Автореферат и диссертация по медицине (14.00.10) на тему:Уровень цитокинов и субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови в сопоставлении с морфологическими изменениями печени у больных хроническими вирусными гепатитами В и С

На правах рукописи

003170234

Лазарева Анна Светославовна

Уровень цитокинов и субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови в сопоставлении с морфологическими изменениями печени у больных хроническими вирусными гепатитами В и С

14 00 10 - инфекционные болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 э плг.

Москва - 2008

003170234

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московской медицинской академии им ИМ СеченоваРосздрава

Научные руководители:

член-корр РАМН, доктор медицинских наук,

профессор Сергей Григорьевич Пак

доктор медицинских наук,

профессор Михаил Валентинович Киселевский

Официальные оппоненты: академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Валентин Иванович Покровский

Наталья Михайловна Беляева

Ведущее учреждение: ГОУ ВПО Российский Государственный медицинский Университет Росздрава

Защита диссертации состоится 2008 г в часов на

заседании диссертационного совета Д 208 040 05 при ГОУ ВПО Московской Медицинской академии им ИМ Сеченова Адрес 119992, Москва, ул Трубецкая, д 8, строение 2

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке

ГОУ ВПО ММА им ИМ Сеченова Росздрава (117998, Москва, Нахимовский

проспект, д 49)

Автореферат разослан

и/? 2008 г

Ученый секретарь Диссертационного совета

Доктор медицинских наук, профессор Елена Васильевна Волчкова

Актуальность темы. Парентеральные вирусные гепатиты, среди которых доминирующее место занимают гепатиты В и С, - одна из наиболее серьезных и актуальных проблем здравоохранения во всем мире Заболевания распространены повсеместно и по данным ВОЗ в мире насчитывается около 400 млн и 170 млн инфицированных вирусом гепатита В и С соответственно Эти инфекции являются основными в развитии хронических заболеваний печени, включая цирроз и гепатокарциному (Шахгильдян И В , Михайлов М И, Онищенко Г Г, 2003, Серов В В , Апросина 3 Г, 2002, Шерлок Ш, Дж Дули, 2002)

Ключевую роль в патогенезе нарушения элиминации вируса и хронизации при вирусных гепатитах играют изменение состава и нарушение функции иммунокомпетентных клеток, что приводит к развитию иммунопатологических реакций Основой развития иммунокомплексных реакций являются нарушения цитокинового статуса, поскольку именно цитокины принимают непосредственное участие в развитии воспаления, иммунного ответа и регенерации печени (Никитин В Ю, Жданов К В , 2004, Курамшин ДХ, Толоконская НП, 2002, Апросина ЗГ., Серов ВВ, 2001, Ивашкин В Г и соавт, 2001, Ковальчук Л В с соавт, 2001 Носик Н Н, 2000) Нарушение баланса ТЫ/ТЬ2 цитокшовой продукции является одним из механизмов неадекватного иммунного ответа, играющего ключевую роль в развитии и прогрессировании заболевания (Наследникова И О , Белобородова Е В, 2005, Царегородцева Т М, Серова Т И, 2003, Собчак Д М, Монакова Э А, 2004, Нетре1 в, 2000, МсС1агу Н, 2000, Огатегш А, 2005) Отмечено, что длительная активация ТЫ-лимфоцитов с гиперпродукцией 1КЫ-у и ЮТ-а способствуют активному прогрессирующему течению заболевания и элиминации вируса, тогда как преобладание в патологическом процессе цитокинов, продуцируемых ШЗ-клетками, напротив, ассоциируется с вирусной персистенцией и хронизацией процесса (Ивашкин В Т и соавт, 2003, Серов В В , Мухин Н А, 2000, Антонов П В, Цинзерлинг В А, 2001, Абдурахманов

Д Т, 2002, Жукова Н Г и соавт, 2002) Нарушения продукции медиаторов ведут к дефектам Т- лимфоцитов, фагоцитирующих клеток и NK которые отвечают за гибель вирусинфицированных гепатоцитов при хронических вирусных гепатитах В и С (Семененко Т А, 2002, Trobonjaca Z, 2002, Falasca К, 2006)

Напряжение местных реакций иммунной системы проявляется в виде гиперплазии лимфоидной ткани в паренхиме печени Показана четкая корреляция между тяжестью течения процесса и выраженностью лимфоцитарной инфильтрации Вслед за развитием воспалительного процесса в печени наблюдаются дистрофические и дегенеративные процессы, некроз гепатоцитов, а затем коллагенизация стромы на месте гибели участков паренхимы и в стенках сосудов (Покровский В И, Непомнящих Г И, 2003, Жданов К В и соавт, 2003, Mosmer JF, 1993)

Иммунная система печени включает в себя большинство компонентов, отвечающих за развитие врожденного иммунного ответа натуральные киллеры (NK), натуральные киллеры-Т-клетки (NKT-клетки), дендритные клетки, макрофаги и эффекторы специфического иммунитета (Т-клетки) (Biron С and Brossay L, 2001, Amaraa R, 2002 , Trobonjaca Z, 2001) Взаимодействие Купферовских (или дендритных) клеток, NK, NKT, CD8 Т- клеток между собой обеспечивают развитие адекватного иммунного ответа на вирусную инфекцию (Exley, М А , Koziel, М J 2004, Park S Н ,2003, Mehta А, 2004, Cecere А, 2004)

В экспериментальных работах по изучению противоопухолевого иммунитета была выявлена особая субпопуляция Т-клеток - Т-регуляторные лимфоциты CD4+CD25+ (Т per ), которые проявляют гипопролиферативную способность, угнетают активацию и ингибируют секрецию цитокинов CD4+CD25 Т-хелперами и CD8+ лимфоцитами Все это препятствует развитию реакций, направленных на элиминацию чужеродного антигена (Peng G, 2008, Boettler Т, 2005, Fu JL, 2006, Stoop JN, 2005, Xu D, 2006) Данные о роли T per

лимфоцитов печени при хронических вирусных гепатитах весьма малочисленны

Несмогря на значительное количество рабог, посвященных изучению показателей цитокинового профиля и иммунного статуса, данные об уровне и значимости цитокинов весьма противоречивы, кроме того, в большинстве работ изучалась только сывороточная концентрация отдельных цитокинов без определения стимулированной продукции цитокинов МНПК (Курамшин ДХ, Толоконская НП, 2001, Наследникова ИО, 2005, Скляр ЛФ, 2005, Abayli В, 2003, Fan X, 2000, Pnímiagi LS, 2003, Spanakis NE, 2002, Zekn AR, 2005) В настоящее время весьма малочисленны сведения о субпопуляциях иммунных клеток печени (NKT, NK, Т per), участвующих в элиминации вируса и повреждении клеток печени при хронических вирусных гепатитах В связи с этим, актуальным представляется изучение механизмов, способствующих развитию и поддержанию длительной персистенции и хронизации при вирусных гепатитах

Цель исследования: изучить особенности цитокинового профиля, субпопуляциошюго состава лимфоцитов периферической крови и лейкоцитарной инфильтрации печени в сопоставлении с морфологическими изменениями в печени у больных хроническими вирусными гепатитами В и С Задачи работы:

1 Изучить концентрацию цитокинов IFN-a, IFN-y, TNF-a, IL-ip, IL-4, IL-6 в сыворотке крови у больных хроническими вирусными гепатитами В и С в сопоставлении с показателями гистологической активности и фиброза

2 Изучить спонтанную продукцию цитокинов IFN-a, IFN-y, TNF-a, IL-ip, IL-4, IL-6 МНПК у больных ХГВ и ХГС с различными показателями гистологической активности и фиброза

3 Изучить индуцированную Ж>У и ФГА продукцию цитокинов НТхГ-а, 1ПЧ-у, ЮТ-а, 1Ь-1р, 1Ь-4,1Ь-6 МНПК у больных ХГВ и ХГС с различной активностью гепатита и выраженностью фиброза

4 Определить субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови в сопоставлении с уровнем гистологической активности и фиброза у больных хроническими вирусными гепатитами В и С

5 Оценить морфологические изменения с определением гистологической активности и фиброза в ткани печени у больных ХГВ и ХГС по данным пункционной биопсии печени

6 Исследовать особенности лейкоцитарной инфильтрации печени у больных хроническими вирусными гепатитами В и С в сопоставлении с активностью гепатита выраженностью фиброза

7 Определить фенотип печень-ассоциированных лимфоцитов иммуногистохимическим и иммуноцитохимическим методом у больных ХГВ и ХГС

Научная новизна. У больных хроническими вирусными гепатитами В и С получены новые данные о стимулированной ЬГОУ и ФГА продукции цитокинов МНПК при различной активности гепатита и выраженности фиброза В группе больных с выраженными морфологическими изменениями в печени определено достоверное угнетение способности МНПК продуцировать ряд цитокинов (1РЫ-а, ШЧ-у, ТОТ-а, 1Ь-6) при стимуляции их №)У и ФГА

Установлено отсутствие статистически значимых отличий концентрации цитокинов ШЧ-а, 1Б1Ч-у, ТЫГ-а, 111.-113, 1Ь-4, 11,-6 в сыворотке крови у больных хроническими вирусными гепатитами по сравнению со здоровыми донорами, что подтверждает необходимость изучения стимулированной продукции цитокинов для оценки цитокинового профиля

Выявлено статистически значимое снижение иммунорегуляторного индекса у больных с высокой гистологической активностью и выраженными морфологическими изменениями в печени

Установлено отсутствие статистически значимых отличий содержания субпопуляций CD3, CD4, CD8, CD16, CD25, HLADR, CD20, CD38 лимфоцитов периферической крови у больных хроническими вирусными гепатитами по сравнению со здоровыми донорами

У больных хроническими вирусными гепатитами В и С сопоставлен характер и интенсивность лейкоцитарной инфильтрации с активностью патологического процесса в печени Установлено, что у больных хроническим вирусным гепатитом С лейкоцитарная инфильтрация выражена больше и распространяется внутрь долек уже на ранних этапах развития инфекционного процесса по сравнению с больными хроническим вирусным гепатитом В

Впервые расшифрован фенотип иммунных клеток лейкоцитарных инфильтратов паренхимы печени у больных ХГВ и ХГС, выявлены популяции Т- лимфоцитов CD3+, цитоксических лимфоцитов CD8+, 1 per лимфоцитов CD4+CD25+, NK- клеток CDI6+CD56+, NKT- клеток CD3+CD16+CD56+

Практическая значимость. Для адекватной оценки активности инфекционного процесса необходимо проводить комплексное обследование больных хроническими вирусными гепатитами В и С, включающее в себя определение концентрации цитокинов не только в сыворотке крови, но и изучение стимулированной NDV и ФГА продукции цитокинов МНПК, а также вычисление показателей иммунорегуляторного индекса.

При морфологическом исследовании гепатобиоптатов у больных хроническими вирусными гепатитами В и С необходимо определять не только гистологическую активность и выраженность фиброза, но и оценивать выраженность, распространенность и субпопуляционный состав

лейкоцитарных инфильтратов печени

Только совокупность полученных данных позволяет выбрать правильную тактику и провести адекватную терапию у больных ХГВ и ХГС

Положения, выносимые на защиту:

1 Уровень цитокшюв IFN-a, IFN-y, TNF-a, IL-ip, IL-4, IL-6 в сыворотке крови у больных ХГВ и ХГС не отражает их реальную концентрацию в сыворотке крови

2. Для оценки цитокинового профиля у больных хроническими вирусными гепатитами В и С необходимо изучите стимулированной продукции цитокинов МНПК

3 Угнетение индуцированной NDV и ФГА продукции ряда цитокинов (IFN-a, IFN-y, TNF-a, IL-6) МНПК у больных как с минимальными, так и с выраженными морфологическими изменениями в печени отражает состояние иммунодефицита при ХГВ и ХГС

4 Нарушение иммунного ответа подтверждается снижением иммунорегуляторного индекса во всех группах больных хроническими вирусными гепатитами В и С

5 Выраженность и распространенность лейкоцитарной инфильтрации печени при хронических вирусных гепатитах более выражена при высокой гистологической активности

6 У больных хроническим вирусным гепатитом С лейкоцитарная инфильтрация более выражена и раньше распространяется внутрь печеночной дольки, чем при хроническом вирусном гепатите В

7 Расположение участков развития соединительной ткани совпадает с конфигурацией области лейкоцитарной инфильтрации в печени у больных хроническими вирусными гепатитами

8 Лейкоцитарные инфильтраты образуют в основном активированные лимфоциты, субпопуляционный состав которых представлен Т-лимфоцитами, цитотоксическими лимфоцитами, Т per лимфоцитами, NK-клетками, NKT-клетками

9 Для оценки активности инфекционного процесса и назначения адекватной терапии необходимо комплексное обследование больных

ХГВ и ХГС с определением стимулированной ЫБУ и ФГА продукции цитокинов МНПК, иммунорегуляторного индекса и характера лейкоцитарной инфильтрации печени о определением фенотипа клеток, составляющих инфильтрацию Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Международном Евро-Азиатском конгрессе но инфекционным болезням (Витебск, 2008г) Диссертационная работа апробирована на заседании кафедры инфекционных болезней Московской Медицинской Академии им ИМ Сеченова

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 161 странице печатного текста и состоит из введения, пяти глав, выводов и списка использованной литературы (36 отечественных и 115 иностранных работ) Работа иллюстрирована 30 графиками и 45 таблицами Материалы и методы исследования

В исследование вошли 37 больных вирусным гепатитом В и С, из них 13 больных хроническим гепатитом В и 24 больных хроническим вирусным гепатитом С До момента обследования больные не получали противовирусной терапии Диагноз хронического вирусного гепатита основывался на выявлении синдромов гепато- и спленомегалии, холестаза и цитолиза Этиологическая верификация диагноза проводилась на основании обнаружения в сыворотке крови ДНК вируса гепатита В (НВУ) и РНК вируса гепатита С (НСУ) с определением генотипа вируса с помощью ПЦР, а также серологических маркеров НВУ (HBsAg, анти-НВсог ^М, анти-НЬсог суммарные) и НСУ (анти-НСУ ^О) с использованием ИФА

Всем больным хроническими вирусными гепатитами В и С выполнена аспирационная пункционная биопсия печени по Менгини с последующим морфологическим исследованием биоптатов печени общепринятым методом полуколичественной оценки гистологической активности и фиброза по Я

Knodell, адаптированной в отношении В и С гепатитов К Ishak (Серов В В, Танащук Е Л, 2004) Все больные были разделены на группы по степени активности гепатита (от минимальной до высокой активности), по степени выраженности перипортальных некрозов (0-5 баллов), внутридольковой дегенерации (1-4 балла), портального воспаления (1-4 балла), фиброза (0-3 балла) вне зависимости от этиологии гепатита Далее изучен цитокиновый профиль и показатели иммунного статуса у больных хроническими вирусными гепатитами В и С в сопоставлении с морфологическими изменениями печени

Материалом исследования являлась венозная кровь, стабилизированная гепарином (25 Ед/мл) Для оценки цитокинового профиля у больных хроническими вирусными гепатитами В и С изучена концентрация цитокинов (IFN-a, IFN-y, TNF-a, IL-ip, IL-4, IL-6) в сыворотке крови, а также спонтанная и стимулированная NDV и ФГА продукция данных цитокинов MHIIK Мононуклеары периферической крови выделяли в стерильных условиях из цельной венозной крови методом градиентного центрифугирования с использованием Ficoll-Paque («Pharmacia», Швеция) (р=1,077 г/см3) (Натвиг Дж, 1980) Выделенные клетки культивировали в течение 36 ч при температуре 37° и 5% СОг в полной культуральной среде (90% RPMI-1640 ("Вектор-Бсст", Новосибирск) без активатора, а также с добавлением 10 мкг/мл фитогемагглютшшна (ФГА) ("Difco", Германия) или вируса болезни Ньюкасла (NDV) для активации лимфоцитов (Хаитов РМ, 1995) Определение концентрации цитокинов производилось «сендвич»-методом твердофазного иммуноферментного анализа с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента (наборы реагентов IFN-a, IFN-y, TNF-a, IL-ф, IL-6, IL-4 ООО «Протеиновый контур» С-Петербург)

Изучение иммунного статуса у больных проводилось с помощью определения экспрессии поверхностных маркеров лимфоцитов CD3, CD4, CD8, CD16, CD25, HLADR, CD20, CD38 при помощи моноклональных антител против соответствующих антигенов (Caltag Laboratories, США), результаты

учитывали методом проточной цитофлюорометрии на проточном циюметрс FACScan (Betton Dickinson, США)

Полученные при аспирационной биопсии печени гистологические препараты окрашивали гематоксилин-эозином для морфологического анализа и пикрофуксином по Ван-Гизону для выявления соединительной ткани Иммупоцитохимическое исследование на мононуклеарных клетках, выделенных из печени, и иммуногистохимическое исследование на криосрезах проведено с использованием меченых моноклональных антител к поверхностным маркерам лимфоцитов (CD3/CD16CD56, CD4/CD25, CD8, CD20), дендритных клеток (CDla) и макрофагов (CD14) Использовалось двойное окрашивание антителами, мечеными флюорохромамл фикоэритрином (РЕ) и флюоресцеинизотиоционатом (FITC) Для морфологического исследования были приготовлены мазки из мононуклеарных лейкоцитов гепатобиоптатов, которые окрашивались зозин-азуром по Романовскому-Гимза и по Браше с контрольной обработкой РНК-азой Световую микроскопию и фотографирование иммунных клеток печени в окрашенных мазках проводили с помощью фотовидеосистемы Axioplan 2 (фирмы Carl Zeiss, Германия)

Дополнительно проводилось ультразвуковое исследование печени Таким образом, каждому больному было проведено больше 40 специальных исследований для решения поставленных задач

В качестве контроля по определяемым нами показателям цитокинового профиля и иммунного статуса мы обследовали группу здоровых лиц в количестве 10 человек (7 мужчин и 3 женщин в возрасте от 18 до 39 лет)

Статистическая обработка данных проводилась с использованием стандартного пакета программ Statistica for Windows (2000, версия 6 0) фирмы Statsoft Inc и пакета программ Microsoft Excel (2003) корпорации Microsoft Гипотезу нормальности распределения во всех выборках проверяли по критерию Колмогорова-Смирнова В связи с ненормальным распределением первичных данных, нами не использованы и не приведены значения средних

величин со стандартным отклонением Описание центральной тенденции количественных признаков в группах проводилось с использованием медианы (т), дисперсия признаков описывалась в виде минимального (мин) и максимального значений (макс) Для оценки достоверности различий выборок использовали критерий Манна-Уитни Все различия считались достоверными при значении р<0,01 (Гланц С, 1999, Боровиков В, 2001)

Результаты исследования и их обсуждение.

Изменение цитокинового статуса в виде нарушения баланса ТЫ/ТЪ2 цитокиновой продукции МНПК является одним из механизмов неадекватного иммунного ответа, играющего ключевую роль в развитии, прогрессировали и хронизации вирусного гепатита (Царегородцева ТМ, Серова ТИ, 2003, Собчак Д М, Монакова Э А, 2004) В связи с этим представляло интерес изучить цитокиновый профиль в сопоставлении с гистологической активностью у больных с хроническими вирусными гепатитами В и С Первоначально все больные с ХГВ и ХГС были разделены на группы по уровню активности гепатита в соответствии с ИГА Значения ИГА 1-3 балла соответствуют минимальной степени активности, при ИГА 4-8 баллов делают заключение о низкой активности, показатели в пределах 9-12 баллов свидетельствуют об умеренной степени активности, а 13-18 баллов - о высокой степени активности хронического гепатита вне зависимости от его этиологии

Ни в одной группе больных с различной степенью гистологической активности содержание исследуемых цитокинов ШЧ-а, 1Ш-у, ТОТ-а, 1Ь-1|3, 1Ь-4,1Ь-6 в сыворотке крови и их спонтанная продукция МНПК достоверно не отличалась от контрольной группы, при этом у больных с высоким уровнем гистологической активности определена явная тенденция к увеличению концентрации 1Ь-6 в сыворотке крови и концентрации 1Ир при спонтанной продукции МНПК по сравнению с группой контроля Установлено статистически значимое снижение индуцированной МЗУ продукции №N-01 МНПК у больных хроническими вирусными гепатитами с минимальной

гистологической активностью, а при высокой степени гистологической активности наблюдалось статистически значимое снижение стимулированной ЫБУ продукции целою ряда цитокинов (1Ш-а, №N-4, ТЫР-а, IЬ-6) МНПК и снижение стимулированной ФГА продукции ЮТа МНПК по сравнению со здоровыми донорами (таблица 1) Таблица!

Выявленные изменения концентрации цитокинов периферической крови в

сопоставлении с уровнем гистологической активности

ГИСТОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ

минимальная высокая контроль

4 инд. NOV IFN-o * Медиана 3Q мин макс 28215 р<0 01 1 инд NDV IFN-a * Медиана Д4 инн маю 30 6В [К0,01 инд ШУ^И-а Медиана 3100 мин макс 1000 3500

1 ИНД NDV IFN-V * Медиана g (¡5 мин макс п ... 0 24 1К001 инд ^Ы-у Медиана -(35 шимакс 2а21я)

1 инд NDVTNF-a* Медиана gg мин макс 15Ш 1X0,01 ИНД ЮУ ТОР« Медиана 1600 инн макс 1000.2000

i инд ФГА TNF-a * Медиана gg мин махе 1(390 р<0,01 инд ФГАТЫР-а Медиана 704 чин макс 1(]0 2адо

1 ИНД NDV IL-6 * Медиана go 1x0,01 т сыв IL-6 t спонт IL-1P ИЦД ЫРУ И-6 Медиана 750 "тмжс 700 800

Примечание *- досговерное различие с группой здоровых доноров (р<0,01)

Учитывая то, что индекс гистологической активности является интегративным показателем, складывающимся из следующих параметров степень выраженности дистрофических и некротических изменений геяатоцитов, степени выраженности воспалительной инфильтрации портальных трактов и разрастания в печени соединительной ткани, представляло интерес изучить каждый параметр в отдельности в сопоставлении с цитокиновым профилем периферической крови

У больных с отсутствием перипортальных некрозов (0 баллов) достоверно выявлено только снижение индуцированной ЫЭУ продукции 1Р>1-а МНПК В группах больных с выраженностью перипортальных некрозов 1,2, 3, 4 балла ни один из исследуемых цитокинов пе отличался от контрольной

группы в сыворотке крови, при их спонтанной и стимулированной продукции МНПК При выраженности перипортальных некрозов 5 баллов определено статистически значимое снижение индуцированной Ж)У продукции ПТЧ-а, №N-7, ТИР-а МНПК и достоверное снижение стимулированной ФГА продукции ЮТ-а МНПК, а также выявлена тенденция к увеличению спонтанной продукции ЮТ-а, 1Ь-1р, 1Ь-6 МНПК по сравнению со здоровыми донорами (таблица 2) Таблииа2

Выявленные изменения концентрации цитокинов периферической крови в

сопоставлении с выраженностью перипортальных некрозов

ПЕРИПОРТАЛЬНЫЕ НЕКРОЗЫ

0 баллов 5 баллов контроль

1 инд NDV IFN-a * Мадиаиа 29 мин макс 28 38 р<0,01 ^ инд ^N-0 * Медиана 29 9 мин макс 2д 58 с<0,01 инд NOV IFN-a Медиана 3100 мин макс 1000 3500

| инд N07* Медиана 3 мин макс ф 24 р<0.01 инд NDVIFN-y Медиана 135 мшмакс 2В2100

1 инд N07 Т^-а * Медиана ^ 5 мии макс 15175 р<0,0] ИНД NDVTNF-a Медиана """ "а|<с 1000 2000

| инд. ФГА Т№-а * Медиана 3-] мин макс 1086 1X0,01 Т спонт ТЫР-а Т спонт 11.-13 Т спонт 11.-6 инд ФГА TNF-a Медиаиа 704 мин Макс 100 2000

Примечание *- достоверное различие с группой здоровых доноров (р<0,01)

В группе больных с выраженностью внутридольковой дегенерации и очаговых некрозов 1 балл определено достоверное снижение индуцированной ЖГУ продукции №N-<1 МНПК по сравнению с контрольной группой Ни в одной из групп больных с активностью 2, 3 балла внутридольковой дегенерации не было статистически значимых различий концентрации исследуемых цитокинов в сыворотке крови, при их спонтанной и индуцированной Ж)У и ФГА продукции по сравнению со здоровыми донорами В группе 4 балла внутридольковой дегенерации определено достоверное снижение стимулированной Ж)У продукции ШЫ-а, ЮТ-а, 1Ь-6 МНПК и стимулированной ФГА продукции ЮТ-а МНПК, а также выявлена

тенденция к повышению спонтанной продукции 1Ир МНПК по сравнению с контрольной группой (таблица 3) ТаблицаЗ

Выявленные изменения концентрации цитокинов периферической крови в сопоставлении с выраженностью внутридольковой дегенерации

ВНУТРИДОЛЬКОВАЯ ДЕГЕНЕРАЦИЯ

1 балл 4 балла контроль

1 ИНД. NDV IFN-a * Медиана 29 5 мтиакс 0250 р<0 01 1 инд NDV IFN-a * Медиана 375 мин макс 2д 53 IK0 01 инд ШУ^И-а Медиана ЗЮО мин макс ,000 3500

i инд. NDV TNF-a * Медиана 55 мин макс ош р<0 01 инд NDVTNF.il Медиана "1600 мин макс 1С00 2000

J инд. ФГА TNF-o * Медиана 7 5 мин макс 3'88 1X0,01 инд ФГАТЫЯ-а Медиана 704 мин макс 100 2000

| инд NDVIL-6* Медиана 60 ми» макс 25558 1X0,01 Т спокт IL-1 р инд ЫОУИ-б Медиана 750 мин макс 70а800

Примечание *- достоверное различие с группой здоровых доноров (р<0,01)

Важнейшим показателем, входящим в состав интегративного индекса гистологической активности, является уровень портального воспаления, выраженный в баллах от 1 до 4 При анализе содержания 1РЫ-а, №N-7, ЮТ-а, 1ИР, 1Ь-4, 1Ь-6 у больных хроническими вирусными гепатитами с выраженностью портального воспаления 1, 2 балла статистически значимых отличий содержания исследуемых цитокинов в сыворотке крови, при спонтанной и стимулированной Ж)У и ФГА продукции не установлено Только у больных в группе 3 балла портального воспаления обнаружено достоверное снижение индуцированной Ж>У продукции ГРЫ-а, ТЫР-а, 11,-6 МНПК, а у больных с выраженностью портального воспаления 4 балла показана тенденция к повышению спонтанной продукции 1Ь-1р МНПК по сравнению с контрольной группой (таблица 4)

Таблица4

Выявленные изменения концентрации цитокинов периферической крови в сопоставлении с выраженностью портального воспаления

ПОРТАЛЬНОЕ ВОСПАЛЕНИЕ

3 балла 4 балла контроль

^инд NDVIFN-a* Медиана 28 мин макс 0115 ixOOl Î спонт IL-1p инд NDVIFN-a Медиана 3100 мин ма«с 1000 3600

| инд NDV TNF-a* Медиана <{0 тншкс 0654 р<0 01 инд NDV TNF-a Медиана 1600 мин макс 1000.2000

| инд NDV IL-6 * Медиана 12 мин макс 0230 р<0,01 инд NDVIL-6 Медиана 750 иикм «с 700800

Примечание *- достоверное различие с группой здоровых доноров (р<0,01)

Следующим показателем, не входящим в состав интегративного индекса гистологической акшвности, но огображающим морфологические изменения печени, является фиброз, выраженный в баллах от 0 до 3 У больных с отсутствием фиброза и с выраженностью фиброза 1 балл не было выявлено статистически значимых отличий концентрации 1Ш-а, 1ЕЫ-у, ЮТ-а, 1Ь-1Р, 1Ь-4, 1Ь-6 в сыворотке крови, при спонтанной и стимулированной продукции МНГДС по сравнению со здоровыми донорами При выраженности фиброза 2 балла установлено достоверное снижение индуцированной ЫБУ продукции ШЫ-а, ТЫР-а, 1Ь-6 МНПК, а также выявлена явная тенденция к увеличению концентрации ЮТ-а, 1Ь-4 в сыворотке крови по сравнению с группой контроля В группе больных 3 балла фиброза определено статистически значимое снижение индуцированной ЫБУ продукции 1Ш-а, ЮТ-а МНПК и установлена тенденция к повышению спонтанной продукции 1Ь-1р МНПК по сравнению со здоровыми донорами (таблица 5)

Таблица5

Выявленные изменения концентрации цитокинов периферической крови в сопоставлении с выраженностью фиброза

ФИБРОЗ

2 балла 3 балла контроль

1 инд NDV IFN-a * Медиана 45 мин макс 4146 р<0 01 J инд. NDV IFN-a * Медиана 45 р<0 0| инд NDV IFN-a Мвдиана 3100 мин иакс 1000 3500

1 инд NDV TNF-a* Медиана 3Q мин маке 2535 1*0 01 | инд NDV TNF-a* Медиана 175 мичмакс 15 697 pO.OI ИНД NDV TNF-a Медиана 1600 мин макс 1000 2000

1 ИНД NDV IL-6 * Медиана 52 минчане 4556 р<0 01 t сыв TNF-a Т сыв IL-4 fcnoHT IL-lp ИНД NDV IL-6 Медиана 75Q мин макс 700 800

Примечание *- достоверное различие с группой здоровых доноров (р<0,01)

В целом, анализируя концентрацию исследуемых цитокинов у больных ХГВ и ХГС установлено, что статистически значимые отличия от здоровых доноров выявлены только в отношении индуцированной NDV и ФГА продукции цитокинов МНПК У больных с минимальными морфологическими изменениями в печени определено достоверное снижение индуцированной NDV продукции IFN-a, а в группе больных с выраженными морфологическими изменениями печени установлено статистически значимое снижение индуцированной NDV продукции целого ряда цитокинов IFN-a, IFN-y, TNF-a, IL-6 и индуцированной ФГА продукции TNF-a МНПК по сравнению со здоровыми донорами Несмотря на отсутствие достоверных отличий, обнаружены тенденции к увеличению концентрации IL-4, IL-6, TNF-a в сыворотке крови и спонтанной продукции TNF-a, IL-ip, IL-6 МНПК у больных с выраженными морфологическими изменениями в ткани печени по сравнению с группой контроля

В настоящее время установлено, что колебания концентрации цитокинов в сыворотке крови до уровня 50 пг/мл находятся в пределах физиологических значений и не могут рассматриваться как повышение по сравнению со здоровыми донорами (Тугуз А Р, 2001, Abayli В, 2003, Guida М, 2007) Время циркуляции свободных цитокинов в системном кровотоке

колеблется от десятков минут до нескольких часов, кроме того, цитокины могут присутствовать в крови больных в "скрытых" комплексах, неопределяемых ИФА, при этом в связанном состоянии цитокины не инактивированы, а нековалентный характер связывания с рецепторами обеспечивает возможность диссоциации цитокинов, что может сопровождаться повторным увеличением их концентрации в сыворотке крови (Тугуз АР и соавт, 2001,2002) Низкие уровни цитокинов могут быть обусловлены высоким содержанием растворимых рецепторов к этим цитокинам, так как уровень свободных рецепторов превышает концентрацию цитокинов в сыворотке крови в десятки - сотни раз (Тугуз А Р и соавт , 2002, Barash J et al, 2003, Chodorowska G et al, 2003, Fulop AK, 2001) Таким образом, определяемый методом ИФА уровень цитокинов в сыворотке крови не отражает истинную концентрацию цитокинов в сыворотке крови По нашему мнению, у больных ХГВ и ХГС диагностическое значение имеет не только определение концентрации свободных цитокинов в сыворотке крови, а установление функциональных резервов МНПК вырабатывать цитокины в ответ на стимуляцию (Тугуз А Р , 2002, Dong Y, 2004, Gramenzi А, 2005, Sanh М, 2000, Tajimi М, 2006) Достоверное снижение индуцированной NDV продукции ряда цитокинов (IFN-a, IFN-y, TNF-a, IL-6) МНПК у больных как с минимальными, так и с выраженными морфологическими изменениями в печени подтверждает суждение о хроническом вирусном гепатите как об иммунокомпрометированном состоянии и отражает снижение функциональной способности МНПК вырабатывать цитокины в ответ на вирусную инфекцию (Fan X, 2000, Falasca К, 2006, Gramenzi А, 2005, Hyodo N, 2003, Malaguarnera M, 1997, McClary H, 2000, Streetz KL, 2001) Уменьшение продукции IFN-a приводит к нарушению противовирусной защиты организма, что способствует длительной персистенции вируса и хронизации гепатита (Torre F, 2004, Trobonjaca Z, 2001) Установленное нами снижение способности МНПК вырабатывать TNFa в ответ на стимуляцию ФГА у больных хроническими

вирусными гепатитами с высокой гистологической активностью свидетельствует о неполноценности клеточного звена иммунитета, что приводит к нарушению активации цитотоксических лимфоцитов и реализации апоптотической гибели клеток, в первую очередь вирусинфицированных (Хаитов Р М , 2001, Буеверов А О и соавт, 2000, Ataseven Н , 2006, Сесеге А, 2004, Jia HY, 2002)

Анализируя относительное содержание субпопуляций лимфоцитов периферической крови и иммунорегуляторный индекс у больных ХГВ и ХГС в сопоставлении с выраженностью морфологических изменений в печени, статистически значимые отличия по сравнению со здоровыми донорами выявлены только в отношении иммунорегуляторного индекса у больных с высокой активностью гепатита (ш=1,2, от 0,9 до 1,2) и в группе больных с выраженностью перипортальных некрозов 5 баллов (т=1,1, от 0,7 до 1,2) по сравнению с группой коптроля (m=l,75, от 1,2 до 2,3), при этом во всех группах больных определена тенденция к снижению иммунорегуляторного индекса, что является отражением состояния иммунодефицита Несмотря на отсутствие статистически значимых отличий, во всех группах больных выявлена тенденция к снижению содержания лимфоцитов, экспрессирующих маркеры CD16+ (натуральные киллеры) и CD4+ (Т-хелперы), что свидетельствует о недостаточности клеточного звена иммунитета, как врожденного, так и приобретенного и может способствовать длительной персистенции вирусов и хронизации вирусных гепатитов (Ивашкин В Г, 2001, Курамшин ДХ, 2002, Никитин В Ю, 2004, Ющук НД, 2005, Abo Т, 2000, Jacobson Brown РМ, 2001, Chang KM, 2001) Нарушение процессов активации и пролиферации Т- и В- лимфоцитов у большинства больных находит отражение в снижении содержания лимфоцитов, несущих маркер CD38 по сравнению со здоровыми донорами

Наиболее выраженные изменения выявлены при высоком уровне активности гепатита, когда наблюдается не только снижение субпопуляций

лимфоцитов, отвечающих за развитие клеточного иммунного ответа (СОЗ+, СБ4+, СБ 16+ лимфоцитов) и иммунорегуляторного индекса, но и снижение содержания лимфоцитов СБ20+, отвечающих за развитие гуморального иммунитета, а также снижается содержание активационных молекул СБ38+ и молекул антигенной презентации НЬА1Ж+ Снижение НЬА1Ж+ лимфоцитов может приводить к нарушению представления антигена, что в конечном итоге препятствует развитию приобретенных иммунных реакций (Змушко Е И, 2001, Ивашкин В Г, 2001, Курамшин ДХ, 2002, Собчак ДМ, 2004) У больных ХГВ и ХГС при максимальной выраженности портального воспаления в печени увеличивается количество В-лимфоцитов периферической крови (СБ20+) и лимфоцитов, экспрессирующих активационные молекулы СБ25, СБ38, НЬА011, что рассматривается как проявление системного иммунного ответа на фоне местной иммунной реакции в виде лимфоидной инфильтрации ткани печени

Следовательно, нами установлено нарушение врожденного и приобретенного звена клеточного иммунного ответа у больных ХГВ и ХГС Достоверное снижение иммунорегуляторного индекса является важнейшим показателем, свидетельствующим о состоянии иммунодефицита у больных ХГВ и ХГС, что находит отражение в снижении резервных функциональных способностей МНПК вырабатывать цитокины в ответ на стимуляцию

Напряжение местных реакций иммунной системы у больных хроническими вирусными гепатитами проявляется в виде гиперплазии лимфоидной ткани в паренхиме печени (Апросина 3 Г ,1995, Дмитреева Е В , 2003, Покровский В И , 2003, Сесеге А, 2004)

В результате проведенных нами исследований установлено, что лейкоцитарные инфильтраты печени у больных ХГВ и ХГС представлены преимущественно лимфоидными клетками, среди которых большая часть активированных лимфоцитов Выраженность лимфоидной инфильтрации определяет гистологическую активность На начальных этапах заболевания

происходит инфильтрация соединительной ткани лейкоцитами в области портальных трактов, а при умеренной и высокой активности гепатита инфильтрация распространяется внутрь измененных печеночных долек У больных хроническим вирусным гепатитом С лейкоцитарная инфильтрация выражена больше и распространяется внутрь долек уже на ранних этапах развития инфекционного процесса по сравнению с больными хроническим вирусным гепатитом В

При изучении фенотипа клеток лейкоцитарных инфильтратов печени больных хроническими вирусными гепатитами В и С методом иммуноцитохимии и иммуногистохимии обнаружены субпопуляции лимфоцитов, обладающих цитотоксичностью в отношении вирусинфицированных гепатоцитов Эти клетки представлены субпопуляциями лимфоцитов, являющимися эффекторами врожденного (NK-клетки CD16+CD56+, NKT-клетки CD3+CD16+CD56+) и приобретенного (CTL CD8+) иммунитета, что может свидетельствовать об участии как специфического, так и неспецифического звеньев иммунитета в элиминации вирустрансформированных клеток печени Известно, что цитотоксические клетки вызывают некроз и апоптоз инфицированных гепатоцитов, затем на месте разрушенных клеток печени развивается соединительная ткань (Дмитреева Е В , 2003, Покровский В И, 2003, Змушко Е И , 2001, Сесеге А, 2004) Этим объясняется совпадение локализации и выраженности развития соединительной ткани с областью лейкоцитарной инфильтрации в гепатобиоптатах у больных ХГВ и ХГС Наряду с этим в лейкоцитарных инфильтратах мы выявили участки, представленные Трег лимфоцитами CD4/CD25 Эта субпопуляция лимфоцитов формируется в ответ на избьп очную секрецию IL-2, оказывает супрессивное действие на CTL и NK Первоначально в результате продукции IL-2 активированными лимфоцитами происходит активация цитотоксических клеток CTL и NK, но избыточная продукция IL-2 приводит к формированию субпопуляции Т per лимфоцитов, оказывающих

супрессивное влияние на эффекторы врожденного и приобретенного иммунитета Очевидно, с субпопуляцией Трег лимфоцитов может быть связано нарушение элиминации вируса, хронизация при вирусных гепатитах В и С

В целом, лейкоцитарные инфильтраты печени у больных хроническими вирусными гепатитами В и С представлены преимущественно следующими субпопуляциями лимфоцитов Т-лимфоциты (CD3+), NKT-клетки (CD3+CD16+CD56+), NK-клетки (CD16+CD56+), Т per лимфоциты (CD4+CD25+), цитотксические лимфоциты (CD8+)

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что изучение выраженности, распространенности и субпопуляционного состава лейкоцитарных инфильтратов печени у больных ХГВ и ХГС имеет важное значение для оценки активности, прогноза течения хронического гепатита и выбора тактики лечения

Выводы.

1 Установлено отсутствие статистически значимых отличий концентрации IFN-a, IFN-y, TNF-a, IL-ip, IL-4, IL-6 в сыворотке крови у больных хроническими вирусными гепатитами В и С по сравнению со здоровыми донорами, тк методом ИФА определяют только уровень свободных цитокинов, не соответствующий их реальной концентрации в сыворотке крови

2 Установлено достоверное снижение стимулированной NDV и ФГА продукции ряда цитокинов (IFN-a, IFN-y, TNF-a, IL-6) МНПК у больных как с минимальной активностью гепатита, так и с высокой степенью гистологической активности, что отражает состояние иммунодефицита при ХГВ и ХГС

3 Изучение субпопуляций лимфоцитов CD3, CD4, CD8, CD16, CD25, HLADR, CD20, CD38 периферической крови у больных хроническими вирусными гепатитами В и С не выявило статистически значимых отличии от здоровых доноров

4 У больных хроническими вирусными гепатитами В и С с выраженными морфологическими изменениями в печени определено статистически значимое снижение иммунорегуляторного индекса по сравнению с группой контроля

5 Выраженность и распространенность лейкоцитарной инфильтрации печени при хронических вирусных гепатитах более выражена при высокой гистологической активности

6 У больных хроническим вирусным гепатитом С лейкоцитарная инфильтрация более выражена и раньше распространяется внутрь печеночной дольки, чем при хроническом вирусном гепатите В

7 Расположение участков соединительной ткани совпадает с конфигурацией области лейкоцитарной инфильтрации в печени у больных хроническими вирусными гепатитами

8. Лейкоцитарные инфильтраты в основном состоят из активированных лимфоцитов, субпопуляционный состав которых представлен Т-лимфоцитами, цитотоксическими лимфоцитами, Т per лимфоцитами, NK-клетками, NKT-клетками

9 Для оценки активности инфекционного процесса и назначения адекватной терапии необходимо комплексное обследование больных ХГВ и ХГС с определением стимулированной NDV и ФГА продукции цитокинов МНПК, иммунорегуляторного индекса и характера лейкоцитарной инфильтрации печени с определением фенотипа клеток, составляющих инфильтрацию

Практические рекомендации. Выявленные изменения цитокинового профиля и иммунного статуса, а также изучение лимфоидной инфильтрации печени позволяет рекомендовать комплексное обследование больных хроническими вирусными гепатитами В и С с определением стимулированной NDV и ФГА продукции цитокинов МНПК, вычисление показателей иммунорегуляторного индекса, а также

морфологическое исследование гепатобиоптатов с определением выраженности, распространенности лейкоцитарных инфильтратов и установлением их субпопуляционного состава для оценки активности патологического процесса и проведения адекватной терапии

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1 Умбетова К Т, Алленов М Н, Свиридова М Б, Иванова И В, Волчкова Е В , Лазарева А С Динамика аутоантител при острых вирусных гепатитах // Материалы научно-практической конференции, посвященной 35-летию лечебного факультета МГМСУ - Москва 2004г - с 322

2 Лазарева А С, Умбетова К Т. Уровень цитокинов у больных хроническим вирусным гепатитом С // Материалы VI Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» - Москва 2005г- с 277

3 Умбетова К Т, Волчкова Е В, Киселевский М В, Чжан М Ю, Петрова Е В , Лазарева А С Цитокиновый профиль у больных хроническими вирусными гепатитами // Материалы VI Всероссийской научно-практической конференции « Вирусные гепатиты- проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики» - Москва 2005г-с 424

4 Лазарева А С, Чжан М Ю, Умбетова К Т, Петрова Е В, Волчкова Е В , Аллепов М Н, Верескунова Н В , Пак С Г, Киселевский М В Особенности иммунного статуса и цитокинового профиля у больных вирусными гепатитами В и С // Военно-медицинский журнал - 2006г, том 327-№3- с 66-67

5 Умбетова К Т, Лазарева А С , Пархоменко Ю Г, Волчкова £ В Цитокиновый профиль в сыворотке крови и резервные возможности мононуклеаров периферической крови у больных хроническими вирусными гепатитами различной этиологии // Медицинский журнал Западного Казахстана - 2007г - 3(15)- с 26-34

Парентеральные вирусные гепатиты, среди которых доминирующее I место занимают гепатиты В и С, - одна из наиболее серьезных и актуальных проблем здравоохранения во всем мире. Заболевания распространены повсеместно и по данным ВОЗ в мире насчитывается около 400 млн. и 170 млн. инфицированных вирусом гепатита В и С соответственно. Прогрессирование в хронический гепатит может наблюдаться более чем у 60% больных острым гепатитом Сиу 10% больных острым гепатитом В. Эти инфекции являются доминирующими в развитии хронических заболеваний печени, включая цирроз и гепатокарциному[1,14,25,29,35,112].

Ключевую роль в патогенезе нарушения элиминации вируса и хронизации при вирусных гепатитах играют изменение состава и нарушение функции иммунокомпетентных клеток, что приводит к развитию иммуносупрессорных и иммунопатологических реакций. Основой развития иммунокомплексных реакций являются нарушения цитокинового статуса, поскольку именно цитокины принимают непосредственное участие в развитии воспаления, иммунного ответа и регенерации печени [17,20,28,59,92,132]. Известно, что цитокины осуществляют регуляцию межклеточных взаимодействий, но в ряде случаев выходят за рамки чисто медиаторных функций и, приобретая системный характер, запускают каскад патологических реакций [17, 23,145,148]. Таким образом, дефекты цитокиновой сети отражаются на эффективности противоинфекционного иммунитета. Нарушение баланса Thl/Th2 цитокиновой продукции и является одним из механизмов неадекватного иммунного ответа, играющего ключевую роль в развитии и прогрессировании заболевания [37,47,61,67,78,96]. Нарушения продукции медиаторов ведут к дефектам Т- лимфоцитов, фагоцитирующих клеток и NK, которые отвечают за гибель вирусинфицированных гепатоцитов при хронических вирусных гепатитах В и С.

Напряжение местных реакций иммунной системы проявляется в виде гиперплазии лимфоидной ткани в ткани печени. Показана четкая корреляция между тяжестью течения процесса и выраженностью лимфоцитарной инфильтрации. Вслед за развитием воспалительного процесса в печени наблюдаются дистрофические и дегенеративные процессы, некроз гепатоцитов, а затем коллагенизация стромы на месте гибели участков паренхимы и в стенках сосудов [2,14,19,25,35,49].

Иммунная система печени включает в себя большинство компонентов врожденной иммунной системы (натуральные киллеры (NK), натуральные киллеры-Т-клетки (NKT-клетки), дендритные клетки, макрофаги и др.) и эффекторы специфического иммунитета (Т-клетки) [35,42,56,]. Взаимодействие Купферовских (или дендритных) клеток, NK, NKT, CD8 Т- клеток между собой обеспечивают развитие адекватного иммунного ответа на вирусную инфекцию [39,55,84,90].

В экспериментальных работах по изучению противоопухолевого иммунитета получены новые сведения о субпопуляционном составе иммунных клеток в печени. Была выявлена особая субпопуляция Т-клеток - Т-регуляторные клетки CD4+CD25+ (Т per.), которые проявляют гипопролиферативную способность, обладают способностью угнетать активацию и ингибировать секрецию цитокинов CD4+CD25~ Т-хелперами и CD8+, таким образом препятствуя развитию реакций, направленных на элиминацию чужеродного антигена [45,64,146]. Данные о роли Т per. лимфоцитов печени при хронических вирусных гепатитах весьма малочисленны.

В связи с этим, актуальным представляется поиск механизмов, способствующих развитию и поддержанию длительной персистенции и хронизации при вирусных гепатитах. Представляет интерес провести комплексное обследование больных хроническим вирусным гепатитом В и С с определением цитокинового профиля не только в сыворотке крови, но и изучить спонтанную и индуцированную продукцию цитокинов МНПК, изучить показатели иммунного статуса в сопоставлении с выраженностью показателей гистологической активности и фиброза, а также установить фенотип иммунных клеток печени для определения роли этих показателей в хронизации вирусных гепатитов и возможности коррекции их нарушений.

Цель работы.

Изучить особенности цитокинового профиля, субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови и лейкоцитарной инфильтрации печени в сопоставлении с морфологическими изменениями в печени у больных хроническими вирусными гепатитами В и С.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

Задачи исследования.

1. Изучить концентрацию цитокинов IFN-a, IFN-y, TNF-a, IL-1(3, IL-4, IL-6 в сыворотке крови у больных хроническими вирусными гепатитами В и С в сопоставлении с показателями гистологической активности и фиброза.

2. Изучить спонтанную продукцию цитокинов IFN-a, IFN-y, TNF-a, IL-ip, IL-4, IL-6 МНПК у больных ХГВ и ХГС с различными показателями гистологической активности и фиброза.

3. Изучить индуцированную NDV и ФГА продукцию цитокинов IFN-a, IFN-y, TNF-a, IL-1J3, IL-4, IL-6 МНПК у больных ХГВ и ХГС с различной активностью гепатита и выраженностью фиброза.

4. Определить субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови в сопоставлении с уровнем гистологической активности и фиброза у больных хроническими вирусными гепатитами В и С.

5. Оценить морфологические изменения с определением гистологической активности и фиброза в ткани печени у больных ХГВ и ХГС по данным пункционной биопсии печени.

6. Исследовать особенности лейкоцитарной инфильтрации печени у больных хроническими вирусными гепатитами В и С в сопоставлении с активностью гепатита и выраженностью фиброза.

7. Определить фенотип печень-ассоциированных лимфоцитов иммуногистохимическим и иммуноцитохимическим методом у больных ХГВ и ХГС.

Научная новизна.

У больных хроническими вирусными гепатитами В и С получены новые данные о стимулированной NDV и ФГА продукции цитокинов МНПК при различной активности гепатита и выраженности фиброза. В группе больных с выраженными морфологическими изменениями в печени определено достоверное угнетение способности МНПК продуцировать ряд цитокинов (IFN-a, IFN-y, TNF-a, IL-6) при стимуляции их NDV и ФГА.

Установлено отсутствие статистически значимых отличий концентрации цитокинов IFN-a, IFN-y, TNF-a, IL-lp, IL-4, IL-6 в сыворотке крови у больных хроническими вирусными гепатитами по сравнению со здоровыми донорами, что подтверждает необходимость изучения стимулированной продукции цитокинов для оценки цитокинового профиля.

Выявлено статистически значимое снижение иммунорегуляторного индекса у больных с высокой гистологической активностью и выраженными морфологическими изменениями в печени.

Установлено отсутствие статистически значимых отличий содержания субпопуляций CD3, CD4, CD8, CD 16, CD25, HLADR, CD20, CD38 лимфоцитов периферической крови у больных хроническими вирусными гепатитами по сравнению со здоровыми донорами.

У больных хроническими вирусными гепатитами В и С сопоставлен характер и интенсивность лейкоцитарной инфильтрации с активностью патологического процесса в печени. Установлено, что у больных хроническим вирусным гепатитом С лейкоцитарная инфильтрация выражена больше и распространяется внутрь долек уже на ранних этапах развития инфекционного процесса по сравнению с больными-хроническим вирусным гепатитом В.

Впервые расшифрован фенотип иммунных клеток лейкоцитарных инфильтратов паренхимы печени у больных ХГВ и ХГС, выявлены популяции Т- лимфоцитов CD3+, цитоксических лимфоцитов CD8+, Т per. лимфоцитов CD4+CD25+, NK- клеток CD16+CD56+, NKT-клеток CD3+CD16+CD56+.

Апробация работы и внедрение в практику.

Работа выполнена на кафедре инфекционных болезней Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова (зав. кафедрой, член-корр. РАМН, профессор С.Г. Пак).

Тема диссертационной работы является фрагментом комплексной темы кафедры «Интоксикация при бактериальных и вирусных инфекциях: патогенез и механизмы адаптации» № 01200110439. Рекомендации, полученные в результате исследования, внедрены в практику на кафедре инфекционных болезней ММА имени И.М. Сеченова и 2-й клинической инфекционной больницы г. Москвы.

Все основные положения диссертации опубликованы в открытой печати. Работа апробирована на заседании кафедры инфекционных болезней ММА имени И.М. Сеченова, лаборатории по изучению токсических и септических состояний кафедры инфекционных болезней 22 ноября 2007г.

Практическая значимость.

Для адекватной оценки активности инфекционного процесса необходимо проводить комплексное обследование больных хроническими вирусными гепатитами В и С, включающее в себя определение концентрации цитокинов не только в сыворотке крови, но и изучение стимулированной NDV и ФГА продукции цитокинов МНПК, а также вычисление показателей иммунорегуляторного индекса.

При морфологическом исследовании гепатобиоптатов у больных хроническими вирусными гепатитами В и С необходимо определять не только гистологическую активность и выраженность фиброза, но и оценивать выраженность, распространенность и субпопуляционный состав лейкоцитарных инфильтратов печени.

Только совокупность полученных данных позволяет выбрать правильную тактику и провести адекватную терапию у больных ХГВ и ХГС.

Выводы.

1. Установлено отсутствие статистически значимых отличий концентрации IFN-a, IFN-y, TNF-a, IL-ip, IL-4, IL-6 в сыворотке крови у больных хроническими вирусными гепатитами В и С по сравнению со здоровыми донорами, т.к. методом ИФА определяют только уровень свободных цитокинов, не соответствующий их реальной концентрации в сыворотке крови.

2. Установлено достоверное снижение стимулированной NDV и ФГА продукции ряда цитокинов (IFN-a, IFN-y, TNF-a, IL-6) МНПК у больных как с минимальной активностью гепатита, так и с высокой степенью гистологической активности, что отражает состояние иммунодефицита при ХГВ и ХГС.

3. Изучение субпопуляций лимфоцитов CD3, CD4, CD8, CD 16, CD25, HLADR, CD20, CD38 периферической крови у больных хроническими вирусными гепатитами В и С не выявило статистически значимых отличий от здоровых доноров.

4. У больных хроническими вирусными гепатитами В и С с выраженными морфологическими изменениями в печени определено статистически значимое снижение иммунорегуляторного индекса по сравнению с группой контроля.

5. Выраженность и распространенность лейкоцитарной инфильтрации печени при хронических вирусных гепатитах более выражена при высокой гистологической активности.

6. У больных хроническим вирусным гепатитом С лейкоцитарная инфильтрация более выражена и раньше распространяется внутрь печеночной дольки, чем при хроническом вирусном гепатите В.

7. Расположение участков соединительной ткани совпадает с конфигурацией области лейкоцитарной инфильтрации в печени у больных хроническими вирусными гепатитами.

8. Лейкоцитарные инфильтраты в основном состоят из активированных лимфоцитов, субпопуляционный состав которых представлен Т-лимфоцитами, цитотоксическими лимфоцитами, Т per. лимфоцитами, NK-клетками, NKT-клетками.

9. Для оценки активности инфекционного процесса и назначения адекватной терапии необходимо комплексное обследование больных ХГВ и ХГС с определением стимулированной NDV и ФГА продукции цитокинов МНПК, иммунорегуляторного индекса и характера лейкоцитарной инфильтрации печени с определением фенотипа клеток, составляющих инфильтрацию.

Практические рекомендации.

Выявленные изменения цитокинового профиля и иммунного статуса, а также изучение лимфоидной инфильтрации печени позволяет рекомендовать комплексное обследование больных хроническими вирусными гепатитами В и С с определением стимулированной NDV и ФГА продукции цитокинов МНПК, вычисление показателей иммунорегуляторного индекса, а также морфологическое исследование гепатобиоптатов с определением выраженности, распространенности лейкоцитарных инфильтратов и установлением их субпопуляционного состава для оценки активности патологического процесса и проведения адекватной терапии.