Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Уровень активных форм кислорода в венозной крови у пациентов с обструктивными заболеваними легких как критерий эффективности проводимой фармакотерапии

На правах рукописи

НОВИКОВ Алексей Кириллович

УРОВЕНЬ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В ВЕНОЗНОЙ КРОВИ У ПАЦИЕНТОВ С ОБСТРУКТИВНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ ЛЕГКИХ КАК КРИТЕРИЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОВОДИМОЙ ФАРМАКОТЕРАПИИ

14.00.25-фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА 2009

003460589

Работа выполнена в ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Росздравнадзора

Научные руководители:

- академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Кукес Владимир Григорьевич

- доктор биологических наук, профессор Воейков Владимир Леонидович

Официальные оппоненты:

- доктор медицинских наук, профессор Блинков Иосиф Львович

- доктор медицинских наук, профессор Сюч Наталия Иосифовна

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Рязанский Государственный М е д и ц и 11 с к и I и п ере и т с т

Защита диссертации состоится «_^609 г на заседании

Диссертационного Совета Д 208.040.13 при ГОУ ВПО Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова Росздрава(119991, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2.)

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке ММА им. И.М. Сеченова по адресу: 117998, Москва, Нахимовский проспект, д. 49.

А,_й/

Автореферат разослан «/~7»__2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208.040.13 д.м.н. Архипов Владимир Владимирович:

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Бронхиальная астма (БА) и хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) относятся к наиболее распространенным обструктивным заболеваниям легких. В последние десятилетия отмечается тенденция к росту количества больных, страдающих этими заболеваниями. В общей популяции распространенность ХОБЛ составляет 10 - 15%, а БА 5 -7% [Авдеев С.Н., 2003; Чучалин А.Г., 2004; GINA, 2006].

Ведущими патогенетическими факторами в развитии этих заболеваний выступают гипоксия и воспаление [Федосеев Г.Б., 1998; Agusti A.G.N., 2005]. И при БА, и при ХОБЛ, в условиях гипоксии и воспаления, различные клетки участвуют в генерации свободных радикалов и, в первую очередь, активных форм кислорода (АФК) [Ракита Д.Р., 1999; Болевич С.Б., 2006; Mathur S.K. et al., 2008].

К АФК относятся высокореакционные химические частицы, возникающие в результате последовательного одноэлектронного восстановления молекулы кислорода и представляющие собой свободные радикалы (02~Н02», НО», NO», ROO*), а также молекулы, способные легко продуцировать свободные радикалы ('02, 03, ONOOH, НОС1, Н202, ROOH, ROOR) [Halliwell В., 1991; Воейков В.Л., 2003; Новиков К.Н., 2004].

Исключительно важно, что АФК в патологии образуются особенно интенсивно при исходной гипоксии с эпизодами реоксигенации, зависимой от течения заболевания и фармакологической коррекции [Меерсон Ф.З., 1984]. Среди эффективных способов коррекции избыточного уровня АФК широко распространено применение антирадикальных средств (дибунол), антиоксидантов непрямого действия (глутатион) и антигипоксантов (мексидол, гипоксен) [Блинков И.Л., 2007; Кукес В.Г., 2004; Харкевич Д.А., 1999].

Свободно-радикальные процессы с участием АФК подробно изучались у пациентов с БА, а в последние годы было уделено внимание изучению прооксидантно-антиоксидантнтого статуса у пациентов с ХОБЛ [Болевич

С.Б. и др., 1995; Болевич С.Б., 2006; Даниляк И.Г. и др., 1993; Даниляк И.Г. и др., 1995; Максимова A.B. и др., 2005; Ракита Д.Р., 1999].

С помощью метода люминолзависимой хемилюминесценции (XJ1) было установлено, что у больных бронхиальной астмой базальный и стимулированный показатели генерации АФК альвеолярными макрофагами достоверно выше, чем в контроле. Таким образом, по количеству АФК, продуцируемых альвеолярными макрофагами, можно судить о степени и характере воспалительного процесса, протекающего в бронхолегочной системе [Болевич С.Б. и др., 1995; Даниляк И.Г. и др., 1993; Даниляк И.Г. и др., 1995].

В последние годы был предложен способ дифференциальной диагностики хронических обструктивных заболеваний легких, который позволяет провести точную диагностику между БА и ХОБЛ на основании различной степени хемилюминесцентной активности фагоцитирующих клеток бронхиального дерева (исследовали бронхиальные смывы), а в дальнейшем корректировать назначенную терапию в соответствии с установленным диагнозом [Максимова A.B. и др., 2005].

Однако, применение вышеописанных методов в повседневной клинической практике может быть ограничено, поскольку метод оценки функциональной активности альвеолярных макрофагов включает процедуру выделения чистой фракции исследуемых клеток, что является достаточно трудоемким и затратным процессом. Определение различной степени хемилюминесцентной активности фагоцитирующих клеток бронхиального дерева связано с различными неблагоприятными факторами, возникающими на этапе забора материала для исследования (не всегда возможно пациентам с обструктивными заболеваниями легких адекватно провести лаваж бронхиального дерева из-за имеющихся противопоказаний к его проведению или опасности развития осложнений).

С другой стороны известен метод анализа АФК в цельной неразведенной венозной крови больных с ишемической болезнью сердца для

объективной оценки эффективности низкоинтенсивной внутривенной лазеротерапии [Воейков В.Л. и др., 1998].

Актуальной представляется проблема анализа уровня АФК в цельной неразведенной венозной крови пациентов с БА и ХОБЛ методом ХЛ на фоне стандартной фармакотерапии и комплексной фармакотерапии с включением антигипоксанта гипоксена с целью определения значения этого анализа в оценке эффективности проводимого лечения и для дифференциальной диагностики данных заболеваний с учетом результатов исследования функции внешнего дыхания (ФВД) и сатурации кислорода (8а02) у этих больных. Данный метод исследования является быстрым и простым в техническом исполнении лабораторным тестом, не требующим серьезных затрат и не влияющим на состояние исследуемого пациента или здорового лица. Он также достаточно достоверен, поскольку в качестве объекта исследования выступает цельная неразведенная венозная кровь. Цель исследования. Определить значение исследования в динамике уровня АФК в цельной неразведенной венозной крови больных с обструктивными заболеваниями легких - БА и ХОБЛ в оценке эффективности проводимой фармакотерапии. Задачи исследования:

1. Изучить уровень АФК в крови здоровых лиц.

2. Изучить уровень АФК в крови больных БА и ХОБЛ в остром периоде заболеваний, после проведения стандартной фармакотерапии и фармакотерапии с включением гипоксена.

3. Изучить динамику объема форсированного выдоха за 1 с (ОФВ1), 8а02, клинической симптоматики у больных БА и ХОБЛ на фоне стандартной фармакотерапии и фармакотерапии с включением гипоксена.

4. Провести сравнительный анализ результатов динамики ОФВ1, уровня АФК в крови пациентов с БА и ХОБЛ и клинической симптоматики на фоне стандартной фармакотерапии и фармакотерапии с включением гипоксена.

Научная новизна. Впервые изучен уровень АФК в цельной венозной крови пациентов с наиболее распространенными обструктивными заболеваниями легких - БА и ХОБЛ, находящихся на стационарном лечении, в зависимости от степени тяжести их состояния и на фоне проводимой фармакотерапии. Показано, что уровень АФК в цельной крови пациентов с БА и ХОБЛ достоверно превышает уровень АФК в крови здоровых лиц.

Выявлено диагностическое значение исследования в динамике уровня АФК крови больных с обструктивными заболеваниями легких с использованием различных хемилюминесцентных зондов - нозологически достоверно разделены между собой больные с БА и ХОБЛ в фазе обострения. Показано, что изучение уровня АФК в крови больных с БА и ХОБЛ в динамике курсового лечения может быть использовано для достоверного прогноза степени риска обострения.

Впервые выявлено, что изучение уровня АФК в крови больных БА и ХОБЛ, с применением дискриминантного анализа (ДА) в качестве статистического метода обработки результатов исследования, может быть использовано в оценке эффективности проводимой фармакотерапии. Проведен сравнительный анализ результатов изучения в динамике уровня АФК и показателей ФВД (ОФВ1), БаО^. Показано отсутствие корреляции между уровнем АФК и ОФВ1 у всех испытуемых пациентов на фоне проводимой терапии. Доказано, что исследование динамики уровня АФК в крови больных БА и ХОБЛ в совокупности с ОФВ1 позволяет повысить достоверность оценки эффективности проводимой фармакотерапии по сравнению с исследованием только уровня АФК в крови у этих больных.

Впервые метод ХЛ цельной венозной неразведенной крови был применен для оценки эффективности лекарственного средства (ЛС) антигипоксантного типа гипоксена в составе комплексной фармакотерапии больных с БА и ХОБЛ.

Практическая значимость. Для адекватной диагностики и оценки эффективности фармакотерапии БА и ХОБЛ показана важность анализа

уровня АФК в крови больных методом ХЛ цельной венозной неразведенной крови (с использованием ХЛ - зондов (люминола (ЛМ), люцигенина (ЛГ)) и активатора «окислительного взрыва» («ОВ») зимозана (ЗМ).

Показано повышение эффективности стандартной фармакотерапии за счет применения ЛС со свойствами антигипоксантов (гипоксен).

Определение АФК в цельной венозной крови может быть использовано для уточнения диагноза БА и ХОБЛ, а также выбора рациональной фармакотерапии на начальном этапе лечения с последующим сравнением с полученной базой данных при помощи ДА. Положения, выносимые на защиту:

1. Ретроспективный дискриминантный статистический метод анализа динамики АФК в цельной неразведенной венозной крови больных БА и ХОБЛ оказался перспективной базой для дифференциальной диагностики БА и ХОБЛ в фазе обострения.

2. Незначительная положительная динамика исходных показателей резервных возможностей для развития «ОВ» (по данным ЛМ-зависимой ХЛ при добавлении ЗМ) под влиянием курсовой фармакотерапии прогнозирует высокий риск обострения в ближайшие недели.

3. Включение антигипоксанта гипоксена в комплексную фармакотерапию у больных ХОБЛ и БА отчетливо и статистически достоверно повышает 8а02 и снижает уровень АФК в крови.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 1 - в центральной печати.

Конкретное личное участие автора в получении результатов. Автор лично занимался сбором материала для диссертации: отбирал больных и здоровых лиц для участия в исследовании (всего 50 больных и 20 здоровых лиц); участвовал в отборе проб крови для проведения регистрации уровня АФК; проводил исследование уровня АФК у всех испытуемых пациентов и здоровых лиц методом ХЛ цельной крови; измерял сатурацию кислорода в артериальной крови методом пульсоксиметрии; проводил исследование ФВД.

g

Автором была выполнена статистическая обработка и анализ полученных результатов с помощью программных пакетов Microsoft ® (USA) - Microsoft office 2003 - Excel 2003; программ Statistica V. 6.0 и OriginPro-75 с применением основных методов параметрической и непараметрической статистики. Для интерпретации межгрупповых различий, классификации и анализа полученных результатов в исследуемой выборке пациентов применялся ДА, являющийся разделом многомерного статистического анализа. Статистическая достоверность оценивалась с помощью непараметрического критерия Уилкоксона с учетом различных уровней значимости а. Для корреляционного анализа использовался коэффициент корреляции Пирсона.

Апробация работы. Апробация работы проведена на Секции Ученого Совета №1 ФГУ «НЦ ЭСМП» Росздравнадзора 9 июня 2008 года. Результаты исследований были представлены в виде тезисов, устных и стендовых сообщений за период с 2006г. по 2008г. на российских и международных симпозиумах и конференциях: Научно-практическая конференция «Клинико-фармакологические подходы в оптимизации фармакотерапии» (Москва, 2006); Научно-практическая конференция, посвященная 140-летию 23 ГКБ им. «Медсантруд» (Москва, 2006); Международный симпозиум «Активные формы кислорода, азота и хлора в регуляции клеточных функций в норме и при патологии» (Гродно, Беларусь, 2006); Научно-практическая конференция «Рациональная фармакотерапия: теория и практика применения лекарств» (Москва, 2007); 8th Congress of the European Assosiation for Clinical Pharmacology and Therapeutics (Amsterdam (The Netherlands), 2007); Международная научная конференция «Лекарственные средства и биологически активные добавки» (Гродно, Беларусь, 2007); The 1-st International Online Medical Conference (May 10-11, 2008).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы,

материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов и практических рекомендаций, списка литературы, включающего 100 отечественных источников и 86 зарубежных источников, приложений. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 15 рисунками. Материалы и методы исследования. Исследование проводилось в отделе лекартсвенного мониторинга ИКФ ФГУ «НЦ ЭСМП» Росздравнадзора РФ с 2006 по 2008 г.г.

В исследование было включено 70 лиц: из них 30 пациентов со средней и тяжелой степенью тяжести БА, 20 пациентов с ХОБЛ средней и тяжелой степени и группа контроля - 20 практически здоровых лиц.

Критериями включения в исследование служили: диагноз БА или ХОБЛ в стадии обострения, подтвержденный на основании клинических, анамнестических данных, параметров ФВД [С1ЫА, 2006].

Группу контроля составили 20 практически здоровых лиц: преобладали лица женского пола (п = 16) - средний возраст составил 47±5,3 лет; средний возраст лиц мужского пола (п = 4) составил 56±4,1.

В группе больных с БА преобладали пациенты мужского пола в возрастной категории от 51 до 70 лет, средний возраст составил 57±2,5 лет. В группе больных с ХОБЛ преобладали пациенты мужского пола в возрастной категории от 51 до 70 лет, средний возраст составил 65,8±2,1 лет.

Всем пациентам проводилось общеклиническое обследование, включающее общий и биохимический анализы крови, анализ мочи, ЭКГ, рентгенологическое исследование легких, общеврачебное объективное обследование. Здоровым лицам проводилось общеврачебное объективное обследование и ФВД.

Эффективность терапии у всех исследуемых пациентов оценивали по ФВД (в частности ОФВ1), которая проводилась исходно в стадии обострения БА или ХОБЛ и на 7-10 сутки от начала проведения терапии, клиническим симптомам, которые оценивались по степени выраженности одышки и

хрипов (от 1 до 3 баллов) и величине частоты дыхательных движений (ЧДД) до и после лечения.

Для оценки эффективности и безопасности терапии у части пациентов (п = 15) использовали измерение БаОг. Сюда входила объединенная группа пациентов с БА (п = 8) и ХОБЛ (п = 7). Sa02 регистрировали у пациентов на фоне стандартной терапии в отсутствие гипоксена и повторно при возникновении очередного обострения, когда в комплексе со стандартной терапией назначался гипоксен.

Оценку уровня АФК у всех исследуемых пациентов и здоровых лиц проводили методом измерения интенсивности ХЛ неразведенной цельной венозной крови исходно, в период обострения и после проведенной фармакотерапии.

Лекарственная терапия: У больных, включенных в исследование, ингаляции ЛС проводились с помощью небулайзера Pulmo-Aide® 56501 (DeVílbiss Health Care Inc. USA) - через маску. Ингалирование стандартною объема-2,5 мл занимало 5 мин.

Бронхиальная астма (стандартная фармакотерапия). С помощью небулайзера использовались: Вентолин Небулы - раствор для ингаляций, содержащий 2,5 мг сальбутамола сульфата в 2,5 мл раствора (Glaxo Wellcome, UK) или Беродуал - раствор для небулайзерной терапии, содержащий фенотерола гидробромид 500 мкг (0,5 мг), ипратропия бромид 250 мкг (0,25 мг) в 1 мл раствора (Boehringer Ingelheim, Germany). Все исследуемые больные БА получали таблетированные метипред по 4 мг в таб. (Orion Pharma) в суточной дозе не более 24 мг/сут. или преднизолон по 5 мг в таб. (Gedeon Richter) в суточной дозе из расчета 0,5 мг/кг, но не более 60 мг/сут. Эуфиллин назначался в виде 2,4% раствора аминофиллина для инъекций по 10 мл в 1 ампуле (192 мг теофиллина в 10 мл раствора) (Мосхимфармпрепараты). Раствор эуфиллина вводился в виде ударной (из расчета 5,6 мг/кг в течение первых 20 мин.) и поддерживающей доз (из расчета 0,9 мг/кг) для создания концентрации препарата в крови на уровне

10-12 мгк/мл с дальнейшим переводом на пролонгированные теофиллины [Кэри Ч. и др., 2000] - теопэк 300 мг (Мосхимфармпрепараты). В редких случаях по показаниям назначались антибактериальные препараты; при необходимости проводились ингаляции кислородом.

ХОБЛ (стандартная фармакотерапия). С помощью небулайзера использовались: Вентолин Небулы - раствор для ингаляций, содержащий 2,5 мг сальбутамола сульфата в 2,5 мл раствора (Glaxo Wellcome, UK) или Беродуал - раствор для небулайзерной терапии, содержащий фенотерола гидробромид 500 мкг (0,5 мг), ипратропия бромид 250 мкг (0,25 мг) в 1 мл раствора (Boehringer Ingelheim, Germany).

По показаниям проводилась антибиотикотерапия и назначались глюкокортикостероиды [Чучалин А.Г., 2004] - таблетированные метипред по 4 мг в таб. (Orion Pharma) в суточной дозе не более 24 мг/сут. или преднизолон по 5 мг в таб. (Gedeon Richter) в суточной дозе из расчета 0,5 мг/кг, но не более 60 мг/сут. коротким курсом (10-14 дней). При необходимости проводилась кислородотерапия. Гипоксен. Гипоксен назначался 15 пациентам с БА и ХОБЛ перорально в дозе по 0,5 г (2 капсулы по 0,25 г) три раза в день, курсом в течение 10 дней, в комплексе с описанной выше терапией.

Исследование ФВД. Для оценки эффективности терапии использовалось исследование ФВД (ОФВ1). Исследование поток-объем проводилось при помощи спирографа (Erich Jaeger GmbH, Germany). Исследование проводилось трижды и, если при этом показатели не отличались более, чем на 5%, то исследование считалось методологически выполненным верно; фиксировался лучший результат ОФВ1.

Исследование SaO> Значения Sa02 оценивались у больных в фазе обострения БА или ХОБЛ и после проведенного лечения. Исследование Sa02 проводилось с помощью пульсоксиметра Onix®Nanin, при этом нормальными считались значения Sa02, попадающие в интервал 96-98%. Регистрация клинических данных БА и ХОБЛ. Клинически симптомы БА и

ХОБЛ оценивались по степени выраженности одышки (отсутствие, умеренная, выраженная), хрипов с использованием 3-х бальной шкалы, а также величине частоты дыхательных движений (ЧДЦ) [Juniper E.F. et al., 1995].

Регистрация ХЛ цельной венозной крови. Оценку уровня АФК крови пациентов и здоровых лиц проводили методом измерения интенсивности ХЛ цельной венозной крови [Voeikov V.L., Novikov C.N., 1997; Voeikov V.L. et ah, 1997, 1999]. Ее измеряли исходно, в период обострения заболевания, и после фармакотерапии в крови пациентов и практически здоровых лиц с помощью счетчика одиночных фотонов «Биотоке 7А» (Россия), оснащенного фотоэлектронным умножителем (ФЭУ) с фотокатодом S-11 и диаметром окна 5 см, обладающим максимальной чувствительностью в диапазоне длин волн 400-500 нм. ФЭУ располагается горизонтально и позволяет регистрировать потоки фотонов с боковой поверхности образцов крови [Voeikov V.L., 2003]. Кинетические кривые записывали с временем накопления 1 сек. Все измерения проводили при комнатной температуре без перемешивания образцов с кровью. Манипуляции с кровью проводили при тусклом внешнем освещении.

У пациентов и здоровых лиц из кубитальной вены самотеком забирали в пробирку не более 5 мл крови в утреннее время суток. Кровь стабилизировали цитратом натрия в соотношении 1/10 и исследовали в течение 1-4 часов.

Для регистрации ХЛ использовали ее инициаторы - люминол (ЛМ), (Sigma) и люцигенин (ЛГ), (Sigma) и активатор «OB» зимозан (ЗМ), (Sigma). Маточный раствор ЛМ получали растворением навески в диметилсульфоксиде (ДМСО) до концентрации 10"1 М, далее производили разведение до рабочей концентрации - 210"3 М. Маточный раствор ЛГ получали растворением навески в физиологическим растворе (физ. р-ре) до концентрации 10*' М и производили разведение до рабочей концентрации 210"3 М. Конечные концентрации ЛМ и ЛГ в образцах крови составляли 10"4

М. ЗМ суспендировали в физиологическом растворе (физ. р-ре) так, чтобы полученный препарат содержал ЗМ в концентрации 10 мг/мл. Конечная концентрация ЗМ в крови - 0,5 мг/мл. JIM и ЛГ вносили в кровь из запасных растворов, приготовленных на ДМСО и физ. р-ре, соответственно. «OB» индуцировали в крови ЗМ (конечная концентрация - 0,5 мг/мл). В качестве контейнеров для измерения ХЛ крови использовали полипропиленовые пробирки типа Эппендорф объемом 1,5 мл. В каждую пробирку вносили 100 мкл неразведенной крови пациента или здорового донора. По 5 мкл ЛМ или ЛГ (2-10"3 М) перед началом эксперимента наслаивали на поверхность образца крови. 5 мкл ЗМ вносили из раствора 10мг/мл в ЮОмкл крови.

Схема эксперимента может быть представлена следующим образом: 1). К 100 мкл цельной крови добавляли 5 мкл ЛМ (конечная концентрация - 10*4 М) и измеряли интенсивность ХЛ в течение 5 минут. 2). Добавляли ЗМ (конечная концентрация - 2 мг/мл) и производили измерение в течении 10 минут. 3). К новой порции цельной крови (100 мкл) добавляли 5 мкл ЛГ и опыт также проводился в течение 5 минут. Для каждого пациента все три этапа эксперимента отражались на одной кривой. Измерения кинетики ХЛ проводили в течение 20 минут [Novikov A.K. et al., 2007]. Результаты автоматически поступали на компьютер в формате ASCII. Интенсивность ХЛ выражали в количестве импульсов в секунду.

Обработка результатов. Обработка результатов и вычисления проводились на компьютере с процессором типа Pentium IV и операционной системой Windows ХР с использованием программных пакетов Microsoft ® (USA) -Microsoft office 2003 - Excel 2003; статистической многофункциональной программы Statistica V.6.0 с применением основных методов параметрической и непараметрической статистики. Для интерпретации межгрупповых различий, классификации и анализа полученных результатов в исследуемой выборке пациентов применялся дискриминантный анализ (ДА), являющийся разделом многомерного статистического анализа. Статистическая достоверность оценивалась с помощью непараметрического

критерия Уилкоксона. Для корреляционного анализа использовался коэффициент корреляции Пирсона.

Результаты исследований и обсуждение. В полном объеме были исследованы в динамике и проанализированы XJ1 цельной венозной крови всех испытуемых пациентов и здоровых доноров, ОФВ1 у всех испытуемых пациентов, Sa02 - у 30% пациентов. Оценена динамика клинических симптомов у всех пациентов с БА и ХОБЛ на фоне лечения.

На рис. 1 показано изменение в динамике средних величин интенсивности ХЛ цельной крови у пациентов с БА до и после стандартной фармакотерапии. Наблюдается изменение в динамике у пациентов с БА до и после стандартной фармакотерапии средних величин интенсивности ХЛ цельной венозной крови под влиянием инициатора ХЛ ЛМ с последующим добавлением активатора «OB» ЗМ на 300 с регистрации ХЛ. Показатели интенсивности ХЛ под влиянием ЛМ до и после стандартной фармакотерапии не отличаются. Введение в систему ЗМ показывает существенное снижение интенсивности ХЛ после стандартной фармакотерапии (в 2 раза на 500 с и 900 с регистрации ХЛ соответственно). При изучении ХЛ во второй порции крови у больных БА с добавлением инициатора XJ1 ЛГ существенного различия от проводимой стандартной фармакотерапии не выявлено. Таким образом, для адекватной оценки эффективности проводимой стандартной фармакотерапии у пациентов с БА по данным динамики интенсивности ХЛ цельной венозной крови необходимо изучение ЛМ-зависимой ХЛ на фоне добавления ЗМ, что характеризует существенное снижение резервных возможностей для развития «OB» при его активации.

На рис. 2 показано изменение в динамике средних величин интенсивности ХЛ цельной крови у пациентов с ХОБЛ до и после стандартной фармакотерапии. Наблюдается незначительное изменение средних величин интенсивности ХЛ цельной венозной крови на фоне инициатора ХЛ ЛМ. Зато при добавлении в систему активатора «OB» ЗМ на

300 с с начала регистрации ХЛ это различие становится высоко значимым (в 2,5 раза на 500 с и в 3,6 раз на 900 с с начала регистрации ХЛ). При изучении ХЛ во второй порции крови у больных ХОБЛ с добавлением инициатора ХЛ ЛГ отмечается отчетливая тенденция уменьшения генерации суперанион радикала (САР).

Таким образом, для адекватной оценки эффективности проводимой стандартной фармакотерапии у пациентов с ХОБЛ по данным динамики интенсивности ХЛ цельной венозной крови необходимо изучение ЛМ-зависимой ХЛ на фоне добавления ЗМ, что характеризует существенное снижение резервных возможностей для развития «ОВ» при его активации, и ЛГ-зависимой ХЛ, характеризующей степень интенсивности генерации САР - родоначальника различных видов АФК - в цельной крови.

Видно, что указанные выше закономерности подтверждаются при сравнении динамики средних величин интенсивности ХЛ цельной крови у пациентов с ХОБЛ и БА до и после стандартной фармакотерапии по отношению к здоровым донорам (рис. 3). У всех испытуемых пациентов наблюдалось достоверное совпадение средних значений интенсивности ХЛ крови (при добавлении ЛМ, ЛМ и ЗМ, ЛГ) после проведенного лечения -графически кривые ХЛ накладывались друг на друга (рис. 3).

На рис. 4 приводится сравнительная динамика средних величин интенсивности ХЛ цельной крови объединенной группы больных ХОБЛ и БА до и после стандартной фармакотерапии при первой госпитализации и до (II А) и после (II Б) комплексной фармакотерапии с включением гипоксена, показавших при первой госпитализации (до лечения - I А и после курса стандартной базисной терапии -1 Б) незначительную динамику показателей резервных возможностей для развития «ОВ» при его активации различными патологическими факторами (в отличие от общей группы больных - сравни на рис. 3).

О 100 200 300 <00 МО 600 700 100 9000 100 200 300 Время, сек

Рисунок I. Изменение в динамике средних величин интенсивности ХЛ цельной крови у пациентов с БА до и после стандартной фармакотерапии

— -цорош« доноры Лимнтоп- ----поем мчеиия (БА) ямсинмХЛ jT\ —» >домчмм (БА) • поаи мчмм (ХОБЛ) f — 'Доягшии (ХОБЛ) S i Зииым» / „ии*-"* 5 Лимииоп / * Люниим / Í / Люиигенин

• злисимХЛ

Кровь* Лицигенин

о юо гооюомоиоютооюмооюогооэоо Бремя, сек

Рисунок 3. Изменение в динамике средних величин интенсивности ХЛ цельной крови у пациентов с ХОБЛ и БА до и после стандартной фармакотерапии в сравнении со здоровыми донорами

о 100 200 »0 400 <00 100 700 too НО О 100 200 900 Время, cei

Рисунок 2. Изменение в динамике средних величин интенсивности ХЛ цельной крови в у пациентов с ХОБЛ до и после стандартной фармакотерапии

О 100 ПО 300 400 500 (00 700 КП МО 0 100 200 100

Время, с

Рисунок 4. Изменение в динамике средних величин интенсивности ХЛ цельной крови у объединенной группы пациентов с ХОБЛ и БА до (I А) и после (I Б) стандартной терапии при 1-ой госпитализации и до (II А) и после (II Б) комплексной фармакотерапии с включением гипоксена при повторной госпитализации

Этот факт настораживал в плане прогноза возможного обострения заболевания. Действительно, в сроки от 2-х до 3-х недель эти больные были повторно госпитализированы с показателями, характеризующими АФК, несколько большими, чем при предыдущей госпитализации. Выявлено достоверное увеличение значений 8а02 у объединенной группы пациентов с БА и ХОБЛ (п = 15) на фоне стандартной фармакотерапии при уровне значимости а = 0,05 (Ък= 1,85) (для оценки динамики 8а02 на фоне лечения был использован ранговый критерий Уилкоксона (¿1у) при различных уровнях значимости (а)).

Рисунок 5. Корреляции между ДБаОг (г = - Рисунок 6. Корреляции между ЛЯаО; (г = -

0,5) и Динтенсивности ХЛ крови на фоне 0,9) и Динтенсивиости ХЛ крови на фоне

стандартной фармакотерапии без включения терапии в комплексе с гипоксеном

гипоксена

Показана корреляция между значениями 8а02 и значениями интенсивности ХЛ крови в динамике у исследуемой группы пациентов на фоне проводимой стандартной фармакотерапии - коэффициент корреляции г = -0,5 (был посчитан коэффициент корреляции Пирсона (г) для разницы значений 8а02 и интенсивности ХЛ крови) (рис. 5). Достоверно более значимое увеличение значений 8а02 было выявлено у той же группы пациентов с БА и ХОБЛ (п = 15) после лечения очередного обострения на фоне фармакотерапии с включением гипоксена - а = 0,01 ('¿№ = 2,69). При этом, показана корреляция между значениями БаОг и значениями интенсивности ХЛ крови в динамике у пациентов с БА и ХОБЛ (п = 15), получавших комплексную фармакотерапию с включением гипоксена -коэффициент корреляции - г = -0,9 (рис. 6). Таким образом у испытуемых пациентов на фоне фармакотерапии с включением гипоксена коэффициент корреляции Пирсона (г) изменился с г = -0,5 до г = -0,9. Следовательно, хороший клинический эффект с полной корреляцией с показателями АФК наблюдался после комплексной фармакотерапии с присоединением гипоксена.

Достоверное увеличение значений ОВФ1 выявлено у всех исследуемых пациентов с БА на фоне стандартной фармакотерапии при уровне значимости а = 0,002 (7»=3,3) и у пациентов с ХОБЛ, но при более низком

уровне значимости а = 0,05 (Z|y= 1,95) (для оценки динамики ОФВ1 на фоне лечения был использован ранговый критерий Уилкоксона (Zw) при различных уровнях значимости (а)).

Корреляция мевду значениями ОФВ1 и значениями интенсивности XJ1 крови в динамике у всех исследуемых пациентов практически отсутствует - г = 0,076 (был посчитан коэффициент корреляции Пирсона (г) для разницы значений ОФВ1 и интенсивности XJ1 крови).

Для статистической обработки полученных в исследовании данных -по изменению интенсивности XJI цельной крови и ОФВ1 у всех испытуемых пациентов до и после проводимой фармакотерапии, нами был применен дискриминантный анализ (ДА) [Дюк В.А., 1994]. Оценка только значений интенсивности ХЛ крови всех испытуемых пациентов до и после лечения позволила нам подобрать моменты времени в процессе регистрации XJ1 (1181 с, 1189 с, 985 с, 971 с, 83 с, 50 с, 866 с, 60 с, 355 с, 346 с, 1163 с, 337 с, 372 с, 1198 с, 385 с, 850 с, 1172 с). Были также получены коэффициенты для функций дискриминации у пациентов с БА и ХОБЛ. По уровню интенсивности ХЛ в эти подобранные моменты времени можно с высокой достоверностью разделить исследуемых пациентов на группы. К 1-ой группе были отнесены испытуемые пациенты, которые различаются между собой по нозологическому принципу (пациенты с БА или с ХОБЛ) в фазе обострения заболеваний с достоверностью 70%. Ко 2-ой группе относятся все пациенты с ХОБЛ, у которых выделены различия между фазами заболевания - фазой обострения и состоянием после курса стандартной фармакотерапии с достоверностью 75%. К 3-ей группе относятся все пациенты с БА, у которых выделены различия между фазами заболевания - фазой обострения и состоянием после курса стандартной фармакотерапии с достоверностью 72%.

При оценке изменения значений интенсивности ХЛ крови и ОФВ1 одновременно у всех исследуемых пациентов на фоне проведенной стандартной фармакотерапии методами ДА, достоверность вышеуказанного разделения пациентов по группам повысилась: в 1-ой группе достоверность

различия между пациентами по нозологическому принципу в фазе обострения составила 82%; во 2-ой группе достоверность различия между пациентами с ХОБЛ в фазе обострения и после лечения составила 80%; в 3-ей группе достоверность различия между пациентами с БА в фазе обострения и после лечения составила 85% (рис. 7, рис. 8, рис. 9).

Рисунок 7. Достоверность (в %) разделения пациентов на группы по нозологическому признаку в период обострения (при анализе зн. инт. ХЛ и зн. инт. ХЛ + зн. ФВД)

Рисунок 8. Достоверность (в %) разделения пациентов с БА в остром периоде и после лечения (при анализе зн. инт. ХЛ и зн. инт. ХЛ + зн. ФВД)

Рисунок 9. Достоверность (в %) разделения пациентов с ХОБЛ в остром периоде и после лечения (при анализе зн. инт. ХЛ и зн. инт. ХЛ + зн. ФВД)

Итак, ДА, примененный в качестве статистического метода обработки

результатов исследования, оказался весьма перспективным для

дифференциальной диагностики варианта поражения бронхо-легочной

системы - БА и ХОБЛ - только при анализе групп больных.

Достоверность разделения больных на группы по результатам комплексного анализа ХЛ, ОФВ1, клинической симптоматики устанавливается ретроспективно с помощью ДА. На основании изучения достоверности верификации диагноза БА и ХОБЛ возможна дифференциальная диагностика указанных патологий уже при поступлении больных в стационар.

Течение рассматриваемых обструктивных заболеваний легких определяется, помимо гипоксического синдрома, сочетанием различных форм и этапов развития острого и хронического воспаления в дыхательных путях [Абросимов В.Н., 1994; Петров Р.В., 1987, 1988; Пыцкий В.И. и др., 1991]. Именно к медиаторам воспаления как при БА, так и при ХОБЛ относятся АФК, генерация и утилизация которых, в свою очередь, зависит от многих факторов, а их чрезмерное выделение лейкоцитами ведет к развитию множества различных патологических изменений, характерных для этих заболеваний.

При БА в зависимости от степени тяжести и фазы заболевания снижается ингибирующее влияние на АФК таких факторов, как углекислота, тромбоциты и гистамин, а тесно связанные с интенсивным выделением АФК свободно-радикальные процессы вызывают повреждение клеточных мембран, усиливают их проницаемость, потенцируя воспаление бронхов, инициируют развитие гиперкоагуляции [Болевич С. и др., 1995; Федосеев Г.Б., 1998].

АФК также участвуют в формировании аутоиммунного процесса при БА - реакций, протекающих с участием перекиси водорода, относящейся к АФК, и приводят к окислительной модификации эндогенных макромолекул, вызывая появление структур со свойствами аутоантигенов [Коган А.Х., 1999].

При ХОБЛ в усилении процессов воспаления в бронхолегочной системе и повреждении легочной ткани важную роль играет «окислительный стресс», к которому приводят высокий уровень АФК, либо

несостоятельность собственных механизмов антиоксидантной защиты [Федосеев Г.Б., 1998].

Итак, к настоящему времени получены данные, позволяющие говорить о несомненно важной роли АФК в патогенезе как БА, так и ХОБЛ.

В течение последних 15-20 лет свободно-радикальные процессы с участием АФК изучались как у пациентов с БА [Болевич С. и др., 1995; Болевич С., 2006], так и у пациентов с ХОБЛ [Ракита Д.Р., 1999]. Однако при исследовании вышеуказанных процессов использовали методы, позволяющие изучать лишь процесс генерации АФК лейкоцитами, которые выделяли из венозной крови в различных условиях, определяя хемилюминесцентный критерий генерации АФК [Коган А.Х. и др., 1991] или рассчитывая показатель интенсивности ХЛ лейкоцитов [Болевич С.Б. и др., 1995]. При этом не изучали подробно конкретные АФК и связанные с ними эффекты; также широко использовали метод определения МДА и изучали активность СОД и некоторых других ферментов, принимающих участие в реакциях с участием свободных радикалов [Коган А.Х. и др., 1996; Ракита Д.Р., 1999].

Мы впервые исследовали динамику изменения уровня АФК в неразведенной крови пациентов с БА и ХОБЛ на фоне проводимой фармакотерапии. Для изучения уровня АФК в крови пациентов с БА и ХОБЛ нами впервые был применен метод ХЛ цельной неразведенной крови, который позволил исследовать именно нативную кровь испытуемых пациентов, стабилизированную небольшим количеством антикоагулянта, в первые часы после ее забора из кубиталыюй вены. Ранее данный метод был впервые описан рядом авторов [Voeikov V.L. et al., 1997] в конце 90-х годов прошлого века при изучении процессов с участием АФК у пациентов, перенесших стенокардию и инфаркт миокарда, на фоне проведения курсов внутривенной лазеротерапии.

Таким образом, в отличие от более ранних работ, в которых описывались, в основном, эксперименты по изучению АФК на выделенных

из крови клетках (лейкоцитах, макрофагах), мы применили метод исследования уровня АФК в неразведенной крови больных. Эта методика позволила изучить процессы с участием АФК непосредственно в сложной естественной кооперативной системе - неразведенной крови человека, в которой несколько видов специализированных клеток находятся в тесном взаимодействии между собой. В данной ситуации АФК, которые, в основном, продуцируются в крови нейтрофилами, частично участвуют в биохимических процессах некоторых других клеток крови, или вступают в реакции с веществами, растворенными в плазме крови. Таким образом, интенсивность ХЛ цельной крови оказалась наиболее достоверным показателем уровня АФК, продуцируемых лейкоцитами в крови человека. Метод ХЛ цельной крови позволил нам изучить в динамике показатели интенсивности ХЛ (в импульсах в секунду - имп/с) в пробах неразведенной крови всех испытуемых пациентов с БА и ХОБЛ на фоне проводимой комплексной фармакотерапии, а также при применении антиоксиданта гипоксена у части исследуемых пациентов. Параллельно были исследованы в динамике показатель ФВД - ОФВ1 (у всех пациентов) и 8а02 (у части больных), оценены симптомы заболеваний на фоне лечения.

Впервые было показано, что метод ХЛ цельной крови может быть применен в комплексе с традиционными методами, такими как исследование ОФВ1 (фактически показателя ФВД, показывающего степень бронхообструкции, а значит и определяющего наличие внешней гипоксии) и регистрация 8а02 (показателя, косвенно характеризующего тканевую гипоксию), для оценки эффективности фармакотерапии и курсового применения антигипоксантов (на примере гипоксена) при лечении больных с обструктивными заболеваниями легких.

Исследование корреляционной связи показателей ОФВ1 с показателями интенсивности ХЛ крови в динамике на фоне фармакотерапии выявило, что корреляция между показателями ОФВ1 и показателями интенсивности ХЛ у всех испытуемых пациентов практически отсутствует.

Этот результат был ожидаем, поскольку ОФВ1 относится к показателю ФВД, который оценивается с помощью функциональных проб и зависит от степени выраженности бронхообструктивного синдрома, тогда как интенсивность ХЛ крови является показателем, характеризующим процессы с участием АФК, происходящие в неразведенной крови испытуемых на тканевом уровне. И поэтому корреляция между этими показателями была маловероятна. В то же время корреляционная связь между показателями интенсивности ХЛ и значениями БаОг четко прослеживается, поскольку оба показателя характеризуют процессы с участием кислорода и его активных форм, протекающие на тканевом уровне (в крови пациентов).

Применяя в качестве статистического метода обработки ДА, нам удалось выявить диагностическое значение метода ХЛ цельной крови для пациентов с БА и ХОБЛ.

Так, были нозологически достоверно разделены между собой больные с БА и ХОБЛ, а также достоверно выделены группы больных с БА и ХОБЛ по степени тяжести их состояния (в фазе обострения заболевания и после проведенной фармакотерапии).

Исходя из полученных нами результатов проведенной работы, метод ХЛ цельной венозной неразведенной крови можно рекомендовать в качестве наиболее объективного метода исследования уровня АФК в крови у пациентов (наравне с другими методами исследования, необходимыми для оценки состояния больных, эффективности и безопасности проводимого лечения) с заболеваниями, подобными обструктивным заболеваниям легких (БА и ХОБЛ), в патогенезе которых играют ведущую роль синдромы гипоксии и воспаления. Выводы.

1. Уровень АФК в цельной венозной неразведенной крови пациентов с БА и ХОБЛ достоверно превышает уровень АФК в крови здоровых лиц.

2. Ретроспективный дискриминантный статистический метод анализа динамики АФК в цельной неразведенной венозной крови больных БА и

ХОБЛ оказался перспективной базой для дифференциальной диагностики БА и ХОБЛ в фазе обострения.

3. Незначительная положительная динамика исходных показателей резервных возможностей для развития «ОВ» (по данным ЛМ-зависимой ХЛ при добавлении ЗМ) под влиянием курсовой фармакотерапии прогнозирует высокий риск обострения в ближайшие недели.

4. Включение антигипоксанта гипоксена в комплексную фармакотерапию у больных ХОБЛ и БА отчетливо и статистически достоверно повышает 8а02 и снижает уровень АФК в крови.

Практические рекомендации.

1. Для оценки резервных возможностей развития «ОВ» при его активации патогенными факторами у больных ХОБЛ и БА, необходимо изучать ЛМ зависимую ХЛ цельной венозной неразведенной крови в присутствии ЗМ.

2. Для изучения интенсивности генерации супероксид-анион радикала -родоначальника различных видов АФК - в цельной венозной неразведенной крови у больных ХОБЛ и БА необходимо исследование ЛГ-зависимой ХЛ.

3. Для снижения риска обострения заболевания у больных БА и ХОБЛ необходимо включать в состав комплексной фармакотерапии антигипоксант гипоксен.

4. Для объективной верификации БА и ХОБЛ в фазе обострения необходимо сравнивать показатели АФК в цельной венозной крови с разработанной базой данных с помощью ДА.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Новиков А.К., Кукес И.В. Значение реакций, протекающих с участием активных форм кислорода, для организма человека и возможность их использования в комплексном лечении терапевтических заболеваний. // Материалы научно-практической конференции «Клинико-фармакологические подходы в оптимизации фармакотерапии» // Хабаровск: 3 марта 2006 г. - с.42.

2. Новиков А.К., Воейков ВЛ., Герасимов В.Б., Бердникова Н.Г., Кукес И.В. Оценка содержания активных форм кислорода методом хемилюминесценции цельной крови у пациентов с патологией бронхолёгочного аппарата. - Активные формы кислорода, азота и хлора в регуляции клеточных функций в норме и при

патологии. Материалы международного симпозиума // Гродно: 28-29 сентября

2006 г. / Часть 2 - с.42.

3. Новиков А.К., Воейков B.JI. Антоновский Ю.А., Бердникова Н.Г., Кукес И.В. Исследование содержания активных форм кислорода (АФК) методом хемилюминесценции (XJ1) цельной крови у пациентов с патологией бронхолегочной системы. - Современные проблемы медицины. -Материалы научно-практической конференции, посвященной 140 - летию 23 ГКБ им. «Медсантруд» // Москва-2006. - с.116.

4. Novikov А. К., Berdnikova N. G., Voeikov V. L. Investigation of reactive oxygen species (ROS) using the method of chemiluminescence from nondiluted whole blood in patients with bronchial asthma // Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. - 2007. - Vol. 101 (Suppl. 1), p. 189.

5. Новиков A.K., Бердникова Н.Г., Кукес В.Г., Воейков B.JI. - Изучение активных форм кислорода (АФК) методом хемилюминесценции цельной крови у пациентов с патологией бронхолегочной системы // Психофармакология и биологическая наркология. - 2007. - т.7. - Спец. Выпуск,- Часть 2. - с. 1877.

6. Новиков А.К., Бердникова Н.Г., Кукес В.Г., Воейков B.J1. Оценка влияния фармакотерапии на биохимические процессы с участием активных форм кислорода методом хемилюминесценции цельной крови у больных с обострением бронхиальной астмы и хронической обструктивной болезнью лёгких // Сборник материалов научно-практической конференции «Рациональная фармакотерапия: теория и практика применения лекарств».-18-19 апреля 2007 г., Москва. - с. 53.

7. Новиков А.К., Бердникова Н.Г., Воейков В.Л., Люзина О.Ю., Новиков К.Н., Кукес В.Г., Кукес И.В. Возможное диагностическое значение метода хемилюминесценции цельной крови у пациентов с обструктивными заболеваниями легких // Материалы международной научной конференции «Лекарственные средства и биологически активные добавки». -11-12 октября

2007 г., Гродно. - с. 117.

8. Novikov А.К., Lusina O.Y. Voeikov V.L., Novikov K.N., Chalkin S.F. Diagnostic value of the method of chemiluminescence from nondiluted whole blood in patients with obstructive pulmonary diseases. 10MC 2008 Proceedings Book: A Collection of the 1st International Online Medical Conference Papers Edited by: Mostafa Nejati and Forouzan Bayat Nejad. Universal Publishers, Boca Raton, Fl., USA. - pp. 187-194,2008 ISBN-10 1599429667

9. Новиков A.K., Бердникова Н.Г., Воейков В.Л., Люзина О.Ю., Новиков К.Н., Кукес В.Г., Кукес И.В. - Исследование в динамике уровня активных форм кислорода в крови пациентов с обструктивными заболеваниями легких и его значение в оценке эффективности проводимой фармакотерапии // Клиническая фармакология и терапия. - 2008. - 17(5) - с. 24 - 28.

Актуальность исследования.

Бронхиальная астма (БА) и хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) относятся к наиболее распространенным обструктивными заболеваниями легких, и в последние десятилетия отмечается тенденция к росту количества больных, страдающих этими заболеваниями.

Ведущими патогенетическими факторами в развитии этих заболеваний выступают гипоксия и воспаление [Федосеев Г.Б., 1998; Agusti A.G.N., 2005]. И при БА, и при ХОБЛ, в условиях гипоксии и воспаления, различные клетки участвуют в генерации свободных радикалов и, в первую очередь, активных форм кислорода (АФК) [Ракита Д.Р., 1999; Болевич С.Б., 2006; Mathur S.K. et al., 2008].

К АФК относятся высокореакционные химические частицы, возникающие в результате последовательного одноэлектронного восстановления молекулы кислорода и представляющие собой свободные радикалы (02—*, Н02*, НО*, NO*, ROO*), а также молекулы, способные легко продуцировать свободные радикалы (102, 03, ONOOH, НОС1, Н202, ROOH, ROOR) [Halliwell В., 1991; Воейков В.Л., 2003; Новиков К.Н., 2004].

По минимальным оценкам в состоянии покоя при дыхании у человека на продукцию АФК уходит от 10 до 30% молекулярного кислорода (02). Однако в норме стационарный уровень АФК в органах и тканях достаточно низок (порядка Ю"10 - 10"11 М) за счет распространенности в них мощной ферментативной (оксидазы, супероксиддисмутаза (СОД), каталаза, пероксидазы) и неферментативной (например, витамин Е и др.) систем регуляции накопления и устранения АФК [Oshino N. et al., 1975; Shoaf A.R. et al., 1991; Vlessis A.A. etal., 1995].

Исключительно важно, что АФК в патологии образуются особенно интенсивно при исходной гипоксии с эпизодами реоксигенации, зависимой от течения заболевания и фармакологической коррекции [Меерсон Ф.З., 1984].

Среди эффективных способов коррекции избыточного уровня АФК широко распространено применение антирадикальных средств (дибунол), антиоксидантов непрямого действия (глутатион) и антигипоксантов (мексидол, гипоксен) [Блинков И.Л., 2007; Кукес В.Г., 2004; Харкевич Д.А., 1999].

Свободно-радикальные процессы с участием АФК подробно изучались у пациентов с БА, а в последние годы было уделено внимание изучению прооксидантно-антиоксидантнтого статуса у пациентов с ХОБЛ [Болевич С.Б. и др., 1995; Болевич С.Б., 2006; Даниляк И.Г. и др., 1993; Даниляк И.Г. и др., 1995; Максимова A.B. и др., 2005; Ракита ДР., 1999].

С помощью метода люминолзависимой хемилюминесценции (ХЛ) было установлено, что у больных бронхиальной астмой базальный и стимулированный показатели генерации АФК альвеолярными макрофагами достоверно выше, чем в контроле. Таким образом, по количеству АФК, продуцируемых альвеолярными макрофагами, можно судить о степени и характере воспалительного процесса, протекающего в бронхолегочной системе [Болевич С.Б. и др., 1995; Даниляк И.Г. и др., 1993; Даниляк И.Г. и др., 1995].

В последние годы был предложен способ дифференциальной диагностики хронических обструктивных заболеваний легких, который позволяет провести точную диагностику между БА и ХОБЛ на основании различной степени хемилюминесцентной активности фагоцитирующих клеток бронхиального дерева (исследовали бронхиальные смывы), а в дальнейшем корректировать назначенную терапию в соответствии с установленным диагнозом [Максимова A.B. и др., 2005].

Однако, применение вышеописанных методов в повседневной клинической практике может быть ограничено, поскольку метод оценки функциональной активности альвеолярных макрофагов включает процедуру выделения чистой фракции исследуемых клеток, что является достаточно трудоемким и затратным процессом. Определение различной степени хемилюминесцентной активности фагоцитирующих клеток бронхиального дерева связано с различными неблагоприятными факторами, возникающими на этапе забора материала для исследования (не всегда возможно пациентам с обструктивными заболеваниями легких адекватно провести лаваж бронхиального дерева из-за имеющихся противопоказаний к его проведению или опасности развития осложнений).

С другой стороны известен метод анализа АФК в цельной неразведенной венозной крови больных с ишемической болезнью сердца для объективной оценки эффективности низкоинтенсивной внутривенной лазеротерапии [Воейков В.Л. и др., 1998].

Актуальной представляется проблема анализа уровня АФК в цельной неразведенной венозной крови пациентов с БА и ХОБЛ методом ХЛ на фоне стандартной фармакотерапии и комплексной фармакотерапии с включением антигипоксанта гипоксена с целью определения значения этого анализа в оценке эффективности проводимого лечения и для дифференциальной-диагностики данных заболеваний с учетом результатов исследования функции внешнего дыхания (ФВД) и сатурации кислорода (ЭаОг) у этих больных. Данный метод исследования является быстрым и простым в техническом исполнении лабораторным тестом, не требующим серьезных затрат и не влияющим на состояние исследуемого пациента или здорового лица. Он также достаточно достоверен, поскольку в качестве объекта исследования выступает цельная неразведенная венозная кровь.

Цель исследования.

Определить значение исследования в динамике уровня АФК в цельной неразведенной венозной крови больных с обструктивными заболеваниями легких — БА и ХОБЛ в оценке эффективности проводимой фармакотерапии.

Задачи исследования.

1. Изучить уровень АФК в крови здоровых лиц.

2. Изучить уровень АФК в крови больных БА и ХОБЛ в остром периоде заболеваний, после проведения стандартной фармакотерапии и фармакотерапии с включением гипоксена.

3. Изучить динамику объема форсированного выдоха за 1 с (ОФВ1), 8аОг, клинической симптоматики у больных БА и ХОБЛ на фоне стандартной фармакотерапии и фармакотерапии с включением гипоксена.

4. Провести сравнительный анализ результатов динамики ОФВ1, уровня АФК в крови пациентов с БА и ХОБЛ и клинической симптоматики на фоне стандартной фармакотерапии и фармакотерапии с включением гипоксена.

Научная новизна.

Впервые изучен уровень АФК в цельной венозной крови пациентов с наиболее распространенными обструктивными заболеваниями легких - БА и ХОБЛ, находящихся на стационарном лечении, в зависимости от степени тяжести их состояния и на фоне проводимой фармакотерапии. Показано, что уровень АФК в цельной крови пациентов с БА и ХОБЛ достоверно превышает уровень АФК в крови здоровых лиц.

Выявлено диагностическое значение исследования в динамике уровня АФК крови больных с обструктивными заболеваниями легких с использованием различных хемилюминесцентных зондов - нозологически достоверно разделены между собой больные с БА и ХОБЛ в фазе обострения. Показано, что изучение уровня АФК в крови больных с БА и ХОБЛ в динамике курсового лечения может быть использовано для достоверного прогноза степени риска обострения.

Впервые выявлено, что изучение уровня АФК в крови больных БА и ХОБЛ, с применением дискриминантного анализа (ДА) в качестве статистического метода обработки результатов исследования, может быть использовано в оценке эффективности проводимой фармакотерапии. Проведен сравнительный анализ результатов изучения в динамике уровня АФК и показателей ФВД (0ФВ1), БаСХ Показано отсутствие корреляции между уровнем АФК и ОФВ1 у всех испытуемых пациентов на фоне проводимой терапии. Доказано, что исследование динамики уровня АФК в крови больных БА и ХОБЛ в совокупности с ОФВ1 позволяет повысить достоверность оценки эффективности проводимой фармакотерапии по сравнению с исследованием только уровня АФК в крови у этих больных.

Впервые метод ХЛ цельной венозной неразведенной крови был применен для оценки эффективности лекарственного средства (ЛС) антигипоксантного типа гипоксена в составе комплексной фармакотерапии больных с БА и ХОБЛ.

Практическая значимость.

Для адекватной диагностики и оценки эффективности фармакотерапии. БА и ХОБЛ показана важность анализа уровня АФК в крови больных методом ХЛ цельной венозной неразведенной крови (с использованием ХЛ — зондов (люминола (ЛМ), люцигенина (ЛГ)) и активатора «окислительного взрыва» («ОВ») зимозана (ЗМ).

Показано повышение эффективности стандартной фармакотерапии за счет применения ЛС со свойствами антигипоксантов (гипоксен).

Определение АФК в цельной венозной крови может быть использовано для уточнения диагноза БА и ХОБЛ, а также выбора рациональной фармакотерапии на начальном этапе лечения с последующим сравнением с полученной базой данных при помощи ДА.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Ретроспективный дискриминантный статистический метод анализа динамики АФК в цельной неразведенной венозной крови больных БА и ХОБЛ оказался перспективной базой для дифференциальной диагностики БА и ХОБЛ в фазе обострения.

2. Незначительная положительная динамика исходных показателей резервных возможностей для развития «ОВ» (по данным ЛМ-зависимой ХЛ при добавлении ЗМ) под влиянием курсовой фармакотерапии прогнозирует высокий риск обострения в ближайшие недели.

3. Включение антигипоксанта гипоксена в комплексную фармакотерапию у больных ХОБЛ и БА отчетливо и статистически достоверно повышает 8аОг и снижает уровень АФК в крови.

Внедрение результатов исследования.

Методика регистрации уровня АФК в венозной крови пациентов с БА и ХОБЛ методом ХЛ цельной неразведенной крови и полученные результаты исследования внедрены в практическую деятельность пульмонологического отделения ГКБ №23 им. «Медсантруд».

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ: 7 в отечественных и 2 в международных изданиях, в том числе 1 - в центральном журнале.

Апробация работы.

Апробация работы проведена на Секции Ученого Совета №1 ФГУ «НЦ ЭСМП» Росздравнадзора 9 июня 2008 года. Результаты исследований были представлены в виде тезисов, устных и стендовых сообщений за период с 2006г. по 2008г. на российских и международных симпозиумах и конференциях: Научно-практическая конференция «Клинико-фармакологические подходы в оптимизации фармакотерапии» (Москва, 2006); Научно-практическая конференция, посвященная 140-летию 23 ГКБ им. «Медсантруд» (Москва, 2006); Международный симпозиум «Активные формы кислорода, азота и хлора в регуляции клеточных функций в норме и при патологии» (Гродно, Беларусь, 2006); Научно-практическая конференция «Рациональная фармакотерапия: теория и практика применения лекарств»

Москва, 2007); 8th Congress of the European Assosiation for Clinical Pharmacology and Therapeutics (Amsterdam (The Netherlands), 2007); Международная научная конференция «Лекарственные средства и биологически активные добавки» (Гродно, Беларусь, 2007); The 1-st International Online Medical Conference (May 10-11, 2008).

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов и практических рекомендаций, списка литературы, включающего 100 отечественных и 86 зарубежных источников, приложений. Работа иллюстрирована 8 таблицами и 15 рисунками.

Выводы.

1. Уровень АФК в цельной венозной неразведенной крови пациентов с БА и ХОБЛ достоверно превышает уровень АФК в крови здоровых лиц.

2. Ретроспективный дискриминантный статистический метод анализа динамики АФК в цельной неразведенной венозной крови больных БА и ХОБЛ оказался перспективной базой для дифференциальной диагностики Б А и ХОБЛ в фазе обострения.

3. Незначительная положительная динамика исходных показателей резервных возможностей для развития «ОВ» (по данным ЛМ-зависимой ХЛ при добавлении ЗМ) под влиянием курсовой фармакотерапии прогнозирует высокий риск обострения в ближайшие недели.

4. Включение антигипоксанта гипоксена в комплексную фармакотерапию у больных ХОБЛ и БА отчетливо и статистически достоверно повышает 8а02 и снижает уровень АФК в крови.

Практические рекомендации.

1. Для оценки резервных возможностей развития «OB» при его активации патогенными факторами у больных ХОБЛ и БА, необходимо изучать ЛМ зависимую ХЛ цельной венозной неразведенной крови в присутствии ЗМ.

2. Для изучения интенсивности генерации супероксид-анион радикала — родоначальника различных видов АФК - в цельной венозной неразведенной крови у больных ХОБЛ и БА необходимо исследование ЛГ-зависимой ХЛ.

3. Для снижения риска обострения заболевания у больных БА и ХОБЛ необходимо включать в состав комплексной фармакотерапии антигипоксант гипоксен.

4. Для объективной верификации БА и ХОБЛ в фазе обострения необходимо сравнивать показатели АФК в цельной венозной крови с разработанной базой данных с помощью ДА.

Список принятых сокращений.

АОС - антиоксидантные системы

АФК - активные формы кислорода

БА - бронхиальная астма

БАВ - биологически активные вещества

ГКС - глюкокортикостероиды

ДМСО - диметилсульфоксид

ДА - дискриминантный анализ

ЗМ - зимозан

ИБС - ишемическая болезнь сердца

JIM - люминол

ЛГ - люцигенин

ЛС - лекарственные средства

МДА - малоновый диальдегид

MX - митохондрии

НАД - никатинамиддинуклеотид

НАД*Н - никатинамиддинуклеотид восстановленный

ОФВ1 - объем форсированного выдоха за 1 секунду

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПМЯЛ - полиморфно-ядерные лейкоциты

САР - супероксид-анион радикала

СОД - супероксиддисмутаза

ССИ - сверх-слабые излучения

Физ. р-р - физиологический раствор

ФЖЕЛ - форсированная жизненная емкость легких

ФЭУ - фотоэлектронный умножитель

ФВД - функция внешнего дыхания

ХЛ - хемилюминесценция, хемилюминесцентный

ХОБЛ - хроническая обструктивная болезнь легких

ЧЧД - частота дыхательных движений ЭВС - электронно-возбужденное состояние ЭКГ - электрокардиограмма ЭПР - электронный парамагнитный резонанс 8а02 - сатурация кислорода