Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Молекулярные механизмы васкулогенной мимикрии при злокачественных заболеваниях

правах рукописи

ВАРТАНЯН АМАЛИЯ АРТАШЕВНА

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ВАСКУЛОГЕННОЙ МИМИКРИИ ПРИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ

14.01.12 - онкология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина» Российской академии медицинских наук (директор - академик РАН и РАМН, профессор Давыдов М.И.)

Научный консультант:

доктор медицинских наук Степанова Евгения Владиславовна

Официальные оппоненты:

Красильников Михаил доктор биологических наук, профессор,

Александрович ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН, заведующий

лабораторией молекулярной эндокринологии

Киселев Сергей Львович доктор биологических наук, профессор,

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, заведующий отделом эпигенетики

Егоров Егор Евгеньевич доктор биологических наук, профессор,

Федеральное государственнлое бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, ведущий научный сотрудник

Ведущая организация:

ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» Минздравсоцразвития России

10

«<&» Л+е* 201?

Защита состоится___

диссертационного совета Д001.017.02 ФГБУ

Ой

в _часов на

«РОНЦ им. H.H.

заседании Блохина»

РАМН по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «РОНЦ

им. H.H. Блохина» РАМН по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24.

Автореферат разослан 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Юрий Андреевич Барсуков

ЭОССИЙСКАЯ

ГОСУДАРСТВЕННАЯ

БИБЛИОТЕКА

2013 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Опухоли самых различных гистологических типов должны индуцировать ангиогенез для того, чтобы выжить-Процесс ветвления близлежащих сосудов начинается с выбросом опухолью растворимых активаторов ангиогенеза. Концепция о том, что УЕОРА-индуцируемый ангиогенез действительно является фактором7 лимитирующим рост опухоли, сегодня принята всеми. Отличаясь друг от друга по очень многим параметрам, все опухоли используют одни и те же ангиогенные сигнальные пути для васкуляризации. Большое количество микрососудов в опухоли способствует ее быстрой пролиферации в результате постоянного поступления питания и выведения продуктов метаболизма. Эффективная антиангиогенная терапия имеет значительно более широкий спектр применения в качестве общего противоопухолевого воздействия, и этот подход должен минимизировать некоторые проблемы, связанные с химиотерапией, например, лекарственная резистентность. Казалось бы, в этом правиле не должно быть исключений. Но уже первые клинические испытания препаратов, потенциально направленных на снижение кровоснабжения опухоли, выявили, антиангиогенная терапия не всегда является эффективной, и что оказалось совершенно неожиданным, к антиангиогенной терапии может возникать резистентность. Более того, большинство опухолей практически не отвечают на эту терапию и антиангиогенная терапия опухоли сегодня не находит столь широкого применения, как цитотоксическая химиотерапия. Гетерогенность кровеносных сосудов может быть одной из причин выживаемости опухолевых клеток (ОК): формирование сосудов в опухолях происходит на фоне неконтролируемой митогенной стимуляции и измененного внеклеточного матрикса. Это приводит к развитию неполноценных сосудов, имеющих нередко нарушенную эндотелиальну'ю выстилку. Эндотелий может замещаться ОК, а иногда и вовсе отсутствовать в сосудах опухоли.

Образование микроваскулярной сети агрессивными ОК получило название «васкулогенная мимикрия» (ВМ), которое подчеркивает образование таких

каналов de novo без участия эндотелиальных клеток (ЭК), т.е. независимо от ангиогенеза.-Образование таких структур является уникальной~способностью клеток с высоко злокачественным клеточным фенотипом. Предполагается, что формирование сети таких каналов внутри опухоли может поддерживать гомеостаз и предотвратить ранний некроз внутри опухоли. Высокая статистическая корреляция между способностью опухоли к ВМ и частотой метастазирования подтверждает эту гипотезу. Тот факт, что наличие ВМ встречается в различных типах агрессивных опухолей - при раке молочной железы, простаты, яичника, легкого, почки, саркоме мягких тканей говорит о том, что мы имеем дело с новой характеристикой агрессивной опухоли.

Детальное исследование влияния широко используемых в клинике блокаторов ангиогенеза на модулирование ВМ in vitro показало, что эти препараты не оказывают влияния на формирование васкулярной сети ОК. По-видимому, нечувствительность многих типов опухоли к антиангиогенной терапии можно, по крайней мере, частично объяснить появлением в опухоли васкулярной сети, формированной ОК. Присутствие каналов, выстланных ОК, предполагает потенциально новый путь распространения метастазов.

Анализ исследований последних десяти лет, посвященных изучению механизмов развития опухоли и ее васкуляризации, дает основание к выбору меланомы кожи как оптимальной модели для изучения ВМ. Меланома - опухоль, резистентная к химио- и радиотерапии, что подтверждает высоко агрессивный фенотип опухоли, а значит и возможность формирования каналов ВМ. Меланома также резистентна к антиангиогенной терапии, что указывает на существование альтернативной, не зависимой от эндотелия, системы циркуляции крови в опухоли. Таким образом, меланома может явиться той идеальной моделью, которая позволит выявить молекулярные детерминанты формирования васкулярной сети каналов, выстланных ОК.

Становление ВМ - сложный биологический процесс, в который вовлекаются несколько сигнальных путей. Не определен ее вклад в общую циркуляцию крови в опухоли. Бесспорным остается то, что ВМ может иметь неоценимое значение для

питания и доставки кислорода в опухоли солидного строения, растущих массивными опухолевыми узлами с небольшим количеством васкулярной стрбмы. Изучение молекулярных механизмов формирования каналов ВМ позволит не только лучше понять взаимодействия между метастатическими клетками, их микроокружением и переключением опухоли в агрессивную стадию роста, но и предложить -новый подход к диагностике, прогнозированию течения болезни и рациональному лечению злокачественных заболеваний. Цель исследования

Целью данной работы явилось изучение молекулярных механизмов феномена васкулогенной мимикрии. Задачи исследования

1. Идентифицировать молекулярные детерминанты опухолевой клетки, позволяющие ей формировать васкулярные каналы в опухоли.

2. Изучить механизмы инициации формирования каналов васкулогенной мимикрии при меланоме.

3. Исследовать участие Са2+ сигнального пути в формировании каналов васкулогенной мимикрии.

4. Исследовать статус васкулогенной мимикрии в васкуляризации меланомы в условиях блокирования" ангиогенеза анти-Notch терапией.

5. Охарактеризовать васкулогенную мимикрию при светлоклеточном раке почки.

Научная новизна

В работе впервые показано, что в условиях антиангиогенной терапии опухоли посредством подавления сигнального пути Notch активируется альтернативный, независимый от эндотелия путь васкуляризации - васкулогенная мимикрия, что и позволяет опухоли выживать.

Впервые показано, что присутствие сети каналов васкулогенной мимикрии в светлоклеточном раке почки служит независимым прогностическим маркером агрессивной опухоли (Р=0.05, х2=7.813).

Впервые показано, что васкулогенная мимикрия находится под контролем VEGFA/VEGFRI/PKCa сигнального пути и не зависит от "VEGFR2-тирозинкиназной активности.

Впервые на основе in vitro и in vivo экспериментов показано, что формирование каналов васкулогенной мимикрии зависит от клеточно-матриксной адгезии, которая обеспечивается интегринами av(33 и avp5. В процессе формирования каналов васкулогенной мимикрии происходит Са2+-зависимая перестройка актинового цитоскелета.

Впервые показано, что необходимым условием формирования каналов васкулогенной мимикрии является активация каспазы-3.

Впервые показано, что антиоксиданты снижают уровень экспрессии ангиогенных факторов, таких как VEGFA, VEGFR1, VEGFR2, и ингибируют активность каспазы-З, тем самым блокируя формирование каналов васкулогенной мимикрии.

Научно-практическая значимость Результаты данной работы расширяют наши представления об особенностях формирования васкулярной сети каналов, выстланных ОК, в меланоме человека. Молекулярно-биологические мишени процесса васкулогенной мимикрии при меланоме, идентифицированныё нами, могут быть использованы в различных научно-исследовательских институтах для создания лекарственных препаратов, направленных на ингибирование васкулогенной мимикрии.

Полученные нами результаты о прогностическом значении PAS-положительных структур при светлоклеточном раке почки в дополнение к применяемым диагностическим методам - гистологическому и биохимическому, могут служить основой для индивидуализации лечения больных раком почки в лечебных учреждениях РФ. Внедрение таких систем расширит возможность диагностики, в том числе дифференциальной, а также позволит определить риск метастазирования опухоли и выбрать верную тактику терапии.

Выявленная нами в экспериментах in vivo компенсаторная роль васкулогенной мимикрии в кровоснабжении опухоли в условиях блокирования

ангиогенеза антм-Notch терапией может служить основой для оптимизации антиангиогенной терапии опухоли.

Основные положения, выносимые на защиту

• Васкулогенная мимикрия при злокачественной меланоме находится под контролем VEGFA/VEGFR1 сигнального пути и не зависит от VEGFR2 киназной активности;

• Присутствие сети каналов васкулогенной мимикрии в светлоклеточном раке почки служит независимым прогностическим маркером агрессивной опухоли (Р=0.05,х2=7.813);

• В условиях антиангиогенной терапии посредством подавления сигнального пути Notch активируется альтернативный, независимый от эндотелия путь васкуляризации - васкулогенная мимикрия, что и позволяет опухоли выжить;

• Васкулогенная мимикрия является неблагоприятным прогностическим фактором и, видимо, может быть индуцирована самим терапевтическим воздействием. Для повышения эффективности лечения злокачественных новообразований необходимым становится комбинирование антиангиогенных препаратов с ингибиторами васкулогенной мимикрии.

Апробация работы. Диссертация апробирована и рекомендована к защите 28 июня 2012 года на совместной научной конференции лабораторий биомаркеров и механизмов опухолевого ангиогенеза, экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, комбинированной терапии опухолей, клеточного иммунитета, трансгенных препаратов, экспериментальной химиотерапии, фармакологии и токсикологии и лаборатории лекарственных форм НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН. Материалы диссертации доложены на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты», Нижний Новгород, 2010г.; 20lh International Congress on Anti-Cancer Treatment, Paris, France, 2009; National Cancer Research Institute Cancer Conference, Birmingham, UK, 2006, 2007, 2008 и 2009;

National Cancer Research Institute Cancer Conference, Liverpool, UK, 2010, 2011 и 2012.

Структура к объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 3 глав собственных результатов, обсуждения, выводов, -списка сокращений, списка литературы, включающего 2 отечественные работы и 345 зарубежных источников. Материалы диссертации изложены на 206 страницах машинописного текста и иллюстрированы б таблицами и 42 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОЛЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе Выли использованы клеточные линии метастатической меланомы кожи человека (Mel Cher, Mel Р, Mel II, Mel Kor, Mel Si), полученные в лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН из опухолевого материала больных диссеминированной меланомой, клеточные линии метастатической меланомы кожи человека MeWo, рака яичника SKOV3, молочной железы MCF7, клеточная линия мышиных ЭК SVEC 4-10 (каталог АТСС). Культивирование клеточных линий in vitro проводили в полной среде RPMI-1640 в соответствии со стандартными условиями.

В работе использованы следующие методы исследования: формирование сосудисто-подобных структур (СПС) in vitro, PAS-окрашивание на базальные мембраны каналов, формированных OK, анализ динамики роста ксенографтов в бестимусных мышах, иммуногистохимический анализ срезов опухолевых тканей, иммуноцитохимический анализ, определение сосудистой плотности опухоли, тест на миграцию в камере Бойдена, анализ «зарастания раны» клеточными линиями in vitro, качественное и количественное определение апоптотических "клеток, определение концентрации активных форм кислорода, нокдаун гена с помощью трансфекции клеток siRNA, анализ белков с помощью вестерн-блот гибридизации.

Статистическую обработку данных выполняли с использованием компьютерной программы SPSS v. 17.0 для Windows.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Молекулярные детерминанты ВМ

1.1. Оценка способности клеточных линий диссеминированной меланомы колеи формировать СПС в 3D культуре

Способность образовать уникальную васкулярную сеть, впервые обнаруженная в гистологическом материале от больных увеальной меланомой, впоследствии была подтверждена in vitro при культивировании клеток н так называемых ЗЭ-культурах - объемных гелевых матрицах - Матригеле и коллагеновом геле. Тест на формирование СПС в 30-культуре в настоящее время рассматривается как in vitro модель ВМ.

На начальном этапе работы мы исследовали способность клеток меланомы кожи человека Mel II, Mel Р, Mel Ког, Mel Cher, Mel Si формировать СПС на Матригеле. Все использованные клеточные линии экспрессировали маркеры, характерные для ЭК, - VEGFA, VEGFR1, VEGFR2, bFGF, bGFR, СОХ-2 и интегрин avß3. Инвазивный потенциал клеток меланомы был выше 11.9±0.6 (п=6). Культивирование клеток меланомы Mel II, Mel Р, Mel Kor и Mel Cher в полной среде RPMI-1640 на Матригеле в течение 16-24 ч приводило к образованию СПС. Физические характеристики образованных структур - количество образовавшихся узлов, длина трубочек, степень разветвления - были практически одинаковы для всех клеточных линий меланом и повторяли рисунок сосудистой сети, образованной ЭК линии SVEC-4-10 (honey comb-like network). Контакт с Матригелем в минимальной среде (без ростовых факторов) приводил "К формированию малых кластеров с короткими прерывающимися трубочками, и все эти дефекты исчезали при добавлении в культуральную среду телячьей сыворотки. Таким образом, наличие факторов роста сыворотки явилось тем критерием, который способствовал сборке клеток меланомы в СПС на Матригеле.. Другой детерминатой образования подобных структур оказалась механическая

жесткость геля - его способность деформироваться в ответ на кооперацию с клетками: разбавление Матригеля более чем в два раза снижало способность клеток меланомы к организации в СПС.

Анализ способности клеток меланомы формировать СПС в зависимости от времени инкубации клеток на Матригеле выявил три основных этапа этого процесса. Первая стадия (0-4 ч) характеризовалась миграцией клеток в различных направлениях, взаимодействию их с соседними клетками, распластыванию их на

y^^-SA «С /гч*«.:

v.*,

штйш

Рис. 1. Формирование СПС клетками меланомы Mel Р. Клетки росли в полной среде RPMI 1640 на Матригеле в течение 0 (А), 4 (В), 7 (С) и 16 ч (D). Увеличение х40 (а, с, d) и xlOO (Ь).

Матригеле и формированию многоклеточной сети, геометрия которого не менялась на последующих стадиях (Рис. 1, В). На второй стадии (4-8 ч) сформированная сеть подвергалась небольшим деформациям, которые только подчеркивали предварительный рисунок сети (Рис. 1, С). На третьей стадии (8-16 ч) - единичные клетки мигрировали к уже практически зрелой сети (Рис. 4, Э). Мы предполагаем, что основные геометрические признаки СПС задаются молекулярными характеристиками опухолевых клеток (ОК) и уже проявляются на начальном этапе кооперирования клеток на Матригеле.

Также была исследована способность клеточных линий рака молочной железы (МСР7) и рака яичника (8КОУЗ) формировать СПС на Матригеле.

Отметим одинаково высокую способность агресивных ОК формировать васкулярную сеть in vitro. Различная геометрия рисунка СПС, формированная клетками рака молочной железы и рака-яичника, подтверждает предположение, что основные геометрические признаки СПС задаются молекулярными характеристиками ОК.

1.2. Вовлечение апоптоза в ВМ при меланоме.

Неожиданным, но стабильно воспроизводимым свойством ВМ оказалось заметное уменьшение количества клеток к моменту, когда образование СПС уже необратимо. К 18 ч инкубации клеток на Матригеле, когда рисунок СПС уже не меняется, живыми оставались только 70-75% от числа посаженных клеток. Количество живых клеток, инкубировавшихся на пластике, увеличивалось до 180%. Подобные изменения характерны для перехода клеточной популяции из статуса пролиферации в статус дифференцировки. По-видимому, прикрепление клеток к Матригелю активирует дифференцировочные сигналы, позволяя клеткам меланомы имитировать поведение ЭК, а снижение количества клеток к моменту организации клеток меланомы в СПС объясняется элиминированием тех клеток, которые оказались неспособными к выполнению эндотелий подобной функции. Морфологические признаки апоптотической гибели клетки - сморщивание цитоплазмы, конденсация ядра и его фрагментация, образование апоптотических

А - В

Рис. 2. Вовлечение апоптоза в формирование СПС клетками меланомы Mel II. Флуоресцентная микроскопия клеток, окрашенных красителем Хехста (А) демонстрирует характерную для апоптоза фрагментацию ядра. (В) Количественная характеристика апоптотических клеток, определенная цитофлуориметрическнм методом с окрашиванием ядер йодистым пропидием. Увеличение хЮО (А)

телец - оценивались по окраске ДНК йодистым пропидием или Хехстом (Hoechst 33342) с помощью флуоресцентного микроскопа. На Рис. 2, А видны характерная для апоптоза фрагментация ядра и образование апоптических телец. Метод проточной цитофлуориметрии позволил дать количественную характеристику этому процессу. Доля клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК, являющаяся критерием интенсивности апоптоза, увеличивалась с увеличением времени инкубации клеток на Матригеле и достигала 20±2% к 10 ч инкубации. В качестве контроля использовали клетки, растущие на пластике. Количество апоптотических клеток в контроле не превышало 3-4%, что соответствовало уровню спонтанного апоптоза. Полученные данные подтверждают результаты Segura и соавт., которые регистрировали 25-30% апоптотических клеток при формировании СПС на Матригеле ЭК человека линии HUVEC.

Более детальное исследование участия апоптоза в ВМ показало, что Fas/Fas -L индуцированая гибель клеток с активацией каспазы-8 не реализуется в клетках меланомы в процессе формирования СПС, так как антогонистические анти-Fas антитела не блокировали этот процесс (Рис. 3, А-В). Подтверждением этому явились данные проточной цитофлуориметрии: в процессе формирования СПС не

Рис. 3. Индукция сигнального пути Fas/FasL не влияет на формирование СПС. Mel Cher клетки росли на Матригеле без (А) и в присутствии энти-Fas блокирующих антител. (В) Формирование СПС сопряжено с активацией апоптоза, индуцированного высвобождением цнтохрома с из митохондрии (а) и активацией каспазы-3 (Ь). (Са) Клетки меланомы росли на Матригеле в течение 2, 4, 6 и 8 ч. (СЬ) Активация каспазы-3. Клетки росли на Матригеле & течение 2, 4, 8 и 10 ч.(Сс) Активность каспазы снижается при инкубировании с ресвератролом. Увеличение х40 (А-В).

наблюдалось экспрессии ни Fas, ни Fas-L. Таким образом, индукция апоптоза внеклеточными стимулами не участвует в формировании СПС. С другой стороны, наблюдается зависимое от времени инкубации клеток на Матригеле высвобождение цитохрома с и повышение уровня активной каспазы-3 (Рис. 3, С), что свидетельствует об участии митохондриального пути индукции апоптоза в процессе формирования СПС. Ни высвобождения цитохрома с, ни активации каспазы-3 в клетках меланомы, не формирующих СПС на Матригеле, не происходит, что также указывает на участие митохондриального пути индукции апоптоза в процессе формирования СПС. Полученные результаты об апоптической гибели клеток меланомы в процессе формирования СПС, указывают на то, что часть ОК, которые оказались не способны имитировать поведение ЭК и формировать СПС, погибают.

Далее было решено выяснить, может ли активация каспаз быть необходимым условием формирования СПС. zVAD-fmk (панкаспазный ингибитор) полностью останавливал кооперацию клеток меланомы в СПС (Рис.4, А-В). В контроле, когда клетки инкубировали с 1% ДМСО (органическим растворителем ингибитора), никаких изменений в формировании СПС не происходило, также 1% ДМСО не был токсичен для клеток и не влиял на их миграцию.

Рис. 4. Влияние ингибиторов каспаз на формирование СПС клетками меланомы Mel II. (а) контроль, (Ь) клетки инкубировали с 50 мкмоль zVAD-fmk на Матригеле. (с) клетки инкубировали с 10 мкмоль DEVD на Матригеле. Увеличение х40.

Для подтверждения роли каспаз в формировании СПС использовали ингибитор каспазы-3, ОЕУО. Специфический ингибитор касгтазы-3 также блокировал процесс формирования СПС (Рис. 4, С). Эти наблюдения были подтверждены нами на четырех клеточных линиях меланомы. Для того, чтобы исключить возможный токсический эффект ингибиторов каспаз, жизнеспособность клеток меланомы определяли методом МТТ теста. При концентрациях иигибиторов каспаз, которые блокировали формирование СПС, 9395% клеток были живыми. Представленный экспериментальный материал указывает, что активация каспаз в агрессивных ОК является необходимым условием организации клеток меланомы в СПС. Таким образом, идентифицирован механизм, который участвует на самых ранних стадиях формирования СПС, до организации клеток в СПС - апоптоз. Подтверждением является тот факт, что добавление ингибитора к моменту, когда клетки уже образовали СПС, не изменяет геометрию рисунка СПС. Исследования последних лет позволяют рассматривать каспазу-3 как плейотропный фермент, необходимый не только для гибели, но и для нормальной жизнедеятельности клетки, а катализируемые каспазой-3 реакции как необходимые для поддержания клеточного гомеостаза. В процессе дифференцировки активность каспазы требуется для неспецифической, так называемой неапоптотической функции. Сегодня у нас нет ответа на вопрос, как каспаза может активироваться и не убивать клетку? Ответ, по-видимому, надо искать в несогласованности событий в цитоплазме и ядре, или в активации белковых ингибиторов каспаз в ответ на неидентифицированные еще стимулы. Сегодня мы стоим у самых истоков исследования участия каспаз в становлении ВМ и полученные нами данные лишь указывают, что для формирования СПС необходима активация каспаз.

1.3. Активные формы кислорода участвуют в ВМ

Известно, что в патогенезе злокачественных заболеваний существенная роль принадлежит окислительному стрессу. Уровень активных форм кислорода (АФК) в ОК значительно выше, чем в нормальных клетках, что, по-видимому, является одним из факторов в становлении болезни. Более того, АФК функционируют

также как важнейший медиатор в ангиогенезе опухоли. Мы предположили, что АФК могут таже контролировать процесс формирования васкулярных каналов ОК. Результаты проведенных исследований показали, что снижение уровня АФК на 50-60% антиоксидантами (АО), ресвератролом (РТ), эпигаллокатехин галлатом (EGCG), NAC или тролоксом, полностью блокировало способность клеток формировать СПС. Представленные результаты были воспроизведены на четырех клеточных линиях меланомы, включая коммерческую линию MeWo, и подтвердили выявленную закономерность, что наблюдаемое блокирование формирования СПС в ответ на АО может иметь феноменологический характер. Для верификации непосредственного участия АФК в формировании СПС, использовали клетки меланомы, которые не формируют СПС на Матригеле. Преинкубация этих клеток с РТ или EGCG незначительно снижала уровень АФК. Клетки в присутствие АО меняли свою первоначальную удлиненную форму, слегка ошаривались, пускали отростки, распластывались на Матригеле и практически останавливали миграцию.

Для - исключения аддитивного эффекта Матригеля, который является обогащенным внеклеточным матриксом, влияние АО на формирование СПС исследовали также на росте клеток в другой 3 D-культуре - коллагене типа 1. РТ ингибировал формирование СПС также на коллагене типа 1. Полученный экспериментальный материал указывает на участие АФК в формировании СПС. Основываясь на экспериментальных данных, что из всех исследованных АО только РТ разрушал уже сформированные СПС, мы исследовали влияние РТ на формирование каналов ВМ in vivo на экспериментальной модели меланомы, растущей у мышей С57/В1аск. В этих экспериментах плотность васкулярных каналов дозозавпсимо снижалась в ответ на введенный внутрибрюшинно РТ (Рис. 5, А-С).

Более детальное изучение этого феномена показало, что АО ингибировали высвобождение цитохрома с, снижая тем самым уровень каспазы-3 (Рис. 3, Сс). Определенный интерес вызывала способность АО влиять на экспрессию «классич_еских маркеров» ангиогенеза в клетках меланомы.

Рис. 5. Ресвератрол снижает плотность каналов ВМ в экспериментальной модели меланомы, растущей у мышей С57/В1. (А) PAS-окрашнвание гистологических срезов в контроле, (В и С) Мыши получали 2.5 мг/кг и 10 мг/кг веса ресвератрола. Увеличение х200.

Иммуноцитохимимический анализ экспрессии этих молекул показал, что РТ, EGCG и тролокс заметно снижали экспрессию VEGFR2 по сравнению с контролем. Несколько слабее выраженный эффект наблюдался на экспрессии VEGFR1. Эти результаты были подтверждены с использованием анти-VEGFRl и aHTH-VEGFR2 антител в Вестерн блоте. Мы полагаем, что уровень АФК является тем чувствительным индикатором, который сигнализирует о способности ОК формировать каналы ВМ.

2. Сигнальные пути, контролирующие васкулогенную мимикрию 2.1. В M находится под контролем VEGFA/VEGFR1 сигнального пути и не зависит от VEGFR2-mupo3unKuna3Hoù активности Способность ОК экспрессировать не только VEGFA, но VEGFR сегодня связывают с активацией пролиферации ОК, в которой VEGFA отводится роль аутокринного фактора роста ОК. Мы предположили, что наблюдаемая в процессе малигнизации высокая экспрессия маркеров ЭК не-ЭК может быть необходима для имитации поведения ЭК и формирования каналов ВМ. В пользу этого предположения говорили и недавно опубликованные данные, что HIF-la обнаруживается вдоль каналов ВМ и не окрашивается в зоне CD-31 кровеносных сосудов. Для подтверждения гипотезы об участии VEGFA в формировании CF1C клетки меланомы Mel Cher инкубировали на Матригеле с VEGF нейтрализирующими антителами. СПС не формировались. Аналогичный

результат был получен и для трех других линий меланомы: Mel IL, Mel Р и Mel Ког. Эти результаты предполагали, что VEGFA в ОК клетках играет двойную функцию: стимулирует пролиферацию ОК, как аутокринный фактор роста, и участвует в ВМ. Через год- после их опубликования эти результаты были подтверждены двумя независимыми группами. Su и соавт. показали, что рапамицин, ингибитор HIF-la, блокировал экспрессию VEGFA, снижал уровень VE-кадгерина, EphA2 и ММР-2, и предотвращал формирование васкулярных каналов при раке яичника, а использование VEGFA siRNA подтвердило роль VEGFA, как триггера ВМ, при остеосаркоме.

VEGFA связывается и активирует два тирозинкиназных рецептора на ЭК: VEGFR1 и VEGFR2. Сегодня достоверно показано, что в ангиогенезе опухоли участвует VEGFA/VEGFR2 сигнальный путь. Недавно Hiratsuka и соавт. показали, что делеция тирозинкиназного домена VEGFR1 не оказывала существенного влияния ни на внутриутробное развитие мышей, ни на их жизнь в постнатальный период. На основании этих данных был сделан вывод, что тирозинкиназный домен VEGFR1 не нужен для реализации функций ЭК. Роль VEGFR1 и сегодня остается слабо изученной. Предполагается, что этот рецептор негативно регулирует тирозинкиназную активность VEGFR2 посредством конкурентного связывания лиганда - VEGFA. Более высокая экспрессия VEGFR1, наблюдавшаяся на

Рис. 6. УЕСЕА/УЕСП*2-киназнын сигнальный путь не участвует в формировании СПС. (а) Контроль, (Ь) специфический ингибитор тирозннкиназной активности УЕСРК2, РТК1, не влияет на формирование СПС. (с) Вестерн блот демонстрирует снижение уровня УЕСЕШ после трансфскции УЕСЕЮ Количественные характеристики

представлены графически справа. Увеличение х40 (а-Ь).

высокоагрессивных клетках диссеминированной меланомы, по сравнению со слабоагрессивными клетками предполагало возможное участие VEGFA/VEGFR1 сигнального пути в ВМ. И первые же результаты, полученные при исследовании участия этой сигнальной системы в формировании СПС, - подтвердили возможность реализации этой гипотезы. Совершенно неожиданно оказалось, что PTKI, специфический ингибитор тирозинкиназной активности VEGFR2, не блокировал формирование СПС клетками меланомы Mel Cher (Рис. 6, а, Ь). С другой стороны, siRNA-опосредованное подавление экспрессии VEGFR1 (в наших экспериментах на 60-64%, Рис. 6, С) полностью нивелировало способность клеток меланомы формировать СПС, в то время как контрольная siRNA не оказывала никакого влияния на формирование СПС (Рис. 7, а). Этот эффект воспроизведен на трех клеточных линиях меланомы: Mel Р, Mel Kor и Mel Cher. (Рис. 7, b-d)

Рис. 7. Эффект нокдауна гена VEGFR1 на формирование СПС клетками меланомы Mel Cher, (а) клетки были трансфецированы контрольной si RNA, (b-d) Mel Cher, Mel P и Mel Kor клетки были трансфецированы VEGFR1 si RNA. Увеличение х 40 (a-d).

Клетки, трансфецированные VEGFR1 siRNA, не формировали СПС также на коллагене типа 1, что указывало на то, что VEGFR1 - это единственный рецептор VEGFA, который регулирует ВМ, и этот сигнальный путь не зависит от тирозинкиназной активности VEGFR2.

Известно, что плацентарный фактор роста (P1GF) также связывается с VEGFR1 и индуцирует тубулогенез ЭК. В наших экспериментах, когда клетки меланомы инкубировали с VEGF нейтрализирующими антителами, а затем сажали на Матригель в присутствии различных концентраций P1GF, формирования СПС не наблюдалось. Клетки не теряли способность мигрировать, но рисунок структур,

формированных на Матригеле, заметно отличался от геометрии классических СПС. Эти результаты также воспроизводились на трех клеточных линиях меланомы. Более того, добавление УЕСРА восстанавливало способность клеток меланомы формировать СПС. По-видимому, связывание РЮИ и УЕСРА с УЕОРШ активирует разные сигнальные пути, и гены-мишени, активируемые РГСР не способны запустить ВМ.

Для выявления возможных мишеней УЕОРА/УЕОРШ сигнального пути в формировании СПС мы остановились на РКС: исследования последних лет указывали на то, что, по крайней мере частично, УЕвРА реализует свою активность через РКС. Было также показано, что АО ингибируют РКСа и РКС5, а АО, как мы показали ранее, блокировали формирование СПС. Мы заметили, что клетки меланомы, которые росли на Матригеле в присутствие ТРА, активатора РКС, формировали СПС за 5 ч, в то время как контрольные клетки за 5 ч роста на Матригеле только намечали рисунок СПС. Так было получено первое предварительное указание на возможное участие РКС в формировании СПС.

РКС - это семейство 12 серин-треониновых киназ, которые подразделяются на три субгруппы: Са2+-зависимые РКС изоформы а, |31, рп, у; Са2+-независимые РКС изоформы 6, е, т|, 9 и атипические РКСв X, I- Из Са2+-зависимых РКС в клетках меланомы экспрессировалась только РКСа, причем уровень этого белка практически не менялся со временем инкубирования клеток меланомы на Матригеле. Ни РКСР1, ни РКСрП, ни РКСу не определялись методом Вестерн блота. Была также исследована экспрессия РКС5, ключевого белка, ответственного за адгезию и реорганизацию цитоскелета клетки в ответ на различные стимулы, в зависимости от времени роста клеток меланомы на Матригеле. На наш взгляд, эти процессы должны были отразиться на формировании СПС. Экспрессия РКС8 незначительно увеличивалась к 3 ч инкубации клеток на Матригеле и далее оставалась на постоянном уровне в течение последующих 7 ч (Рис. 8, с). Для верификации полученных'данных о роли

РКС в ВМ Mel Cher клетки трансфецировали РКСа siRNA и РКС6

Рис. 8. Вовлечение РКС в формирование СПС. (a) Mel Cher клетки росли на Матригеле в присутствии ТРА в течение 5 ч. (в) Контрольные клетки (без ТРА) росли на Матригеле в течение 5 ч. (с) Вестерн блот, демонстрирующий экспрессию изоформ РКС в клетках Mel Cher. Контроль нанесения - GAPDH. (d) Графическое представление результатов трансфекции клеток РКСа и PKCô siRNA. Увеличение х60 (a-b).

siRNA. Нокдаун гена приводил к снижению уровня обеих изоформ на 50 и 56%, соответственно (Рис. 8, D). Трансфекция клеток РКСа siRNA полностью нивелировала способность клеток меланомы формировать СПС, в то время как PKCô siRNA не оказывал существенного влияния на этот процесс (Рис. 9, а-с). Полученные нами данные указывали на то, что в формировании СПС

Рис. 9. Влияние нокдауна генов РКСа и PKCô на формирование СПС клетками Mel Cher, (а) Клетки, трансфецнрованные контрольной si RNA, формируют СПС на Матригеле. (Ь) Трансфекция клеток меланомы PKCô siRNA не оказывает влияние на формирование СПС. (с) Mel Cher клетки, трансфецнрованные РКСа si RNA, теряют способность к организации в СПС. Увеличение х40(а-с).

основным игроком является РКСа. Тогда объективно вставал другой вопрос, может ли активация РКСа без сигнала от VEGFA/VEGFR1 сигнального пути

служить триггером ВМ? Когда этот сигнальный путь блокировали нейтрализируюшими антителами к VEGFA, а затем добавляли активатор РКС -ТРА, то формирование СПС не наблюдалось. Таким образом, активация РКСа является обязательным, но не необходимым условием формирования СПС.

Полученные данные были подтверждены в экспериментах in vivo. Ro32-0432, селективный ингибитор РКСа, дозозависимо снижал плотность каналов ВМ. Несмотря на то, что в ответ на Ro32-0432 наблюдалось существенное снижение плотности каналов ВМ в экспериментальной модели меланомы, ни вес опухоли, ни ее объем не менялись. Однако количество метастазов в легкие значительно уменьшалось. Мы предполагаем, что присутствие в опухоли каналов, формированных ОК, может служить дополнительным путем, который могут использовать ОК для метастазирования. С другой стороны, наличие таких каналов может доставлять в опухоль питание и кислород, особенно в те участки опухоли, которые характеризуются глубокой гипоксией. Когда плотность кровеносных сосудов снижается в результате антиангиогенной терапии, что обязательно увеличивает гипоксию в отдельных участках опухоли, то, как следствие, должна наблюдаться стимуляция ВМ. Таким образом, антиангиогенная терапия непреднамеренно способствует активации процесса формирования каналов ВМ, и опухоль, способная формировать каналы ВМ, имеет больше шансов выжить.

2.2. Са}+ сигнальный путь вовлекается в ВМ

Формирование СПС в ЗЭ-культуре проходит через ряд последовательных событий. Клетки останавливают пролиферацию, мигрируют, узнают друг друга, формируя контакты посредством VE-кадхерина, удлиняются, прикрепляются к внеклеточному матриксу и формируют СПС. Известно, что взаимодействие между клетками происходит путем формирования сайтов межклеточной адгезии. Процесс этот - Са2+-зависимый. Са2+-связывающие сайты идентифицированы на внеклеточном домене кадхеринов, F-актина, тубулина и интегринов, что предполагает, что Са2+ необходим не только для гомотипического узнавания клеток, но и для формирования стабильных контактов с внеклеточным матриксом. Исследования последних лет указывают, что подвижность и интеграция ЭК в

сосуды зависит от Са2+ и модулируется УЕОРА. Мы предположили, что подобный сценарий может реализоваться и при формировании СПС.

Удаление внеклеточного Са ЕСТА полностью блокировало формирование СПС. При этом миграционная способность клеток сохранялась: клетки двигались и формировали небольшие кластеры. Внутриклеточный Са2+ хелатор, ВАРТА-АМ, также дозозависимо нивелировал способность клеток формировать СПС. Этот эффект воспроизводился на трех клеточных линиях меланомы. Когда же клетки с ВАРТА-АМ инкубировали на Матригеле, затем удаляли среду и заменяли на свежую, содержащую ионофор А23187, то клетки восстанавливали способность формировать СПС. Мы объясняем эти результаты способностью ионофора А23187 высвобождать ионы Са2+ мобилизацией их из митохондрий и эндоплазматического ретикулума. Таким образом, для организации клеток меланомы в СПС необходимым является как внеклеточный, так и внутриклеточный Са2+.

Как отмечалось ранее, миграция клеток меланомы - одна из основных стадий формирования СПС и изменение актинового цитоскелета клетки, который находится под непосредственным контролем Са2^ сигнального пути, так или иначе должно отразиться на формировании СПС. Для подтверждения гипотезы о реорганизации актинового цитоскелета в процессе формирования СПС, клетки

Рис. 10. Внутриклеточный Са2+ хелатор ВАРТА-АМ индуцирует реорганизацию актина, (a) Mel Cher клетки на Матригеле фиксировали и окрашивали FITC-коныогированным фаллоидином. (в) Клетки росли на Матригеле в присутствии ВАРТА-АМ, затем клетки фиксировали и окрашивали FITC-конъюгированным фаллоидином. Увеличение хЮО (а-Ь)

меланомы были окрашены Р1ТС-фаллоидином. На Рис. 10 видно, что клетки меланомы в процессе формирования СПС удлиняются и при этом заметно образование стресс фибрилл. Конденсация актина в ответ на ВАРТА-АМ происходит через 3-4 ч после посадки клеток- на Матригель (Рис. 10, Ь). Полученные результаты указывают на то, что в процессе формирования СПС происходит реорганизация актина. С этим выводом согласуется блокирование формирования.СПС цитохолазином О - агентом, препятствующим полимеризации актина. Таким образом, формирование каналов васкулогенной мимикрии зависит от Са2+-чувствительной перестройки актинового цитоскелета.

Целостность цитоскелета клетки, ее контрактильные функции могут контролироваться и микротрубочками. Они состоят из глобулярного белка тубулина, молекулы которого соединяются друг с другом, образуя цилиндрическую структуру. Микротрубочки, подобно актиновым микрофиламентам, чрезвычайно динамичны и обладают структурной полярностью: на (+) конце происходит самосборка микротрубочки, на другом (-) конце - разборка. Сборка микротрубочек из тубулинов происходит только в присутствии Са2\ Лабильное состояние микротрубочек (сборка-деполимеризация) необходимо для нормального функционирования клетки. При планировании экспериментов мы ожидали реорганизацию актинового цитоскелета в процессе формирования СПС. Вовлечение же микротрубочек, важнейшей функцией которых является формирование митотического веретена и участие в перемещение внутриклеточных органелл, в процесс формирования СПС, было не предсказуемо. Основывались мы в своих последующих экспериментах на том общеизвестном факте, что цитоскелет клетки - это система актиновых микрофиламентов, находящихся в тесной кооперации с микротрубочками. Некоторые растительные яды, например колцемид, присоединяясь к мономерам тубулина, блокируют рост микротрубочек. Для выяснения роли микротрубочек в формирование СПС мы следили за изменениями в формировании СПС на Матригеле в присутствии колцемида. В наших экспериментах колцемид не только блокировал формирование СПС, но и вызывал диссоциацию уже формированных

СПС. Таким образом, впервые показана необходимость интактности микротрубочек при формировании СПС. Полученные in vitro результаты о роли Са2+ сигнального пути в формировании СПС были подтверждены in vivo на экспериментальной модели меланомы, растущей у С57/В1аск мышей.

2.3. Участие интегринов в формирование СПС

К участию интегринов в формировании СПС мы пришли после анализа ряда экспериментальных наблюдений. Было замечено, что СПС формируются на Матригеле или на другой гелевой матрице и не формируются на пластике. Эти наблюдения указывали на то, что для формирования СПС необходима кооперация клеток с внеклеточным матриксом. Как известно, связь клетки с внеклеточным матриксом осуществляется через интегрины. Кроме того, как мы уже отмечали, в формировании СПС участие Са2+ было обязательным условием. А Са2+, как известно, регулирует функциональную активность практически всех интегринов. На сегодняшний день идентифицированы 24 интегрина с 18а-субъединицами и 8[3-субъединицами. Мы остановились на изучении роли ccvp3 и ctvP5 интегринов и в качестве контроля использовали pi интегрин. На начальном этапе работы исследовали экспрессию трех указанных интегринов в клетках меланомы. Клетки Mel Cher, Mel Р и Mel Ког экспрессировали интегрины avp3, avp5 и pi, ~ незначительно отличаясь по уровню экспрессии. На следующем этапе работы мы

Рис. 11. Вовлечение интегрина avp3 в формирование СПС. (а) Контрольные клетки Mel Cher росли на Матригеле в течение 14 ч. (Ь, с) Mel Cher и ) Mel Р клетки росли на Матригеле в течение 14 ч в присутствии анти-интегрин avp3 антител. Увеличение х40 (а-с).

попытались дифференцировать вклад каждого их этих интегринов в формирование СПС. Оба интегрина, avß3 и avß5, осуществляют адгезию клетки к внеклеточному матриксу посредством связывания с витронектином, однако проводят они разные сигналы. Интегрин avß3 индуцирует миграцию клетки, ее распластывание и участвует в ангиогенезе и метастазировании опухоли, не требуя дополнительной активации. Для участия в этих же процессах интегрину avß5 необходима активная РКС. Более того, интегрин avß3 обнаруживается в сайте фокального контакта, в то время как интегрин avß5 определяется в сайтах, удаленных от- сайта фокального контакта. Для выявления различий функциональной активности обоих интегринов в формировании СПС, клетки меланомы инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре с поликлональными антителами к интегринам avß3 и avß5, затем сажали на Матригель. По сравнению с контролем, клетки, инкубированные с антителами к интегрину avß3, ненормально удлинялись и не формировали СПС (Рис. Г1, Ь, с). При инкубировании клеток меланомы Mel Cher и Mel Kor с анти-интегрин avß5 антителами мы наблюдали формирование СПС (Рис. 12, Ь, с), однако рисунок

Рис. 12. Вовлечение интегрина avß5 в формирование СПС. (А) Контрольные клетки Mcl Cher росли на Матригеле в течение 14 ч. (b) Mel Cher и Mel Р клетки росли на Матригеле в течение 14 ч в присутствии анти-интегрин avß5 - антител. Увеличение х40 (а-с).

СПС несколько менялся: длина трубочек была меньше (на 52-54%), (Mel Cher, Mel Kor, />=0.01). Меньше было также стыковок. Статистически достоверных изменений в длине трубочек СПС, формированных клетками Mel Р в условиях блокирования связывания интегрина avß5 с рецептором, не обнаружено. Таким образом, оба интегрина, и avß3, и avß5, участвуют в формировании СПС.

25

Было изучено также вовлечение интегрина pi в формирование СПС. Известно, что интегрин pi контролирует адгезию ОК к матриксу и его экспрессия не меняется при прогрессии клетки в более агрессивный фенотип. Интегрин pi-неблокирующие и блокирующие антитела не оказывали влияния на формирование СПС на Матригеле, указывая на то, что ипгегрин pi не играет существенной роли в этом процессе. Как отмечалось ранее, формирование СПС зависит от миграции клетки и образования связи клетка-клетка и клетка-внеклеточный матрикс. В формировании СПС подобные связи должны быть подвижными и потому вклад интегрина pi, который «приклеивает» клетку к матриксу, не является критическим. Обнаруженное нами участие нтегрина avp3 в формировании СПС в последующем было подтверждено Lewis и соавт.: в их экспериментах интегрин avP3 активировал экспрессию VEGF и VEGFR1, которые, как было нами показано, являются триггерами ВМ. Суммируя все сказанное, можно сделать вывод, что становление ВМ зависит от Са2+-чувствительной перестройки актинового цитоскелета, включая как изменение формы клетки, так и создание адгезивных сайтов, необходимых для подвижности клетки, ее удлинения и формирования контактов между клетками и с внеклеточным матриксом. Роль каждого из перечисленных сигнальных путей требует дальнейшего изучения. Но тот факт, что Са2+/интегриновый сигнальный путь контролирует ВМ, предполагает, что связывание внутриклеточного Са2+ может быть терапевтически значимым.

2.4. Участие Notch сигнального пути в ВМ

Предполагается, что способность высоко агрессивных ОК экспрессировать гены, характерные для множества типов клеток, является следствием реактивации сигнальных каскадов эмбриона. Накоплен большой клинический материал, указывающий, что активация сигнального пути Notch важна для образования глиомы, рака молочной железы, рака панкреатической железы, колоректального рака и различных гематопоэтических новообр_азований и служит триггером для прогрессии опухоли в более агрессивный фенотип, что является одним из необходимых условий формирования васкулярных каналов ОК. В процессе эмбриогенеза сигнальный путь Notch контролирует становление билатеральной

симметрии. С другой стороны, экспрессия Notch и его лигандов наблюдается также в ЭК, и активация Notch сигнального пути в ЭК останавливает пролиферацию, способствуя их дифференцировке. Этот высоко консервативный внутриклеточный сигнальный путь активируется при взаимодействии трансмембранных лигандов семейств Jagged (Jagged 1 и 2) и Delta (Delta-like 1, 3 и 4) с Notch рецепторами (Notch!-4). После связывания с лигандом активация Notch рецептора происходит за счет протеолитнческого действия у-секретазы, путем высвобождения инутриклеточного домена, который мигрирует в ядро и, образуя комплекс с ДНК. выполняет функцию транскрипционного регулятора экспрессии генов Hesl и Hes5, а также Heyl and Неу2.

Иммуноцитохимическое исследование экспрессии молекул Notch сигнального каскада в клетках меланомы, с которыми мы работали, показало высокую экспрессию Notch3, Notch4 and Jagged 1. Экспрессия Jagged2 и D114 была довольно слабой и практически не определялась в клетках меланомы. Мы не смогли детектировать экспрессию Notchl и Dili ни в одной из трех клеточных линий меланом. Интересным оказался тот факт, что экспрессия рецепторов Notch2 and Notch4 в клетках меланомы Mel Р, по сравнению с клетками Cher cells, была заметно снижена. Поскольку Mel Р клетки также формировали СПС на Матригеле, полученные результаты указывали, что вклад этих двух рецепторов менее критичен для формирования СПС.

Как отмечалось ранее, активация сигнального пути Notch напрямую зависит от функционального состояния у-секретазы. В наших экспериментах блокирование Notch сигнального пути ингибитором у-секретазы, DAPT, приводило к заметному снижению уровня Hes-1, транскрипционного фактора, находящегося-под контролем Notch сигнального пути (Рис. 13, А1). Аналогичные результаты были получены и при использовании другого ингибитора у-секретазного комплекса, бензодиазепина (BZ) (Рис. 13, А1). Была также исследована экспрессия другого таргетного гена, находящегося под контролем Notch сигнального пути - Heyl. Уровень Неу-1 в клетках меланомы был

изначально выше, чем Не51, и каких-либо изменений в ответ на ЭАРТ мы не заметили (Рис. 13, АЗ). По всей видимости, в формировании СПС участвует

А DAPT BZ - - + - + lEEH'-^^Hesl 2 г— — — GAPDH + 2 mm mm Heyl 4 LIISL-' GAPDH Шла ùi.-Mtr ■• '¿vi л .г» ¡13

С _

Рис. 13. Блокирование Notch сигнального пути стабилизирует СПС. (А1-4) Уровень Hesl снижается в клетках Mel Cher в ответ на DAPT или BZ. (A3) Уровень Heyl в в клетках Mel Cher не меняется в ответ на DAPT. (А2, A4) GAPDH был использован как контроль нанесения. (В, F) Контрольные клетки Mel Cher и Mel Р росли на Матригеле течение 36 ч. (С, G) Mel Cher и Mel Р клетки росли на Матригеле в течение 36 ч в присутствии 10 мкмоль DAPT, (D, H) 2 мкмоль BZ и 5 мкг/мл анти-Jaggedl антител (Е). Увеличение х40 (В-Н). Представленные данные отражают шесть независимых экспериментов.

транскрипционный фактор Hes-1, а экспрессия Неу-1 свидетельствует об агресивности опухоли. Далее было исследовано влияние 1-20 мкМ DAPT- на пролиферацию клеток меланомы Mel Cher. Подсчет количество клеток в камере Горяева показал, что 20 мкМ DAPT снижало пролиферацию клеток Mel Cher на 40% (/"<0.001, п=9). Аналогичное поведение в ответ на блокирование у-секретазы наблюдалось и в клетках Mel Ког (/><0.001, п=6) и Mel Р cells (/><0.001, п=6). Представленные контрольные эксперименты позволяют заключить, что компоненты Notch сигнального пути экспрессируются в клетках диссеминированной меланомы и этот сигнальный путь активирован при меланоме.

На следующем этапе работы было изучено влияние блокирования Notch сигнального пути на способность клеток Mel Cher формировать СПС. В наших

экспериментах контрольные СПС, формированные всеми тремя выбранными клеточными линиями меланомы, были стабильны в течение 20-24 ч после посадки клеток на Матригель. Затем клетки ошаривались, теряя связь клетка-клетка и клетка-внеклеточный матрикс и СПС разрушались. При инкубировании клеток Mel Cher с 10 мкМ DAPT спонтанный рилиз фокальных контактов происходил в период от 32 до 36 ч, что указывало на то, что в поддержании целостности структур СПС необходимо затухание сигнального пути Notch (Рис. 13, В-С). Для подтверждения этого феномена был использован другой ингибитор у-секретазы -BZ. Сформированные на Матригеле СПС были стабильны также в течение 32-36 ч (Рис. 32, D, Н). Эти результаты были верифицированы блокированием связывания лиганда с рецептором. Анти-Jaggedl нейтрализирующие антитела также стабилизировали СПС (Рис. 13, Е). Аналогичные результаты были получены для Mel Р клеток (Рис. 13, F-H). Таким образом, стабильность и целостность СПС зависит от активности сигнального пути Notch.

Целью следующей части работы было исследование поведения опухоли и статус ВМ в условиях, когда в опухоли ингибирован ангиогенез анти-Notch терапией. Сигнальный путь Notch в экспериментальной опухоли блокировали ингибитором у-секретазы - DAPT, который вводили внутрибрюшинно бестимусным мышам в дозах 3 и 20 мг/кг. Ежедневное введение 3 мг/кг в течение 21 дня не оказало никакого влияния на рост опухоли. 20 мг/кг DAPT, введенный внутрибрюшинно в течение 21 дня, снизило рост опухоли на 40±3% по сравнению с контролем (Рис. 14, F). Эти результаты согласуются с литературными данными о модулировании роста опухоли DAPT. Анализ ксенографтов показал, что 20 мг/кг DAPT заметно снижало плотность кровеносных сосудов (6.37 ± 1.84 сосудов против 9.60 ± 2.9 (SE)), что также согласуется с литературными данными. Окраска ксенографтов реагентом PAS показала, что каналы ВМ становятся более разветвленными и увеличиваются в диаметре (Рис. 14, С, Е). Окраска на Ламинин, внеклеточный белок базальных мембран каналов ВМ, подтвердила эти данные (Рис. 14, A, D). Определенный интерес представляла следующая закономерность: в ВМ-положительных зонах опухоли плотность сосудов, выстланных ЭК, была

значительно ниже (/>=0.039). Гистологический анализ опухоли выявил большие зоны некроза в ОАРТ-леченых опухолях, что, по-видимому, являлось следствием

Рис. 14. Статус ВМ в условиях анти-Notch терапии. Иммуногистохимическое окрашивание анти-ламинин антителами срезов контрольной (А) и DAPT-леченой опухоли (D). Окрашивание PAS реагентом DAPT-леченой опухоли. Стрелки указывают на каналы ВМ (В, D). (Е) Стрелки указывают на каналы ВМ в норме (2) и расширенные (1). (С) Интенсивность PAS-окрашивания в леченой DAPT опухоли. Результаты представлены в процентах к контролю. (F) Кинетика роста опухоли. 20 мг/кг веса DAPT вводили мышам ежедневно внутрибрюшинно 21 день (Р<0.05). Увеличение х200 (А, В, D, Е).

снижения кровоснабжения опухоли. Весьма интересным оказалось, что в тех областях опухоли, где наблюдалась высокая плотность каналов ВМ, отсутствовал некроз, что подтверждает функциональную активность каналов ВМ и ее способность поддерживать рост опухоли. Нами получено также экспериментальное подтверждение недавно описанного феномена, что антиангиогенная терапия опухоли, хотя изначально и приводит к снижению размеров опухоли, переводит опухоль в более агрессивную фазу роста, которая характеризуется увеличением инвазии и метастазирования: экспрессия ММР-2 и VEGFR1 - известных медиаторов метастазирования - значительно повышалась в ксенографтах мыши в ответ на анти-Notch терапию. Становится очевидным, что в

условиях блокирования ангиогенеза анти-Notch терапией опухоль прибегает к альтернативной- наскуляризации, независимой от эндотелия, ВМ, и уже "ВМ позволяет опухоли выжить, предостанляя питание в участки опухоли с выраженной гипоксией и вклад ВМ в общую циркуляцию крови в опухоли надо учитывать при аптиангиогенной терапии.

3. Прогностическое значение РАЗ-положнтельных структур при свстлоклсточном раке почки Рак почки из-за безсимптомного течения болезни диагностируется во многих случаях только на поздних стадиях болезни. Даже в тех редких случаях, когда заболевание диагностируется на рамних стадиях болезни, у 25% пациентов обнаруживаются метастазы. Светлоклеточпый рак почки составляет от 80 до 90% всех типов рака почки и является самым агресивным из них. Становление и прогрессия светлоклеточного рака почки связана с мутациями в туморсупресорном гене фон Хиппель-Линдау (VHL). Стадия опухолевого процесса (Т), отражающая анатомическую распространенность новообразования, является наиболее значимым фактором прогноза при раке почки. Многие авторы концентрируются на определение корреляции между ангиогенезом опухоли и возможностью рецидива. Но на сегодняшний день эти данные не являются полными. Более того пациенты с одинаковыми гистологическими характеристиками и одинаковой стадией заболевания отличаются различным периодом безрецидивной выживаемости. Мы предположили, что определение компонента ВМ в светлоклеточном раке почки, может служить независимым прогностическим фактором агресивности опухоли. Подобная корреляция показана при меланоме, раке простаты, раке молочной железы. В наше исследование были включены 45 пациентов (27 мужчин и 18 женщин) с диагнозом светлоклеточный рак почки, проходивших лечение в РОНЦ им. H.H. Блохина. У всех 45 пациентов была радикальная нефрэктомия. Никто из больных не получал химиотерапию. Возраст больных был от 35 до 75 лет. У 42 больных (93%) диагностировали Т2 стадию заболевания и у 3 пациентов (7%) была ТЗ стадия. Метастазы в

лимфатические узлы не были обнаружены ни у кого из больных. Рецидив заболевания был отмечен у 14 (31%) больных.

Анализ опухолевого материала больных светлоклеточным раком почки показал, что в опухоли присутствуют каналы ВМ (Рис. 15, А-В). Двойное окрашивание анти CD31 антителами и PAS реагентом не только верифицировало эти результаты, но и наглядно продемонстрировало сайты сообщения сосудов, выстланных ЭК и каналами ВМ (Рис. 15, С). Далее рутинно окрашивали образцы опухолевого материала PAS реагентом для характеристики геометрии рисунка канала ВМ и возможного разделения их на подгруппы в целях идентификации

Рис. 15. PAS-положительные структуры при светлоклеточном раке почки. (А) PAS-положительная сеть каналов ВМ. (В) Параллельные PAS-положительные структуры. (С) Двойное окрашивание aHTH-CD31 антителами и PAS реагентом. Видны сайты сообщения сосудов, выстланных ЭК и каналами ВМ Увеличение х200.

прогностического значения рисунка PAS-положительных структур. В образцах опухоли были обнаружены различные структуры: арки, параллельные каналы и сеть каналов (Рис. 15, А-В). Двойное окрашивание анти-С031 антителами и PAS реагентом показало, что 30-35% васкуляризации опухоли осуществляется через каналы ВМ.

Использование кривых выживаемости Каплана-Мейера для каждого типа PAS-положительных структур показало, что только обнаружение сети каналов ВМ в образцах опухоли является прогностически значимым независимым фактором предсказания течения безрецидивного заболевания (х2=7.813, Р=0.005). Больные, чьи опухоли содержали сеть каналов ВМ, имели значительно более низкую безрецидивную выживаемость, чем больные, в чьих опухолях определялись

параллельные каналы ВМ или арки. Более того опухоль, содержащая сеть каналов ВМ, была толще. Внимание наше привлек тот экспериментальный факт, что в опухолевом материале 2 из 3 больных с ТЗ стадией по сравнению с Т2 стадией мы не обнаружили сети каналов, а только параллельные каналы ВМ. Эти наблюдения послужили основой для введения второго маркера в прогнозироване течения светлоклеточного рака почки - тимидинфосфорилазы (TP) - ангиогенного фактора опухоли, который был показан как независимый прогностический маркер для светлоклеточного рака почки. Больные, у которых наблюдался низкий уровень экспрессии TP, имели достоверно более высокую безрецидивную выживаемость (5-летняя выживаемость доходила до 93.6%). Высокий уровень экспрессии TP служил неблагоприятным прогностическим фактором для больных Т2 и Т1 стадий. Наши данные подтвердили эту закономерность и позволили заключить, что экспрессия TP - статистически достоверный фактор прогноза безрецидивного течения болезни (Р=0.035). ТР(+) Больные, в опухолевом материале которых определялись сеть каналов ВМ, рецидив наблюдался через 4-12 месяцев. Болезнь возвращалась также к больным с ВМ(+)ТР(-), но на более поздних сроках (25-154 месяца). Таким образом, присутствие сети каналов ВМ в светлоклеточном раке почки служит независимым прогностическим маркером агрессивной, метастатической опухоли. Эта корреляция становится более выраженной, если сопровождается экспрессией ТР. По-видимому, наличие обеих характеристик опухоли необходимо для перехода болезни в более агрессивную стадию заболевания ("malignant switch").

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Впервые о ВМ заговорили в самом конце 1999г. За прошедшие г-оды был накоплен экспериментальный материал, подтверждающий гипотезу о частичной трансдифференцировке агресивных ОК в эндотелий подобные клетки, способные формировать сеть каналов внутри опухоли, которая может частично компенсировать недостаточно быстрое развитие в ней кровеносной микроциркуляторной сети. Крайне интересным оказался тот факт, что в тех

областях опухоли, где наблюдалась высокая плотность каналов ВМ, отсутствовал некроз, что несомненно подтверждает функциональную активность каналов ВМ и их способность поддерживать рост опухоли.

ВМ представлена неодинаково в разных типах опухолей. Так, в меланоме 60-62% кровоснабжения осуществляется через каналы ВМ; при саркоме мягких тканей - 35-40%; при раке почки - 30-35%, при раке яичника, раке молочной железы - 15-18%; при раке толстой кишки - 10-12%. На фоне крайнего несовершенства кровеносных сосудов в опухоли каналы ВМ в количестве 10-12% вряд ли что существенно изменят, однако 60-62% явно могут иметь существенное значение.

Пожалуй, самым важным выводом проделанной нами работы является экспериментальное подтверждение не раз высказанной гипотезы, что в условиях блокирования ангиогенеза опухоль прибегает к альтернативной, не зависящей от эндотелия васкуляризации.

Наши результаты также подтверждают недавно описанный феномен, что антиангиогенная терапия опухоли, хотя изначально и приводит к снижению размеров опухоли, переводит опухоль в более агрессивную фазу роста, которая характеризуется увеличением инвазии и метастазирования. Мы показали, что экспрессия ММР-2 и УЕОРЯ.1 - известных медиаторов метастазирования -значительно повышалась в ксенографтах мыши в ответ на анти-Ыо^Ь терапию.

Показано также, что присутствие сети каналов васкулогенной мимикрии в светлоклеточном раке почки служит независимым прогностическим маркером агрессивной опухоли (Р=0.05, х2=7.813).

Современная антиангиогенная терапия направлена на снижение пролиферации ЭК или их апоптоз и не эффективна для разрушения васкулярных каналов, выстланных ОК. Однако когда плотность кровеносных сосудов снижается в результате антиангиогенной терапии, как следствие, увеличивается гипоксия, которая стимулирует формирование каналов ВМ для компенсации недостатка кислорода и питания. Таким образом, антиангиогенная терапия непреднамеренно способствует стимуляции процесса формирования каналов ВМ и -

при выборе терапевтического воздействия на опухоль необходимо учитывать возможность развития ВМ. ВМ является неблагоприятным прогностическим фактором и, видимо, может быть индуцирована самим терапевтическим воздействием. Для повышения эффективности лечения злокачественных новообразовании необходимым становится комбинирование антиангиогенмых препаратов с ингибиторами ВМ.

ВЫВОДЫ

1. Васкулогенная мимикрия при злокачественной меланоме находится под контролем VEGFA/VEGFR1 сигнального пути и не зависит от VEGFR2 киназной активности. Васкулогенная мимикрия не может быть активирована PIGF.

2. Присутствие сети каналов васкулогенной мимикрии в светлоклеточном раке почки служит независимым прогностическим маркером агрессивной опухоли (Р=0.05, х2=7-813). Эта корреляция становится более выраженной, если сопровождается экспрессией TP (Р=0.035, х2=4-436).

3. В процесс формирования сосудисто-подобных структур вовлекаются компоненты митохондриального пути индукции апоптоза. Показано, что необходимым условием формирования каналов васкулогенной йимикрии является активация каспазы-3.

4. Антиоксиданты блокируют формирование каналов васкулогенной мимикрии. При этом снижается уровень экспрессии VEGF, VEGFR1 и VEGFR2. а также ингибируется активация каспазы-3.

5. Формирование каналов васкулогенной мимикрии зависит от клеточно-матрикспой адгезии, которая обеспечивается интегринами av|33 и av|35. В процессе формирования каналов васкулогенной мимикрии происходит Са2т-зависимая перестройка актинового цитоскелета.

6. В условиях антиангиогенной терапии посредством подавления сигнального пути Notch активируется альтернативный, независимый от эндотелия путь васкуляризации - васкулогенная мимикрия, что и позволяет

опухоли выживать. При этом в опухоли значительно увеличивается экспрессия маркеров метастазирования ММР-2 и VEGFR1, что свидетельствует о прогрессии опухоли в более агрессивный фенотип. 7. При выборе терапевтического воздействия на опухоль необходимо учитывать возможность развития васкулогенной мимикрии. Васкулогенная мимикрия является неблагоприятным прогностическим фактором и, видимо, может быть индуцирована самим терапевтическим воздействием. Для повышения эффективности лечения злокачественных новообразований необходимым становится комбинирование антиангиогенных препаратов с ингибиторами васкулогенной мимикрии.

Список печатных работ по теме диссериации

1. Вартанян, A.A. Вовлечение апоптоза в становление васкулогенной мимикрии при злокачественных новообразованиях. / A.A. Вартанян, Е.В. Степанова, А.Ю. Барышников, М.Р. Лициницер. // Доклады РАН.—2005.— Т. 402, №1,—С. 129-132.

2. Вартанян, A.A. Васкулогенная мимикрия при злокачественных новооброзованиях. / A.A. Вартанян, Е.В. Степанова, М.Р. Личиницер. // Молекулярная медицина.—2006.—№1.—С. 23-30.

3. Вартанян, A.A. Вовлечение антиоксидантов в васкулогенную мимикрию при диссеминированной меланоме. / A.A. Вартанян, О.С. Бурова, ЕТЗ. Степанова // Российский биотерапевтический журнал.—2006.—Т. 5, №3.— С. 15-20.

4. Вартанян, A.A. Молекулярные механизмы действия препаратов платины. / A.A. Вартанян, М.В. Огородникева // Российский биотерапевтический журнал—2004.—'Г. 3,№1.—С. 14-20.

5. Ва рта ни м, А.А. Блокирование Notch сигнального пути стабилизирует васкулогенмую мимикрию при меланоме. / А.А. Вартанян, И. Н. Григорьева, В. С. Домбровский, Е. В. Степанова, А.Ю. Барышников// Российский биотерапевтический журнал.—2012.—Т. 11, №3.—С. 3-7.

6. Vartaninn, A. The involvement of apoptosis in melanoma vasculogenic mimicry. / A. Vartanian, O. Burova, E. Stepanova, A. Baryshnikov. // Melanoma Research.—2007,—Vol. 17, №1,—P. 1-8.

7. Vartanian, A. Melanoma vasculogenic mimicry is strongly related to reactive oxigen species level. / A. Vartanian, O. Burova, E. Stepanova, A. Baryshnikov, M. Lichinitser//Melanoma Research.—2007,—Vol. 17, №6,—P. 370 -379.

8. Vartanian, A. Crosstalk between apoptosis and antioxidants in melanoma vasculogenic mimicry. / A. Vartanian, A. Baryshnikov // Adv Exp Med Biol.— 2007.—'Vol. 601,—P. 145-153.

9. Vartanian, A. VEGFR1 and PKCa signaling control melanoma vasculogenic mimicry in a VEGFR2 kinase-independent manner. / A. Vartanian, E. Stepanova, I. Grigorieva, E. Solomko, A. Baryshnikov, M. Lichinitser // Melanoma Research.—2011 .—Vol. 21, №2,—P. 91-98.

10. Vartanian, A. Prognostic significance of Periodic Acid-Shiff-positive patterns in clear cell renal cell carcinoma. / A. Vartanian, E. Stepanova, S. Gutorov, I. Grigorieva, Г. Sokolova, E. Solomko, A. Baryshnikov, M. Lichinitser //The Canadian Journal of Urology—2009,—Vol. 16, №4,—P. 4726^731.

11. Vartanian, A. Melanoma vasculogenic mimicry capillary-like structure formation depends on integrin and calcium signaling. / A. Vartanian, E. Stepanova, I. Grigorieva, E. Solomko, V. Belkin, A. Baryshnikov, M. Lichinitser / Microcirculation—2011,—Vol. 18,№5—P. 390-399.

12. Vartanian, A. The involvement of Notch signaling in melanoma

37

vasculogenic mimicry. / A. Vartanian, G. Gatsina, I. Grigorieva, E. Solomko, V. Dombrovsky, A. Baryshnikov, E. Stepanova. // Clin Exp Med.—2012.— Vol. 12, №2,—P. 121-128.

13. Vartanian, A. Signaling pathways in tumor vasculogenic mimicry. //Biochemistry.—2012.—Vol. 77, №9,—P. 1044-1055.

Патенты

J_. Патент на изобретение № 2404243. РФ. «Применение клеточной линии меланомы кожи человека mel Cher в качестве положительной модели васкулогенмой мимикрии». И.Н. Григорьева, Е.В. Степанова, И.Н. Михайлова, А.А.Вартанян, Л.Ф. Морозова, О.С. Бурова, А.Ю. Барышников.

Тезисы конференций, конгрессов и симпозиумов

1. Вартанян, А. Молекулярные детерминанты васкулогенной мимикрии при меланоме. // Материалы IX Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» Нижний — Новгород 17-19 мая 2010. Российский биотерапевтический журнал.-2009,- Т.8, № 2.-С. 7. Устный доклад

2. Vartanian, A. Positive tumour model of vasculogenic mimicry among cutaneous melanoma cell lines. / I.N. Grigorieva, E.V. Stepanova, O.S. Burova, Т.К. Kharatishvilh E.Sh. Solomko, A.A. Vartanian, A.Y. Baryshnikov. // 20,llIntemational Congress on Anti-Cancer Treatment, Paris, France. Abstract book-2009.—P. 442.

3. Vartnian, A. Molecular determinants of melanoma vasculogenic mimicry. /А. Vartanian, E. Stepanova, M. Lichinitser. NCRI Cancer Conference, Birmingham, UK. Abstract book-2006.—P. 47.

4. Vartanian, A. Melanoma vasculogenic mimicry is strongly related to reactive oxigen species level. / A. Vartanian, O.S. Burova, E.V. Stepanova, A.Yu.

Baryshnikov, M.R. Lichinitser. // NCR1 Cancer Conference, Birmingham, UK. Abstract book.-2007.—P. 73.

5. Vartanian, A. Prognostic significance of Periodic acid Schiff-positive patterns in clear cell renal cell carcinoma. / A. Vartanian, E. Stepanova, M. Lichinitser. // NCRI Cancer Conference, Birmingham, UK. Abstract book.-2008.-P. 45.

6. Vartanian, A. VEGFR1 and PKCa signaling controls melanoma vasculogenic mimicry in a VEGFR2 kinase-independent manner. / A. Vartanian, E. Stepanova, G. Gatsina, I. Grigorieva, A. Baryshnikov, M. Lichinitser. // NCRI Cancer Conference, Birmingham, UK. Abstract book-2009.—P. 97. Устный доклад

7. Vartanian, A. Essential role of alpha v beta3 integrin and calcium in melanoma vasculogenic mimicry. / A. Vartanian, E. Solomko, I. Grigorieva, E. Stepanova // NCRI Cancer Conference, Liverpool, UK. Abstract book.—2010.— P. 58.

8. Vartanian, A. Disruption of Notch sigaling stabilizes melanoma vasculogenic mimicry. / A. Vartanian, G. Gritsina, E. Stepanova, A. Baryshnikov, M. Lichinitser. // NCRI Cancer Conference, Liverpool, UK. Abstract book-

2011.—P.85.Устный доклад.

9. Vartanian, A. Under the condition of angiogenesis blockade tumour relapses to the alternative vascularization. / A. Vartanian, M. Ogorodnikova, A. Baryshnikov // NCRI Cancer Conference, Liverpool, UK. Abstract book-

2012,—P. 151.

Подписано в печать 02.10.12 . Формат60x84/16. Бумага офисная «5уек)Сору». Тираж 100 экз. Заказ №944 Отпечатано на участке множительной техники ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН 115478, г. Москва, Каширское ш., 24

13- -779

2012249603

2012249603