Автореферат и диссертация по медицине (14.00.20) на тему:Участие внутриклеточных регуляторных систем в реакциях нейронов мозга на фосфакол



ВОЕННО-МЕДИЦИНСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА КРАСНОЗНАМЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени С. М. КИРОВА

На правах рукописи

КАМЕНЕВ Алексей Львович

УЧАСТИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ РЕГУЛЯТОРНЫХ СИСТЕМ В РЕАКЦИЯХ НЕЙРОНОВ МОЗГА НА ФОСФАКОЛ

14.00.20 — токсикология 14.00.17—НОРМАЛЬНАЯ ФИЗИОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1992

Работа выполнена на кафедре военной токсикологии н медицински' защиты ВМедА имени С. М. Кирова, в лаборатории регуляции функцш' нейронов мозга Института физиологии имена И. П. Павлова РАН.

Научные руководители: доктор медицинских наук профессор Г. А. СОФРОНОВ доктор медицинских наук М. О. САМОЙЛОВ

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук профессор И. И. БАРЫШНИКОВ доктор медицинских наук профессор Л. Г. МЕДВЕДЕВ

Ведущая организация — Научно-исследовательский институт военно! медицины г. Санкт-Петербурга.

Защита диссертации состоится ЧЬ июня 1992 года в часо!

на заседании специализированного совета Д 106.03.08 ВМедА име ни С. М. Кирова по адресу: г. Санкт-Петербург, Лесной проспект, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВМедА име ни С. М. Кирова.

Автореферат разослан « » мая 1992 года

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук профессор И. Г. ЧУРСИН

•• »»»я

ä3

ктуалъностъ теш. К настоящему времени накоплен большой

ческий материал, посвященный механизмам токсического дейст-¡ия фосфороргавическях соединений (ЗОС) - необратимых ингибито->ов ацетилхолинэстеразн (Голиков С.Н., Розенгарт В.И., 1964; íaMtía Т., 1972; Прозоровский В.Б., Саватеев Н.В., 1976; Абдува-:абОВ A.A. И соавт., 1989; Taylor i?., 1984; Carczmar А.З., 1984; Kusscli K.w., overstreet d.h., 1987). Подробно исследо-

¡аны эффекты этих соединений на процессы холинергической передачи [ервного импульса на синаптическо!/: тровне. Однако недостаточно изучено влияние $0С на внутриклеточные механизма нейропалыюй ¡игнальной трансдукции.

Согласно современным представлениям, важная роль в механизмах ¡игналыюй трансдукции принадлежит -ключевым внутриклеточным системам регуляции метаболизма и функций нейронов - кальциевой, по-шфосфоинозитидной и циклических нуклеотидов, участвующих в пере-»че сигналов от нейромедиаторных и гормональных рецепторов тс эф-зекторным молекулам («шкеладзе Д.Г., 19ВЗ; Самойлов ¡И.О., 1985; 3arvalho А.?., 1982; Abdel-i-atif A.A., 1986; Berridge L.J.,1987; Berridge i.ioJ., Irvine к.P., 1989). Сочетанная работа указанных ¡истем обеспечивав? адаптивные функциональные перестройки деяте-tbHOCTH нейронов при действии на организм различных факторов шешней среды. Повреждающие воздействия вызывают расстройства Шятелыюсти внутриклеточных регуляторных систем (ВРС), что при-юдит к тяжелым неврологическим последствиям (Самойлов LÍ.0., 385; Тюлькова E.H., I98S; Ikeyer F.В., Siesjö В.К., Bengtsson F., 1989).

В последнее время установлено вовлечение различных компонен-?ов БРС в механизмы сигнальной трансдукции при активации холино-эецепторов (долго-Сабуров В.Б., Шорохов Ю.А., ISS9; Abdel-Latif i.A., 1986; Harden Т.К. et al., 1986; tfathans^n. H.í.í., 1987; Jhrisfcie Ы.J., North tí.A., 1988; Duggan M.J., bunt G.'J.,, 1988; Peralta к. Gr. et al., 1988). Вместе с тем до настоящего времени je было предпринято систематических исследований состояния ВРС в шйронах центральной нервной системы (ДНО) при отравлениях ЮС. )стается неизвестной связь возможных изменений активности систем эегуляции с определенными нарушениями функционального состояния юйронов мозга при воздействиях этими ядами. Учитывая, что ФОС 5 смертельных дозах вызывают расстройства гемодинамики мозга Lee Н.Б., boda к А.'Г., 1983; JäcLeed «.li., 1985), сдвиги в ВРС,

очевидно, могут быть обусловлены как непосредственным влиянием этих соединений на процессы холинергической синаптической передачи, так и дополнительными эффектами циркуляторной гипоксш.

В последние годы появились сведения об эффективности испсш зования ентиоксидантов при профилактике отравлений ЮС (Зацегш Э.П. и соавт., 1990; Софронов Г.А. и соавт., 1991; ТаууаЪа ;с., Hasan i\i., Однако механизмы их защитного действия изуче-

ны недостаточно.

Целью настоящей работы явилось комплексное исследование динамики содержания ключевых компонентов BPG, импульсной активности нейронов и микроциркуляции крови в головном мозге кошек при отравлениях фосфаколом, а такае оценка защитного действия ант* оксиданта оксиметацила.

Задачи исследования;:

- изучение влияния фосфакола в летальных дозах на динамику содержания внутриклеточного кальция, импульсной активности нейронов и микроциркуляции крови в коре головного-мозга кошки;

- оценка эффектов фосфакола в летальных дозах на содержание цАМФ, базальную и стимулированную норадреналином активность аде нилатциклазы, активность фосфодиэстеразы в сопоставлении с изж ненияш функционального состояния нейронов в коре головного мое га котки;

- оценка защитного действия оксиметацила и амизила при отравлении фосфаколом в-летальных дозах по показателям динамики содержания внутриклеточного кальция, импульсной активности нейронов и микроциркуляции крови в коре головного мозга кошки.

Натчная новизна. Для решения поставленных задач использова* комплексный методический подход, основанный на базе црижизненнс микроскопии и спектрофлуориметрии нервной ткани, в сочетании с физиологическими и биохимическими методиками. Впервые выполненс комплексное исследование влияния фосфакола на дингдику содержания некоторых узловых компонентов систем внутриклеточной регул* ции - мембраносвязанного кальция и цАМФ в сопоставлении с изменениями микроциркуляции крови и нейрональной электрической ак-тивностн в коре головного мозга кошки. Результаты работы выявили доза-зависиыое влияние фосфакола на функциональное состояли« ьейронов коры головного мозга и активность кальциевой и цАМФ-еистеы внутриклеточной регуляции. Показана неоднородность реак-

;ий исследуемых показателей при отравления животных фссфаколом дозе 1,5 ЛД5д, в основе которой, по-видимому, лежат различные ффекгы фосфакола на сердечно-сосудистую систему. Получены поив данные об опосредовании системами внутриклеточной регуляции еханизмов токсического действия фосфавола в корреляции с изме-ениями уровня активности нейронов и микроциркуляции !фови в кое головного мозга кошки. Установлено, что выявленные изменения ктивности в рэгуляторных системах и сопутствующие им перестрой-ж биоэлектрической активности нейронов мозга связаны не только непосредственным влиянием фосфакола на процессы холинергичес-ой синаптической передачи, но и с дополнительными эффектами дркуляторной гипоксии. Показано, что профилактическое применено антиоксиданта оксиметацила в сочетании с М-холинолитиком мизилом при смертельном отравлении фосфаколом оказывает защит-ое действие на функциональное состояние нейронов и способству-т восстановлению нарушенной микроциркуляцки крови в коре голового мозга.

Теоретическое и практическое значение. Результаты работы дполняют представления о нарушениях механизмов внутриклеточной кгнальной трансдукции при острых отравлениях $0С. Установлены орреляции между изменением функционального состояния' нейронов юзга и сдвигами содержания'некоторых компонентов ВРС, что сви-;етельетвует о важной роли этих систем в реакциях нейронов на оздействие ЗОС. Выявлено, что отравление фосфаколом в летальных ;озах вызывает нарушение внутриклеточного гомэостаза кальция, то может быть одной из причин структурно-функционального повреждения нервных клеток. Установлено, что расстройства'микроцирку-яции в головном мозге при смертельном отравлении фосфаколом -носят существенный вклад в нарушения механизмов внутриклеточ-юй сигнальной трансдукции. Положительный эффект оксиметацила ¡а функциональное состояние нейронов мозга и восстановление ми-:роциркуяяции крови в сосудах коры мозга после введения амизила [ри отравлении фоефаколом свидетельствует о вовлечении процессов ¡ерекисного окисления липидов в патогенезе интоксикации и о нер-пективности использования антиоксвдантов в качестве средств [рофилактики отравлений ЗОС.

Результаты работы свидетельствуют, -что при изыскании средств [рофилактики и лечения острых отравлений ЙЗС целесообразно учи-

тывать полученные результаты об изменении активности ВРС и сопутствующих л»'- перестройках функционального состояния нейронов. В связи с этим, наряду с традиционными лечебными средствами, представляется обоснованным использование препаратов, направленно влияющих на нормализацию механизмов внутриклеточной сигнальной трансдукцни, кровоснабжения мозга, процессов перекисного ок! сления лшшдов.

Научные положения.-выносимые на защиту:

- в патогенезе неврологических расстройств при отравлении фосфаколом существенное место принадлежит нарушениям механизмов внутриклеточной регуляции метаболизма и функций нейронов головне го мозга животных, которые формируются в результате непосредстве ного воздействия фосфакола на холинергическую синаптическую передачу, а также вследствие сопутствующей циркуляторной гипоксии;

- терапия холинолитиками (амизилом) отравлений фосфаколом в летальных дозах недостаточно эффективна для восстановления электрической активности нейронов, гемодинамики в сосудах мозга и внутриклеточного гомеостаза кальция;

- профилактическое использование антиоксидантов (оксиметаци-ла) представляется перспективным направлением в изыскании способов повышения эффективности хояинолитиков в качестве средств терапии отравлений 50С.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на кафедральных совещаниях; XI научной конференции молодых ученых и специалистов Академии, Ленинград, 1990; научной конференции "Токсикологические проблемы химических-катастроф", Ленинград; 1991.

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обз литературы, описание материалов и методов исследования, результг ты экспериментальных исследований, обсуждение результатов, вывог и список литературы. Работа изложена на 147 страницах, иллюстрирована 31 рисунками. Список литературы включает 5? отечественных и 232 зарубежных источников.

' 1 МАТЕРИАЛЫ й МЕТОДЫ ИССЛВДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на легко наркотизированных нембуталоь обездвиженных тубокурархшом и переведенных на принудительную вентиляцию легких с помощью аппарата искусственного дыхания

УВДЖ-I 80 кошках (самцах) массой тела 2,8-3,5 кг. В работе применен комплексный методический подход, основанный на базе прижизненной микроскопии и спектрофяуориметрии нервной' ткани в сочетании с физиологическими и биохимическими методиками, позволивший в экспериментах in situ исследовать состояние компонентов ВРС- содержание мембраносвязэнного кальция, цАМФ, я-> тявность аденилатциклазы и фосфодиэстеразы в сопоставлении с изменениями импульсной активности нейронов и микроциркуляции крови в коре головного мозга кошек при отравлении фосфаюэлом.

Объектом исследования служили сенсомоторная и зрительная области коры мозга. Используя контактный микроскоп ЛОМИМ КФ-1, осуществляли прижизненную микроскопию и спектрофлуориметрию микроучастков живого препарата сенсомоторной коры с сохраненным кровотоком, включающих нейроны и окружающий их нвйропшгь (Самойлов 5/1.0., 1985). Динамику содеряания мембраносвязашого кальция (Сас) в различных слоях препарата коры (5-7 микроучастков в каждом эксперименте) исследовали с применением хлортетрацик-линового флуоресцентного зонда (Самойлов М.О., 1985; Caswell а.н., 1979). Динамику микроциркуляции крови в визуально наблюдаемых прекапидлярах, капиллярах, венулах (10-12 микрососудов в каждом опыте) оценивали способом, предложенным iicCusfcey R.S. et al. (1972). Способ дозволил провести качественную оценку состояния кровотока в микрососудах по балльной шкале, где 5-высожий'кровоток, 4 - умеренное замедление кровотока с урежением прохождения порций форменных элементов крови, 3 - внракенное замедление кровотока с идентификацией отдельных форменных элементов крови, 2 - маятннкообразное движение крови, I - отсутствие кровотока.

Динамику импульсной активности нейронов (ИАН) исследовали с помощью внеклеточных металлических шшро электродов двумя способами: в первом - регистрировали импульсную активность одиночных нейронов при непрерывном отведении, во втором - в различные интервалы времени эксперимента определяли количество фоновоактив-ных нейронов (ФАН) при погружении микроэлектрода от поверхности коры мозга вглубь до 2 мм (трековый анализ). Систолическое артериальное давление (сАД) регистрировали прямым методом с использованием электронного манометра 1ШВ-02. ■

)]дя изучения состошшя компонентов цАМФ-системы осуществляли

прижизненную биопсию серого вещества моторной и зрительной обла стей юры мозга в исходном состоянии и в определенный интервал времени после введения фосфакола. Активность аденилатциклазы (АД) определяли методом Solomon т. et al. (1974). Содержание ц АМФ исследовали с использованием наборов реактивов фирмы " АшегзЬат". Активность общей фосфодиэстеразы (ЩЭ) определяли методом Cheung W.X.(1969).

Фосфакол вводили животным внутривенно в дозах 1,5, 3,0 и 4,5 ДЦ50 (0,266; 0,532 ; 0,798 мг/кг). Амизил (0,5 мг/кг; в/в) инъецировали кошкам на высоте отравления фосфаколом. Оксиме-тацил (5,0 мг/кг; в/в) вводили за 60 мин до инъекции фосфакола;

Полученные результаты обработаны статистически с применение критерия Стыодента. Динамические взаимосвязи между показателями реакции исследовали с помощью вычисления кросс-корреляционных функций.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУВДЕНИЕ.

I. Влияние фосфакола в летальных дозах на динамику содержания мембраносвязанного кальция, импульсной активности нейронов и микроциркуляцш крови в коре головного мозга;

После 5 мин отравления фосфаколом в дозе 1,5 ЗД50 у иивотны выявлено 2 типа реакций по проявлению динамики исследуемых пока зателей (табл.1). У 33% кошек (I тип реакций) до 30 мин наблюдали учащение потенциалов действия (ПД) нейронов в 2-2,5 раза по отношению к исходному значению с тенденцией к формированию пачечно-группового типа разрядов, увеличен® количества <ЭШ на 50-56%. После повышения сАД отмечали его снижение на 20$ к 30 мин отравления, при этом нарушения микроциркуляции крови в сосудах коры не выявлялись. Содержание Сас снижалось на 10% к г мин. Коэффициенты корреляции (г) составили для динамики Сас и количества ©Ш - 0,7, Сас и сАД 0,95.

У &7% животных (2 тип реакций) регистрировали торможение МН и уменьшение количества Ш1 (на 65$ к 30 мин). После 5-мнн прессорного эффекта отмечали падение сАД на 65$ к 30 мин, при этом выявляли выраженные расстройства микроциркуляции крови в сосудах коры. Содержание Сас к 30 глин снижалось на 29,5$. Значе ния г составили для динамики Сас и количества SAH 0,92, CaQ и шкроциркуляции 0,9, Сас и сАД 0,92, микроциркуляции к сАД О,

Введение амизила ломотным этой группы на 30 мин после отравления фосфаколом сопровождалось нормализацией сАД и улучшением гемодинамики в сосудах коры. Уровень содержания Сас'после инъекции амизила повышался на 10 мин на 8$, но к 20 мин оставался ниже исходного на 18$. ИАН появлялась через 5-10 мин, однако имела неустойчивый характер.

После введения фосфакола в дозе 3,0 ДД5д в первые 2-3 мин у животных регистрировали повышение сАД на 40$ и увеличение частоты потенциалов действия нейронов в 4-5 раз по отношению к доходному уровню. ЖН угнеталась после 5 мин, количество ФАН к 20 мин снижалось на 80$, на 30 мин SAH не выявлялись. Уровень содержания Сас уменьшался к 20 мин на 17$, а к 30 мин - на 47,5$. К 30 мин сАД снижалось на 75$; в этих случаях после 5 мин регистрировали выраженные расстройства микроциркуляции крови, а после 20 мин - прекращение кровотока. Значения г составили для динамики Сас'и количества ®Ш 0,95, Сас и-микроциркуляции 0{9, Сас и сАД 0,95, микроциркуляции и сАД 0,95. Введение амизила животным этой группы на 30 мин после отравления фосфаколом не сопровождалось восстановлением исследуемых показателей. ИАН появлялась после 10 мин, однако имела неустойчивый характер; на 10-20 мин регистрировали единичные К 15-20 мин после инъекции амизила уровень содержания CaQ оставался ниже исходного на 33$. К 20 мин сАД составляло 75% от исходного, а кровоснабжение коры мозга оставалось на низком уровне (табл.1).

Через 2 мин после введения фосфакола в дозе 4,5 ЛД^д у кошек цроисходило стремительное падение сАД на 65-90$, лреедащение кровотока в сосудах коры, угнетение ИАН. На 5-10 мин ФАН не выявлялись. К 5 мин уровень содержания Сас уменьшался на 29$, к 10 мин - на 40$ (табл.1). Введение амизила в этих случаях на 3-5 мин после отравления фосфаколом не оказывало положительного эффекта: показатели сАД, микроциркуляции, ИАН и Сас не.восстанавливались (табл.1).

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о вовлечении кальциевой системы регуляции в реакции структур коры мозга на фосфакол. Выявлены дозозависимые эффектычЪсфакола на сдвиги содержания Сас, коррелирующие с изменениями ИАН и гемодинамики в коре мозга. Установлена неоднородность реакций исследуемых показателей при отравления кошек фосфаколом в дозе 1,5

Таблица I

Эффекты фосфакола- на динамику исследуемых показателей

Врет * Доза фос-" Содержание * Количество* Систоличес-'Микро экспе- факела мембраносвя- фоновоак- кое артериа- цирк римента СлД^т занного каль- тивных ней- льное дав- ляция (мин) ии; дня (% к исх.)ронов к- ление (% к 1фови

.исх.) . исх.) .(балл

5 1,5: I тип -5,1 £ 0,9 137,5 £ 3,2 113,3 £ 5,9х 5

2 тип -?,5 ± 1,3 85 £ 2,4 95 £ 5,9х 4

3,0 -3,1 ^ 2,1х 85 £ 3,2 56 £ 4,2 4

4,5 а -28,8 £ 2,4 0 6,5 £ 2,1 I

10 1,5: I тип -5,1 £ 0,96 151,5 £ 3,6 96 £ 5,45х 5

2 тип -12,7 ± 0,9 48 £ 3,3 54,3 £3,7 4

3,0 -16,9 £ 1,9 35 £ 3,6 43 £ 5,2 3

4,5 -39,6 ±. 2,6 0 - I

15 1,5: I тип -6,2 ± 1,2 153,2 £ 4,4 89,3 £ 3,35 5

2 тип - 17 £ 1,3 45 £ 4,7 47 £ 4,4 3

3,0 -29,52 £ 3,1 25 £3,4 41 £4,2 3

20 1,5: I тип - 7,3 1 1,3 150,8 £ 5,1 85,5 £ 2,35 5

2 тип -19,5-£ 1,3 42 £ 3,8 38,5 4 4,1 3

3,0 -34,8£ 2,2 20 £ 5,2 41 £ 4,1 3

25 1,5: I теп - 7,4 ± 1,2 149,0 4 3,2 80,8 £ 3,15 5

2 тип -22,5 £ 1,5 39,4 £ 3,14 35,8^ 3,8 3

3 -40,1 £ 1,9 7 £ 2,3 35 £3,7 2

30 1,5: I тип - 9,5 £ 1,0 156 £ 3,9 79,3 £ 2,85 5

2 тип а - 29,5 £ 2,8 34,5 ± 7,8 34,8 £3,7 3

3,0 а -47,5 £ 2,5 0 25 £3,2 I

40 1,5: 2 тип -21,2 £ 2,4 39,5 £ 3,1 % £ 2,2х 4

3,0 -35,1 £ 3,1 7,5 £ 2,3 70 £ 3,4 3

50 1,5: 2 тип - 18 £ 2,2 £ 3,3 97,5 £ 2,1х 4

3,0 - 33 £ 3,7 В + 2,3 74,5 £3,2 4

а - момент введения амизила.

Различия достоверны с исходным уровнем (р<0,05);

х - различия недостоверны ( р > 0,05).

5%0* Отчетливо проявившиеся два типа изменений ИАН и сопутствующие характерные сдвиги содержания Сас, по-видимому, связаны з непосредственным влиянием уосйакола на холинергическую синапти-ческую передачу ( I тип реакций), а также с развитием циркулятор-ной гипоксия (2 тип реакций). Наиболее выраженные изменения со стороны регистрируемых показателей выявлены при введении шосфа-кола в дозах 3 и 4,5 ЛДцд, приводящих к развитию ишемии нервной ткани.

Полученные результаты относительно динамики Сас в коре головного мозга при действии шоссуакола дополняют немногочисленные данные об изменениях внутриклеточного содержания Са2+ при отравлениях <±0С. Выявленное ранее повышение концентрации ионов Са2+ в цитозоле нейронов при действии зарина, зомана, табуна (¡Vatanabe н.к. et al.,1^86), очевидно, в значительной степени связано с высвобождением Сас, что наиболее характерно проявляется при отравлениях фосйаколом в дозах, превышающих 1,5 ДДдд. Похожие сдвиги содержания Са„ в горе' мозга кошек были'обнаружены в экспериментах с использованием коразола-и при аноксии ( Самойлов LL0, И соавт., 1969; Lazarewicz J.VV. et al., 1987)-Mohiio полагать, что в условиях отравления фосфаколом активация избыточным аце-тилхолииом М-холинорецепторов приводит к усиленному гидролизу трифосфошюзитядов (№1), что подтверждается' некоторыми экспериментальными исследованиями. В частности, обнаружено-снижение содержания ТШ в коре мозга'юшек, отравленных фосфаколом в дозе 1,5 ДЦзд(Каменев АЛ. и соэет., IS9I), активация фосфолипазн С (-Davies о.в., riolub B.J., л~)S3) и увеличение содержания конечного продукта гидролиза ТШ - нлозитол - I - фосфата ( Savolainen 1С.л., et al., 1989) £ головном мозге грызунов при интоксикациях • -ЭОС. Пак известно, один из продуктов гидролиза ТФИ - инозит- 1/1,5 - трифосфат-(К53) индунпрует енход ионов Са~+ из эндо-плазматического ретикулума в цитозоль ( Berridge ь.. J., 1987; ffa-horskx s.h., 1988). Дополнительное повышение концентрации ионов Са*^ в цитозоле может быть обусловлено их высвобождением из плазмалемыы при гидролизе ТфИ (Киселев Г.В., 1987; Abdel-latif А.д., 1986). Вопрос об усилении входа из внеклеточного пространства в цитозоль нейронов при действии $0С в дозах, не вызывающих расстройства гемодинамики мозга, до ста пор остается открытым ( Dretciien K.L. et al., 1986; fttsler J,A., Forney B.3. , 1986).

Одним из важных последствий повышения концентрации ионов Са2* в примембранной постсинаптической области, а также активации протеизшшазы С, которая вызывается вторым продуктом гидролиза ТФИ -1,2-диацилглицеролом, является модификация работы К4"- и Са^ - ионных каналов, что приводит к изменению возбудимости плазмалеммы нейронов (81айео2;ек В1., 1987). Вероятно, этот механизм связан с обнаруженной в экспериментах характерной перестройкой нейронального паттерна с формированием пачечно-груп-повото типа разрядов и увеличением количества Ш1 у животных I типа при отравлении фосфаколом в дозе 1,5 1Щ50. Выявленные электрофизиологические изменения функционального состояния нейронов согласуются с данными авторов, показавших, что холиномиметики, ацетилхолин и зоман индуцируют увеличение частоты потенциалов действия нейронов, группирование спайков и активируют "молчащие" нейроны (Ноздрачев А.Д., федин А.Н., -1987; Вма^аи с.м. et а1., 1985; ^еэкоу К. еЪ а1., 1986; Вешай Р.О., 1989).

Торможение ИАН и уменьшение количества (САН при действии фос-факола в дозе 1,5 ДЦ^д у животных со 2 типом реакций сопровождается глубоким падением содержания Сас на 29,5$ на фоне развития циркуляторной гипоксии. Установленные значения кросс-корреляционных функций свидетельствуют о сильной динамической взаимосвязи сдвигов содержания Сас с изменением ИАН и микроциркуляции крови в сосудах коры при отравлении фосфаколом. Похожие соотношения между динамикой содержания Сас и нейрональной активности обнаружены ранее в условиях гилоксического воздействия различной степени тяжести (.Ьагагевасг еь а1., 1987; ЗатоНоу Й.О. et а1., 1990), что подтверждает представление о важной роли изменений уровня Сас в механизмах контроля возбудимости нейронов.

Описанный выше характер реагирования нервной ткани на ФОС осложняется в случаях сопутствующего расстройства гемодинамики мозга при отравлениях фосфаколом в дозах более 1,5 ¿Ц^д. Возникающая в т;;кой ситуации ишемия мозга инициирует глубокие нарушения функций,нервных клеток, о чем свидетельствует быстро возникающее подавление ИАН при действии фосфакола в дозах 3 и 4,5 ЛД50.

Согласно современным представлениям, расстройству внутриклеточного гомеостаза придается ведущая роль в механизмах повреждения нейронов при ишемии, отравлениях токсическими вещества-

ми (Самойлов М.О., 1985; Shier W.T., я>35; Choi-D.W., 1988; Воп-iy S.C., 193Э; tieyer S.B., 1989; Siesjö В.К., Bengsson F.,

IS89). Последствием устойчивого повышения концентрации внутриклеточного свободного Са^*" может быть активация процессов пере-кисного окисления липидов (ПОЛ), приводящих к деструктивным повреждениям нервных клеток (Kaplan J. et a"1., 19S7; Sisjö Б.К., Sengfcsson F., 1989).

Таким образом, при отравлениях ЮС в смертельных дозах следует учитывать, что наряду с нарушениями холинергической синапти-iecKoM передачи развивается комплекс нейротоксических эффектов, этветственных за структурно-функциональные повреждения нейронов. 1еэффективность действия амизила, вводимого на высоте интоксика-хая фосфаколом (при отравлениях в дозах 3, 4,5 ЛД^д), вероятно ■ звязана как с изменением функционального состояния М-хр ¡три действии 30G в ВЫСОКИХ дозах (Chambers J.S., Chaabers H.W., 1987; Pintor A. et al.,1988), так и с последствиями ишемии мозга. Следовательно, даке при своевременном назначении антвдота, действие соторого направлено на купирование симптомов холинергической ги-1ерактивации, повреждения нейронов глогут проявляться в отстав-¡енные сроки отравления ЗОС в связи с постишемическими расстройками внутриклеточного Са^* гомеостаза, инициацией ПОЛ ( Kaplan J. et al., 198?; Siesjö В.1С., Bengtsson У., 1989).

2. Влияние фосфакола в летальных дозах на содержание цАШ, активность аденилатцкклазы и фосфодиэстеразы в сопоставлении с шенениями импульсной активности нейронов в коре головного мозга.

Как отмечено в предыдущем разделе, после введения фосфакола ¡ дозе 1,5 ЛД^д у животных выявлены два мша реакций по проявле-1шэ динамики ИА.Н, сАД и другим исследованншд показателям. У ко-!ек с I типом реакций (50$ животных) на фоне повышения частоты ¡Д нейронов, увеличения количества Ú11, небольшого падения сАД : 30 мин отравления выявлено достоверное (р í 0,05) снижение ба-альной и стимулированной норадреналином активности АЦ на 27$ и 1,2%, соответственно, уровйя цАМФ на 43,5$, активности общей ЩЭ на 23$ (табл.2).

У кошек со 2 типом реакций (50$ животных) на фоне торможения АН, уменьшения количества ФАН на 60-65$ и падения сАД на 67$ ' ; 30 мин обнаружено достоверное повышение содержания цА.1® на 09$, базальной и стимулированной норадреналином активности АЦ

на 35$ и 34,5$, соответственно, достоверных изменений активности общей фЦЭ не выявлено (табл.2).

После введения фосфакола в дозе 4,5 ЛДдд у животных ко 2 мин регистрировали резкое падение с АД на 85-90$, подавление ИАН. На 5-10 мин не выявлялись. Содержание цА.МФ к 4-8 мин отравления возрастало на 391$. Базальная и стимулированная норадренал! ном активность АЦ увеличивались на 60$ и 66$, соответственно. Активность общей ФДЭ повышалась на 28,6$ (табл.2).

Обнаруженные неодинаковые изменения со стороны цАМФ-системы при отравлениях фосфаколом вызывают определенный интерес. Выявленное у животных с I типом реакций при действии фосфакола в дозе- 1,5 ЛД5д достоверное понижение активности компонентов ц/ШФ -системы согласуется с результатами авторов, обнаруживших ранее снижение уровня ц/ШФ, базальной и стимулированной норадреналино( активности АЦ в головном мозге грызунов, отравленных <ЮС в дозах до I ЛД50 (Bleyer Н. et al., 1976; 3ris¡£ A. et al.,1980; Blen-kisop i.s, et al., -¡984). 'Очевидно, при отравлениях фосфаколом в дозах, не сопровождающихся развитием циркуляторной гипоксии, снижение содержания ц^МФ обусловлено ингибированием АЦ вследствие стимуляции избыточным ацетклхолином М-хр нейронов мозга (Nathanson N.M.,*1987). Понижение активности АЦ шкет также происходить в результате изменения функционального состояния ITS -связывающих белков, сопрягающих рецепторы плазмалемвд с АЦ, в результате модификации свойств плазматической мембраны при действии ФОС (Stale A. et al., 1989). Вместе с тем ингибирование АЦ может происходить вследствие увеличения уровня кальмодулина в нейронах ЦНС, как это бнло показано при отравлениях зарином, 3оыаном, табуном в дозах до I ДДзд (Hoskias В. et al., 1986).

У другой группы животных при действии фосфакола в дозе 1,5 JUÍ5q на фоне торможения ИАН а развития циркуляторной гипоксии обнаружено увеличение содержания цАМФ, базальной и стимулированной норадреналином активности АЦ. Наиболее сильное повышение активности компонентов системы цШФ выявлено при отравлении фосфаколом в дозе 4,5 ЗД50, приводящей к стремительному развитию ишемии мозга и подавлению электрической активности нейронов. Полученные результаты согласуются с немногочисленными данными авторо показавших увеличение активности АЦ и уровня цА.М§ в головном мо ге грызунов, отравленных ЗОС в судорожных дозах (Coult D.B. et

Таблица 2

Влияние фосфакола на компоненты цАМф.системы

Активность аденилатциклазы : Гп71рпжяния ,тДМг5 Активность общей цАМФ/мг'белка -бмин Д^ДД КЖ^

белка

. пмоль :базальная

стимулированная.' норадреналином

мин.

I тип

Исходный уровень

Доза 1,5 ^50 фосфа- 2 тип

кола 4.5ЛД50

266,2 ¿ 6,56 394 ±. 12,2

195 ±. 7,9 247,6 * 5,9

359,6 ±.8,4 529,8 ±.3,1

425,8 ± 14,4 653,7 ^ 12

28,34 2,59 16,04 ± 1,95 59,23 ± 8,4

139,14 ±. 11,9

125,43 ±. 7,3 96,56 ±. 5,29 141,45 ±. 9,2 2

161,3 ¿4,5

Различия достоверны с исходным уровнем (р < 0,05); х - недостоверные различия ( р > 0,05).

al., 1979; Blenkinsop I.S. et al., 1984; Sevaljevic L. et al., 1984). Установлено, что циркуляторнэя гипоксия (ишешш) головного мозга индуцирует резкое увеличение содержания цАМФ в результате активации АД (Ласт У.Д., Пассоннеу Д.В., I982;Lust W.D. et al., 1977? Domansfca-Janik X., Pylova S., 1989)«Одной Из причин повшения активности АЦ при шемии является увеличение сс держания в мозге нейромедиагоров (дофамина, норадреналина, аденс зина и т.д.), обладающих стимулирующим эффектом на АЦ (Палъмер Д.К., Меньян А.А., .1982; Damsma Cr. et al., 199>, Obreaovifcch Т.] efc al., 1990). Повышение концентрации дофамина, серотонинг обнаружено также в головном мозге млекопитающих при действии £0С В судорожных дозах ( Coudray-bucas С. et al., 1987; Tanasijevic D. et al. ,1989; Posbraey P.,1990).'Таким образом, увеличение ypoi цАМФ в нейронах мозга при отравлениях <ЮС в смертельных дозах мс жет быть связано с повышением концентрации нейромедиаторов, акч вирующих АД. Очевидно, изменение содержания цАМФ в этих случаях обусловлено повышением активности АЦ, поскольку несмотря на некс торый рост активности общей ФДЭ уровень цАА1ф возрастает почти в 5 раз по сравнению с исходным.

Следовательно, изменения со стороны системы цАМФ при отра! лениях ФОС носят сложный характер и зависят как от непосредстве! ного действия избыточного количества ацетилхолина наМ-хр в ре; льтате необратимого иягибирования ацетилхолинэстеразы, так и от влияния сопутствующего анемического фактора. Учитывая важную poj цАМФ- зависимой протеинкиназы в модуляции состояния ионных KaHaj и Еозбудимости нервных клеток (Микеладзе Д.Г., 1983; Костюк П.Г. 1986; bewitan I.E., 1988) можно полагать, что выявленные разнс направленные изменения содержания цАМФ цри отравлениях различно! степени тяжести могут вносить определенный вклад в неодинаковый характер изменения функционального состония нейронов цри дейск фосфакола в дозах 1,5 - 4,5 ДП,5д.

3. Влияние оксиметацида и амизила на динамику содержания мембраносвязэнного кальция, импульсной активности нейронов и мш роциркуляции крови в коре головного мозга при отравлении фосфакс лом в летальных дозах.

На фоне профилактического действия оксиметацила после введения фосфакола в дозе 1,5 ЛД5д в течение 30 мин наблюдения у животных? регистрировали повышение частоты ГЩ нейронов в 1,5-2

раза и увеличение количества ФАН на 30$ по сравнению с исходным уровнем. Вслед за 5 мин прессорным эффектом отмечали снижение Щ на 30$ и умеренное нарушение кровотока в сосудах коры мозга ;табл.3). Содержание Сас уменьшалось на 10$. После инъекции амизила на 30 мин отравления через 15-20 мин происходило восстановление исследуемых показателей. Значения г составили для динамики )ас и количества ФАН - 0,75; Сас и микроциркуляции 0,62; CaQ и сАД 0,85; микроциркуляции и с АД 0,75.

В условиях профилактического назначения-оксиметацила введение фосфакола в дозе 4,5 ДЦзд сопровождалось сильным падением Щ на 60$ и прекращением кровотока в сосудах коры мэяга к 20 мин ;табл.3) ИАН подавлялась после 5 мин, к 20 мин количество ФИН умещалось на 80$. Содержание Сас к 20 мин отравления снижалось за 26,5$. Введение амизила на 20 мин интоксикации сопровождалось нормализацией сАД, улучшением микроциркуляции крови в сосудах хоры мозга, появлением ИАН, увеличением количества ФАН (табл.3). 1осле 20 мин действия амизила выявлено повышение частоты ЦД нейронов в 1,5 - 2 раза и количества ФАН на 45-65$ по отношению s исходному уровню. Содержание Сас к 30 мин после инъекции амизила оставалось ниже исходного значения на 13,5$. Значения х доставили для динамики Са0 и количества ФАН 0,6; Сас и мшсроцир-куляции 0,9; Сас и сАД 0,82; микроциркуляции и сАД 0,85.

Полученные результаты свидетельствуют о защитном действии эксиметацила на вызванные фосфаколом изменения гемодинамики, электрической активности нейронов мозга и содержания CaQ. Этот эффект наиболее отчетливо проявлялся при сочетанном использовании оксиметацила и амизила при отравлениях фосфаколом в дозах [,5 и 4,5 ДПзд. Установлено, что оксиметацил нивелирует гетерогенность реакций исследуемых показателе^ у животных, отравленных Фосфаколом в дозе 1,5 ÍSgg, снижая их выраженность. Введение амизила этим кошкам сопровождалось восстановлением ИАН, гемодинамики, содержания Сас в коре головного мозга и сАД.

В условиях сочетанного назначения оксиметацила и амизила отравление фосфаколом в дозе 4,5 ДДэд характеризовалось отсрочен-ностью и меньшей степенью выраженности изменений нейрональной активности, шщроциркуляцш крови и содержания Сас. Введение амизила а этих случаях на высоте интоксикации оказывало положительный эф-

Таблица 3

Влияние оксиметацила и амизила на динамику показателей цри отравлении фосфаколом

Время.'Доза 'Содержание мем-' Количество * Систоличес-' Микро-

экспе- фосфа- браносвязанного фоновоактив- кое артери- циркул

римен- кола кальция- (% к ных нейронов альное дав- ция кр

та (Дсп) исх.) {% к исх.) ленив ви

(мин) ои {% к исх.) (баллы

5 1,5 - 3,2 £ I 4 125 £ 2 5 95 £ 2 5х 5

4,5 -10,1 £ I 2 67,5 £ 2 2 63 £ 3 2 4

10 1,5 - 4,4 £ I 8 140 £ 2 7 85 £ 3 I 4

4,5 -19,4 £ I 6 52,6 £ 2 3 44 £ 3 0 3

15 1,5 - 6,5 £ I 6 130 £ 2 4 82 £ 2 8 4

4,5 -23,6 £ I 2 41,8 £ 2 0 41,4±. 2 9 3

20 1,5 - 7,4 £ I 5 135 £ 2 6 75 £ 2 6 4

4,5 а -26,6 £ I I 21,2 £ 2 3 39,3£ 3 4 I

25 1,5 - В,7 £ I 6 133 £ 2 7 VI £ п 8 4

4,5 -2-1,2 £ 2 2 31,5 £ 2 5 73 3 2 3

30 1.5 а - 9,9 £ I 85 130 £ 2 5 70 ± 3 0 4

4,5 - 17 £ I 9 49,5 £ 2 7 ВЗ £ 2 8 4

40 1,5 - 3,8 £ I 6 125 £ 3 2 90 £ 3 2 4

4,5 -14,7 £ 2 I 118,6 £ 2 9 89,8 £ 3 0 4

50 1,5 - 1,9 £ 2 Iх ПО £ 4 9х 95,5 £ 3 2х 5

4,5 -13,5 £ I 8 165,3 £ 5 2 94 £ 3 4х 4

а - момент введения амизила

Различия достоверны с исходными значениями (р < 0,05) х - (р > 0,05).

кг в отличие от экспериментов без профилактического использова-я антиоксиданта. Обнаруженный факт пролонгирования ИАН на фоне йствия оксиметацила и ее восстановления после относительно доильного периода нарушенного кровоснабжения коры мозга, вызванно-фосфаколом в дозе 4,5 Jffl^g. свидетельствует о защитном влиянии симетацила на электрогенные свойства плазматической мембраны.

Можно полагать, что антиоксидангы, встраиваясь в плазмалем-нейронов, выполняют роль не только ловушек свободных радикалов, и изменяют свойства мембранных лялидов, что, вероятно, повышает тойчивость мембран к действию-повреждающих факторов (Бурлакова Б., Хохлов А.П., IS85; Чернявская 1.И. и соавт., 1989). Усиле-е адаптивных потенций нейронов на воздействие фосфакола, возмож-, связано с изменением оксиметацилом функционального состояния рвных клеток мозга опосредовано через модификацию активности С (Samoilov k.O. et al., 1990).

Положительный эффект применения амизила в условиях профилак-ческого назначения оксиметацила может быть обусловлен влиянием тиоксиданта на свойства плазмалеммы и активность гД-холинергичес-й рецепторной системы (Чернявская Л.И. и соавт.; 1989; Хохлов П., 1990).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использованный в работе методический подход позволил in situ провести комплексное исследование состояния важных компонен-в ÜPC-содержания мембраносвязанного кальция, цАМФ, активности епилатциклазы и фосфодиэотвразы циклических нуклеотидов в сопо-авлении с изменениями функционального состояния нейронов и гею-намики в коре головного мозга кошек при отравлении фосфаколом, также выявить некоторые механизмы защитного действия оксимета-ла.

Результаты работы свидетельствуют о сложном влиянии фосфа-ла на биоэлектрическую активность нейронов, микроциркуляцию ови и состояние ВРС. Обнаружено вовлечение кальциевой и цикло-. ;енозшшопофосфатной систем регуляции в реакции структур коры тонного мозга на гТосфакол. Выявлено дозозависимое влияние фосфа-ла на содержание внутриклеточного кальция и цА¿1Ф, активность , и общей ЗДЭ в корреляции с изменениями импульсной активности кронов и гемодинамики в коре мозга. Установлена неоднородность

реакций исследуемых показателей при отравлении фосфаколом в дозе 1,5 ДД^д, обусловленная, очевидно, неодинаковыми эффектами фос-факола на кровоснабжение мозга животных.

Полученные данные углубляют представления о нарушениях мехг низмов внутриклеточной сигнальной трансдукции при поражениях ФОС Выявленные сдвиги со стороны Са^"-и цАМФ - систем внутриклеточно} регуляции обусловлены'как непосредственным влиянием фосфакола на холинергическую синаптическую передачу, так и сопутствующими эффектами циркуляторнрй гипоксии. Обнаружено снижение лечебного действия амизила но мере утяжеления интоксикации вплоть до отсутствия его эффекта при действии фосфакола в дозе 4,5 ДПзд« Установлено, что оксиметацил оказывает защитное действие на электрогенные свойства пиазмалеммы нейронов, гемодинамику и содержание Сас при отравлениях фосфаколом. Наиболее отчетливо этот эффект проявился при сочетанном применении аитиоксиданта и амизила. что выражалось в восстановлении функционального состояния нейроне кровотока в сосудах коры и'содержания Са„ при действии фосфакола в дозе 1,5 ДПзд. Вместе с тем, при отравлении фосфаколом в дозе 4,5 ЛД50 на фоне нормализации общего кровотока после инъекции амизила не происходило полноценного восстановления ИАН, мнкроцир-куляции крови и содержания Сас в коре мозга. В связи с этим целесообразно в профилактике и лечении отравлений ¿ЮС, наряду с использованием традиционных антидотов, проведение дальнейшего поиска- и-применения средств, направленно влияющих на нормализацию кровоснабжения мозга, процессов перекисного окисления липидов, ш ханизмов внутриклеточной сигнального трансдукции.

ВЫВОДЫ

1. Отравление кошек фосфаколом в летальных дозах приводит к нарушениям механизмов внутриклеточной сигнальной трансдукции в коре головного мозга, о чем свидетельствуют выявленные изменения активности кальциевой и цикдоаденозинмонофосфатной систем регуляции метаболизма и функций нейронов.

2. При отравлении фосфаколом в дозе 1,5 ЛД^ обнаружены два типа реакций, различающихся по изменениям содержания мембраносвя-занного кальция, цАЩ, активности адекилатциклазы и фосфодиэсте-разы, динамике импульсной активности нейронов, микроциркуляции крови в сосудах коры головного мозга и систолического артериаль-

ого давления. Реакции I типа проявляются небольшим снижением одеркания Сас; цАМФ, активности АД и <6ДЭ, повышением частоты ИАН количества ФАН, незначительным падением сАД. Для реакций 2 типа а тоне развития циркуляторной гипоксии характерны выраженное синение содержания Сас, повышение уровня ц/ШФ, увеличение активнос-и АЦ, торможение ПАН и уменьшение количества ФАН.

3. При отравлении животных фосфаколом в дозе 4,5 ЛД^ стре-ителыю'развивается ишемия коры головного мозга, угнетается ИАН, озникают выраженные расстройства механизмов внутриклеточной ре-уляции (значительно снижается содержание Сас, увеличивается уро-ень цАМФ, повышается активность АЦ и 5ДЭ).

4. Введение амизила кошкам, отравленным фосфаколом в дозах ,5 ЛД50 (животные со 2 типом реакций) и 3 ДЦ^д приводит к час-ичному восстановлению содержания Са„, ИАН и гемодинамики в коре

v/

оловного мозга. При увеличении дозы фосфакола до 4,5 ЛД5д ле-збный эфрект амизила исчезает.

5. Профилактическое назначение окснметацила усиливает дейст-ие амизила при отравлении фосфаколом в дозе 1,5 что выра-ается в нормализации содержания Сас, I'M, микроциркуляции крови

сосудах коры и сАД. При отравлении фосфаколом в дозе 4,5 ЛД5д з фоне нормализации сАД проявляется тенденция к восстановлению здеркания Са„, ИАН и гемодинамики в коре головного мозга.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Реакции коры головного мозга кошки при отравлении фосфа-злом // Материалы XI науч.конф.молодых ученых и специалистов {адемии / Боен.-мед.акад. - Л., 1990. - С. II-I2.

2. Применение Э1М при анализе реакций структур головного >зга на действие фосфакола IJ Актуальные проблемы теории и прак-ши военно-медицинской информатики.*- Л., 1990. - С. 21.(соавт. зршинина Е.А.).

3. Протектирующий нейротропный эффект окснметацила при ос-;ом отравлении фосфаколом // Актуальные проблемы лекарственной жсикологии. - , 1990. - С. 128. (соавт. Самойлов М.О., Семе--iB Д.Г., Софронов Г.А.).

4. Влияние фосфакола на внутриклеточные регуляторные системы коре головного мозга кошки // Токсикологические проблеш хими-¡ских катастроф. - Л., 1991. - С.57-58.

( соавт. Самойлов М.О., Тюлькова Е.И.).

5. Комплексный подход к разработке средств профилактики и лечения поражений 500, направленный на коррекцию нарушений механизмов внутриклеточной сигнальной трансдукции // Токсикологические проблемы химических катастроф. - Л., 1991.' - С.99-101. (соавт. Самойлов М.О., Софронов Г.А.).

6. Комплексный подход к оценке антиоксвдантной защиты прк отравлении фосфаколом // Фармакологическая коррекция гипоксичес ких состояний. - Гродно, 1991'. - С. 334.(соавт. Софронов Т.А., Самойлов М.О.).

7. Влияние оксиметацила на микроциркуляцию и импульсную активность нейронов в коре большого мозга кошки при остром отра ленш фосфаколом // Бюл.эксперш.биол. и мед. - 1991. - Л 8. -- С. П5-П7.(соавт. М.О.Самойлов, Д.Г. Семенов, Г.А. Софронов)

8. Уровень содержания циклического аденозинмонофосфата в зрительной и моторной областях коры больших полушарий головного мозга кошки // йн-т физиол. АН СССР-. ,- Л., 1991. - 8 С. - ДЕЛ в ВИНИТИ, № 4121 - В 91.(соавт. Болехан Е.А.).

Подписано (С печати ? . Заказ /77

формат бумаги 60x84 1/16, ^¿ЙГпеч.л. Бесплатно. ПО - 3 "Ленуприздага". 191104 Ленинград, Литейный пр., дом № 55.