Васкулогенная мимикрия при меланоме кожи

Григорьева, Ирина Николаевна

Диссертации по медицине → Онкология

Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Васкулогенная мимикрия при меланоме кожи

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Григорьева, Ирина Николаевна Москва 2011 г.

Ученая степень: кандидата медицинских наук

ВАК РФ: 14.01.12

Автореферат диссертации по медицине на тему Васкулогенная мимикрия при меланоме кожи

На правше рукописи

ГРИГОРЬЕВА Ирина Николаевна

ВАСКУЛОГЕННАЯ МИМИКРИЯ ПРИ МЕЛАНОМЕ КОЖИ Специальность: 14.01.12 - Онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2011

1 СЕН 2011

4852463

Работа выполнена в Российском онкологическом научном центре им. H.H. Блохина РАМН (директор - академик РАН и РАМН, профессор М.И.Давыдов) Научные руководители:

Доктор медицинских наук Степанова Евгения Владиславовна Доктор медицинских наук Харатишвили Теймураз Кобаевич

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, Кадагидзе Заира Григорьевна профессор

Доктор медицинских наук, Рогов Константин Аркадьевич профессор

Ведущая организация

ФГУ Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П. А. Герцена Министерства здравоохранения и социального развития РФ

Защита диссертации состоится « 1 г. в_часов на

заседании диссертационного Совета (Д.001.17.02) Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

Автореферат

разослан 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор , 1 Ю.А. Барсуков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Известно, что с ранних этапов развития новообразования необходим ангиогенез, однако, в ткани меланомы, наряду с ангиогенезом, запускаются альтернативные механизмы кровоснабжения, например, васкулогенная мимикрия.

Васкулогенная мимикрия (ВМ) - это способность опухолевых клеток формировать ограниченные базальной мембраной РАБ-положительные сосудистоподобные каналы без участия эндотелиальных клеток и фибробластов. Полагают, что формирование опухолевыми клетками высокоструктурированных васкулярных каналов, ограниченных базальной мембраной, происходит при гипоксических условиях и недостатке питательных веществ.

В исследованиях было показано, что компоненты ВМ находят в 7080% случаев меланомы кожи и глаза, 10-20% случаев рака молочной железы, яичников и астроцитом. Известно, что пациенты с меланомой, в опухолевой ткани которых есть структуры ВМ, могут иметь худший прогноз заболевания. Так, присутствие в ткани опухоли определенного типа Р А 5 -11 о л ожите л ы I ы х структур коррелирует с появлением отдаленных метастазов после удаления первичной опухоли.

Способность к ВМ может быть обусловлена особенностями фенотипа опухолевых клеток. Отмечено, что клетки, способные к ней, часто экспрессируют молекулярно-биологические маркеры, характерные для эндотелиальных клеток, такие как УЕ-кадхерин, ЕрЬА2, фактор Фон Виллебранда / фактор VIII.

В настоящее время существует трудности в исследовании ВМ, которые преимущественно связаны с методологическими проблемами. В мире есть только ограниченное количество охарактеризованных моделей для изучения ВМ.

В связи с вышеизложенным, разработка экспериментальной модели меланомы кожи для изучения ВМ является очень актуальной.

Не менее важна и своевременная клиническая оценка ВМ, поскольку предполагается ее участие в васкуляризации меланомы кожи человека.

Цель работы

Изучение феномена васкулогенной мимикрии при меланоме кожи.

Задачи исследования

1. Изучение способности клеточных линий метастатической меланомы кожи человека к васкулогенной мимикрии in vitro.

1. Изучение особенностей васкулогенной мимикрии in vivo.

3. Создание экспериментальной модели меланомы кожи человека для исследования васкулогенной мимикрии in vitro и in vivo.

4. Изучение васкулогенной мимикрии на гистологических срезах меланомы кожи человека.

5. Определение особенностей васкуляризации меланомы кожи человека с учетом васкулогенной мимикрии.

Научная новизна

Впервые в России разработаны методы изучения васкулогенной мимикрии in vitro и in vivo на примере клеточных линий метастатической меланомы кожи человека, которые охарактеризованы по их способности к васкулогенной мимикрии. Впервые разработана стандартизированная экспериментальная модель васкулогенной мимикрии для изучения формирования ВМ in vivo и in vitro, а также разработаны экспериментальные подходы к изучению васкулогенной мимикрии на гистологических срезах меланомы кожи человека. Впервые изучено

значение васкулогенной мимикрии для васкуляризации меланомы кожи-человека.

Научно-практическая значимость

Разработаны подходы к изучению способности клеточных линий метастатической меланомы кожи к васкулогенной мимикрии, создана модель ВМ, которая используется в различных научно-исследовательских институтах при создании лекарственных препаратов, направленных на ингибирование ВМ. Разработанные подходы к изучению ВМ при меланоме кожи применяют при исследовании других злокачественных новообразований. Клиническое значение ВМ при меланоме кожи человека может служить основой для создания нового направления диагностики и лечения.

Апробация работы

Апробация диссертационной работы состоялась на совместной научной конференции НИИ ЭДиТО РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН с участием: лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, лаборатории клеточного иммунитета, лаборатории иммунофармакологии, лаборатории биохимической фармакологии, лаборатории фармакологии и токсикологии, лаборатории лучевых методов лечения опухолей, лаборатории трансгенных препаратов, лаборатории медицинской биотехнологии, лаборатории медицинской химии, отделения биотерапии опухолей и хирургического отделения общей онкологии НИИ Клинической Онкологии РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН, состоявшейся 18 мая 2011 года.

Публикации

Материалы данной диссертации представлены на Всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная онкология» (Новосибирск, 2008), на Международном конгрессе 20thInternational Congress on Anti-Cancer Treatment (Париж, 2009), на II Всероссийской

конференции с международным участием «Наноонкология» (Тюмень, 2010).

По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе 6 статей, 1 патент на изобретение и 9 тезисов.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста, содержит 21 рисунок, 29 таблиц. Состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты собственных исследований», «Обсуждение результатов исследования», «Заключение», «Выводы», «Список литературы». Список литературы содержит 188 источников, из них 5 - отечественных, 183 - зарубежных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

В работе были использованы клеточные линии метастатической

меланомы кожи человека (mel Cher, mel Р, mel Mtp, mel Ibr, mel Ksen, mel Kor, mel Gus, mel R, mel Me, mel Ch, mel II, mel Ml, mel Si, mel Bgf, mel RZ84), полученные в лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН из опухолевого материала прооперированных больных и клеточная линия метастатической меланомы кожи человека meWo (каталог АТСС). Культивирование клеточных линий in vitro проводили в полной среде RPMI-1640 в соответствии со стандартными условиями.

Формирование сосудистоподобных структур (СПС) in vitro проводили на матриксе базальных мембран Матригеле (BD Bioscience), клетки наносили в количестве 100 ООО на дно лунки 48-луночного планшета в полной среде RPMI-1640.

Формирование тубулярных структур in vitro проводили на матриксе базальных мембран Матригеле (BD Bioscience) или

фибронектине (BD Bioscience), клетки наносили в количестве 500 ООО на ■ покровное стекло размером 24x24мм.

Имплантация опухолевых клеток и учет динамики роста опухоли in vivo. Для экспериментов in vivo использовали бестимусных мышей. Для каждого опыта в соответствии со схемой эксперимента мышей разделяли на 3 группы по 5 особей в каждой. Для индукции опухолей проводили подкожную перевивку 1, 3 и 5x106 клеток линии mel Cher в 100 мкл клеточной суспензии. Формирующиеся опухоли измеряли раз в три дня.

Размеры опухоли определяли по формуле: V опухоли = Уг Ш х Ш х Д,

где Ш - ширина опухолевого подкожного узла, Д - длина опухолевого подкожного узла.

Исследование феномена васкулогенной мимикрии проводили в ткани подкожных ксенографтов и на парафиновых блоках от 36 больных с морфологически доказанным диагнозом меланомы кожи, проходивших лечение в Российском онкологическом научном центре с 1992 по 2008 год.

PAS-окрашивание на базальные мембраны проводили реактивом Шиффа. Использовали набор Accustain (Sigma Aldrich).

Иммуиогистохимический анализ проводили по стандартной методике. В качестве первичных антител использовали моноклональные антитела к VEGF (DAKO; клон VG1, разведение 1: 25), VEGFR1 ((Flt-1), Neomarkers; Rb-1527p, разведение 1:250), VEGFR-2((Flk- 1/KDR), Neomarkers; Rb-1526p, разведение 1:250), CD34 (Dako, клон QBEndlO, разведение 1: 50) и CD31(DAKO, 7C70A, разведение 1:50). Оценивали количество окрашенных опухолевых клеток в процентах в поле зрения и по интенсивности окрашивания: О - отсутствие окрашивания, 1+ - окрашивание слабой интенсивности, 2+ - окрашивание средней интенсивности,

3+ - окрашивание высокой интенсивности.

Исследуемые случаи считали положительными по экспрессии VEGF в случае процента окрашенных клеток > 25% и средней интенсивности окрашивания (2+).

Исследуемые случаи считали положительными по экспрессии VEGFR1 и VEGFR2 при интенсивности окрашивания от 2+ и проценте положительных клеток > 10 %. Для оценки пролиферативной активности опухоли оценивали экспрессию Ki-67 в ядре клетки (клон MIB-1, разведение 1:100, DAKO).

Комбинированное CD34/CD31/PAS-OKpauiueaHue проводили следующим образом: сразу после иммуногистохимического окрашивания на маркеры CD31 и CD34 без докрашивания гематоксилином проводили PAS-окрашивание на базальные мембраны.

Определение сосудистой плотности опухоли. Подсчет сосудов в ткани опухоли проводили по протоколу Weidner в соответствии с международными рекомендациями.

Статистическую обработку данных выполняли с использованием компьютерной программы SPSS v.17.0 для Windows.

Результаты исследований и их обсуждение

1. Способность клеточных линий метастатической меланомы кожи к васкулогенной мимикрии

В качестве экспериментального подхода к исследованию способности клеточных линий метастатической меланомы кожи к васкулогенной мимикрии была предложена следующая схема:

1) исследование формирования сосудистоподобных структур (СПС) in vitro на внеклеточных матриксах в краткосрочном тесте до 16 часов,

2) последующее исследование способности клеточных линий сохранять СПС в краткосрочном тесте до 24 часов,

3) подтверждение способности к васкулогенной мимикрии в долгосрочных экспериментах по формированию тубулярных структур на внеклеточных матриксах,

4) иммуноцитохимическое исследование экспрессии белков.

Формирование сосудистоподобных структур на внеклеточном

матриксе Матригеле

В исследовании было показано, что 81,3 % (13 из 16) изученных клеточных линий метастатической меланомы кожи обладали воспроизводимой способностью формировать сосудистоподобные структуры при инкубации на Матригеле in vitro. Культивирование клеток в низкой плотности (100 000 клеток на 1 лунку 48-луночного планшета) приводило к формированию СПС через 10-16 часов (табл. 1-3).

Следует отметить, что 37,5% исследуемых клеточных линий (mel Cher, mel Si, mel Bgf, mel P, mel Ch, mel R) образовывали стабильные СПС, структура которых была сохранена через 24 часов (таблица 1). В этом случае опухолевые клетки, посаженные на Матригель, образовывали длинные, соединенные друг с другом трубочки, отсутствовали незамкнутые трубочки, не ограниченные контактами с другими клетками.

Таблица 1.Клеточные линии, формирующие стабильные СПС

Клеточная пиния формирование СПС в течение 16 часов СПС через 24 часа

mel Cher Формирование СПС Сохранены

mel Ch Формирование СПС Сохранены

mel R Формирование СПС Сохранены

mel BGF Формирование СПС Сохранены

mel Si Формирование СПС Сохранены

mel P Формирование СПС Сохранены

Формирование сосудистоподобных структур клеточной линией mel Cher представлено на рисунке 1А. Наблюдаемые СПС были похожи на структуры, формируемые клеточной линией эндотелиальных клеток мыши SVEC-4-10 (рисунок 1Б).

Ч Рисунок 1

»'й А - формирование сосудистоподобных

' у структур клеточной линией mel Cher,

( Б - формирование сосудистоподобных

структур клеточной линией эндотелиальных

•г клеток мыши SVEC-4-10,

' illi ИЯ увеличение х200.

Способность клеточных линий метастатической меланомы кожи к формированию СПС различна. Так, 43,8% исследуемых клеточных линий (mel Kor, mel II, mel Ml, mel Gus, mel Mtp, mel RZ84, me Wo) формировали СПС, которые через 20-24 часа инкубации клеток на Матригеле нестабильны (таблица 2). Формирование нестабильных СПС клеточной линией метастатической меланомы кожи человека mel Ког представлено на рисунке 2А, Б.

Таблица 2.Клеточные линии, формирующие нестабильные СПС

¡Клеточная [линия ' Формирование СПС в течение 16 часов СПС через 24 часа

bel D Формирование СПС Не сохранены

hmeJ Kor Формирование СПС Не сохранены

mel Mtp Формирование СПС Не сохранены

mel Gus Формирование СПС Не сохранены

mel Ml Формирование СПС Не сохранены

mel RZ84 Формирование СПС Не сохранены

me Wo Формирование СПС Не сохранены

Г------- V • 'Л

й Щ: J Щ

-•V

Л з- ШвГ

Рисунок 2 А - формирование сосудистоподобных структур клеточной линией mel Kor через 16 часов инкубации на Матригеле, Б - через 24 часа, увеличение х200.

•Б .

Клеточные линии те1 КБеп, те1 ГЬг, те! Ме (18,7%) обладали низкой способностью к формированию СПС (таблица 3). В этом случае формирование СПС не происходило от опыта к опыту, и часто зависело от наличия/отсутствия монослоя культуры клеток, взятых для эксперимента- При этом опухолевые клетки, не формирующие СПС,

образовывали малые кластеры клеток с короткими прерывающимися трубочками.

Таблица 3, Клеточные линии с низкой способностью к формированию СПС

Клеточная линия Формирование СПС в течение 16 часов СПС через 24 часа

MeJ Ksen Формирование СПС или кластеров клеток Не сохраняются

mel Ibr Формирование СПС или кластеров клеток Не сохраняются

mel Me Формирование СПС или кластеров клеток Не сохраняются

Формирование сосудистоподобных структур клеточной линией mel Me представлено на рисунке ЗА,Б.

1 -г, ; :-Т-лл

** f •

.ut.1

? ,>v

fa-ч

vJ - uU

JÉftsii^iiKi

Рисунок 3

А - формирование СПС клеточной линией П)с1 Ме,

Б - формирование кластеров клеток линией те1 Ме, увеличение х200.

Таким образом, клеточные линии метастатической меланомы кожи человека обладают разной способностью к формированию сосудистоподобных структур.

2. Создание положительной модели васкулогенной мимикрии при мелаиоме кожи

Для создания положительной модели васкулогенной мимикрии исследовали способность к формированию тубулярных структур в долгосрочных экспериментах. При культивировании опухолевых клеток линии mel Cher в высокой плотности на Матригеле или фибронектине формирование тубулярных структур происходило спустя 3 дня, к концу 2 недели формирование тубулярных структур было завершено. При этом на монослое клеток были видны поверхностные, объемные петли, окружающие небольшие кластеры опухолевых клеток, и сети, состоящие из не менее 3 петель, соединенных вместе (рисунок 4А). Для данных структур характерна положительная PAS-реакция, что свидетельствует о

присутствии белков базальных мембран. Стабильное формирование тубулярных структур клеточной линией mel Cher позволило использовать данную клеточную линию для дальнейших экспериментов по созданию

Рисунок 4

А - формирование тубулярных структур клеточной линией mel Cher,

Б - формирование кластеров клеток клеточной линией mel Me, увеличение х200

Проведенный иммуноцитохимический анализ экспрессии белков на клеточной линии mel Cher показал, что для данной клеточной линии метастатической меланомы кожи характерна экспрессия белков базальных мембран (ламинина общего, ламинина 5у2, коллагена IV типа), VEGF и его рецепторов (VEGFR-1, VEGFR-2), VE-кадхерина.

В работе in vivo было подтверждено, что при перевивке опухолевых клеток линии mel Cher бестимусным мышам происходит воспроизведение процесса ВМ. Динамика роста подкожных ксенографтов представлена на рисунке 5.

дни после ниъкцнн

Рисунок 5. Динамика роста подкожных ксенографтов клеточной линии метастатической меланомы кожи человека mel Cher.

положительном модели.

" " Wlf — W я

«W >"<••• fe .••

li:

При гистологическом исследовании опухоль состояла из пласта средних, полиморфных клеток, разделенных узкими прослойками

соединительной ткани (рисунок 6А). В некоторых опухолевых клетках наблюдалось наличие небольшого количества пигмента (меланина). Ядра

опухолевых клеток были овально-округлой формы. Среднее количество СБ34-положительных сосудов в опухоли было равно 8+2 (рисунок 6Б). Окрашивание срезов опухоли реактивом Шиффа на наличие базальных мембран показало, что в ткани опухоли присутствовали РАБ-положительные структуры в виде параллельных и параллельных с пересечением каналов (рисунок 6 Б). Комбинированное окрашивание на маркер СБ34 и наличие базальных мембран показало, что РАБ-положительные структуры не окрашены антителами к СБ34 и ограничены опухолевыми клетками, что является признаком васкулогенной мимикрии (Рисунок 6Г).

Рисунок 6

А - окрашивание гематоксилин-эозином, Б - определение СП34+-сосудов, сосудистая плотность опухоли - 8+2 сосуда в поле зрении. В - РАБ-положнтельные структуры параллельные с пересечением каналы (стрелки),

Г - Комбинированное ('П.МТЛЬ-окрашивание, выявление СГ)34-/РА5+-структур (структур васкулогенной мимикрии), увеличение х200

Таким образом, клеточную линию mel Cher можно рассматривать как модель для изучения ВМ in vitro и in vivo. К характеристикам данной модели относятся:

- стабильное воспроизведение СПС in vitro для получения точных результатов тестирования новых противоопухолевых веществ в краткосрочных тестах (до 24 часов),

- формирование тубулярных структур in vitro в долгосрочных тестах,

- формирование ВМ-структур in vivo, которые воспроизводимы в случае имплантации бестимусным мышам.

■ярпг.

ÍT

- V

В результате иммуногистохимического анализа опухолевой ткани подкожных ксенографтов была выявлена высокая экспрессия VEGF и его рецепторов VEGFR-1 и VEGFR-2. Для VEGF характерно цитоплазматическое окрашивание средней интенсивности, для VEGFR-1 и VEGFR-2 - цитоплазматическое и мембранное окрашивание высокой интенсивности. Ядерная экспрессия Ki-67 была характерна для 30-40% клеток опухоли.

3. Изучение особенностей васкуляризации меланомы кожи человека с учетом васкулогенной мимикрии на парафиновых блоках опухоли

Проанализированы парафиновые блоки опухолей 36 больных меланомой кожи с разными стадиями болезни (I - Ш ст.) Средний возраст больных составил 45 лет (21-68). Локализация меланомы кожи: на туловище - 47%, на конечностях - 50%, на коже головы - 3% . В 36 % случаев анализировали ткань метастазов в региональные лимфоузлы или мягкие ткани, в 64% случаев - опухолевую ткань первичного очага меланомы кожи.

В опухолевой ткани больных меланомой кожи выявлены 7 типов PAS-положительных структур (таблица 4): прямые каналы, распределенные случайным образом, без ответвлений и не соединенные между собой; параллельные каналы, представляющие собой структуры, идущие параллельно друг другу без ответвлений и пересечений; параллельные с пересечением каналы, связанные между собой; арки, представляющие собой не полностью замкнутые петли; арки с ветвлением, по типу ветвления деревьев; петли, представляющие собой полностью замкнутые структуры; сети, которые представляют собой как минимум три замкнутые петли, прилегающие одна к другой.

Поскольку в ткани одной опухоли могут присутствовать несколько типов PAS-положительных структур, был проведен анализ их корреляции. Наличие прямых каналов коррелировало с присутствием в ткани опухоли

арок с ветвлением (X2 = 4,213, р = 0,04) и сетей (X2 = 7,204, р = 0,007), в свою очередь наличие арок с ветвлением коррелировало с присутствием в ткани меланомы кожи петель (Х2= 11,638, р = 0,001).

Таблица 4. Частота различных типов РАв-структур в опухолевой ткани меланомы кожи человека

Тип РАБ-структур Количество больных

Абсолютное кол-во(п) %

Прямые каналы 21(36) 58,3

Параллельные каналы 14(36) 38,9

Параллельные с пересечением каналы 5(36) 13,9

Арки 29(36) 80,6

Арки с ветвлением 26(36) 72,2

Замкнутые петли 20(36) 55,6

Сети 9(36) 25

Статистически значимой зависимости между присутствием в ткани опухоли определенных типов PAS-положительных структур и такими показателями, как локализация, стадия заболевания и возраст пациента, не отмечено. Однако, нами было показано, что для всех метастатических очагов характерно присутствие в ткани опухоли арок (100%) по сравнению с первичным очагом (61,1%) (р=0,008) (таблица 5).

Таблица 5. Наличие PAS-структур и исследуемый очаг

Тип РАБ-структур Первичный очаг (%) Метастат. очаг(%) X (коэффициент корреляции) Пирсона Р

Прямые каналы 58,8 71,4 0,533 0,465

Параллельные каналы 33,3 42,9 0,305 0,581

Параллельные с пересечением каналы 16,7 14,3 0,034 0,854

Арки 61,1 100 6,969 0,008»

Арки с ветвлением 77,7 64,3 0,709 0,400

Петли 56,3 57,1 0,008 0,928

Сети 44,4 7,1 5,420 0,020*

Также продемонстрировано, что сети присутствуют чаще в первичном очаге - 44,4% по сравнению с метастатическим - 7,2 % (р=0,02).

В результате проведенного анализа было определено, что существует обратная зависимость между экспрессией УЕОР и присутствием в опухолевой ткани РА5-положитслыгых прямых каналов (таблица 6).

Таблица 6. Наличие PAS-структур и экспрессия VEGF

Тип РАЭ-структур Экспрессия VEGF (%) X (коэффициент корреляции) Пирсона Р

Прямые каналы + 27,8 64,3 4,265 0,039*

Парал. каналы + 50 42,9 0,157 0,692

Парал. с перес. + 40 46,4 0,071 0,790

Арки + 48,1 33,3 0,435 0,510

Арки с ветвлением + 41,7 55,6 0,509 0,373

Петли + 38,9 53,3 0,689 0,407

Сети + 50 44 0,088 0,767

* - данные статистически значимы, р < 0,05

Выявлена обратная корреляция между цитоплазматической экспрессией УЕОИМ и присутствием в опухолевой ткани РА5-положительных параллельных с пересечением каналов (таблица 7).

Выявлена обратная корреляция между присутствием в ткани опухоли прямых каналов и экспрессией УЕСРЯ-2 (таблица 8). Следует отметить, что РА5-окрашивание выявляет базальные мембраны сосудов, состоящих из эндотелиальных клеток, базальные мембраны каналов, состоящих из клеток опухоли (ВМ-структуры), а также соединительную ткань.

Таблица 7. Наличие РАБ-структур и экспрессия \TiGFR-l

Тип РА5-структур Экспрессия УЕСПЫцито (%) X2 (коэффициент корреляции) Пирсона Р

Прямые каналы + 41,2 57,1 0,784 0,376

Парал. каналы + 41,7 50 0,209 0,647

Парал. с перес. + 0 55,в 5,229 0,022*

Арки + 44 57,1 0,379 0,538

Арки с ветвлением + 41,7 62,5 1,046 0,306

Петли + 47,4 46,2 0,005 0,948

Сети + 55,6 34,8 0,379 0,411

* - данные статистически значимы, р < 0,05

Таблица 8. Наличие РАв-структур и экспрессия УЕСИ{-2

Тип РАН-структур Экспрессия \'ЕОП*2 (%) X (коэффициент корреляции) Пирсона Р

Прямые каналы + 25 71,4 6,467 0,011*

Парал. каналы + 36,4 50 0,533 0,465

Парал. с перес. + 20 50 2,355 0,125

Арки + 44 50 0,070 0,791

Арки с ветвлением + 50 28,6 1,005 0,316

Петли + 44,4 46,2 0,009 0,925

Сети + 62,5 39,1 1,309 0,253

Проведено изучение сосудистой плотности меланомы кожи человека. Области с высокой степенью васкуляризации определяли путем сканирования среза опухоли при низком увеличении (х40 и хЮО), выбирали 3 области опухоли, содержащие максимальное количество СВ31+/СБ34+ микрососудов. Отдельные микрососуды подсчитывали при увеличении х200 после фотографирования. Любые видимые эндотелиальные клетки, отделенные от окружающих сосудов, подсчитывали как отдельные микрососуды. Максимальную плотность микрососудов (МПМ) определяли как среднее значение количества сосудов в 3 полях зрения.

Анализ микрососудов, окрашенных антителами к маркерам эндотелиальных клеток, показал, что МПМ меланомы кожи человека составила 35+4 сосуда в поле зрения (этот показатель варьировался от 13 от 65). 50% опухолей были отнесены к опухолям с высокой МПМ, а 50% -к опухолям с низкой МПМ.

Для исследования областей ВМ было проведено комбинированное СВ34/СБ34/РА8-окрашивание опухолевых срезов меланомы кожи. СВ34+/СБ31+/РА5+структуры представляют собой кровеносные сосуды, состоящие из эндотелиальных клеток, которые характерны для всех исследуемых опухолей, а СВ31-/СВ34-/РА5+структуры - каналы, состоящие из опухолевых клеток (ВМ).

Комбинированное СВ34/СВ31/РА5-окрашивание меланомы кожи показало, что для 77 % случаев характерны ВМ-структуры.

Проанализирована плотность микрососудов в зоне ВМ на срезах опухоли при комбинированном окрашивании. Среднее значение плотности микрососудов составило 10+2 сосуда в поле зрения (от 0 до 27). 46% исследуемых опухолей характеризовалось относительно высокой плотностью сосудов в зоне ВМ (количество сосудов в поле зрения > 10). 31% исследуемых образцов характеризовались низкой сосудистой плотностью в зоне ВМ (количество сосудов в поле зрения <10).

При сравнении участков с ВМ и без нее для каждой отдельной опухоли нами было показано, что в зонах с ВМ-структурами количество кровеносных микрососудов было ниже, чем в тех зонах опухоли, где ВМ-структуры отсутствовали (рисунок 7).

Средний показатель уменьшения сосудистой плотности составил 23+14 сосуда в поле зрения (от 0 до 53).

Также было показано, что ВМ-структуры соединяются с ангиогенными сосудами (рисунок 8).

Уменьшение плотности ангиогенных сосудов в зоне васкулогенной мимикрии и отсутствие некрозов в этой области может косвенно свидетельствовать об участии ВМ-структур в васкуляризации опухоли.

35±4

10+2

зона максимальном зона васкулогенной

сосудистой плотности мимикрии

Рисунок 7. Уменьшение сосудистой плотности в зоне васкулогенной мимикрии. Максимальная плотность микрососудов - 35+4 сосуда в поле зрения. Сосудистая плотность зоне ВМ - 10+2 сосуда в поле зрения, различия статистически значимы, р <_0,05

Рисунок 8. Комбинированное С031/СШ4/РА5-окрашивание, увеличение х400. Соединение СШ1-/СЦ34-/РА8+ структуры (ВМ-структура, стрелка) и СШ1+/СШ4+/РАБ+ структуры (сосуд, состоящего из эндотелиальных клеток). В просвете канала - эритроциты.

Таким образом, РА8-окрашивание срезов с парафиновых блоков и комбинированное СВ31/СВ34/РА8-окрашивание выявило присутствие компонента васкулогенной мимикрии в ткани меланомы кожи человека. Обнаружено снижение количества сосудов, состоящих из эндотелиальных клеток, в областях васкулогенной мимикрии исследуемых опухолей.

Выводы

1. Показано, что клеточные линии метастатической меланомы кожи обладают разной способностью к васкулогенной мимикрии и формированию СПС: 37,5% формируют стабильные СПС, 43,8 % формируют нестабильные СПС, 18,7% обладают низкой способностью к формированию СПС.

2. Создана экспериментальная модель для изучения васкулогенной мимикрии in vitro с использованием методов формирования сосудистоподобных структур в краткосрочных тестах и тубулярных структур в долгосрочных тестах.

3. Разработана модель для изучения васкулогенной мимикрии in vivo на бестимусных мышах.

4. Изучены особенности васкулогенной мимикрии при меланоме кожи человека. В ткани опухоли присутствуют 7 типов PAS-положительных структур: прямые каналы, параллельные каналы, параллельные с пересечением каналы, арки, арки с ветвлением, петли и сети.

5. Показано, что структуры васкулогенной мимикрии (CD31-/CD34-/PAS+-cTpyKTypbi) в ткани меланомы кожи присутствуют в 77% случаев.

6. Показано уменьшение плотности микрососудов (CD34+/CD31+/PAS+-cipyKTyp) в зоне васкулогенной мимикрии (р<0,05). Максимальная плотность микрососудов в ткани меланомы кожи составила 35+4 сосуда в поле зрения. Плотность микрососудов в зоне ВМ составила 10+2 сосуда в поле зрения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. A.Vartanian, E.Stapanova, A.Baryshnikov, S.Gutorov, M.Lichinitser, I.Grigorieva, I.Sokolova, E.Solomko. Prognostic significance of Periodic Acid-Shiff-positive patterns in clear cell renal cell carcinoma // The Canadian journal of urology. - 2009. -V.16 (4). - P.4726 — 31.

2. Vartanian, Amalia; Stepanova, Eugenia; Grigorieva, Irina; Solomko, Elico; Baryshnikov, Anatoly; Lichinitser, Mikhail. VEGFR1 and PKCa signaling control melanoma vasculogenic mimicry in a VEGFR2 kinase-independent manner // Melanoma Res. - 2011. - V.21 (2). - P. 91-98.

3. Vartanian A, Stepanova E, Grigorieva I, Solomko E, Belkin V, Baryshnikov A, Lichinitser M. Melanoma vasculogenic mimicry capillary-like structure formation depends on integrin and calcium signaling // Microcirculation. - 2011. - V.18 (5). - P. 390-399.

4. И.Н.Григорьева, О.С.Бурова, Е.В.Степанова, Т.К.Харатишвили, А.Ю. Барышников. Способность клеточных линий метастатической меланомы кожи к васкулогенной мимикрии // Российский биотерапевтический журнал. - 2010. -, Т.9, №4. - С. 97-102.

5. И.Н.Григорьева, Т.К.Харатишвили, А.Ю. Барышников. Васкулогенная мимикрия - альтернативный механизм кровоснабжения опухоли? // Российский биотерапевтический журнал. - 2011. - Т.З. - с.25-29.

6. И.Н.Григорьева, Я.В. Вишневская, М.Е.Абрамов, Т.К.Харатишвили, А.Ю. Барышников, Е.В.Степанова. Особенности васкуляризации меланомы кожи человека //Забайкальский медицинский вестник. - 2011. - Т.2 - с. 12-18.

7. Е.В.Степанова, Э.Ш.Соломко, И.Н.Григорьева, А.Ю.Барышников. Механизмы опухолевой васкуляризации in

vitro II Российский биотерапевтический журнал. - 2008 - Т.7, -№1 - С. 32.

8. I.N.Grigorieva, E.V.Stepanova, O.S.Burova, T.K.Kharatishvili, E.Sh.Solomko, A.Y.Baryshnikov. The evaluation of highly aggressive cutaneous melanoma cells ability to vasculogenic mimicry // Материалы конференции «Молекулярная онкология», Новосибирск - 2008 - С.27.

9. И.Н.Григорьева, Е.В.Степанова, Т.К.Харатишвили, О.С.Бурова, Э.Ш.Соломко, А.А.Вартанян, А.Ю.Барышников. Клеточная линия меланомы кожи mel Cher как положительная модель васкулогенной мимикрии // Российский биотерапевтический журнал. - 2009. - Т.8, №2 - С.7

Ю.Э.Ш.Соломко, Е.В.Степанова, И.Н.Григорьева,

А.Ю.Барышников. Оценка антиангиогенной активности экстрактов растений и их фракций, произрастающих на территории России // Российский биотерапевтический журнал. -2009. - Т.8, №2 - С. 56.

11 .I.N.Grigorieva, E.V.Stepanova, O.S.Burova, T.K.Kharatishvili, E.Sh.Solomko, A.A.Vartanian, A.Y.Baryshnikov. Positive tumour model of vasculogenic mimicry among cutaneous melanoma cell lines // 20ftInternational Congress on Anti-Cancer Treatment, abstract book. - 2009. - P.442.

12.E.V.Stepanova, I.N.Grigorieva, A.Y.Baryshnikov, M.R.Lichinitser. The evaluation of antiangiogenic activity of Russian native medicinal plants // 20thInternational Congress on Anti-Cancer Treatment, abstract book. - 2009. - P.435.

13.И.Н.Григорьева, Е.В.Степанова, А.Ю.Барышников. Клиническое значение васкулогенной мимикрии для больных меланомой кожи // Российский биотерапевтический журнал -2011. - Т.10, №1 -С.20.

14.A.Vartanian, Eugenia Stepanova, Galina Gatsina, Irina Grigorieva, Anatoly Baryshnikov, Michail Lichinitser. VEGFRl/PKCa signaling controls melanoma vasculogenic mimicry and is not dependent on VEGFR2 kinase- manner // NCRI, poster session. -2010.-A137.

15.И.Н.Григорьева, Э.Ш.Соломко, Е.В.Степанова, Т.К.Харатишвили Ингибирование васкулогенной мимикрии -новый подход к противоопухолевой антиагниогенной терапии с использованием нанопрепаратов // Российский биотерапевтический журнал. - 2010. - Т.9, №3. - С.9.

Патент на изобретение

1. И.Н.Григорьева, Е.В.Степанова, И.Н.Михайлова, А.А.Вартанян, Л.Ф.Морозова, О.С.Бурова, А.Ю.Барышников. Применение клеточной линии меланомы кожи человека mel Cher в качестве положительной модели васкулогенной мимикрии // Патент на изобретение № 2404243.

Подписано в печать 30.06.11 Формат 60x84/16. Бумага офисная «БуеШСору». Тираж 100 экз. Заказ №629 Отпечатано на УМТ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 115478, г. Москва, Каширское ш., 24

Оглавление диссертации Григорьева, Ирина Николаевна :: 2011 :: Москва

Список сокращений

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

Раздел 1.1. Васкуляризация опухолей и васкулогенная мимикрия.

Раздел 1.2.Исследование васкулогенной мимикрии на срезах опухолей.:.

Раздел 1.3. Клиническое значение васкулогенной мимикрии.

Введение диссертации по теме "Онкология", Григорьева, Ирина Николаевна, автореферат

Актуальность темы

В последние десятилетия стремительно растет заболеваемость злокачественными новообразованиями. Смертность от онкологической патологии уступает лишь смертности от сердечно-сосудистых заболеваний.

Меланома составляет не более 10% от всех форм новообразований кожи, но ответственна за 80% смертей, приходящихся на группу злокачественных опухолей кожи [3], за счет высокого метастатического потенциала и быстрого прогрессирования [61].

Известно, что с ранних этапов развития новообразования необходим ангиогенез [50, 58, 134]. Однако, в ткани меланомы, наряду с ангиогенезом, запускаются альтернативные механизмы кровоснабжения, например, васкулогенная мимикрия (ВМ) [42].

Васкулогенная мимикрия - это способность опухолевых клеток формировать ограниченные базальной мембраной сосудистоподобные каналы без участия эндотелиальных клеток (ЭК) и фибробластов. Полагают, что формирование опухолевыми клетками высокоструктурированных васкулярных каналов, ограниченных базальной мембраной, происходит при гипоксических условиях и недостатке питательных веществ [5].

Для изучения васкулогенной мимикрии in vitro используются эксперименты, результатом которых является создание сосудистоподобных и тубулярных структур при культивировании опухолевых клеток на внеклеточных матриксах [42]. Высокоагрессивные клетки меланомы при инкубации на Матригеле (компоненте базальных мембран) способны формировать сосудистоподобные (при культивировании опухолевых клеток в низкой плотности в течение 8-24 часов) и тубулярные структуры (при культивировании клеток в высокой плотности в течение 2-3 недель). Эти структуры сходны с опухолевыми каналами, которые находят при морфологическом исследовании образцов меланомы кожи человека. При окрашивании гистологических срезов опухолей человека и животных на ламинин с использованием метода иммуногистохимии или реактивом Шиффа (PAS-окрашивание) можно определить PAS-положительные и ламинин-положительные структуры, часть из которых представляет собой васкулогенную мимикрию. ВМ определена как компонент экстраваскулярной сети и представлена каналами между опухолевыми клетками, содержащими' эритроциты и плазму крови [112]. Каналы из опухолевых клеток не окрашиваются антителами к маркерам эндотелильных клеток CD31 и CD34 [42].

В исследованиях было показано, что компоненты ВМ находят в 70-80% случаев меланомы кожи и глаза, 10-20% случаев рака молочной железы, яичников и астроцитом [5, 125, 150]. Известно, что пациенты с меланомой, в опухолевой ткани которых есть структуры васкулогенной мимикрии, могут иметь худший прогноз заболевания [43, 26, 102, 138, 147, 161, 173]. Так, присутствие в ткани опухоли определенного типа PAS-положительных структур коррелирует с появлением отдаленных метастазов после удаления первичной опухоли [42].

Способность к васкулогенной мимикрии может быть обусловлена особенностями фенотипа опухолевых клеток. Известно, что опухолевые клетки экспрессируют фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), основной фактор роста фибробластов (bFGF), гепатоцитарный фактор роста (HGF) и другие [30]. Отмечено, что клетки, способные к васкулогенной мимикрии in vitro, часто экспрессируют молекулярно-биологические маркеры, характерные для эндотелиальных клеток, такие как VE-кадхерин, EphA2, фактор Фон Виллебранда / VIII as.ag.

В настоящее время существуют трудности в исследовании ВМ, которые преимущественно связаны с методологическими проблемами. В мире есть только ограниченное количество охарактеризованных моделей для изучения ВМ.

В связи с вышеизложенным, разработка экспериментальной модели для изучения васкулогенной мимикрии при меланоме кожи является актуальной.

Цель работы

Изучение феномена васкулогенной мимикрии при меланоме кожи.

Задачи исследования

2. Изучение особенностей васкулогенной мимикрии in vivo.

4. Изучение васкулогенной мимикрии на гистологических срезах меланомы кожи человека.

5. Определение особенностей васкуляризации меланомы кожи человека с учетом васкулогенной мимикрии.

Научная новизна

Впервые в России разработаны методы изучения васкулогенной мимикрии in vitro и in vivo на примере клеточных линий метастатической меланомы кожи человека, которые охарактеризованы по их способности к ней. Впервые разработана экспериментальная модель васкулогенной мимикрии для изучения ее формирования in vivo и in vitro, а также разработаны экспериментальные подходы к изучению васкулогенной мимикрии на гистологических срезах меланомы кожи человека. Впервые изучено значение васкулогенной мимикрии для васкуляризации меланомы кожи человека.

Научно-практическая значимость

Разработаны подходы к изучению способности к васкулогенной мимикрии, создана модель васкулогенной мимикрии, которая используется в различных научно-исследовательских институтах при создании лекарственных препаратов, направленных на ингибирование ВМ. Разработанные критерии изучения васкулогенной мимикрии при меланоме кожи человека применяют для исследовании других злокачественных новообразований. Клиническое значение васкулогенной мимикрии при меланоме кожи человека может служить основой для создания нового направления диагностики и лечения.

Заключение диссертационного исследования на тему "Васкулогенная мимикрия при меланоме кожи"

109 Выводы

3. Разработана модель для изучения васкулогенной мимикрии in vivo на бестимусных мышах.

5. Структуры васкулогенной мимикрии (CD31-/CD34-/PAS+-CTpyKTypbi) в ткани меланомы кожи присутствуют в 77% случаев.

6. Показано уменьшение плотности микрососудов (CD34+/CD31+/PAS+-структур) в зоне васкулогенной мимикрии (р < 0,05). Максимальная плотность микрососудов в ткани меланомы кожи составила 35+4 сосуда в поле зрения. Плотность микрососудов в зоне ВМ составила 10+2 сосуда в поле зрения.

Заключение

Клеточные линии метастатической меланомы кожи человека обладают способностью к формированию сосудистоподобных структур (СПС). Происходит формирование стабильных СПС (37,5%), нестабильных СПС (43,8%), 18,7% клеточных линий обладают низкой способностью к формированию СПС.

Экспрессия VEGFR-1 (Fltl) и VEGFR-2 (Flkl/KDR) характерна для 100 % исследуемых клеточных линий. 100% протестированных клеточных линий экспрессируют ламинин общий, 55,6% -5у2 цепь ламинина, 77,8% - коллаген IV типа. Экспрессия ламинина 5у2 характерна для всех клеточных линий, обладающих способностью формировать стабильные сосудистоподобные структуры. 100% протестированных клеточных линий экспрессируют комплекс фактор Фон Виллебранда/фактор VID.

Клеточная линия метастатической меланомы кожи mel Cher может быть использована в качестве модели для изучения механизмов ВМ и скрининга противоопухолевых препаратов, способных блокировать ВМ in vitro и in vivo. Проведенный иммуноцитохимический анализ экспрессии белков на клеточной линии mel Cher показал, что для данной клеточной линии метастатической меланомы кожи характерна экспрессия белков базальных мембран (ламинина общего, ламинина 5у2, коллагена IV типа), VEGF и его рецепторов (VEGFR-1, VEGFR-2), VE-кадхерина.

Способность клеточной линии метастатической меланомы кожи mel Cher к васкулогенной мимикрии подтверждена тестами на внеклеточных матриксах. Наряду с формированием тубулярных структур в долгосрочных экспериментах in vitro, клеточная линия mel Cher формирует стабильные СПС in vitro, что является преимуществом опухолевой модели васкулогенной мимикрии. Способность клеточной линии метастатической меланомы кожи mel Cher к васкулогенной мимикрии подтверждена экспериментами in vivo.

При подкожном введении опухолевых клеток бестимусным мышам происходит формирование структур васкулогенной мимикрии.

Полученные данные свидетельствуют о присутствии компонента васкулогенной мимикрии в опухолевой ткани больных меланомы кожи.

В ткани меланомы кожи определено 7 типов PAS- положительных структур: прямые каналы (58,3%), параллельные каналы (38,9%), параллельные с пересечением каналы (13,9%), арки (80,6%)), арки с ветвлением (72,2%), петли (55,6%), сети(25%). ВМ-структуры (CD31-/CD34-/PAS+) характерны для 77 % опухолей.

Максимальная плотность микрососудов (МПМ) составила 35+4 сосуда в поле зрения при увеличении х200 (этот показатель варьировался от 13 от 65). 50% были отнесены к опухолям с высокой МПМ (МПМ>30), а 50% - к опухолям с низкой МПМ (МПМ< 30).

Среднее значение плотности микрососудов в зоне ВМ составило 10+2 сосуда в поле зрения (от 0 до 27). При сравнении участков с ВМ и без нее каждой отдельной опухоли нами было выявлено уменьшение плотности ангиогенных сосудов в зоне васкулогенной мимикрии и отсутствие некрозов в этой области (р < 0,05), что может косвенно свидетельствовать об участии ВМ-структур в васкуляризации опухоли. Средний показатель уменьшения сосудистой плотности составил 23+14 сосуда (от 0 до 53).

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2011 года, Григорьева, Ирина Николаевна

1. Астахова, С.Е. Роль и специфические особенности ангиогенеза в патогенезе увеальной меланомы: Дис. кандидата медицинских наук: 14.00.08 / С.П. Астахова Москва. - 2004. - 126 с.

2. Демидов, JI.B. Меланома кожи: стадирование, диагностика и лечение / Л.В. Демидов, Г.Ю. Харкевич // Русский медицинский журнал. 2003. -Т. 11, №11.- С.658-665.

3. Степанова, Е. В. Васкулярная мимикрия при злокачественных образованиях / Е. В Степанова, А. А. Вартанян, М.Р. Личиницер // Молекулярная медицина. 2006. - Т.1.- С.23-30.

4. Abbott, D.E. The epigenetic influence of tumor and embryonic microenvironments: how different are they? / D.E. Abbott, C.M. Bailey, L.M. Postovit, E.A. Seftor, N. Margaryan, R.E. Seftor, M.J. Hendrix // Cancer Microenvironment. 2008. - V.l - P. 13-21.

5. Alitalo, K. Molecular mechanisms of lymphangiogenesis in health and disease / K. Alitalo, P. Carmeliet // Cancer Cell. 2002. - V.l - P.219-227.

6. Allenspach, E. J. Notch signaling in cancer / E.J. Allenspach, I. Maillard, J.C. Aster, W.S. Pear. // Cancer Biol. Ther. 2002. - V. 1. - P. 466^76.

7. Becker, MR COX-2 expression in malignant melanoma: a novel prognostic marker? / MR Becker, M.D. Siegelin, R. Rompel, A.H. Enk, T. Gaiser // Melanoma Res. 2009 - V. 19 (1) - P. 8-16.

8. Bissell, M J. Putting tumours in context / M. J. Bissell, D. Radisky // Nature Rev. Cancer. 2001. - V.l. - P.46-54.

9. Bissell, M.J. Tumor plasticity allows vasculogenic mimicry, a novel form of angiogenic switch: A rose by any other name? Commentary. / Am J Pathol -1999.-V.155.-P. 675-9.

10. Glatfelter, P. Polloc, J Carpten, E. Gillanders, D. Leja, K. Dietrich, C. Beaudry, M. Berens, D. Alberts, V. Sondak, N. Hayward, J. Trent // Nature. -2000. V. 406. - P.536-540.

11. Bouck, N. How tumors become angiogenic / N Bouck, V Stellmach, SC Hsu // Adv Cancer Res. 1996. - V.69. - P. 135-74/

12. Carmeliet, P. Angiogenesis in cancer and other diseases / P Carmeliet, RK. Jain // Nature. 2000. - V.407 - P. 249-57.

13. Carmeliet, P. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. // Nat Med -V.2000. V.6. - P. 389-95

14. Carmeliet, P. Transgenic mouse models in angiogenesis and cardiovascular disease / P Carmeliet, D Collen // J Pathol. 2000. - V. 190. - P.387^105.

15. Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine // Nature. — 2005.-V. 438. P. 932-936.

16. Carnochan, P. The vascularity of cutaneous melanoma: a quantitative histological study of lesions 0.85-1.25 mm in thickness / P. Carnochan, JC Briggs, G Westbury, A.J.S. Davies // Br J Cancer. 1991. - V.64. - P. 102107.

17. Chang, Y.S. Mosaic blood vessels in tumors: frequency of cancer cells in contact with flowing blood / Y.S Chang, E. DiTomaso, D.M. McDonald, R/ Jones, R.K. Jain, L.L. Munn // Proc Natl Acad Sci USA.- 2000. V.26. -P. 14608-13.

18. Chen, X. Uveal melanoma cells staining for CD34 and assessment of tumor vascularity / X. Chen, A.J. Maniotis, D. Majumdar, J. Pe'er, R. Folberg // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2002. - V. 43. - P. 2533-2539.

19. Clarijs, R. Presence of a fluid-conducting meshwork in xenograft cutaneous and primary human uveal melanoma / R Clarijs, I Otte-Holler, DJ Ruiter, R.M.W. de Waal // Invest Ophtalmol Vis Sci. 2002. - V.43. - P:912-8.

20. Clarijs, R. Lack of lymphangiogenesis despite coexpression of VEGF-C and its receptor Flt-4 in uveal melanoma / R Clarijs, L Schalkwijk, DJ Ruiter,

21. RMW de Waal // Invest.Ophthalmol. Vis. Sci. 2001. - V. 42. - P. 14221428.

22. Colognato, H. Form and function: the laminin family of heterotrimers / H. Colognato, P.D. Yurchenco // Dev. Dynamics. 2000. - V.218. - P. 213-234.

23. Condorelli, G. Cardiomyocytes induce endothelial cells to transdifferentiate into cardiac muscle: implications for myocardium regeneration / G Condorelli, U Borello, L De Angelis // Proc. Natl Acad. Sci. USA 2001. -V.98. - P.10733-10738.

24. Crouch, S. HGF and ligation of alphavbeta5 integrin induce a novel, cancer cell-specific gene expression required for cell scattering / S.Crouch, C.S. Spidel, J.S. Lindsey // Exp Cell Res. 2004. - V.292. - P.274-287.

25. David, E. Elder Pathology of Melanoma / Clinical Cancer Research. 2006. - V.12.-P.2308-14.

26. DeMay, R.M. The art and science of cytopathology // Chicago, ASCP Press. -1996.-P. 463-492.

27. Depasquale, I. Micro vessel density for melanoma prognosis / I. Depasquale, W.D. Thompson // Histopathology. 2005. - V. 47(2) - P. 186-94.

28. Dome, B. Vascularization of cutaneous melanoma involves vessel co-option and has clinical significance / B. Dome, S. Paku, B. Somlai, J. Timar // J.Pathol. 2002. - V. 197. - P. 355-62.

29. Donald, MMcDonald Vasculogenic Mimicry: How Convincing, How Novel, and How Significant? / M.McDonald Donald, L. Munn, R.K. Jain // American Journal of Pathology. 2000. - Vol. 156, No. 2. - P. 383-388.

30. Donovan, D. Comparison of three in vivo human angiogenesis assays with capillaries formed in vivo / D. Donovan, N J. Brown, E.T. Bishop, C.E. Lewis // Angiogenesis. 2001. - V. 4. - P. 113-121.

31. Dvorak, H.F. Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, microvascular hyperpermeability, and angiogenesis. / H.F.Dvorak, L.F.Brown, M. Detmar, A.M. Dvorak // Am J Pathol. 1995. - V.146. - P. 1029-1039.

32. Easty, DJ. Up-regulation of ephrin-Al during melanoma progression / D.J. Easty, S.P. Hill, M.Y. Hsu, M.E. Fallowfield, V.A. Florenes, M. Herlyn, D.C. Bennett // Int. J. Cancer. 1999. - V. 84. - P.494-501.

33. Ferrara, N. The biology of vascular endothelial growth factor / N. Ferrara, T. Davis-Smyth // Endocr Rev. 1997. - V. 18 - P.4-25.

34. Ferrara, N. Pituitary follicular cells secrete a novel heparin-binding growth factor specific for vascular endothelial cells / N. Ferrara, W.J. Henzel // Biochem Biophys Res.Commun. 1989. - V.161. - P.851-858.

35. Folberg, R. Vasculogenic mimicry and tumor angiogenesis // R. Folberg, M.J.C. Hendrix, J. Maniotis // Am J Pathol. 2000. - V. 156. - P. 361-81.

36. Folberg, R. The prognostic value of tumor blood vessel morphology in primary uveal melanoma / R. Folberg, V. Rummelt, R. Parys-Van Ginderdeuren, T. Hwang, R.F. Woolsen, J. Pe'er, L.M. Gruman // Ophthalmology. 1993. - V.100. - P.1389-1398.

37. Folberg, R. Tumor progression in ocular melanomas / R.Folberg // J Invest Dermatol. 1993. - V. 100. - P. 326-331.

38. Folberg, R. Fineneedle aspirates of uveal melanomas and prognosis / R. Folberg, JJ. Augsburger, J.W. Gamel, J.A. Shields, W.R. Lang // Am J Ophthalmol. 1985. - V.100. - P. 654-657.

39. Folberg, R. The microcirculation of choroidal and ciliary body melanomas / R. Folberg, M. Mehaffey, L.M. Gardner, M. Meyer, V. Rummelt, J. Pe'er // Eye. 1997. - V.l 1. - P. 227-238.

40. Folberg, R. Discussion of paper by Foss et al / R.Folberg // Br J Ophthalmol. 1997. - V.81. - P. 247-248.

41. Folkman, J. Long-term culture of capillary endothelial cells / J. Folkman, C.C. Haudenschild, B.R. Zetter // Proc Natl Acad Sci USA. 1979. - V.76. -P.5217-5221.

42. Folkman, J. Angiogenesis in vitro / J. Folkman, C. Haudenschild // Nature. -1980.-V.288.-P.551 -6.

43. Foss, A.J.E. Microvessel count predicts survival in uveal melanoma / A.J.E. Foss, R.A. Alexander, L.W. Jefferies, J.L. Hungerford, A.L. Harris, S. Lightman // Cancer Res 1996. - V. 56. - P. 2900-2903.

44. Foss, A.J.E. Re-assessment of the PAS patterns in uveal melanoma / A.J.E. Foss, R.A. Alexander, J.L. Hungerford, A.L.Harris, I.A. Cree, S. Lightman // Br J Ophthalmol. 1997. - V.81. - P. 240-246.

45. Foss, A.E. Reassessment of the PAS patterns in uveal melanoma — reply / A.E. Foss, I.A. Cree // Br J Ophthalmol. -1998. V.82. - P. 101-102.

46. Fukumura, D Tumor induction of VEGF promotor activity in stromal cells / D. Fukumura, R. Xavier, T. Sugiura, Y. Chen, E.C. Park, N.F. Lu, M. Selig, G. Nielsen, T. Taksir, R.K. Jain, B. Seed // Cell. 1998: - V. 94. - P. 715725.

47. Garber, K. Angiogenesis inhibitors suffer new setback / K. Garber // Nature Biotech. 2002. - V.20. - P. 1067-1068.

48. George, E. D. Biosynthesis, Remodeling, and Functions During Vascular Morphogenesis and Neovessel Stabilization. Endothelial Extracellular Matrix / George E. Davis, D.R. Senger // Circulation Research. 2005. - V.97. -1093-1107.

49. Giannelli, G. Induction of cell migration by matrix metalloprotease-2 cleavage of laminin-5 / G. Giannelli, J. Falk-Marzillier, O. Schiraldi, W.G. Stetler-Stevenson, V. Quaranta // Science. 1997. - V. 277. - P. 225-228.

50. Graham, C.H. Extent of vascularization as a prognostic indicator in thin (0.76 mm) malignant melanomas / C.H. Graham, J. Rivers, R.S. Kerbel, K.S. Stankiewicz, W.L. White // Am J Pathol. 1994. - V. 45. - P. 510-514.

51. Gridley, T. Notch signaling during vascular development / T. Gridley // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2001. - V.98. - P. 10733-10738.

52. Gross, JL. Increased capillary endothelial cell protease activity in response to angiogenic stimuli in vitro / J.L. Gross, D. Moscatelli, D.B. Rifkin // Proc Natl Acad Sci USA. 1983. - V.80. - P. 2623-2627.

53. Gullino, PM. Angiogenesis and oncogenesis / P.M. Gullino II J Natl Cancer Inst. 1978. - V.61. - P.639-43.

54. Gumbiner, B. M. Cell adhesion: the molecular basis of tissue architecture and morphogenesis / B.M. Gumbiner // Cell. 1996. - V.4. - P. 345-357.

55. Hanahan, D. The hallmarks of cancer / D. Hanahan, R.A. Weinberg // Cell. -2000.-V.100.-P. 57-70

56. Hao, X. Microarray study of vasculogenic mimicry in bi-directional differentiation malignant tumor / X. Hao., B. Sun, S. Zhang, X. Zhao // Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2002. - V.82. - P.1298-1302.

57. Hashizume, H. Openings between defective endothelial cells explain tumor vessel leakiness / H. Hashizume, P. Baluk, S. Morikawa, J.W. McLean, G. Thurston, S. Roberge, R.K. Jain, D.M. McDonald // Am. J.Pathol. 2000. -V. 156. -P.1363-1380.

58. Hendrix, M.J.C. Vasculogenic mimicry and tumour-cell plasticity: lessons from melanoma / M.J.C Hendrix, E.A Seftor, A.R Hess, R.E. Seftor // Nature Reviews Cancer. 2003. - V.3. - P. 411-421.

59. Hendrix, MJ.C. Molecular biology of breast cancer metastasis. Molecular expression of vascular markers by aggressive breast cancer cells / M.J.C. Hendrix, E.A. Seftor, D.A. Kirschmann, R.E.B. Seftor // Breast Cancer Res. -2000. V. 2. - P.417-422.

60. Hess, R. Deciphering the signaling events that promote melanoma tumor cell vasculogenic mimicry and their link to embryonic vasculogenesis: role of the

61. Eph receptors / R. Hess, N.V. Margaryan, E.A. Seftor, M.J. Hendrix // Dev.Dyn. 2007. - V.236. - P. 3283-3296.

62. Hoang, M. P. CD34 expression in desmoplastic melanoma / M.P. Hoang, M.A. Selim, R.C. Bentley, J.L. Burchette, C.R. Shea // J. Cutan. Pathol. -2001.-V. 28.-P. 508-512.

63. Holash, J. Vessel cooption, regression, and growth in tumors mediated by angiopoietins and VEGF / J.Holash, P.C. Maisonpierre, D. Compton, P. Boland, C.R. Alexander, D. Zagzag, G.D. Yancopoulos, S.I. Wiegand // Science. 1999. - V.284. - P. 1994-1998.

64. Hood, J.D. VEGF upregulates ecNOS message, protein, and NO production in human endothelial cells / J.D Hood, C.J. Meininger, M. Ziche, H.J. Granger // Am J Physiol Heart Circ Physiol. 1998. - V.274. - P.H1054-H1058.

65. Hynes, R.O. Integrins in vascular development / R.O. Hynes, B.L. Bader, K. Hodivala-Diike // Braz. J. Med. Biol. Res. 1999. - V.32. - P. 501-510.

66. Hynes, R.O. Specificity of cell adhesion in development: the cadherin superfamily / R.O. Hynes // Curr. Opin. Genet. Dev. 1992. - V.2. - P.621-624.

67. Ilmonen, S. Prognostic value of tumour vascularity in primary melanoma / S. Ilmonen, A.L. Kariniemi, T. Vlaykova, T. Muhonen, S. Pyrhonen, S. Asko-Seljavaara // Melanoma Res. 1999. - V.9. - P.273-278.

68. Ivanova, N. B. A stem cell molecular signature / N.B. Ivanova, J.T. Dimos, C. C. Schaniel, J.A. Hackney, K.A. Moore, I.R. Lemischka // Science. 2002. -V.298.-P. 601-604.

69. Kemler, R. Classical Cadherins / R. Kemler // Semin. Cell Biol. 1992. - V.3. - P. 149-155.

70. Kerbel, R.S. Tumor angiogenesis: past, present and the near future / R.S. Kebler // Carcinigenesis. 2000. - V.21. - P.505-15.

71. Kim, C. J. The promise of microarray technology in melanoma care / C.J. Kim, D.S. Reintgen, T.J. Yeatman // Cancer Control. 2002. - V.9 (1). -P.49-53.

72. Klausner, R.D. The fabric of cancer cell biology — weaving together the strands / R.D. Klausner // Cancer Cell. 2002. - V. 1. - P.3-10.

73. Kon, K. Transformation of fibroblasts into endothelial cells during angiogenesis / K. Kon, T. Fujiwara // Cell Tissue Res. 1994. - P.625-628.

74. Korpelainen, E.I. Signaling angiogenesis and lymphangiogenesis / E.I. Korpelainen, K. Alitalo // Curr. Opin. Cell Biol. 1998. - V.10. - P. 159-164.

75. Koshikawa, N. Role of cell surface metalloprotease MT1-MMP in epithelial cell migration over laminin-5 / N. Koshikawa, G. Giannelli, V. Cirulli, K. Miyazaki, V. Quaranta // J. Cell Biol. 2000. - V.148. - P.615-624.

76. Ku, D.D. Vascular endothelial growth factor induces EDRF-dependent relaxation in coronary arteries / D.D. Ku, J.K. Zaleski, S. Liu, T.A. Brock // Am J Physiol Heart Circ Physiol. 1993. - V.265. - P.H586-H592.

77. Kumar, R. Angiogenesis molecules and cancer metastasis / R. Kumar, I.J. Fidler // In vivo. 1998. - V.12. - P. 27-34.

78. Laakkonen, P. A tumor-homing peptide with a targeting specificity related to lymphatic vessels / P. Laakkonen, K. Porkka, J.A. Hoffman, E. Ruoslahti // Nature Med. 2002. - V.8. - P.751-755.

79. LaBarge, M.A. Biological progression from adult bone marrow to mononucleate muscle stem cell to multinucleate muscle fiber in response to injury. / M.A. LaBarge, H.M. Blau // Cell. 2002. - V.lll. - P. 589-601.

80. Lampugnani, M.G. A novel endothelial-specific membrane protein is a marker of cell-cell contacts / M.G. Lampugnani // J. Cell Biol. 1992. - V.118. -P.1511—1522.

81. Levy, A. P. An endothelial cell growth factor from the mouse neuroblastoma cell line NB4 / A.P. Levy, R. Tamargo, H. Brem, D. Nathans // Growth Factors. 1989. - V.2. - P.9-19.

82. Makitie, T. Microvascular loops and networks as prognostic indicators in choroidal and ciliary body melanomas / T. Makitie, P. Summanen, A. Tarkkanen, T: Kivela //J. Natl Cancer Inst.- 1999. V.91. - P.359-367.

83. Malinda, K.M. The; laminins / K.M. Malinda, U.K. Kleinman // Int. J.Biochem. Cell Biol. 1996. - V.28. - P.957-959.

84. Maniotis, A.V.Control of melanoma morphogenesis, endothelial survival, and perfusion by extracellular matrix / A.J: Maniotis^ X. Chen, C. Garcia, P.J. DeChristopher, D. Wu, J. Pe'er, R. Folberg // Lab Invest . 2002. - V.82. -P.1031-43.

85. Maniotis, A:J. Distinguishing fibrovascular septa from vasculogenic mimicry patterns / A.J. Maniotis, A.Y. Lin, K. Valyi-Nagy, D: Majumdar, S. Setty, S. Kadkol, L. Leach, J. Pe'er, R. Folberg // Arch Pathol Lab Med. -2005. V. 129 (7). - P. 884-92.

86. Martin, T.A. Assessing microvessels and angiogenesis in human breast cancer, using VE-cadherin / T.A. Martin, G. Watkins, G. Lane, W.G. Jiang // Histopathology. 2005. - V.46. - P.422-430.

87. McLean, I.W.Uveal melanoma: comparison of the prognostic value of fibrovascular loops, mean of the ten largest nucleoli, cell type and tumor size / I.W. McLean, K.S. Keefe, M.N. Burnier // Ophthalmology. 1997. - V. 104. -P. 777-780/

88. McLean, I.W. The biology of haematogenous metastasis in human uveal malignant melanoma / I.W. McLean // Virchows Arch A Pathol Anat. 1993. - V.422. - P.433-437.

89. Mehaffe, M.G. Relative importance of quantifying area and vascular patterns in uveal melanoma / M.G. Mehaffey, R. Folberg, M. Meyer, S.E. Bentler, T. Hwang, R.F. Woolson, K.C. Moore // Am J Ophthalmol. 1997. - V.123. -P. 798-809.

90. Nickoloff, B.J. Etiology and pathogenesis of Kaposi's sarcoma / B.J. Nickoloff, K. E Foreman // Recent Results Cancer Res. 2002. - V.160. - P. 332-342.

91. Pasquale, E. B. The Eph family of receptors / E.B. Pasquale // Curr. Opin. Cell Biol. 1997. - V.9, 608-615.

92. Paulis, Y.W.J. Signalling pathways in vasculogenic mimicry / Y.W.J Paulis, P.M.M.B. Soetekouw B, H.M.W. Verheul, V.C.G. Tjan-Heijnen, A.W. Griffioen // Biochimica et Biophysica Acta Reviews on Cancer. - 2010. -V.1806 (1). -P.18-28.

93. Pett, A.P. Overexpression of carcinoma and embryonic cytotrophoblast cell specific Mig-7 induces invasion and vessel-like structure formation / A.P. Petty, K.L. Garman, V.D. Winn, C.M. Spidel, J.S. Lindsey // Am J Pathol. -2007. V.170. - P. 1763-1780.

94. Phillips, T.M. Carcinoma cell-specific Mig-7: a new potential marker for circulating and migrating cancer cells / T.M. Phillips, J.S. Lindsey // Oncol Rep. 2005. - V.13. - P.37^14

95. Postovit, L.M. Targeting Nodal in malignant melanoma cells / L.M. Postovit, E.A. Seftor, R.E. Seftor, M.J. Hendrix // Expert Opin. Ther. Targets. 2007. - V.l 1. - P.497-505.

96. Potter, C.J. Drosophila in cancer research: an expanding role / C.J. Potter, G. S. Turenchalk, T. Xu // Trends Genet. 2000. - V.16. - P.33-39.

97. Qin, J.Z. Interrupting activated Notch signaling triggers apoptosis in melanoma cells / J.Z. Qin, V. Chatirvedi, M.J.C. Hedrix // Proc. J. Invest. Dermatol. 2003. - V.78. - 185A.

98. Rahimi, N. Receptor chimeras indicate that the vascular endothelial growth factor receptor-1 (VEGFR-1) modulates mitogenic activity of VEGFR-2 inendothelial cells / N. Rahimi, V. Dayanir, K. Lashkari // J Biol Chem. 2000. -V.275.-P. 16986-16992.

99. Rak, J. Treating cancer by inhibiting angiogenesis: new hopes and potential pitfalls / J. Rak, R.S. Kerbel // Cancer Metastasis Rev. 1996. - V.15. -P.231-6.

100. Reya, T. Stem cells, cancer, and cancer stem cells / T. Reya, S.J. Morrison, M.F. Clarke, I.L. Weissman // Natureio 2001. - V.414. - P.105-111.

101. Risau, W. Mechanisms of angiogenesis / W. Risau // Nature. 1997. -V.386.-P.671-674.

102. Robbins, J. Mouse mammary tumor gene Int-3: a member of the Notch gene family transforms mammary epithelial cells / J. Robbins, B.J. Blonel, D. Gallahan, R. Callahan // J: Virol. 1992. - V.66. - P.2594-2599.

103. Robertson, G.P. Mig-7 Linked to Vasculogenic Mimicry / G.P. Robertson // The American Journal of Pathology. 2007. - V.170 (5). - P. 1454 - 1457.

104. Rummelt, V. Reassessment of the PAS patterns in uveal melanoma — reply / V. Rummelt, G.H. Naumann, R. Folberg // Br J Ophthalmol. 1998. - V.82. -P. 102.

105. Sakamoto, T. Histologic findings and prognosis of uveal malignant melanoma in Japanese patients / T. Sakamoto, M. Sakamoto, H. Yoshikawa, Y. Hata, T. Ishibashi, Y. Ohnishi, H. Inomata // Am. J.Ophthalmol. 1996. -V.121. -P.276-283.

106. Seftor, E.A. Molecular determinants of human uveal melanoma invasion and metastasis / E.A. Seftor, P.S. Meltzer, D.A. Kirschmann, J. Pe'er, A.J. Maniotis, J.M. Trent, R. Folberg, M.J.C. Hendrix // Clin. Exp. Metastasis. -2002. V.l9. - P.233-246.

107. Seregard, S. Prognostic accuracy of the mean of the largest nucleoli, vascular patterns, and PC-10 in posterior uveal melanoma / S. Seregard, B. Spangberg, C. Juul, M. Oskarsson // Ophthalmology. 1998. - V.105. -P.485—491.

108. Sharma, N. Prostatic tumor cell plasticity involves cooperative interactions of distinct phenotypic subpopulations: role in vasculogenic mimicry / N. Sharma, R.E. Seftor, E.A. Seftor, L.M. Gruman, P.M. Heidger, M.B. Cohen,

109. D.M. Lubaroff, M.J. Hendrix // Prostate. 2002. - V.50. - P. 189-201.

110. Shubik, B.A. Warren // Am. J. Pathol. 2000. - V.156. - P.736. 153. Sood, A.K. Molecular determinants of ovarian cancer plasticity / A.K. Sood,

111. E.A. Seftor, M.S. Fletcher, L.M.G. Gardner, P.M. Heidger, R.E. Buller, R.E. Seftor, M.J. Hendrix // Am. J Pathol. 2001. - V.158 (4). - P.1279-1288.

112. Thompson, W.D. Tumours acquire their vasculature by vessel incorporation, not vessel ingrowth / W.D.Thompson, K.J. Shiach, R.A. Fraser, L.C. Mcintosh, J.G. Simpson // J Pathol. 1987. - V. 151. - P. 323-332.

113. Timar, J. Tumor sinuses — vascular channels / J. Timar, J. Toth // Pathol. Oncol. Res. 2000. - V.6. - P.83-86.

114. Tom, GS Expression of vascular endothelial growth factor in uveal melanoma and its correlation with metastasis / T.G. Sheidow, P.L. Hooper3,

115. C. Crukley, J. Young, J.G. Heathcote // Br J Ophthalmol. 2000. - V.84. -P.750-756.

116. Tomanek, R.J. Assembly of the Vasculature and Its Regulation / ed. R.J. Tomanek // Birkhauser, Boston. 2002.

117. Uyttendaele, H. Vascular patterning defects associated with expression of activated Notch4 in embryonic endothelium / H. Uyttendaele, J. Ho, J. Rossant, Kitajewski // Proc. Natl Acad. Sei. USA. 2001. - V.98. - P.5643-5648.

118. Vailhe, B. In vito models of angiogenesis and vasculogenesis / B. Vailhe, D. Vittet, J. Fiege // Lab. Invest. 2001. - Vol.7. - P.473-477.

119. Waltenberge, J. Different signal transduction properties of KDR and Flt-1, two receptors for vascular endothelial growth factor / J. Waltenberger, L. Claesson-Welsh, A. Siegbahn, M. Shibuya, C.H. Heldin // J Biol Chem. -1994. V.269. - P. 26988-26995.

120. Warren, B.A.The growth of the blood supply tomelanoma transplants in the hamster cheek pouch / B.A. Warren, P. Shubik // Lab. Invest. 1966. - V.15. P. 464-478.

121. Weidner, N. Tumor angiogenesis and metastasis—correlation in invasive breast carcinoma / N. Weidner, J.P. Semple, W.R. Welch, J.N. Folkman // Engl J Med. 1991. - V.324 (1). - P. 1-8.

122. Weissman, I.L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution / I.L. Weissman // Cell. 2000. - V.100. - P. 157-168.

123. Wei-Ying, Yue Does Vasculogenic Mimicry Exist in Astrocytoma? / Wei-Ying Yue, Zhong-Ping Chen // Journal of Histochemistry & Cytochemistry. -2005. V. 53(8). - P. 997-1002.

124. Witte, M.H. Lymphangiogenesis and lymphangiodysplasia: from molecular to clinical lymphology / M.H. Witte, M.J.Bernas, C.P. Martin, C.L. Witte // Microscopy Res. Tech. 2001. - V.55. - P. 122-145.

125. Wu, H.M. VEGF induces NO-dependent hyperpermeability in coronary venules / H.M. Wu, Q. Huang, Y. Yuan, H.J. Granger // Am J Physiol Heart Circ Physiol. 1996. - V.271. - P. H2735-H2739.

126. Yancopoulos, G.D. Vascular-specific growth factors and blood vessel formation / G.D. Yancopoulos, S. Davis, N.W. Gale, J.S. Rudge, S.I. Wiegand, J. Holash // Nature. 2000. - V.407. - P. 242-248.

127. Yao, L. Effective targeting of tumor vasculature by the angiogenesis inhibitors vasostatin and interleukin- 12 / L. Yao, S.E. Pike, J. Setsuda, J. Parekh, G. Gupta, M. Raffeld, E.S. Jaffe, G. Tosato // Blood. 2000. - V.96. -P. 1900-1905.

128. Zagouras, P. Alterations in Notch signaling in neoplastic lesions of the human cervix / P. Zagouras, S. Stifani, C.M. Blaumueller, M.L. Carcangiu, S. Artavanis-Tsakonas // Proc. Natl Acad: Sci. USA. 1995. - V.92. - P.6414-6418.

129. Zhaocheng, Zhang VEGF-dependent tumor angiogenesis requires the inverse and reciprocal regulation of VEGFR1 and VEGFR2 / Z. Zhang, KG. Neiva, M.W. Lingen, L.M. Ellis,J.E. Nor // Cell Death Differ. 2010 - V. 17(3)-P. 499 -523.

130. Zhong, T.P. Gridlock signaling pathway fashions the first embryonic artery / T.P. Zhong, S. Childs, J.P. Leu, M.C. Fishman // Nature. 2001. - V.414. -P.216-220.