Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Влияние нарушений функции опухолевого супрессора p53 на васкуляризацию опухолей: идентификация неизвестных ранее сигнальных путей и механизмов

На правах рукописи

ХРОМОВА Наталья Викторовна

ВЛИЯНИЕ НАРУШЕНИИ ФУНКЦИИ ОПУХОЛЕВОГО СУПРЕССОРА р53 НА ВАСКУ ЛЯРИЗАЦИЮ ОПУХОЛЕЙ: ИДЕНТИФИКАЦИЯ НЕИЗВЕСТНЫХ РАНЕЕ СИГНАЛЬНЫХ ПУТЕЙ

И МЕХАНИЗМОВ

Специальность 14.01.12 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 2 пен 2010

004ЫЭЧЫ1

МОСКВА 2010

004615401

Работа выполнена в лаборатории цитогенетики НИИ Канцерогенеза Учреждения Российской академии медицинских наук Российский онкологический научный центр имени Н. Н. Блохина РАМН (директор -академик РАН и РАМН, д.м.н., проф. М. И. Давыдов)

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор

Доктор биологических наук, профессор

Ведущая организация:

Копнин Борис Павлович

Лазаревич Наталия Леонидовна

Народицкий Борис Савельевич

Гематологический научный центр Минздравсоцразвития РФ

Защита диссертации состоится « 2010 года в /Г часов на

заседании диссертационного совета Д.001.017.01 РОНЦ имени Н.Н.Блохина РАМН по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ им. Н. Н.Блохина РАМН.

Автореферат разослан 2010

года.

Ученый секретарь диссертационного совета д.м.н., профессор Ю.В. Шишкин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГАБОТЫ

Актуальность темы

Васкуляризация - образование сосудов и сосудоподобных структур, обеспечивающих кровоснабжение и дренирование опухолевых тканей, -необходимое условие для прогрессивного роста новообразований. Неопластические клетки обладают способностью индуцировать гемангиогенез и лимфангиогенез - процессы формирования новых мелких кровеносных и лимфатических сосудов. Механизмы опухолевого гемангиогенеза активно исследовались в последние годы. Согласно общепринятым в настоящее время представлениям новая сосудистая сеть в основном образуется за счет ветвления сосудов окружающих нормальных тканей и их врастания в опухоль. Этот процесс стимулируется опухолевыми клетками путем секреции ими ряда проангиогенных факторов, важнейшими из которых являются факторы роста эндотелия УЕйР-А и УЕСБ-В. Индукция лимфангиогенеза исследована значительно хуже. Предполагается, что его стимуляция осуществляется главным образом за счет секреции опухолевыми клетками других цитокинов семейства УЕОИ: УБвР-С и УЕОР-Б, которые связываются с рецептором лимфатического эндотелия УЕСРЯ-З.

Механизмы, ответственные за ангиогенную активность опухолевых клеток и, в частности, за повышенную продукцию ими различных факторов роста семейства УЕБР, изучены довольно плохо. До недавнего времени исследования цитокинов семейства УЕСР были сосредоточены на их функциях как паракринных стимуляторах ангиогенеза. В последнее время появляются данные, что УЕвР-С, подобно УЕОР-А, может принимать участие и в аутокринной регуляции размножения и миграции неопластических клеток, хотя механизмы увеличения экспрессии рецепторов этих факторов в самих опухолевых клетках изучены плохо.

На протяжении многих лет опухолевая васкуляризация рассматривалась только как прорастающий гемангиогенез. В последние годы были обнаружены новые механизмы кровоснабжения, которые могут быть задействованы одновременно в одной опухоли, либо преобладать в определенном типе новообразований. Один из таких механизмов — васкулогенная мимикрия - явление, при котором неопластическими клетками формируются каналы, соединяющиеся с истинными сосудами и обеспечивающие дополнительное кровоснабжение опухолевой ткани. В состав таких каналов не входят эндотелиальные клетки, и поэтому опухоли с развитой сетью мимикрических структур устойчивы к антиангиогенной терапии. В последние годы все больше накапливается данных об участии

васкулогенной мимикрии в кровоснабжении различных новообразований, однако вопрос о механизмах формирования неопластическими клетками сосудоподобных структур до сих пор остается открытым. Имеются лишь отдельные данные, что к индукции этого процесса может приводить экспрессия неопластическими клетками белков УЕ-кадгерина, и

УЕСР-С.

В настоящее время не вызывает сомнения участие в индукции опухолевого гемангиогенеза нарушений функции опухолевого супрессора р53 - наиболее универсального молекулярного изменения в различных новообразованиях человека. Известно, что потеря экспрессии р53, контролирующего продукцию многих проангиогенных факторов и ингибиторов гемангиогенеза, может усиливать опухолевый гемангиогенез. Однако не были исследованы последствия миссенс-мутаций в гене р53, которые значительно чаще, чем полная потеря экспрессии р53, обнаруживаются в различных новообразованиях человека, в том числе и в широко распространенных - раке легкого, раке ободочной кишки и др. Кроме того, совершенно не изучен вопрос о вкладе нарушений функции р53 в другие механизмы опухолевой васкуляризации - васкулогенную мимикрию и лимфангиогенез. Ответы на эти вопросы должны углубить знания о механизмах прогрессии опухолей, что, в свою очередь, может привести к разработке новых способов направленной терапии онкологических заболеваний.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось изучение влияния различных нарушений функции опухолевого супрессора р53 в клетках рака ободочной кишки и рака легкого человека на гемангиогенез, васкулогенную мимикрию и лимфангиогенез в формируемых ими опухолевых тканях.

Для достижения поставленной цели были выдвинуты следующие задачи:

1. Изучить влияние синтеза мутантных белков р53 и гомозиготного нокаута гена р53 на гемангиогенез и скорость роста ксенографтов рака ободочной кишки человека линии НСТ116 в бестимусных мышах.

2. Исследовать воздействие нарушений функции р53 на васкулогенную мимикрию в ксенографтах НСТ116 и на экспрессию ряда потенциальных ее регуляторов - генов МЮ-7 и УЕ-кадгерина.

3. Изучить влияние наиболее распространенных нарушений р53 на лимфангиогенез в ксенографтах НСТ116 и А549.

4. Изучить последствия подавления продукции VEGF-C на биологические свойства опухолевых клеток НСТ116 и А549 в культурах in vitro: скорость размножения и миграционную активность.

5. Изучить последствия подавления продукции VEGF-C на гемангиогенез, лимфангиогенез и васкулогснную мимикрию в опухолях, образуемых клетками А549 и НСТ116 с различным статусом р53.

Научная новизна и практическая значимость исследования

Обнаружено неизвестное ранее влияние мутаций в гене опухолевого супрессора р53 на выраженность разных типов васкуляризации опухолей -гемангиогенез, васкулогенную мимикрию и лимфангиогенез. Выявлена ключевая роль повышения внутриклеточного уровня активных форм кислорода (АФК) и активируемого ими сигнального пути HIF1/VEGF-A в индукции гемангиогенеза и стимуляции опухолевого роста, вызываемыми различными нарушениями функции опухолевого супрессора р53. Продемонстрировано ингибирующее действие антиоксиданта NAC на гемангиогенез и рост опухолей с дисфункцией р53. Впервые установлено, что нарушения функции р53 в клетках рака ободочной кишки человека приводят к изменению экспрессии гена VEGFC. Показано, что подавление продукции цитокина VEGF-C вызывает ряд эффектов, ингибирующих опухолевую прогрессию: торможение пролиферации и миграции неопластических клеток, уменьшение способности к васкулогенной мимикрии и снижение лимфангиогенной активности, что указывает на перспективность использования VEGF-C в качестве молекулярной мишени для направленной терапии немелкоклеточного рака легкого и рака ободочной кишки человека.

Апробация работы

Диссертация апробирована и рекомендована к защите 16 июня 2010 года на совместной научной конференции лабораторий цитогенетики, генетики опухолевых клеток, регуляции клеточных и вирусных онкогенов, механизмов прогрессии эпителиальных опухолей и молекулярной эндокринологии НИИ Канцерогенеза РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 4 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата биологических наук.

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста, содержит 40 рисунков, 5 таблиц. Состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования», «Обсуждение полученных результатов», «Выводы», «Список литературы». Список литературы содержит 205 источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы следующие методы исследования: молекулярное клонирование, трансдукция лентивирусных векторов, полимеразная цепная реакция (ПЦР), анализ белков с помощью вестерн-блот гибридизации, анализ динамики роста клеток, анализ «зарастания раны» клеточными линиями in vitro, тест на миграцию клеток в камере Бойдена, анализ динамики роста ксенографтов в бестимусных мышах, иммуногистохимический анализ срезов опухолевых тканей, статистическая обработка данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Роль нарушений р53 в васкуляризации опухолей 1.1. Клеточные линии, использованные для изучения опухолевого

гемангиогенеза

Для изучения влияния нарушений опухолевого супрессора р53 на опухолевый гемангиогенез создан набор стабильных клеточных сублиний производных линии рака ободочной кишки человека НСТ116/р53+/+ и ее сублинии НСТ116/р53-/- с гомозиготным нокаутом генар53, синтезирующих экзогенные мутантные белки р53 с аминокислотными заменами в горячих точках мутаций, наиболее характерных для опухолей человека (Табл. 1, Рис. 1).

Табл. 1. Сублинии НСТ116 с нарушениями р53.

Мутантные формы р53 Клеточная линия

НСТ116/р53+/+ НСТ116/р53-/-

«Пустой» вектор рЬ6 (контроль) экспрессия р53 дикого типа полная потеря экспрессии р53

Мутант Ш75Н (кодон 175: аргинин—>гистидин) одновременная экспрессия белков дикого типа и мутантного р53 экспрессия только мутантного р53

Мутант 1Ш8\У (кодон 248: аргинин—»триптофан)

Мутант Й273Н (кодон 273: аргинин—»гистидин)

& ф Ф*'

■—- ..........i Р53 щ*

у-тубулин

Рис. 1. Вестерн блог-аналт экспрессии р53 в культурах клеток НСТ116.

Представлены типичные результаты одного из трех экспериментов. Белок у-тубулин использовали как контроль количества нанесенных образцов.

Таким образом, был создан набор сублиний клеток НСТ116, имитирующих практически все возможные ситуации нарушений р53, наблюдаемые при раках толстой кишки.

1.2. Влияние нарушений р53 на размножение клеток НСТ116 in vitro, in vivo и их ангиогенную активность

В начале этого раздела исследований нами была поставлена задача: изучить влияние наиболее характерных для опухолей человека мутаций опухолевого супрессора р53 на опухолевый рост и гемангиогенез.

Дни инкубации Дни после прививки

Рис. 2. Влияние экспрессии мутантных белков р53 в клетках НСТ116 и нокаута гена р53 на скорость роста клеточных культур in vitro (А) и подкожных опухолей in vivo (Б).

А) Скорость роста сублиний НСТ116/р53+/+ in vitro. Каждая точка - средние величины для 3-х лунок.

Б) Скорость роста ксенографтов НСТ116 с различными вариантами экспрессии р53. Приведены средние значения, полученные при анализе 8-12 опухолей в каждом из трех экспериментов.

Синтез экзогенных мутантных белков р53 не влиял на скорость роста клеточных культур in vitro (Рис. 2А), но при этом сопровождался ускорением роста опухолей, формируемых клетками НСТ116/р53+/+ при подкожной прививке бестимусным мышам (Рис. 2Б). Наибольшую скорость роста демонстрировали опухолевые ксенографты, синтезирующие экзогенные мутанты р53 R248W и R273H. Трансдукция R175H мутанта р53 вызывала меньший, но также статистически значимый эффект. В то же время трансдукция мутантных р53 в клетки НСТ116/р53-/-, не экспрессирующих эндогенный р53, существенно не влияла на опухолевый рост, что указывает на ключевую роль доминантно-негативных, а не вновь приобретенных (gain-of-function) активностей мутантных р53 в стимуляции роста подкожных ксенографтов рака ободочной кишки линии НСТ116.

Увеличенная скорость роста клеток НСТ116/р53+/+, синтезирующих мутантные белки р53, в условиях in vivo, но не in vitro, наводила на мысль, что такое влияние на рост опухолей может быть связано с их более эффективной васкуляризацией, которая является важным лимитирующим фактором в развитии новообразований. Ангиогенная активность неопластических клеток определялась путем подсчета числа кровеносных сосудов в опухолевых тканях, выявляемых с помощью

иммуногистохимического окрашивания парафиновых срезов антителами к CD34 -маркеру эндотелия кровеносных сосудов. При этом подсчитывались разные типы сосудов: с просветами (потенциально функциональные), крупные (на гистологических препаратах >100мкм при увеличении хЮО) и сосуды без просветов (вероятно недоразвитые). Анализ срезов ксенографтов показал, что в опухолях, не экспрессирующих эндогенный р53, или экспрессирующих наряду с эндогенным р53 транедуцированные мутантные р53, происходит значительное увеличение количества функционирующих сосудов, т.е. относительно крупных и сосудов с просветами. Особенно сильно (до 4,5 раз) увеличивалось количество относительно крупных сосудов. Следует заметить, что наибольшая эффективность васкуляризации (число сосудов >100 мкм) обнаружена в ксенографтах НСТ116/р53+/+, экспрессирующих р53 R248W. Кроме этого, мы использовали еще один показатель эффективности васкуляризации опухоли, выражающийся в количестве сосудов без просветов, которые могут представлять собой недоразвитые сосуды. Так, было обнаружено, что нарушение функционирования р53 сопровождается уменьшением количества мелких сосудов без просветов (Рис.3, Табл.2).

Рис. 3. Иммуногистохимическое окрашивание срезов опухолей НСТ116 с различным статусом р53 антителами к СШ4.

Экспрессия мутантных р53, также как и потеря экспрессии р53, увеличивает число С034-позитивных структур в опухолевых тканях. Представлены типичные поля зрения для каждой экспериментальной группы. Увеличение *100.

Табл. 2. Влияние статуса р53 на количество С034-позитивных структур.

р53+/+ (контроль) р53+/+ + R175H р53+/+ + R248W р53+/+ + R273H р53 -/-

Сосуды с просветами 6.9±0.7 10.2±0.9* 12,9±!.1** 10.9±0.8* 14.2±|.0**

Крупные сосуды (>100мкм) !.1±0.1 3.2±0.3* 5.7±0.6** 2.9±0.3* 3.8±0.4**

Сосуды без просветов 8.2±0.9 5.5±0.7* 5.4±0.6* 5.7±0.5* 5.4±0.4*

Различия между значениями в контрольной и экспериментальных группах достоверны по критерию Стьюдента; * р < 0,05, **р < 0,01.

1.3. Влияние нарушений р53 на уровень АФК и синтез HTF-la

Основываясь на данных, что потеря функции р53 ослабляет антиоксидантную защиту [Sablina et al., 2005], а увеличение внутриклеточного уровня активных форм кислорода (АФК) может приводить к активации сигнального пути HIF1/VEGF-A [Xia et al, 2007; Zhou et al, 2007], было решено проверить, связана ли стимуляция опухолевого гемангиогенеза при экспрессии мутантных р53 с изменением уровня активных форм кислорода (АФК). Было обнаружено, что экспрессия всех

изучаемых мутантов р53 индуцировала примерно двукратное увеличение уровня АФК в клетках НСТ116/р53+/+ (Рис. 4).

<ь

I*

ц.

о гс° «

НСТ116 р53+/+

I

Рис. 4. Влияние экспрессии мутантных р53 на уровень АФК в клетках НСТ11б/р53+/+.

Средние значения суммарной флюоресценции БСР в Ю4 клеток в двух экспериментах. Различия .между контрольными клетками и сублиниями, экспрессирующими мутантные р53, статистически достоверны по критерию Стьюдента (р< 0,01).

^VV44

№

Для ответа на вопрос, ведет ли повышение уровня АФК в клеточных культурах, экспрессирующих мутантные р53, к увеличению содержания в них транскрипционного фактора HIFI-а был проведен Вестерн-блот анализ этого белка.

А)

<?vr <?,£>

Б)

HIF1a-»

Y-ТубуЛИНт

VEGf-Л а-1убулин-»|

Рис. 5. Влияние экспрессии мутантных р53 в клетках НСТ116/р53+/+ и

нокаута гена р53 на содержание HIF1-« (А) и уровень мРНК VEGFA (Б).

А) Вестерн блот-анализ экспрессии HIFI-а. Белок у-тубулин использовали как контроль количества нанесенных образцов. Б) Результаты ОТ-ПЦР анализа уровня мРНК VEGFA. мРНК а-тубупина использовали как контроль количества нанесенных образцов.

Полученные данные указывают на существенное увеличение содержания HIF-la в сублиниях НСТ116/р53+/+, экспрессирующих мутанты р53 (Рис. 5А). Увеличение продукции HIFl-a в таких клетках коррелирует с повышением экспрессии его гена-мишени VEGFA. Полу количественный ОТ-ПЦР анализ показал увеличение уровня мРНК VEGFA щ и VEGFA165 -продуктов альтернативного сплайсинга гена VEGFA (Рис. 5Б).

1.4. Влияние антиоксиданта NAC на уровень АФК, HIFl-a и гемангиогенез

На следующем этапе этой части работы было исследовано воздействие антиоксиданта N-ацетил-Ь-аспартата (NAC) на анализируемые культуры

клеток и образуемые ими опухоли, который, из общих соображений, должен подавлять АФК-зависимую стимуляцию гемангиогенеза. В экспериментах in vitro было показано, что добавление в среду 5мМ NAC на 12 часов снижает уровень АФК в клетках с дисфункцией р53 примерно в 1,5 раза, делая его сопоставимым с наблюдаемым в контрольных клетках (Рис. 6А). Подавление АФК приводит к примерно двукратному снижению содержания белка HIFI-а в клетках с трансдуцированными мутантными белками р53 или гомозиготным нокаутом гена р53 (Рис. 6Б).

А)

Б)

s §

fe Q

/ ? #

"У 4Î4&

р53

HIFItn

tubulin-y^

Рис. 6. Влияние антиоксиданта NAC (5 мМ, 12 час.) на уровень АФК (А) и содержание HIFl-a (В) в клеточных линиях НСТ116 с измененной функцией р53.

А) Средние значения суммарной флюоресценции DCF в 104 клеток в двух экспериментах. Различия между контрольными клетками с дисфункцией р53 и ¡слетками, обработанными NAC, достоверны по критерию Стьюдента (р < 0,05). Б) Вестерн блот-анализ продукции HIFl-a. Белок у-тубулин использовали как контроль количества нанесенных образцов.

Иммуногистохимическое окрашивание срезов опухолей у бестимусных мышей, получавших NAC, показало, что снижение внутриклеточного уровня АФК вызывает уменьшение синтеза HIFl-a in vivo, что сопровождается подавлением опухолевого гемангиогенеза и, как следствие, существенным подавлением скорости роста опухолевых ксенографтов (Рис. 7). Так, NAC-индуцированное торможение скорости роста опухолей наблюдалось только при нарушениях функции р53, тогда как в опухолях НСТ116, несущих оба аллеля р53 дикого типа, этот эффект выражен незначительно (Рис. 7А).

NAC-индуцированное подавление гемангиогенеза в опухолевых ксенографтах, формируемых клетками НСТ116 с дисфункцией р53, выражается как в уменьшении количества функционирующих кровеносных сосудов, так и в увеличении числа недоразвитых капилляров без просветов (Рис. 7Б). Наибольший эффект NAC на рост крупных сосудов наблюдается в

опухолях, экспрессирующих контактные мутанты р53 Я248\У и 11273Н, а также в опухолях с нокаутом гена р53.

А)

350 300250' 200 150' 100 50 0

- и- p53+»,pL6 —»—p53+/+,pL6, NAC • -о— p53+M-, R248W —<р53»/+, R248W, NAC —A" p53-/-,pL6 -*— p53-i-,pL6. NAC

Б)

с

s-

Ш Крупные сосуды (> ЮО.мкм) О Недоразвитые сосуды (без просветов)

т к

^ V -V4 ^ ä -1.5 -1.S -2.0 5 5, -2.;

tj -2.4

скорость роста подкожных

11 14 17 20 23 Дни после прививки

Рис. 7. Влияние антиоксиданта NAC на к-еенографтов (А) и опухолевый гемангиогенез (Б).

А) Влияние NAC на скорость роста ксенографтов НСТ116 с разным статусом р53. Различия между объемами контрольных и NAC-обработанных опухолей с нарушениями р53 достоверны по критерию Стьюдента (р < 0,01). Б) Влияние NAC на количество крупных и недоразвитых сосудов в опухолях. Значения представлены как отношение среднего количества сосудов в опухолях, формируемых у мышей, получавших NAC, к среднему количеству сосудов в опухолях контрольной группы.

Таким образом, проведенные в этой части работы эксперименты позволили продемонстрировать, что экспрессия характерных для различных новообразований мутантных р53, повышая внутриклеточный уровень АФК, приводит к активации сигнального пути H1F1/VEGF-A, что ведет к усиленному опухолевому гемангиогенезу и ускоренному росту опухолей. Антиоксидант NAC подавляет эти эффекты и замедляет опухолевый рост, что указывает на перспективность использования антиоксидантов в комбинации с другими антиангиогенными препаратами в противоопухолевой терапии.

1.5. Роль нарушений р53 в васкулогениой мимикрии

Во многих типах опухолей функционирование кровеносных сосудов может дополняться или заменяться сосудоподобными кровенаполняемыми структурами, которые не выстланы клетками эндотелия - так называемой «васкулогенной мимикрией». Этот феномен известен давно, но до сих пор плохо изучены механизмы формирования сосудоподобных структур. Хотя уже известны молекулярные маркеры васкулогенной мимикрии, остается

неизвестным, что же стимулирует опухолевые клетки к формированию сосудоподобных каналов. Поэтому одной из задач данной работы являлось изучение влияния нарушений р53 на васкулогенную мимикрию. Для этого было проведено иммуногистохимическое окрашивание срезов опухолей, формируемых клетками НСТ116/р53+/+ и НСТ116/р53-/-, антителами к ламинину. Такое окрашивание позволяет выявить как структуры, в состав которых входят ламинины, т.е. васкулогенную мимикрию, так и кровеносные сосуды, базальная мембрана которых формируется этими белками. Площадь васкулогенной мимикрии определяли как разность между относительными площадями ламинин-содержащих структур и С034-позитивных структур (кровеносных сосудов) после окрашивания серийных срезов опухолевых тканей. Таким образом, мы обнаружили, что в опухолях НСТ116/р53-/-площадь сосудоподобных структур, увеличена в 1,5 раза по сравнению с ксенографтами НСТ116/р53+/+ (Рис. 8А).

А) Б)

Рис. 8. Влияние статуса р53 в клетках НСТ116 на площадь сосудоподобных структур (А) и экспрессию генов-маркеров васкулогенной мимикрии (Б).

А) Относительная площадь ламинин7С034" сосудоподобных структур в ксенографтах. Значения представлены как разность между площадью ламинин-позитивных и СГО4-позитивных структур. Различия между значениями контрольной группы (р53+/+) и значениями экспериментальных групп достоверны по критерию Стьюдента (р < 0,05). Б) ОТ-ПЦР анализ экспрессии генов УЕвРС, М1в-7 и СЭН5 в культурах клеток. мРНК а-тубулина использовали как контроль количества нанесенных образцов.

Интересно, что к увеличению площади сосудоподобных структур в ксенографтах НСТ116 приводит не только потеря экспрессии р53, но и экзогенная экспрессия мутантного р53 И273Н - одной из наиболее частых мутаций р53 в колоректальных раках. При этом экспрессия другого часто встречающегося в этом типе новообразований мутантного р53 - Я248\У, наоборот, уменьшает площадь сосудоподобных структур, а экспрессия р53

Л175Н не приводит к статистически значимым изменениям площади сосудоподобных структур. Вероятно, миссенс-мутации р53 могут по-разному влиять на способы васкуляризации опухолевой ткани. Так, мутант р53 R248W, в значительной степени стимулирующий гемангиогенез и, очевидно, за счет этого обеспечивающий кровоснабжение опухолевых тканей, подавляет васкулогенную мимикрию. При этом Я273Н мутант р53 стимулирует и гемангиогенез и васкулогенную мимикрию, дополняющие друг друга механизмы кровоснабжения опухолей.

Неожиданными оказались результаты эксперимента, когда мышам прививали смесь клеток НСТ116/р53+/+ и НСТ116/р53-/- в равном соотношении. В этом случае наблюдалось еще большее увеличение площади сосудоподобных структур по отношению к опухолям, образуемым каждой из линий (Рис. 8А). Полученные данные наводят на мысль, что р53 может разнонаправлено регулировать молекулярные детерминанты васкулогеиной мимикрии, и что наиболее благоприятным для роста опухолей может являться инактивация р53 не во всех, а только в части опухолевых клеток.

Проведя анализ уровня мРНК генов потенциальных молекулярных маркеров васкулогенной мимикрии, мы не обнаружили жестких корреляций между ее выраженностью и экспрессией УЕСЕС, МЮ-7, СОН5 (УЕ-кадгерина) (Рис. 8Б). Таким образом, механизмы обнаруженной нами связи между нарушениями функционирования опухолевого супрессора р53 и стимуляцией васкулогенной мимикрии остаются неясными и требуют дальнейшего изучения. Возможно, наибольшая выраженность васкулогенной мимикрии в опухолях, формируемых смесью р53-позитивных (экспрессирующих УЕСРС и СВН5) и р53-негативных клеток (экспрессирующих МЮ-7), обусловлена одновременной экспрессией в них большего числа индукторов/маркеров васкулогенной мимикрии, что обеспечивает более эффективное формирование сосудоподобных структур.

1.6. Роль нарушений р53 в опухолевом лимфангиогенезе

Для изучения влияния нарушений р53 на рост лимфатических сосудов было использовано иммуногистохимическое окрашивание срезов подкожных ксенографтов НСТ116 антителами к ЬУУЕ-1 - надежному маркеру лимфатического эндотелия. Оказалось, что в подкожных ксенографтах НСТ116/р53+/+ и НСТ11б/р53-/- лимфатические сосуды не образуются. Поэтому мы использовали дополнительные модели для изучения опухолевого лимфангиогенеза, в которых выявляются ЬУУЕ-1 -позитивные структуры. Одна из них - внутрикишечные ксенографты клеток НСТ116, привитых в подслизистый слой слепой кишки бестимусных мышей. Вторая

модель - подкожные ксенографты аденокарциномы легкого человека линии А549. Для изучения влияния нарушений опухолевого супрессора р53 на опухолевый лимфангиогснез получена панель стабильных клеточных сублиний производных р53-позитивной линии А549, синтезирующих наиболее характерные для опухолей человека мутантные белки р53 (Ш75Н, К248"\¥, Я273Н). Кроме того, была получена сублиния А549, в которой экспрессия р53 была подавлена с помощью вьРНК.

20

12

И *

ft И И

з S

R S

о о ? <=

щ 1 о!

НСТ116

А549

I

Рис. 9. Количество лимфатических сосудов в ксенографтах НСТ116 и А549 с различной экспрессией р53.

Различия достоверны по критерию Стьюденгта (р < 0,01).

p53w pSS-l-

shOFP shp53

На таких модельных системах методом иммуногистохимического окрашивания антителами к ЬУУЕ-1 было показано, что и во внутрикишечных ксенографтах НСТ116, и в подкожных ксенографтах А549, формируемых р53-негативными, клетками количество внутриопухолевых лимфатических сосудов увеличивается примерно в три раза (Рис. 9).

is

1 о ¥

5|

ге

А 549

I

gfr ffi

Рис. 10. Влияние миссене-мутаций р53 на число внутриопухолевых лимфатических сосудов в ксенографтах А549.

Различия достоверны по критерию Стьюдента (между контрольной группой и экспериментальной группой 1Ш5Н - р<0,05; между контрольной группой и экспериментальной группой Л273Н-р<0,01).

Наряду с этим мы исследовали влияние миссенс-мутаций р53 в кодонах 175, 248, 273 на опухолевый лимфангиогенез. Было обнаружено, что в ксенографтах А549, синтезирующих R175H, число LYVE-1-позитивных структур увеличено в 1,5 раза, а в ксенографтах, экспрессирующих р53 R273H - наиболее часто встречающийся мутант в раках легкого -

наблюдается двукратное увеличение числа лимфатических сосудов. При этом в опухолях, несущих R248W не наблюдалось статистически значимого изменения количества лимфатических сосудов (Рис. 10).

Таким образом, мы показали, что нарушения функции р53 увеличивают лимфангиогенную активность клеток НСТ116 и А549. Проведя анализ экспрессии мРНК генов VEGFC и VEGFD, кодирующих наиболее мощные из известных в настоящее время индукторы лимфангиогенеза, мы не обнаружили четких корреляций между повышенной лимфангиогенной активностью клеток и экспрессией в них исследуемых генов. Так, экспрессия гена VEGFD не изменялась ни в одной из клеточных сублиний НСТ116 и А549. Интересно, что повышенная экспрессия гена VEGFC обнаруживалась лишь в клетках НСТ116 с трансдуцированными мутантными р53, но не при нокауте гена р53 (Рис. 8Б), что указывает на роль вновь приобретенных (gain-of-fimction), а не доминантно-негативных активностей мутантных белков р53. Однако данный эффект не проявлялся в клетках рака легкого А549, демонстрирующих повышенную лимфангиогенную активность. Таким образом, механизмы впервые обнаруженного нами феномена - стимуляции опухолевого лимфангиогенеза при нарушениях функции р53 в неопластических клетках остаются неясными. Вероятно анализ секретома клеток с различными нарушениями функции р53 и обладающих, вследствие этого, повышенной лимфангиогенной активностью, сможет приблизить нас к пониманию механизмов стимуляции опухолевого лимфангиогенеза.

2. Роль VEGF-C в васкуляризации опухолей 2.1. Влияние подавления продукции VEGF-C на биологические свойства опухолевых клеток в культурах in vitro

Обнаружение влияния нокаута гена р53 на уровень экспрессии гена VEGFC (Рис. 8Б), побудило нас изучить последствия подавления синтеза его продукта - VEGF-C - основного лимфангиогенного фактора. Для этого на основе вектора pLKO.l-puro были созданы пять лентивирусных конструкций pLKO.l-shVEGFC. Эффективность подавления VEGF-C была проверена в культурах клеток А549 и НСТ116 через 3 недели после инфекции. Из пяти полученных конструкций для дальнейших исследований были отобраны конструкции №3 и №5 - наиболее эффективно подавляющие экспрессию VEGF-C. Было обнаружено стабильное подавление продукции как протеолитически незрелой, так и зрелой формы VEGF-C (Рис. 11 А). Кроме этого, с помощью иммуногистохимического окрашивания подтверждено подавление синтеза VEGF-C в ксенографтах НСТ116 и А549 через 3 и 6 недель соответственно.

А)

А549

НСТ116/р53+/+ НСТ116/р53-/-

Б)

VEGFC VEGFR2 VEGFR3 a-tubulin

Рис. 11. Влияние трансдукции лентивирусных конструкций pLKO.l-shVEGFC на содержание белка VEGF-C (А) и экспрессию генов VEGFC, VEGFR2 и VEGFR3 в клетках А549 и НСТ116.

А) Вестерн блот-анализ продукции VEGF-C in vitro. Представлены типичные данные одного из трех экспериментов. Б) ОТ-ПЦР анализ экспрессии генов VEGFC, VEGFR2 и VEGFR3. Представлены типичные данные одного из трех экспериментов. Белок а-тубулин и мРНК а-тубулина использовали как контроли количества нанесенных образцов.

При этом подавление экспрессии VEGFC сопровождалось уменьшением уровня мРНК его рецепторов VEGFR2 и VEGFR3 как в р53-позитивных, так и в р53-негативных опухолевых клетках (Рис. 11Б).

1 3 > 7 9 i!

Дни инкубации

Дни инкубации

НСГ116

-т- р53+/+ shGFP р53+/+ stiVEGF-C 3 р53*/* stlVEGF-C 5 -в- p6W-ShGFP

p53V- shVEGF-C 3 -e- ShVEGF-C 5

Рис. 12. Влияние подавления продукции VEGF-C на скорость размножения культивируемых in vitro клеток А549 и НСТ116.

Представлены типичные данные одного из трех экспериментов. Различия между значениями в экспериментальных и контрольной группах (shGFP) достоверны по критерию Стьюдента (р<0,01).

При изучении последствий ингибирования сигнализаций VEGF-C/VEGFR-2 и VEGF-C/VEGFR.-3 на поведение опухолевых клеток в культурах in vitro было обнаружено, что снижение продукции VEGF-C тормозит скорость размножения всех исследованных типов клеток (Рис. 12). Ингибирование VEGF-C приводит также к двукратному снижению миграционной активности р53-позитивных клеток линий А549 и НСТ116 в камере Бойдена. В то же время, р53-негативные клетки НСТ116/р53-/-, экспрессирующие si-VEGFC, не демонстрировали достоверного подавления миграционной способности (Рис. 13). Возможно, это связано с тем, что р53-негативные клетки характеризуются исходно низкой миграционной активностью, и дополнительное подавление VEGF-C уже не может оказывать существенного влияния на их миграцию.

| 90

S. 8«

AS49

□ shGFP _ shVEGF-C 3 ■ shVEGF-C 5

НСТ116

р53+/+

р53-/-

Рис. 13. Влияние подавления продукции \EGF-C на миграцию опухолевых клеток в камере Бойдена.

Представлены типичные данные одного из трех экспериментов. Различия между экспериментальными и контрольными (вЬОРР) группами р53-позитивных клеток достоверны по критерию Стьюдента (р<0,01).

Таким образом, результаты экспериментов in vitro указывают на существенную роль VEGF-C в аутокринной регуляции размножения и миграционной активности неопластических клеток.

2.1. Влияние подавления УЕСР-С на скорость роста опухолей и

ангиогенез

Обнаружено, что снижение продукции УЕСР-С приводит к существенному торможению скорости роста опухолевых ксенографтов (Рис. 14). При этом динамика роста ксенографтов рака толстой кишки линии НСТ116 существенно ингибировалась вне зависимости от присутствия в опухолевых клетках опухолевого супрессора р53.

А)

* 100 £

Дни после прививки

Б)

НСТП6

-Ъ-^ВМ-чШ1? -»-рЮ'А-зМет-СЗ

-а-р53-/-зЮсР -а-р5Э-/-зИУЕОР-СЗ

Дни паси: притеки УЕКР-С на скорость роста

Рис. 14. Влияние подавления продукции подкожных опухолей А549 и НСТ116.

Приведены типичные данные одного из трех экспериментов. Различия между значениями в экспериментальных и контрольной группах (бЬОРР) всех типов опухолей достоверны по критерию Стьюдента (р<0,01).

Замедление роста опухолей могло быть связано как с прерыванием аутокринной стимуляции пролиферации неопластических клеток, так и с ингибированием гемангиогенеза вследствие способности УЕСТ-С к низкоаффинным взаимодействиям с УЕСРИ-2. Для проверки этого предположения был проведен иммуногистохимический анализ срезов опухолей, окрашенных антителами к СБ34 - маркеру кровеносного эндотелия.

Табл. 3. Влияние подавления продукции \TGF-C на количество СШ4-пазитивных структур в ксенографгах опухолей.

Крупные Сосуды с Сосуды без

Ксенографты сосуды просветами просветов

(>100мкм)

А549-*АОЯР А549-íAK£GFCЗ А549-¡ЬУЕвРа 4,7 ±0,3 10,7 ± 1,5 8,7 ± 2,1

3,4 ±0,5 8,6 ± 2,0 10,9 ± 1,9

3,8 ±0,4 8,7 ± 1,8 14 ± 1.8

НСТПб^йСИ' НСТ116-8кУЕОРС5 1,6 ±0,5 8,9 ± 2,0 10 ±3,2

2,3 ±0.3 9,5 ±1,5 10,2 ±2,2

2,0 ± 0,4 8,5 ± 1,8 16 ±2,8

НСТ116(р53 -/-^НвРР нет 116(р53 -/->¿/1 3 НСТ116(р53 -1-)-*кУЕвРС5 4,2 ±0,2 15 ± 1,1 10 ±2,9

3,0 ±0,3* 10,4 ± 1,4* 8,5 ± 2,5

2,2 ±0,5* 9,1 ± 1,5** 11,2 ±2,0

Различия между значениями в экспериментальных и контрольной группах (хЬОРР) ксенографтов НСТ116/р53-/- достоверны по критерию Стьюдента: * - р<0,05; ** - р<0,01.

Оказалось, что подавление синтеза УЕвР-С не оказывает достоверного влияния на плотность кровеносных сосудов в опухолях, формируемых р53-позитивными клетками НСТ116 и А549, тогда как в р53-негативных опухолях НСТ116/р53-/-, в которых уровень УЕСР-С исходно ниже, дополнительное ингибирование УЕОР-С приводит к уменьшению количества функционирующих сосудов в 1,5-2 раза (Табл. 3).

Таким образом, возможно, что при невысоком уровне продукции УЕСР-С подавление его синтеза может тормозить опухолевый рост как за счет ингибирования аутокринной стимуляции пролиферации неопластических клеток, так и за счет уменьшения их гемангиогснной активности.

Основная функция УЕСтР-С заключается в стимуляции лимфангиогенеза, поэтому было исследовано влияние подавления синтеза УЕОР-С на лимфангиогенную активность клеток рака легкого линии А549. С помощью метода иммуногистохимического окрашивания антителами против ЕУУЕ-1 и дальнейшего подсчета количества лимфатических сосудов было показано, что подавление продукции УЕОР-С приводит к 8-10-кратному ингибированию образования внутриопухолевых лимфатических сосудов в подкожных ксенографтах (Рис. 15).

вЮТ ®1ШЗР-СЗ в^БвР-Сб

Кроме этого, клетки А549 прививали внутрилегочно бестимусным мышам. Эта модель отвечает всем требованиям для изучения опухолевого лимфангиогенеза: во-первых, сохраняются привычное для клеток А549 микроокружение и физиологические лимфоколлекторы; во-вторых, появляется возможность оценивать количество и внутриопухолевых, и околоопухолевых лимфатических сосудов. Используя такой метод прививки клеток А549, мы обнаружили, что подавление синтеза УЕОР-С ингибирует рост первичной опухоли в легком, и в 4 раза подавляет развитие

Рис. 15. Влияние подавления продукции VEGF-C на количество лимфатических сосудов в подкожных ксенографтах А549. Различия достоверны но критерию Стьюдента (р< 0,005).

внутриопухолевых лимфатических сосудов, при этом, достоверного эффекта на плотность околоопухолевых лимфатических сосудов не обнаружено (Рис. 16).

!Г

1Г

Г

Г> о. 4

Г

> 3 о

А 549

□ shGFP ■ shVEGF-C 3

I

внутриопухолевые околоопухолевые лимфатические сосуды

Рис. 16. Влияние подавления продукции УЕСР-С на лимфангиогенез во внутрилегочных ксенографтах А549.

Различия по количеству внутриопухолевых лимфатических сосудов достоверны по критерию Стьюдента (р < 0,01).

Возможно, такой эффект ингибирования продукции УЕОР-С может уменьшить вероятность лимфогенного метастазирования опухолевых клеток и найти применение в клинической практике.

Заключение

В работе изучена роль нарушений функции опухолевого супрессора р53 на различные типы васкуляризации опухолей - гемангиогенез, васкулогенную мимикрию и лимфангиогенез.

Обнаружено стимулирующее действие миссенс-мутаций р53 -наиболее распространенных изменений р53 в различных новообразованиях человека - на рост подкожных ксенографтов клеток рака ободочной кишки человека in vivo. Выявлена ключевая роль повышения внутриклеточного уровня активных форм кислорода и активируемого ими сигнального пути HIF1/VEGF-A в индукции опухолевого гемангиогенеза при нарушениях р53. Антиоксидант NAC подавляет эти эффекты и замедляет опухолевый рост, что указывает на перспективность использования антиоксидантов в комбинации с другими антиангиогенными препаратами в противоопухолевой терапии.

Показано влияние дисфункции р53 на выраженность васкулогенной мимикрии в опухолевой ткани. При этом обнаружено, что для наибольшей эффективности такого типа васкуляризации необходима потеря экспрессии р53 не во всех, а только в части опухолевых клеток.

Обнаружено, что нарушения функции р53 в клетках рака ободочной кишки человека приводят к изменению экспрессии гена VEGFC. Показано, что подавление продукции цитокина VEGF-C приводит к снижению уровня

экспрессии генов его рецепторов VEGFR-2 и VEGFR-3 и вызывает ряд эффектов, ингибирующих опухолевую прогрессию: снижение пролиферативной и миграционной активности клеток in vitro, торможение роста подкожных ксенографтов НСТ116 и А549, уменьшение способности к формированию сосудоподобных структур и ингибирование лимфангиогенеза. Полученные результаты указывают на то, что VEGF-C может быть перспективной молекулярной мишенью для направленной терапии рака немелкоклеточного легкого и рака ободочной кишки человека.

Выводы

1. Изучено влияние различных нарушений функции опухолевого супрессора р53 в неопластических клетках на гемангиогенез, васкулогенную мимикрию и лимфангиогенез в формируемых ими опухолевых тканях. Обнаружены и описаны неизвестные ранее эффекты различных нарушений р53 на васкуляризацию и прогрессию новообразований.

2. Впервые установлено, что экспрессия характерных для различных новообразований человека мутантных р53 R.175H, R248W, R273H, как и потеря экспрессии р53, стимулируют рост ксенографтов рака ободочной кишки НСТ116 и увеличивает гемангиогенную активность клеток HCT И 6, повышая внутриклеточный уровень активных форм кислорода (АФК), активирующих сигнальный путь HIF1/VEGF-A.

3. Снижение внутриклеточного уровня АФК с помощью антиоксиданта NAC ингибирует ангиогенную активность и скорость роста опухолей НСТ116 с дисфункцией р53.

4. Впервые выявлено влияние инактивации опухолевого супрессора р53 на васкулогенную мимикрию: гомозиготный нокаут гена р53 и экспрессия мутантного белка р53 R273H стимулируют этот тип васкуляризации опухолевых тканей. При этом для наиболее эффективного формирования васкулогенной мимикрии в опухолях НСТ116 необходима инактивация функции р53 не во всех, а только в части неопластических клеток.

5. Впервые продемонстрирована стимуляция опухолевого лимфангиогенеза при подавлении экспрессии р53 в неопластических клетках. При этом не обнаружено прямой корреляции между стимуляцией лимфангиогенеза и повышением экспрессии генов, кодирующих лимфангиогенные цитокины VEGF-C и VEGF-D.

б. Подавление в клетках рака легкого А549 и рака ободочной кишки НСТ116 продукции УЕвР-С, ген которого является транскрипционной мишенью р53, снижает экспрессию генов рецепторов УЕСЕК-2 и ИEGFЛ-J, что приводит к уменьшению васкуляризации опухолей, в частности лимфангиогенеза и васкулогенной мимикрии, замедляет опухолевый рост, а также ингибирует пролиферацию и миграцию опухолевых клеток.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Khromova N., Kopnin P., Stepanova E., Agapova L., Kopnin B. p53 hot-spot mutants increase tumor vascularization via ROS-mediated activation of the HIF-1/VEGF-A pathway.// Cancer Letters. - 2009 - 276 (2) -143-151.

2. Хромова КВ., Копиин П.Б., Степанова Е.В., Копнии Б.П. Влияние подавления синтеза VEGF-C в клетках рака легкого и ободочной кишки человека на их рост, миграционную и ангиогенную активность.// Российский биотерапевтический журнал. - 2009 - №3 - с. 21-26.

3. Котин Б.П., Копнин П.Б., Хромова Н.В., Агапова JI.C. Многоликий р53: разнообразие форм, функций, опухоль-супрессирующих и онкогенных активностей.// Клиническая онкогематология. - 2008 -1(1) - с. 2-9.

4. АгаповаЛ.С., Черняк Б.В., Дугина В.Б., Хромова Н.В, Котин Б.П., Копнин П.Б., Скулачев В.П. и др. SkQl подавляет развитие опухолей из р53-дефицитныхклеток.// Биохимия.-2008-т.73,вып. 12-с. 1622-1640.

1. Хромова Н.В., Копнин П.Б., Степанова Е.В., Копнин Б.П. Ингибирование роста, миграционной н ангиогенной активности опухолевых клеток путем подавления синтеза VEGF-C.// 14 международная школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», 19-23 апреля 2010 г., Пущино, Сборник тезисов, том 1, с. 189.

2. Замкова М.А., Копнин П.Б., Хромова Н.В., Копнин Б.П. Изменения активности транскрипционного фактора HSF1 влияют на скорость роста клеток рака ободочной кишки человека in vitro и in vivo.// 14 международная школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», 19-23 апреля 2010 г., Пущино, Сборник тезисов, том 2, с. 137.

Статьи в рецензируемых журналах

Тезисы докладов

Подписано в печать:

26.10.2010

Заказ № 4393 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru