDPDNTDDNGP---------------

:А 13т ----------------------*********************************-_:----N-----—- '

А 13н —■—г—>-------------— *********************************—'---N-—'—т—' . ■

д Х5т ______________________*********************************---------------

А 15н ----------------------*********************************---------------

|а 43т' ■____________________********************************* —^---n-----—

[А 43н --------------■'--------**^*******************************——N-rj;-——' - , '

..................320 -"So- 340* ~3S0 ' "~36Ö "*370 *'*3B0" ' 386

B95. 8 GGPPQLTEEVENKGGDQGPPIMTDGGGGHSHDSGHGGGDPHLPTLLLGSSGSGGDDDDPHGPVQLSYYD

Cao ----N-----A-A---R---S-------**********----------т--------------------

!a i3t,*J —^-н——* * ** *.t*.*z~:"~.zzzzziL'JJ

А 13 h Г-.-N-—"-A—— R—S-------tt't it t't'i'ti -----11"---'-_

А 15т ----------Q-----------------------------P-------T--------------------

'"43и •' *>

* _

делетированные аминокислотные основания

ошибкой Taq-полимеразы, которая в серии экспериментов, в целом, работала хорошо. Важно отметить, что LMP1, полученный in опухолевой и морфологически "нормальной" ткани образца Л13 содержал делению размером 30 п.н. в С-региопе, характерную для варианта LMP1 Cao, обладающего высоким трансформирующим потенциалом.

В сравнении с прототипом LMP1 В95.8 все клоны LMP1, полученные как из опухолевой, так и из "нормальной" ткани желудка имели общие специфические замены аминокислот в положениях 85 (изолейцнп па лейцин, I->L), 106 (фенилаланин па тирозин, F—>Y) и 366 (серии па треонин, S—>Т), которые также характерны и для LMPICao. Интересно, что мутации I85L и F106Y, локализованные в трансмембрапном домене, достаточно консервативны по своей природе. Существует мнение, что в этом отношении LMP1 штамма В95.8 является не достаточно адекватным контролем. Важно отметить, что ни один из исследуемых клонов не содержал точечных замен в пределах N-концевого цитоплазматического домена гена LMP1.

Результаты снквенирования так же показали (см. табл. 4), что С-областп LMP1 А13 и А43 сходны между собой, независимо от наличия или отсутствия делеции размером 30 п.п., тогда как LMP1 Al5 существенно отличается от них. Так, для образцов А13 и А43 наблюдались замены а.к. в положениях 309 (серии 1. на аспарагин, S-»N), 334 (глютамип на аргинин, Q—>R) и 338 (лейцин на серии, L—>S), которые не найдены в LMP1 А15. Необходимо отметить, что каждый из исследуемых вариантов LMP1 имел собственные мутации. Например, только для LMP1 А15, обнаружены замены E328Q и II358P, которых нет в LMP1 А13 и LMP1 А15. Кроме того, установлено, что варианты LMP1 ВЭБ+РЖ характеризуются специфическим набором точечных мутаций достоверно отличающих их от ранее охарактеризованных LMP1 Cao и В95.8, а так же LMP1, полученных от больных пРНГ и здоровых вирусоносителей из России, как было показано нами.

Таким образом, нам удалось охарактеризовать особенности нуклеотидных последовательностей LMP1, амплифицированных на ДНК от больных ВЭБ+РЖ из России.

Для проведения функционального анализа LMP1 ВЭБ изучаемые клоны были реклонированы в эукариотический экспрессирующий вектор pSG5 и трансфицированы в клетки эпителиальной линии человека 293GP. Продукцию белка изучали методами иммуноблоттинга и иммунофлуоресценции при использовании моноклональных антител (мАТ) S12 и CS1-4.

Было обнаружено, что из 6 изолятов LMP1, включая, как опухолевые, так и "нормальные" его варианты, только LMP1 образца А43 экспрессировался в клетках 293GP. Как видно из анализа данных, приведенных на рис. ЗА и ЗБ, молекулярный вес образующегося продукта составил примерно 62 кДа, что соответствует размеру LMP1 стандартного прототипа В95.8. Однако, в многочисленных экспериментах, проделанных нами, не удалось выявить экспрессии полноразмерного LMP1 для клонов А13 и Al5, как из опухолевой так и "нормальной" ткани желудка. Эти результаты воспроизводились. В то же время, на рис. ЗА можно отметить экспрессию низкомолекулярных белков для клонов А 13т и А 15т, молекулярные массы которых составили примерно 42 кДа и 46 кДа, соответственно. Данные белки были выявлены в иммуноблотинге при использовании смеси мАТ CS1-4. В аналогичных экспериментах по трансфекции клонов LMP1 из тканей желудка с помощью мАТ S12 мы выявили высокий уровень экспрессии белка с м.м. 42 кДа только для образца А13т (см. рис. ЗБ). По-видимому, это объясняется тем, что набор эпитопов в пределах молекул LMP1 А13 и Al5 различен, как вследствие их протеолитического нарезания, так и в результате различного набора мутаций, т.е. замен а.к., выявляемых в первичной последовательности белка. Отсутствие экспрессии низкомолекулярных белков при трансфекции клонов LMP1 А13 и А15, амплифицированных из "нормальной" ткани желудка, объясняется, возможно, как качество выделенной ДНК, так и мелкими погрешностями при

приготовлении кальций-фосфатных преципитатов для трансфекции. В целом, данные клоны LMP1 можно рассматривать как неэкспессируемые по аналогии с ранее обнаруженным клоном LMP1, амплифицированным из клеток нРНГ.

ш

23456789

67 —

43-

Ш

30 —

67—

43 — 30 —

<-

Рис. 11. Экспрессия белков LMP1 после трансфекции в клетки 293 GP. Л - иммуноблотинг с мАТ CSI-4, Б - с мАТ S12. 1 - pSG5 (контроль); 2 - В95.8; 3 - Cao; 4 - А 13т; 5 - А 15т; 6 - А43т; 7 -А13н; 8 - А15н; 9 - А43н. Размеры маркеров молекулярной массы указаны слева (кДа), положение возможных продуктов протеолитической деградации LMP1 указаны стрелками справа.

Полученные нами результаты иммуноблотннга хорошо коррелируются с данными РИФ. Во всех экспериментах белок LMP1 образца А43 выявляли с помощью РИФ. С другой стороны, экспрессию LMPI А13 и А15 нам обнаружить не удалось даже при использовании смеси мАТ CS1-4.

Небольшая серия экспериментов нами была проведена с целыо изучения способности вариантов LMP1 от больных ВЭБ+РЖ влиять на активность транскрипционного фактора (ТФ) NFkB. Результаты исследования показали, что LMP1 клонов А43т и А43н индуцировал экспрессию примерно в той же степени, что и LMPI В95.8. Уровень же активации NFkB, вызываемый LMP1

Cao, в наших экспериментах был примерно в 1,8 раза выше, по сравнению с таковым LMP1 В95.8, что полностью совпадает с полученными раннее данными других исследователей. Однако, LMP1 образцов А13 и А15, как из опухолевой, так и из "нормальной" ткани желудка, фактически не способствовал увеличению активности ТФ NFkB выше фонового уровня. Скорее всего, это можно объяснить отсутствием функционально активных полноразмерных белков, что подтверждается данными иммуноблотинга и РИФ.

Таким образом, проведенный нами функциональный анализ LMP1 выявил существенно различное поведение исследуемых вариантов, полученных от больных ВЭБ+РЖ, хотя низкая активность LMP1 случаев А13 и А15 остается пока необъяснимой.

Анализируя приведенные данные, можно сделать вывод, что ВЭБ не принимает участия в генезе большей части опухолей желудка. В то же время результаты наших и зарубежных исследователей позволяют высказать аргументированное предположение, что ВЭБ в ряде случаев возникновения РЖ играет важное, а вероятно, ключевое значение. Обнаруженные нами структурные и функциональные особенности клонов LMP1 от больных ВЭБ+РЖ представляют определенный интерес для дальнейшего молекулярно-биологического анализа и выяснения возможной роли мутантных вариантов гена LMP1 ВЭБ в процессе этиопатогенеза некоторых опухолей человека.

ВЫВОДЫ

1. Впервые согласно данным вирусологического, молекулярно-биологического и клинико-морфологического исследованиям показано наличие ВЭБ-ассоциированных форм РЖ (ВЭБ+РЖ) в России и Узбекистане. Согласно ретроспективным исследованиям (614 случаев) частота ВЭБ+РЖ составляет 7,315,7%.

2. Установлено, что ВЭБ-ассоципронанные случаи 1'Ж:

чаще встречаются среди мужчин (16,8%), чем среди женщин (4,5%);

в основном принадлежат к нпзкодпффсрспцпропапной аденокарпиноме с солидным ростом (18,0%) и умеренподиффсренцпроваипой тубулярной аденокарпиноме (15,3%);

редко локализуются в антралыюн части желудка (5,5%);

80-100% опухолевых клеток содержат генетическую информацию ВЭБ, в то время как инфильтрирующие опухоль лимфоцшы вирусного материала не содержат.

3. Показано, что высокая активность гуморального иммунного ответа к белкам ВЭБ в 70% случаев коррелирует с присутствием генетической информации ВЭБ в опухолевых клетках этих же больных РЖ.

4. Впервые проведено определение нуклеотидных последовательностей вариантов гена LMPI ВЭБ, амплнфпцнропанпых из тканей ВЭБ-ассоципрованных случаев РЖ. Установлено, что варианты I.MPI ВЭБ'РЖ характеризуются специфическим набором точечных муганни достоверно отличающих их от ранее охарактеризованных LMP1 Cao и В95.8, а так же LMPI, полученных от больных нР11Г и здоровых впрусоносителей из России.

5. Функциональный анализ клонов L.MPI ВЭБ'РЖ впервые обнаружил ранее неизвестное явление инактивации гена LMP1 ВЭБ.

СПИСОК ОПУБЛIIK013AIII1ЫХ РАБОТ ПО ТЕМ!-. ДИССЕРТА11,11 И

1. Аль-Мадхажи А., Стенина В.П., Ссшота П.Б., Новикова 13.В., Гурцевпч В.Э. Вирусологическая характеристика лимфомы Беркнтта в Йемене // I съезд онкологов стран СНГ: Тез. докл. - Москва, 1996. Ч. 1. С.74.

2. Галецкий С.А., Цветное В.В., Степина В.Н., Новикова Е.В., Петровичев H.H., Токунага М., Гурцевич В.Э. Случаи рака желудка, ассоциированные с вирусом

Эпстайна-Барр, в России // I съезд онкологов стран СНГ: Тез. докл. - Москва, 1996. 4.1. С. 75.

3. Новикова Е.В., Степииа В.Н., Галсцкий С.А., Яковлева J1.C., Борисова Е.Ю., Гурцевич В.Э. Гуморальный ответ к белкам вируса Эпштейпа-Барр у больных раком желудка в России // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы.-1997.-Т. 1 .-№1 .-С. 152.

4. Гурцевич В.Э., Галецкий С.А., Перед С.Н., Новикова Е.В., Яковлева Л.С., Лэнд Ч.Е., Давыдов М.И., Клименков A.A., Петровичсв H.H., Токумага М. Обнаружение и характеристика опухолей желудка, ассоциированных с вирусом герпес Эпстейна-Барр // Вестник Российской Академии Медицинских Наук,-1999.-№3.-С.56-59.

5. Щербак Л.Н., Хаан П., Новикова Е.В., Грассер Ф., Белоусова Н.В., Павлнш O.A., Меллер- Ланч Н., Гурцевич В.Э. Варианты гена LMP-1 у больных раком носоглотки и здоровых доноров, молекулярно-бпологическне исследования // Симпозиум «Морфологические, иммунологические и молекулярно-бпологическне аспекты идентификации гемобластозов и родственных заболеваний»: Тез. докл. - Адлер, 1999. С.48.

6. Гурцевич В.Э., Новикова Е.В., Борисова Е.Ю., Степииа В.Н., Яковлева Л.С., Давыдов М.И., Клименков A.A., Перед С.И., Франк Г.А., Козловский О.М., Бритвина В.А., Петелышкова Е.С., Петровиче» H.H., Рузабакнев P.M., Токуиага М., Заридзе Д.Г. Клипико-морфологическне особенности ВЭБ-ассоциированных форм рака желудка в некоторых регионах России и бывшего СССР // Проблемы современной онкологии. Томск.- I999.-C.70-72.

7. Щербак Л.Н., Новикова Е.В., Павлиш O.A., Белоусова Н.В., Хаан П., Грассер Ф.А., Мёлер-Ланч Н., Гурцевич В.Э. Молекулярно-биологический анализ вариантов гена LMP-1 вируса Эпштейпа-Барр, исрсистирующих в тканях рака носоглотки (РНГ) // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы.-1999.-Т.З.-№ 1.-С. 103-104.

8. Новикова Е.В., Яковлева Л.С., Стенина В.11., Гурцевпч ПЛ. Обнаружение и клинико-морфологпческая характеристика опухолей желудка, ассоциированных с вирусом Эпнггейпа-Барр // Русский журнал ВИЧ/CI II1Д и родственные проблемы,-1999.-Т.З.-№ I.-C.I03.

9. Гурцевпч В.Э., Новикова П.В., Борисова П.10., Стенина В.П., Яковлева Л.С., Давыдов М.И., Клименко» Л.Д., Перед С.П., Франк Г.Л., Козловским О.М., Бритвииа В.Л., Петельпнкова П.С., Петровичей П.П., Рузабакиен P.M., Токунага М., Зарндзе Д.Г. Обнаружение и клннико-морфолотическая характеристика опухолей желудка, ассоциированных с вирусом Эшитенна-Барр // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы,- 1999.-Т.З.-№ I.-С.28-33.

10. Novikova П., Sclierbak L. Pavlish О., Halm P., Belousova N., Grasser P., Mullcr-Lantzsch N., Gtirtsevilch V. Mutational forms of EBV I,MP-1 genes isolated from patients with nasopharyngeal carcinomas (NPC) and healthy individual in Russia // Virus Res.-1999.-Vol.62.-I'. 158.

11. Гурцевич В.Э., Новикова E.B., Борисова П.10., Степнна B.I I., Яковлева Л.С., Давыдов М.И., Климе!(ков Д.Л., Перед С.Н., Франк Г.А., Козловский О.М., Бритвииа В.Д., Петельпнкова Е.С., Петровиче» I I.I I., Рузабакиев З.М., Токунага М., Зарндзе Д.Г. Молекулярио-бнологнческие и клинико-морфологическне исследования опухолей желудка, ассоциированных с вирусом Эшитенна-Барр // Вестник Российской Академии Медицинских Наук.-2000.-№ 3.-С.27-31.

12. Novikova E.V., Sclierbak L.N., Pavlish О.А., Halm P., Belousova N.V., Nered S.N., Klimenkov A.A. Grasser F.A., Muellcr-I.aiilz.sch N., Gurtsevitdi V.E. LMl'-l gene mutations of EBV isolates persisting in patients and healthy individuals in Russia // Русский журнал ВИЧ/СПИД п родственные проблемы.-2000.-T.4.-№I .-С.193.

13. Yakovleva L., Novikova E., Stepina V., Kadyrova E., Nered S., Frank G., Klimenkov Д., Gurtsevitch V.E. High prevalence of 1IIIV-8 in patients with EBV-positive form of gastric carcinoma // Русским журнал ВПЧ/СПНД и родственные проблемы.-2000.-Т.4.-№ I .-С. 194.

14. Белоусова Н.Б., Поддубиый Б.К., Унгнадзе Г.В., Кондратьева Т.Т., Архипов В.В., Пробатова H.A., Гурцевич В.Э., Стенина В.Н., Щербак J1.II., Михайлова H.A., Новикова Е.В. Современная диагностика рака носоглотки // Современная онкология.-2000.-Т.2.-№3.-С.78-82.

15. Halin P., Novikova Е., Scherbak L., Janik С., Pavlish О., Arkliipov V., Nicholls J., Muller-Lantzsch, Giirtsevitch V., Grasser F.A. The LMP1 gene isolated from Russian nasopharyngeal carcinoma has no 30-bp deletion // Int. J. Cancer.-2001.-Vol.91.-P.815-821.

16. Гурцевич В.Э., Щербак Л.Н., Новикова E.B., Хаан П., Белоусова Н.В., Архипов В.В., Грассер Я'.А., Меллер-Ланч Н., Павлиш O.A. Структурные и функциональные особенности гена LMP-1 вируса Эиштеина-Барр у больных недифференцированным раком носоглотки в России // Вестник РАМН. Принята в печать.

Изучение роли вирусов в возникновении опухолей человека составляет важный аспект современных исследований в области онкологии. Среди различных онкогенных вирусов существенный интерес представляет вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ), который относится к семейству герпесвирусов, является убиквитарным и персистирует в организме человека в течение всей жизни. С этим вирусом связывают возникновение африканской лимфомы Беркитта (ЛБ), недифференцированного рака носоглотки (нРНГ), В-клеточных лимфом у больных с иммунодефицитами различного происхождения и др. /14, 141, 96/. Спектр патологических процессов у человека, в возникновении которых, как полагают, участвует ВЭБ, постоянно расширяется. В настоящее время широко обсуждается вопрос о роли ВЭБ в процессе канцерогенеза эпителиальных клеток желудка. Прямые доказательства ассоциации ВЭБ и рака желудка (РЖ) получены в результате обнаружения в опухолевых клетках ряда вирусных маркеров таких, например, как РНК гена EBER1, белков EBNA1 и LMP2. Кроме того, установлено, что опухолевые клетки, несущие геном вируса моноклональны. Вирусные маркеры находили в опухолевых клетках желудка любой морфологической структуры, но наиболее часто при низкодифференцированных формах с интенсивной лимфоидной пролиферацией /130/.

Учитывая тот факт, что практически 95-100% населения планеты инфицировано ВЭБ, механизм возникновения ассоциированных с этим вирусом заболеваний, включая и РЖ, остается открытым. Возникает вопрос, один и тот же или разные генетические варианты вируса персистируют у здоровых и больных лиц, в опухолевых и морфологически "нормальных" клетках. В этой связи, ген ВЭБ - BNRF1, кодирующий латентный мембранный белок 1 (LMP1) представляет особый интерес. Во-первых, это один из 6 немногих генов ВЭБ, который обладает трансформирующим потенциалом; во-вторых, определенные структурные перестройки этого гена способствуют увеличению трансформирующего потенциала вируса /53/. Возможно, дальнейший глубокий молекулярно-биологический анализ "опухолевых" и "неопухолевых" вариантов ВЭБ позволит, по крайней мере, приблизиться к решению поставленного вопроса.

Рак желудка в России занимает одно из ведущих мест среди наиболее часто встречающихся новообразований человека /3/. В связи с этим, поиск ВЭБ-ассоциированных случаев РЖ (ВЭБ+РЖ), определение их частоты среди всех опухолей этой локализации, а также выяснение роли вируса в их этиопатогенезе, представляется актуальной научной и практической задачей.

Целью настоящей диссертационной работы явилось обнаружение ВЭБ-ассоциированных форм рака желудка в некоторых регионах России с различным уровнем заболеваемости РЖ, определение их удельного веса среди новообразований желудка, серологическая характеристика, а также детальное вирусологическое, молекулярно-биологическое и морфологическое изучение.

В ходе выполнения исследований предполагалось решить следующие задачи: создать архив клинического материала от больных РЖ (парафиновые блоки с фрагментами опухолей, операционный материал, сыворотки крови); исследовать опухолевый материал от больных РЖ из нескольких регионов России и стран бывшего СССР на присутствие вирусной информации в реакции гибридизации in situ (ISH) с использованием в качестве вирусного маркера РНК гена EBER1 ВЭБ; проанализировать морфологическую структуру случаев РЖ, ассоциированных с ВЭБ; провести скрининг сывороток больных РЖ и здоровых носителей на наличие и титры антител к белкам литического цикла ВЭБ; 7 определить первичную нуклеотидную структуру одного из генов латентной инфекции ВЭБ - LMP1, амплифицированного из образцов опухолевой и морфологически неизмененной тканей желудка, больных ВЭБ-ассоциированной формой РЖ; субклонировать полученные варианты LMP1 ВЭБ в эукариотический экспрессирующий вектор и изучить их функциональное поведение.

Научная новизна работы заключается в том, что впервые был проведен поиск ВЭБ-ассоцииированных случаев РЖ в России, охарактеризована их морфологическая структура, изучен гуморальный ответ больных РЖ к белкам литического цикла инфекции ВЭБ. Кроме того, впервые были определены нуклеотидные последовательности вариантов полноразмерного гена LMP1 ВЭБ, амплифицированного из тканей ВЭБ+РЖ; проведен анализ по изучению их экспрессии и способности активировать транскрипционный фактор NFkB.

Практическое значение полученных результатов исследований состоит в выявлении форм опухолей желудка, ассоциированных с ВЭБ на территории нашей страны. Обнаружение таких случаев РЖ может послужить важной предпосылкой для углубленного изучения их этиопатогенеза, разработки новых подходов ранней диагностики и, возможно, терапии ВЭБ+РЖ. Результаты данных исследований будут также способствовать более глубокому пониманию механизмов ВЭБ-ассоциированного канцерогенеза на модели одной из эпителиальных опухолей человека. 8

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ВЫВОДЫ

1. Впервые согласно данным вирусологического, молекулярно-биологического и клинико-морфологического исследованиям показано наличие ВЭБ-ассоциированных форм РЖ (ВЭБ+РЖ) в России и Узбекистане. Согласно ретроспективным исследованиям (614 случаев) частота ВЭБ+РЖ составляет 7,3-15,7%.

2. Установлено, что ВЭБ-ассоциированные случаи РЖ: чаще встречаются среди мужчин (16,8%), чем среди женщин (4,5%); в основном принадлежат к низкодифференцированной аденокарциноме с солидным ростом (18,0%) и умереннодифференцированной тубулярной аденокарциноме (15,3%); редко локализуются в антральной части желудка (5,5%); 80-100% опухолевых клеток содержат генетическую информацию ВЭБ, в то время как инфильтрирующие опухоль лимфоциты вирусного материала не содержат.

3. Показано, что высокая активность гуморального иммунного ответа к белкам ВЭБ в 70% случаев коррелирует с присутствием генетической информации ВЭБ в опухолевых клетках этих же больных РЖ.

4. Впервые проведено определение нуклеотидных последовательностей вариантов гена LMP1 ВЭБ, амплифицированных из тканей ВЭБ-ассоциированных случаев РЖ. Установлено, что варианты LMP1 ВЭБ+РЖ характеризуются специфическим набором точечных мутаций достоверно отличающих их от ранее охарактеризованных LMP1 Сао и В95.8, а так же LMP1, полученных от больных нРНГ и здоровых вирусоносителей из России.

5. Функциональный анализ клонов LMP1 ВЭБ+РЖ впервые обнаружил ранее неизвестное явление инактивации гена LMP1 ВЭБ.

95