Автореферат и диссертация по медицине (14.00.17) на тему:Молекулярно-клеточные механизмы обучения у виноградной улитки

од

УДК 612.821.6+612.822.3

НИКИТИН Владимир Павлович

МОЛЕКУЛЯРНО-КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ОБУЧЕНИЯ У ВИНОГРАДНОЙ УЛИТКИ

(14.00.17 •• нормальная физиология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва 1995

Работа выполнена в лаборатории функциональной нейрохимии НИИ нормальной физиологии им.П.К.Анохина РАМН.

Научный консультант - доктор медицинских наук,

профессор В:В.Шерстнев

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук.

профессор Ю.А.Фадеев доктор биологических наук, профессор А.Ю.Буданцев доктор психологических наук профессор Г.Г.Аракелов

Ведущая организация: Институт высшей нервной деятельности

и нейрофизиологии РАН

Защита диссертации состоится 1 июня 1995 г.

в 10 часов на заседании Специализированного Ученого Совета

Д.001]08.01 при Научно-исследовательском институте нормальной

физиологии им.П.К.Анохина РАМН

по адресу: 103009, г. Москва, ул.Герцена, д. 6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Автореферат разослан

апреля 1995 г.

Ученый секретарь

Специализированного Ученого Совета, кандидат медицинских наук

В.А.Гуменюк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Изучение молекулярно-клеточных основ обучения и памяти является наиболее актуальной проблемой современной нейробиологии. Однако, несмотря на очевидные успехи, достигнутые в последние годы в этой области, механизмы молекулярных событий, происходящих в мозге при обучении, во многом остаются невыясненными. Для настоящего этапа развития исследований в рамках рассматриваемой проблемы характерно существование многочисленных, зачастую противоречивых гипотез. Одними из наиболее плодотворных и перспективных теоретических представлений для изучения молекулярно-клеточных механизмов обучения и памяти явились гипотеза "конвергентного замыкания условного рефлекса" и химическая гипотеза интегративной деятельности нейрона предложенные академиком П.К.Анохиным (1968, 1974). Согласно этим представлениям, для формирования условной связи необходима конвергенция на одной и той же нервной клетке возбуждений различной сенсорной и биологической модальности. Мотивацион-ные, условные и подкрепляющие возбуждения опосредуются гетерохи-мическими синаптическими процессами в нервных клетках. Специфические молекулярные преобразования, вызванные этими возбуждениями, взаимодействуют в мембранных и цитоплазматических компартмен-тах нейрона на основе генетически детерминированных ферментативных процесзов, обеспечивая нейрохимическую интеграцию возбуждений.

Ряд положений этих концепций нашли подтверждение в многочисленных исследованиях, в которых представлен обширный экспериментальный материал о специфических нейрохимических механизмах опосредования конвергирующих к нейрону возбуждений и их последующей обработке з субсинаптической области, цитоплазме и ядре (Кругли-ковР.И., 1981; Соколов E.H., 1981; Byrne J., 1987; АшмаринИ.П., Титов С.А., 1988; Matties Н., 1988; Шерстнев В.В.. 1990; Анохин К.В., Судаков К.В.. 1993; Hawkins R. et al.. 1993 и др.).

Современные взгляды на клеточные механизмы обучения базируются на представлении о пластических свойствах нервных клеток. Под этим термином понимают "длительные модификации клеточной и синап-гической функций, которые позволяют объяснить простые видоизменения поведенческих реакций" (Кэндел Э., 1980). Имеющиеся к настоя-дему времени данные позволили характеризовать два основных типа мастических изменений, возникающих в нервных клетках при обучении: избирательное или неизбирательное изменение свойств нейронов

- г -

чо отношению к конвергирующим или передаваемым возбуждениям. В основе неизбирательной реактивности нервных клеток может лежать изменение свойств всей или значительной части электрогеьной мембраны, а также одновременное изменение эффективности всех синапти-ческих "входов" или "выходов" нейронов. Таким образом, г.ри обучении у нейронов, обладающих описанными свойствами, информация "кодируется" на уровне целой клетки и она функционирует как один "информационный элемент". Данный тип пластичности нервных клеток называют cell-wide plasticity (Hawkins R. et al.. 1989), whole-cell plasticity (Billy A., Walters E., 1989), нейрональная пластичность (Фролов A.A., Муравьев И.П., 1987). В настоящей работе использован термин "общенейрональная" пластичность. Общеней-рональный тип пластичности описан у большинства изученных нейронов, вовлекаемых в процессы обучения. Однако, наиболее детально его механизмы исследованы для центральных сенсорных нейронов моллюсков аплизии и гермиссенды (Byrne J.. 1987; Hawkins R. et al., 1993), a также некоторых других клеток мозга позвоночных и беспозвоночных животных (Byrne J., 1987).

В основе избирательного изменения свойств нейронов по отношению к конвергирующим возбуждениям может лежать синапс-специфическая пластичность, одной из разновидностью которой является "синапс Хебба". "Информационная емкость" синапс-специфического типа пластичности значительно больше таковой в случае общенейронально-го типа пластичности - нейрон может иметь несколько сотен или ты--:яч избирательно регулируемых синаптических входов. Наиболее глубоко механизмы этого типа пластичности изучены на нейронах мозга млекопитающих и. в частности, клетках гиппокампа при выработке долговременной потенциации.

Процесс формирования пластических перестроек нейронов при обучении может быть подразделен на две стадии: кратковременную и долговременную. Кратковременная стадия связана, по-видимому, с 'ктивацией систем вторичных внутриклеточных посредников и модификацией свойств уже синтезированных белков (Byrne J., 1937; Massi-•otte G.. Baudry G., 1991; Hawkins R. étal., 1993). Долговременные пластические перестройки нейронов сопряжены с синтезом белко-- их молекул и иРНК (Davis H., Squire L., 1984; Goelet P. et al., 1386). Для понимания принципов долговременных изменений'необходимо изучить основные этапы вовлечения белок-синтезирующего аппара-i в механизмы обучения: передачи конвергирующих на нейрон воз-

буждений от мембраны к геному, его активации и реализации функций синтезируемых белков. Достаточно конструктивная, хотя далеко неполная, схема долговременных пластических эффектов предложена для сенсорных нейронов системы оборонительного поведения аплизии (Со-е1е1 Р. е1 а1., 1987). Согласно этой схеме вторичные посредники, такие как ионы кальция или цАМФ. вовлечены в реализацию не только кратковременных, но и долговременных эффектов обучения. В частности, они могут фосфорилировать белки-регуляторы процессов транскрипции, которые затем действуют на энханцсрную последовательность структурных генов ДНК. вовлекаемых в долговременные пластические перестройки (Сое1е1 Р. еЬ а1., 1986; А1Ьег1п1 С. е1 а1., 1994). Синтезируемые белки поступают к "эффекторным коыпарт-ментам" клетки, вызывая долговременную модификацию свойств ионных каналов, рецепторов нейромедиаторов, ферментов и др. Схема механизма долговременных изменений, предложенная для сенсорных нейронов аплизии, может быть общей для всех нервных клеток, обладающих общенейрональным типом пластичности.

Принципиально иными должны быть механизмы долговременной синапс-специфической пластичности - необходимо выяснить, каким образом обучение приводит к изменению эффективности лишь определенных из сотен или тысяч синаптических связей нейронов. Развивая и конкретизируя положения предложенной П.К.Анохиным химической гипотезы интегративной деятельности нейрона, Е.Н.Соколов сформули-эовал концепцию (1981), согласно которой существует "проекция" синаптических входов на определенные генетические локусы нейрона. Аежду постсинаптическими структурами устанавливаются прямые и об-)атные связи с определенными генами, что обеспечивает избиратель-1ую генетическую регуляцию синаптических входов, в том числе при (бучении. Наиболее подходящими кандидатами на роль специфических маркеров", передающих информацию от синапсов к геному, и регуля-■оров синаптической передачи являются молекулы белковой природы, топериментальные возможности проверки этих представлений в нас-оящее время весьма ограничены, поэтому имеются лишь единичные, в начительной мере косвенные данные, служащие в их пользу.

Заключая изложенное, необходимо отметить, что несмотря на оче-идный прогресс в исследовании молекулярно-клеточных механизмов бучения большинство наиболее важных вопросов этой проблемы оста-тся нерешенными. Среди них наиболее актуальными являются, по на-ему мнению, следующие: изучение роли систем вторичных посредни-

ков в специфическом опосредовании возбуждений различной сенсорной и биологической модальности, конвергирующих к нейрону при обучении; изучение механизмов вовлечения генетического аппарата в процессы консолидации, сохранения и воспроизведения долговременной памяти; исследование особенностей метаболического обеспечения пластических перестроек, возникающих в одних и тех же нервных клетках при выработке различных форм обучения. Все эти вопросы в той или иной мере нашли отражение в настоящем исследовании. Особое внимание в нашей работе уделено наименее исследованному аспекту нейробиологии обучения - изучению механизмов синапс-специфического типа пластичности.

Цель исследования. Целью настоящего исследования явилось изучение на поведенческом, клеточном и молекулярном уровнях механизмов ассоциативных и неассоциативных форм обучения у виноградных улиток.

Задачи исследования:

1. Изучение особенностей нейрофизиологических и кальций-зависимых метаболических изменений в идентифицированных нейронах при ассоциативном и неассоциативном обучении у виноградной улитки.

2. Исследование участия систем вторичных внутриклеточных посредников в нейрональных механизмах разных форм обучения.

3. Изучение роли белок-синтезирующего аппарата в молекулярном обеспечении механизмов долговременной сенситизации.

4. Изучение роли негистоновых белков хроматина в механизмах хранения и воспроизведения ассоциативного навыка отвергания пищи у виноградной у улитки.

Научная новизна.

- В работе впервые выявлены отчетливые нейрофизиологические различия кратковременной и долговременной стадий формирования новых навыков. Кратковременные эффекты сенситизации и обусловливания выражались в изменениях мембранного потенциала, а также возбудимости плазматической мембраны командных нейронов оборонительного поведения виноградных улиток. Долговременные - в облегчении си-наптических компонентов ответов этих нейронов на сенсорные раздражения.

- Обнаружено избирательное облегчение эффективности определенных синаптических входов командных нейронов при долговременной сенситизации. Выраженность синаптического облегчения и длительность его сохранения зависят от места нанесения тестирующего стимула пс

отношению к области действия сенситизирующего раздражения (мес-тоспецифическая сенситизация), а также от вида (химическое или тактильное) сенсорного раздражения (модальноспецифическая сенситизация) .

- Впервые найдено, что при ассоциативном обучении отверганию определенного вида пищи в одних и тех же командных нейронах оборонительного поведения возникают нейрофизиологические эффекты, характерные как для обусловливания, так и сенситизации. Через 1 ч после начала обусловливания в командных нейронах возникает характерное для долговременной сенситизации облегчение исходно существующих синаптических ответов на сенсорные раздражения, тогда как ответ на пищевой условный стимул появляется через 1.5 ч после начала обучения за счет активации ранее "молчащих" синаптических входов командных нейронов.

- Выявлено, что ассоциативные и неассоциативные виды обучения сопровождаются специфическими изменениями кальций-зависимого метаболизма в командных нейронах. ВыраСотт привыкания приводит к снижению содержания Са-с. Кратковременн ш и долговременная стадии сенситизации коррелируют с фазным увеличением уровня Са-с. При эбусловливсяии в кратковременную стадию отмечено уменьшение 'содержания Се-с, а в долговременную - его увеличение.

- Впервые показано избирательное вовлечение в механизмы воспроизведения из долговременной памяти мозгоспецифических негистоно-зых белков хроматина. У виноградных улиток, обученных ассоциативному навыку отвергания пищи, антитела против негистоновнх белков ф 3.5, но не Ир 3.6 полностью подавляют поведенческие реакции и ответы командных нейронов оборонительного поведения, вызванные шределенным условным стимулом - морковью. Действие антител к Мр

5 специфично, поскольку они не изменяют нейрональных и поведен-юских реакций на другой условный стимул - яблоко.

- Сформулировано представление о том, что процессы консолидации [ воспроизведения долговременной памяти у виноградных улиток связны с активацией синтеза короткоживущих белковых молекул, специ-мчески регулирующих определенные синаптические входы командных [ейронов оборонительного поведения.

Теоретическая и практическая значимость результатов. 'езультаты выполненной работы имеют значение для понимания нейро-альных и молекулярных механизмов, лежащих в основе процессов бучения и памяти. Выявленные особенности нейрофизиологических и

кальций-зависимых метаболических эффектов разных стадий обучения, а также ассоциативных и неассоциативных навыков в командных нейронах оборонительного поведения позволяют использовать эту модель для изучения молекулярно-клеточных механизмов действия различных биологически активных соединений - предполагаемых регуляторов ин-тегративных функций мозга, а также факторов, вызывающих нарушения его функций. Полученные экспериментальные данные об избирательном вовлечении мозгоспецифических негистоновых белков хроматина в процессы обучения и памяти представляются актуальными для медицинской науки в плане изучения ряда нервно-психических заболеваний (шизофрения, эпилепсия, врожденные энцефалопатии, рассеянный склероз, маниакально-депрессивный психоз и др.), патогенез которых связан с нарушением метаболизма белковых соединений мозга, а также процессов запоминания и воспроизведения.

Основные положения, выносимые на защищу.

1. Выработка различных видов неассоциативного и ассоциативного навыков у виноградных улиток вызывает в командных нейронах оборонительного поведения характерные для каждого из них нейрофизиологические и кальций-зависимые метаболические изменения.

2. В основе отдельных стадий оборонительных форм обучения у виноградной улитки лежат различные нейрональные и молекулярные механизмы. Кратковременная стадия характеризуется изменением свойств электрогенной мембраны (деполяризация и увеличение возбудимости) командных нейронов оборонительного поведения и зависит от активности систем вторичных внутриклеточных посредников, тогда как долговременная стадия выражается в ■облегчении синаптической передачи и зависит от активности белок-синтезирующего аппарата клеток. 1 1

3. Избирательное изменение эффективности определенных синапти-ческих входов командных нейронов при обучении сопряжено, по-види-' мому, с метаболизмом специфических белков-регуляторов, продолжительность жизни которых составляет не более 1-3 ч.

4. При ассоциативном обучении отверганию определенного вида пищи в одних и тех же командных нейронах оборонительного поведения возникают нейрофизиологические' и, метаболические .изменения, характерные как для обусловливания,''так.и.сенситизации. ■ '> '.■■'■

5. В механизмы воспроизведения из долговременной памяти ассоциативных навыков у виноградных улиток избирательно' вовлечены мозгоспецифические негистоновые белки хроматина. Функции этих

белков связаны, по-видимому, с генетической регуляцией синапти-ческих входов командных нейронов оборонительного.поведения, опосредующих возбуждение, вызванное условным стимулом.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 15 съезде Всесоюзного физиологического общества, . Кишинев, 1987; I Всесоюзном биофизическом съезде, 1982; , международном симпозиуме "Молекулярные основы действия биологически активных веществ на поведение" (Таллин, 1989); международных конференциях "Простые нервные системы", 1992. 1994; Всесоюзной конференции по нейронау-кам, Киев. 1986; 1990; 28 Всесоюзном совещании по проблемам высш. нервн. деят., 1989; на Всесоюзном симпозиуме "Медиаторы, в генетической регуляции поведения", Новосибирск, 1986; на заседании Московского физиологического общества, 1984; на итоговых сессиях Института нормальной физиологии им.П.К.Анохина РАМН 1988-1995 гг.; на международном симпозиуме "Интегративная деятельность нейрона. Молекулярные основы", Ялта, 1988; на международном симпозиуме "Современные проблемы клинической и экспериментальной психо-нейроиммунологии", Томск, .1992; 19 arm. meet. "Euro, brain and behavior soc.", Jugoslavia, 1987; 6th meet. "Euro. soc. neuroc-hem. ", Prague, 1986; XVeme conference en neurobiologie de Gif "Synaptogenesls and differentiation of synaptic areas", , Gif Sur Yvette. 1990; In 16th Gif lecture In neurobiology "Calcium and intraneural signalling" Gif, France, 1991; 2-nd Intern. Congress ISNIM, Italy, 1993.

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 31 статье и 23 тезисах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, 3 главы результатов исследования и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа изложена на 259 страницах машинописного текста, содержит 54 рисунка. Список литературы включает 382 источника.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ В опытах исследованы свыше 1000 виноградных улиток Helix luco-rum. Использованы поведенческие,• нейрофизиологические, биофизические и морфологические методы исследований. У моллюсков вырабатывали привыкание к повторным тактильным раздражениям, ноцицеп-гивную сенситизацию и ассоциативный навык отвергания определенного вида пищи.

Поведенческие методы. В поведенческих опытах сенситизацию вырабатывали нанесением 50-100 мкл концентрированного (5-50%) водного раствора хинина дигидрохлорида на голову улитки. Состояние сенситизации оценивали по выраженности и длительности оборонительных реакций животных, вызываемых тестирующими сенсорными раздражениями: слабым (0,1%) раствором хинина и тактильными раздражениями. Тестирующие стимулы наносили на переднюю часть головы через каждые 15-20 мин в течение 1-2 ч до выработки навыка, 3-5 ч после его выработки, а также в последующие 1-3 дня.

Для выработки навыка отвергания пищи (Максимова O.A., Балабан П.М., 1983) в качестве условного стимула использовали разные виды растительной пищи. Подкрепляющим раздражением служил постоянный электрический ток (1-10 мА. 0,5 с), который пропускали через электроды, подведенные к пище и мантийному валику, или концентрированный (5-10%) раствор хинина, 100 мкл которого апплицировали на голову животного. Подкрепление наносилось в момент первых жевательных движений. Осуществляли 3-15 сочетанных предъявлений улиткам пищи и подкрепляющего раздражения через каждые 15-20 мин. Критерием выработки условной связи служила оборонительная реакция на предъявление улитке "условнорефлекторной" пищи, отказ от еды. а также поедание другого вида пищи, использованной в качестве дифференцировочного стимула. Биологически активные вещества в поведенческих экспериментах вводили в полость тела улитки,

Нейрофизиологические методы. Нейрофизиологические опыты проводили на полуинтактных препаратах виноградных улиток. Перед операцией улитку анестезировали охлаждением в смеси воды со льдом или введением в полость тела животного раствора хлористого магния.. У улиток удаляли раковину и рассекали по средней линии переднюю часть ноги, за исключением ее головного конца. Затем ее помещали в ванночку, заполненную парафином, и фиксировали вокруг окологлоточного комплекса ганглиев (ЦНС) силиконовое кольцо, в которое постоянно поступал физиологический раствор со скоростью 100 мкл/мин. Опыты проводили на нейронах ЛПл1. ППл1 ЛПа2-3, ЛПа5 и ППа2-3, относящихся к группе командных нейронов оборонительного поведения улиток, нейронах ЛМц1 и ПМЩ, модулирующих пищевое поведение. а также на некоторых других идентифицированных нейронах подглоточного комплекса ганглиев (Максимова O.A., Балабан П.М., 1983). Внутриклеточное отведение активности нервных клеток осуществляли стандартным методом с помощью стеклянных микроэлектро-

дов. Отводимые потенциалы подавали на усилитель MEZ-8101 (фирма Nihon Kohden, Япония) и регистрировали на осциллографе С1-102 и самопишущем приборе RJG-4024 (Nihon Kohden). Биологически активные вещества подводили к ЦНС улитки в физиологическом растворе, омывавшем ганглии, или вводили внутрь клеток методом микроионофо-реза, а также под давлением сжатого газа с помощью прибора "Пнев-мофор ВН-2" ("Med. Instruments", США).

Сенситизацию в нейрофизиологических опытах вырабатывали нанесением 100 мкл концентрированного (5-10%) раствора хинина на кожу головы. Раздражители, тестирующие состояние сенситизации: слабый раствор хинина (0,25-0,75%), тактильные раздражения, а также пищевой сок, наносили каждые 15-20 мин в течение 1,5-2 ч до выработки навыка. 3-4 ч после его выработки, а также через 24 ч после нанесения сенситизирующего раздражения. Пищевой сок и хинин апп-лицировали на губу животного в течение 30 сек. Тактильные раздражения наносили на переднюю часть головы, среднюю часть ноги и мантийный валик с помощью электромеханического устройства. При выработке ассоциативного навыка на губу улитки в течение 30 сек апплицировали пищевой сок, а после окончания аппликации на голову наносили 100 мкл концентрированного (5-10%) раствора хинина. Цва-пять повторных сочетания производили через каждые 15 мин. Тестирующие раздражения слабым раствором хинина, пищевым соком и тактильную стимуляцию осуществляли так же, как при выработке сенситизации.

В исследованных нейронах регистрировали уровень мембранного ютенциала, возбудимость, спонтанные ВПСП и потенциалы действия ;ПД), а также ответы, вызванные сенсорными раздражениями. В вызванных отвзтах анализировали амплитуду, , длительность и площадь «дленной золны деполяризации - медленный ВПСП (мВПСП) (Логунов 1.Б., 1983). Измерение площади производили в условных единицах с юмощью Graflc table и компьютера IBM.

Микроспектрофотометрические методы. Для прижизненного изучения шнамики метаболизма в нервных клетках использовали хлортетрацик-1иновый (ХТЦ) флуоресцентный зонд, который, как полагают, отража-¡т связывание кальция с гидрофобными компонентами (Са-с) клеток Caswell А.Н., 1979; Добрецов Г.Е., 1989). Опыты, проведенные наи в системе In vitro и In vivo, показали, что ХТЦ зонд способен сражать процессы связывания ионов кальция с кальций-связывающими ¡елками (Никитин В.П. и др.. 1985; Никитин В.П.. Самойлов М.О.,

1990). Микроспектрофлуорометрическую регистрацию нейронов проводили- с помощью люминисцентного контактного микроскопа ЛЮМАМ КФ (фирма ЛОМО). Регистрировали флуоресцентный сигнал в области с максимумом 520 нм (длинна волны возбуждения 400 нм) от большей части тела микроскопируемого нейрона. Оптический сигнал преобразовывался в электрический и регистрировался на приборе Recorder 2210 (LKB, Швеция). После регистрации собственной флуоресценции неокрашенного нейрона ганглии перфузировали в течение всего эксперимента физиологическим раствором, содержавшим 50 мкМ ХТЦ ("Sigma" США). О' динамике содержания Са-с судили ро изменению уровня флуоресценции исследованных нейронов, который выражали в процентах по сравнению с уровнем флуоресценции перед воздействием (100%).

Вещества. Белки группы S-100 и антитела (AT) к ним, AT к каль-модулину, негистоновые белки хроматина и AT к ним, преиммунные AT получены в лаборатории'функциональной нейрохимии НИИ нормальной физиологии им.П.К. Анохина. Белок кальмодулин, его ингибитор W7 (N-(6-аминогексил)-5-хлор-1-нафталин-сульфонамид), блокаторы синтеза белка анизомицин (АН) и циклогексимид (ЦГ). флуоресцентные красители ХТЦ и бисбензимид Хехст 33342 производства фирмы "Sigma" США; хинин дигидрохлорид - "Грузбиофармпрепараты".

Статистика. Экспериментальные данные обрабатывали на компьютере "Априкот" (модель XEN-1 XD-45, Великобритания) с помощью пакета программ статистической обработки данных "Микростат" (Микрософт корпорейшн. США) и программы СуперКалк-5 (Компьютер Ассоши-эйтс Интернэшнл, Инкорпорэйтэд). Для оценки уровня достоверности различий использовали t-критерий Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ Нейрофизиологические и кальиий-зависимые метаболические

механизмы привыкания у виноградных улиток Для выработки привыкания использовали описанный метод (Максимова O.A., Балабан П.М., 1983): три-пять серий тактильных раздражений наносили накожу животного. ' В каждой' серии предъявляли 40-60 стимулов с интервалом 7-10 с. Между сёриями делали перерывы на 15 мин. В качестве экстрастимулов применяли тактильные раздражения, которые наносили на участок тела, отдаленный от повторно раздражаемого. ' • ' '.

При выработке привыкания в ответ на тактильное раздражение в

командных , нейронах оборонительного поведения регистрировали ВПСП и ПД. Нанесение нескольких первых тактильных раздражений приводило к облегчению ответов, которое возникало, по-видимому, вследствие регистрируемой в это время деполяризации мембраны и увеличения ее возбудимости (Максимова O.A.. Балабан n.M., 1983). Продолжение серии раздражений приводило к постепенному снижению выраженности электрофизиологического ответа: уменьшалось количество ПД в ответе, снижалась амплитуда вызванных ВПСП и увеличивался порог генерации ПД (Никитин В.П. и др., 1987). Нанесение экстрастимула вызывало реакцию растормаживания, которая выражалась в восстановлении величины ответа на предъявление одного-двух последующих "привычных" стимулов. Следующие серии раздражений характеризовались более быстрым и выраженным снижением ответа на "привычное" раздражение. Описанные эффекты совпадают с результатами других авторов и удовлетворяют основным критериям' привыкания (Thompson R. F. ¿Spencer W. А., 1966; Соколов E.H.. 1981; Максимова O.A.. Балабан П. М.. 1983).

Во время нанесения первой серии раздражений в командных нейронах оборонительного поведения отмечали плавное уменьшение содержания Са-с на 4-8%. В перерыве между сериями раздражений уровень Са-с обычно стабилизировался в течение нескольких десятков секунд, а затем вновь снижался на 2-8%. При нанесении второй серии раздражений динамика содержания Са-с, как правило, была сходна с таковой в первой серии, однако выраженность изменений была значительно меньшей. Дальнейшее ослабление сдвигов Са-с, вплоть до их полного отсутствия, наблюдалось во время нанесения третьей серии стимулов. Уменьшение содержания Са-с в командных нейронах при выработке привыкания может быть обусловлено либо переходом каль-цийсвязывающих белков в гидрофильную фазу, либо переносом ионов кальция от гидрофобных к гидрофильным структурам. Показано, что такая транслокация кальцийсвязывающих белков возможна при различных стимулирующих воздействиях на клетку, в том числе при обучении (Bank В., et al., 1988). К наиболее распространенным в нервной ткани кальцийсвязывающим белкам относятся кальмодулин, кальций-зависимые протеинкиназы и протеазы, мозгоспецифические белки группы S-100 и др. (Пермяков Е.А., 1993).

Изложенные данные послужили основанием для исследования участия и возможной роли белков S-100 и кальмодулина в нейронных механизмах привыкания к повторным тактильным раздражениям (Никитин

В.П. и др., 1989). АТ против белков Б-ЮО, белка кальмодулина и преиммунные АТ (использованные в качестве контроля) подводили к командным нейронам оборонительного поведения в интервале между первой и второй сериями стимулов, в концентрациях 0,1-: мкМ или вводили внутрь клеток под давлением сжатого воздуха через стеклянный микроэлектрод.

Подведения преиммунных АТ или АТ к кальмодулину либо не оказывали влияния на динамику привыкания, либо (в случае преиммунных АТ) вызывали замедление его выработки и нарушение процесса рас-тормаживания. Эти результаты согласуются с данными, полученными другими исследователями. В частности, обнаружено, что блокада кальмодулина антипсихотиками фенотиазинового ряда (Цитоловский Л.Е., 1984) не изменяла динамики процесса привыкания у командных нейронов оборонительного поведения улитки.

Аппликации АТ к белкам Б-ЮО вызывали более быстрое снижение выраженности ответа в последующей серии раздражений. Количество ПД в ответах нейронов резко уменьшалось в начале серии раздражений. либо уже первые ВПСП не достигали порога генерации ПД. Выраженность ответа на предъявление экстрастимула также снижалась, однако, менее значительно, чем на привычное раздражение. Ускоренное снижение ответов нейронов на повторные раздражения по сравнению с контролем, по-видимому, обусловлено в основном нарушением процесса синаптической передачи. В пользу этого предположения свидетельствуют факты, не "вписывающиеся" в характерную картину привыкания. Прежде всего, это необычно быстрое снижение выраженности ответов на повторные раздражения; резкое замедление восстановления ответа после серии раздражений; снижение выраженности •ответа на предъявление экстрастимула и уменьшение эффективности растормаживающего влияния экстрастимула по сравнению с контролем, а также угнетение синаптических компонентов ответов нейронов без выработки привыкания. Вместе с тем, электрогенные свойства мембраны после подведения АТ к Б-ЮО не изменялись, о чем свидетельствуют сохранность способности нейрона генерировать ПД нормальной формы и отсутствие изменений входного сопротивления плазматической мембраны. Кроме того, АТ к Б-ЮО не оказывали действия на развитие привыкания электрогенной мембраны к прямоугольным импульсам деполяризирующего тока, подаваемым через внутриклеточный электрод. Необходимо отметить сходство действия- АТ к Б-ЮО в случаях их вне- и внутриклеточного подведения, а также большую выра-

женность их эффектов при внутриклеточном введении, что предполагает постсинаптическую внутриклеточную локализацию мишеней-белков S-100, с которыми AT реагируют.

Использованная экспериментальная модель и полученные результаты не позволяют однозначно ответить на вопрос о непосредственном участии белков S-100 в процессах, которые лежат в основе собственно привыкания - избирательного снижения реактивности нейрона по отношению к определенному раздражителю. Можно лишь констатировать, что даже при резком снижении эффективности синаптической передачи сохраняется дифференцировка ответов на привычное раздражение по сравнению с реакцией на предъявление экстрастимула. Однако, более выраженное угнетение ответа на действие привычного стимула может быть объяснено большим нарушением синаптической передачи AT к S-100 в условиях функциональной нагрузки (повторные раздражения).

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что выработка привыкания к тактильным раздражениям приводит к уменьшению выраженности электрофизиологического ответа командных нейронов оборонительного поведения, а также к снижению содержания Са-с в этих клетках. AT против белка S-100 ускоряют уменьшение ответа на повторную стимуляцию, тогда как AT к белку кальмодулину не оказывают влияния на выработку привыкания в командных нейронах.

Механизмы ноцицептивной сенситизации у улиток

Интенсивно разрабатываемым вопросом нейробиологии является изучение механизмов ноцицептивной сенситизации. Значение этого направления исследований определяется тем, что механизмы пластичности нервных клеток, лежащие в основе сенситизации, могут быть общими с механизмами некоторых форм ассоциативного обучения (Вуг-ie J., 1987; Hawkins R. ez al.. 1993). Кроме того, показано сходство ряда нейрофизиологических механизмов ноцицептивной сенситизации у млекопитающих (включая человека) и беспозвоночных, нто предполагает их эволюционную древность и широкую распространенность в животном мире, свидетельствуя о биологической важности i универсальности этих механизмов (Walters Е.. 1991).

В поведенческих экспериментах, проведенных нами на виноградных глитках. обнаружено, что нанесение концентрированного раствора мнина на голову животного приводит к облегчению оборонительных и тнетению пищевых реакций (Никитин В.П., Козырев С.А., 1991). Эти

эффекты сохраняются от нескольких часов до 1-3 суток. Необходимо отметить фазность выявленных изменений: приблизительно через 1 ч после нанесения сенситизирующего раздражения у большинства животных происходило временное уменьшение выраженности эффектов сенси-тизации. Это временное "ослабление" выработанного навыка является, по-видимому, проявлением т.н. "дефицита сохранения памяти Камина", который, как полагают, связан с неполным "перекрытием" механизмов кратковременной и долговременной памяти (Matties Н., 1988).

Нейрофизиологические и каяьщй-зависимые метаболические механизмы ноцицепшивной сенситизации. Эффекты сенситизации. выявленные в поведенческих экспериментах, хорошо коррелировали с результатами опытов, проведенных на клеточном уровне. Сенситизирующее воздействие концентрированным раствором хинина приводило к кратковременным и долговременным изменениям различных показателей би оэлектрической-активности командных нейронов оборонительного поведения, а также к выраженным перестройкам содержания Са-с в этих клетках (Никитин В.П., Козырев С.А., 1991; Никитин В.П. и др., 1991).

В период кратковременного развития сенситизации (приблизительно в течение часа от момента нанесения сенситизирующего раздражения) выявлены деполяризация плазматической мембраны на 10-16 мВ и увеличение ее возбудимости в 1.5-2 раза, слабо выраженное уменьшение параметров мВПСП в ответах на химические и тактильные сенсорные раздражения, а также первоначальное интенсивное увеличение содержания Са-с на 10-16%. Количество ПД в ответах на все сенсорные раздражения возрастало в 3-5 раз непосредственно после сенситизирующего воздействия и уменьшалось до исходных значений к 50-60 мин. Увеличение количества ПД на фоне некоторого уменьшения параметров мВПСП в ответах на сенсорную стимуляцию связано,'. по-видимому, с модификацией свойств электрогенной мембраны нейро-* нов - деполяризацией мембраны и увеличением ее возбудимости. Сходные изменения свойств мембраны при выработке сенситизации обнаружены также другими исследователями (Береговой А.Н., Гайнутди-нов X.Л., 1988; Балабан П.М., Захаров И.С., 1992). Долговременный период развивался приблизительно через час после сенситизирующего раздражения и характеризовался выраженным, быстро нарастающим в течение 30-40 мин облегчением синаптических компонентов ответов

нейронов (мВПСП) на тестирующие сенсорные раздражения, увеличением в 3-8 раз количества ПД в ответах и повторным нарастанием Са-с на 15-20%. Синаптическое облегчение сохранялось в командных нейронах от нескольких часов до.1-2 суток (Никитин В.П.. Козырев С. А., 1995).

Необходимо отметить, что изменения биоэлектрической активности командных нейронов в кратковременный период сенситизации неспецифичны по отношению к определенным сенсорным раздражителям - деполяризация мембраны и увеличение ее возбудимости способствуют усилению ответа (по количеству ПД) на любой сенсорный стимул. Напротив, в долговременный период появляется возможность избирательной регуляции ответов нейрона на сенсорные раздражения за счет изменения эффективности определенных синаптических входов. Это подтверждается рядом фактов, полученных в наших экспериментах. Об этом свидетельствует, в частности, феномен "местоспецифической" сенситизации - в долговременную стадию выраженно облегчались си-наптические компоненты ответов (мВПСП) на сенсорные раздражения, наносимые на голову улитки, т. е. на место воздействия сенситизи-рующего раздражения. В то же время, ответы на раздражения отдаленных от головы участков тела улитки (середины ноги или мантийного валика) усиливались в долговременную стадию значительно, менее выраженно. чем реакции на тестирующую стимуляцию головы. Обращают также на себя внимание определенные различия динамики изменений ответов командных нейронов оборонительного поведения на тактильные и химические раздражения на долговременной стадии сенситизации. Так выявлено, что в в 15-25% опытов в одних и тех же нейронах облегчались ответы только на один из сенсорных раздражителей (слабый раствор, хинина или тактильная стимуляция). Кроме того, обнаружено, что площадь мВПСП в ответах нейронов на слабый раствор хинина увеличивалась приблизительно в 2 раза более выраженно, чем таковая в ответах на тактильную стимуляцию головы. Различие выраженности изменений ответов нейронов на разные виды сенсорных раздражений может Сыть одним из нейрональных проявлений эффектов "модально-специфической" сенситизации - более выраженное облегчение ответов на тестирующее сенсорное раздражение (слабый раствор хинина), которое совпадает по сенсорной модальности с сенситизирующим стимулом (концентрированный раствор хинина), по сравнению с увеличением выраженности ответов на тестирующее раздражение другой сенсорной модальности (тактильная стимуляция). Не-

обходимо отметить также, что минимальная продолжительность эффектов сенситизации неодинакова для разных видов сенсорных раздражений. В частности, минимальная длительность сохранения облегчения синаптических компонентов ответов (мВПСП) на тактильные раздражения составляла около 1 ч (облегчающий эффект появлялся через 1 ч после нанесения сенситизирующего раздражения и исчезал примерно через 2 ч после него). Это время для химического раздражения (слабый раствор хинина) составляло 2-3 ч.

Очевидно важная роль в индукции выявленных эффектов сенситизации принадлежит вторичным внутриклеточным посредникам. Выявленная в наших экспериментах первая фаза нарастания Са-с в нейроне, по-видимому, обусловлена входом кальция и его последующим связыванием в клетке при деполяризации плазматической мембраны, которая регистрируется в течение 15-20 мин после сенситизирующего воздействия. Представляется интересным факт обнаружения фазы повторного повышения уровня содержания Са-с спустя 50-60 мин от момента нанесения сенситизирующего воздействия, коррелирующего с облегчением синаптической передачи. Указанные изменения содержания Са-с не связаны с деполяризацией нейронов, поскольку в данный период мембранный потенциал клеток близок к исходным параметрам. Кроме того, в это время не наблюдается изменений спонтанного си-наптического притока к командным нейронам. Эти результаты позволяют предположить, что регистрируемые метаболические и электрофизиологические эффекты долговременной сенситизации локализуются в исследованных командных нейронах оборонительного поведения, однако, не исключают определенного "вклада" в эти эффекты изменений в афферентных по отношению к командным нейронам клетках. Возможно, имеется связь между повторной фазой повышения уровня Са-с в нейронах и экспрессией синтеза белков. Показано, что при выработке разных форм обучения, как у позвоночных, так и у беспозвоночных, приблизительно в течение 1 ч после обучения происходит консолидация долговременной памяти, которая подавляется блокаторами синтеза белка (Davis Н.P., Squire L.R.. 1984; Goelet Р. et al., 1986).

Таким образом, выработка ноцицептивной сенситизации у улиток сопровождается кратковременными и долговременными изменениями нейрофизиологических и кальций-зависимых метаболических показателей активности командных нейронов оборонительного поведения. Кратковременная стадия развивается в течение 1 ч от начала выработки сенситизации и характеризуется деполяризацией плазматичес-

кой мембраны, увеличением ее возбудимости и первоначальным нарастанием содержания Са-с. Долговременная стадия развивается через 1 ч после начала обучения, характеризуется избирательным облегчением определенных синаптических входов командных нейронов и повторным увеличением содержания Са-с.

Участие кальций/кальмодулиновой системы в механизмах выработки сенситизации. Изложенные экспериментальные факты позволяют предположить, что важная роль в механизмах выработки сенситизации в командных нейронах оборонительного поведения принадлежит кальций-зависимым метаболическим процессам и, в частности, каль-ций/кальмодулиновой системе. В этой связи, используя ингибитор кальмодулина W7, а также физиологический раствор для моллюсков, не содержавший ионов кальция, нами изучено участие этого белка и ионов кальция в механизмах выработки сенситизации у виноградной улитки.

Обнаружено, что сенситизирующее воздействие во время подведение к ЦНС улиток W7 (100 мкМ) вызывало деполяризацию мембраны и учащение генерации ПД аналогичные таковым у нейронов, к которым не подводили W7. Вместе с тем, в условиях действия W7 происходила реверсия возбудимости плазматической мембраны: сразу после сенси-тизирующего воздействия она уменьшалась на 50-60% ниже исходного уровня, а в последующие 50-70 мин восстанавливалась практически до исходного уровня. После сенситизирующего раздражения на фоне подведения W7 наблюдали уменьшение площади мВПСП в ответах нейронов на сенсорные раздражения, которое было на 10-20% большим, чем у контрольных улиток. К 50-70 мин отмечена тенденция к восстановлению исходных параметров вызванных ответов с сохранением таковых до конца эксперимента, при этом синаптическое облегчение, характерное для долговременной сенситизации, не возникало. В спектро-фотометрических опытах выявлено, что при нанесении сенситизирующего раздражения во время подведения к командньм нейронам оборонительного поведения W7 или раствора для моллюсков, не содержащего ионов кальция, практически полностью подавлялись как первоначальное, так и повторное нарастание флуоресценции. Подведения W7 или бескальциевого раствора после сенситизирующего воздействия не оказывали существенного влияния на ее динамику - происходило увеличение флуоресценции, сходное с таковым у контрольных нейронов.

Таким образом, проведенные опыты показали, что удаление ионов

кальция из раствора, омывавшего ганглии, или ингибирование каль-модулина с помощью №7 в момент сенситизирующего воздействия приводило к блокаде ряда кратковременных и долговременных эффектов сенситизации. В то же время, ингибирование действия кальмодулина и ионов кальция после нанесения сенситизирующего раздражения не препятствовало возникновению долговременных эффектов. Ети данные позволяют полагать, что кальций/кальмодулиновая система непосредственно участвует в регуляции мембранных и синаптических событий, приводящих к развитию кратковременных эффектов сенситизации в командных нейронах. Кроме того. она. по-видимому, вовлечена 'в инициацию метаболических реакций, приводящих к возникновению долговременных эффектов, однако непосредственного участия в их проявлении не принимает.

Зависимость выработки долговременной сенситизации от синтеза белков. Имеющиеся в литературе данные позволяют предположить, что долговременные пластические перестройки нейронов при формировании новых навыков связаны с активацией синтеза иРНК и белковых молекул. На основании этих фактов нами изучено влияние блокаторов синтеза белка АН и ЦГ (30-100 мкМ) на электрофизиологическую активность и содержание Са-с в командных нейронах оборонительного поведения ЛПл1 и ППл1 при выработке сенситизации у виноградной улитки. Блокаторы апплицировали в раствор, омывавший•ЦНС животных, за 60 мин до применения сенситизирующего раздражения и в дальнейшем подводили в течение всего эксперимента (3-4 ч).

Обнаружено, что сенситизирующее воздействие во время подведения к ЦНС улиток АН и ЦГ вызывало деполяризацию мембраны и генерацию ПД командных нейронов, сходные с таковыми у контрольных нейронов, к которым не подводили блокаторы. Возбудимость плазматической мембраны после сенситизирующего раздражения в условиях действия блокаторов увеличивалась менее выраженно, чем у контрольных нейронов.

После сенситизирующего раздражения на фоне подведения блокаторов параметры мВПСП в ответах нейронов на тактильные и химические раздражения уменьшались или увеличивались на 10-20% по сравнению с их величинами перед выработкой сенситизации, сохраняясь на этом уровне до конца эксперимента (более 3 ч).- При этом не обнаружено' синаптического облегчения'в ответах нейронов на сенсорные раздражения, регистрируемые у нервных.клеток контрольных улиток через 1

ч после сенситизирующей стимуляции. Блокаторы синтеза белка не влияли на первоначальное увеличение интенсивности флуоресценции, развивавшееся в течении 15-20 мин после сенситизирующего раздражения и достигавшее 10-14%. Вместе с тем, блокаторы практически устраняли повторное увеличение уровня флуоресценции, наблюдавшееся у контрольных клеток с 50 по 90 мин после сенситизирующего раздражения.

Таким образом, результаты проведенных экспериментов свидетельствуют, что долговременные нейрофизиологические и метаболические эффекты сенситизации в командных нейронах оборонительного поведения зависят от синтеза белков. Подведения ингибиторов синтеза белка АН или ЦГ блокируют облегчение синаптической передачи и повторное увеличение содержания Са-с, регистрируемые приблизительно через 1 ч после нанесения сенситизирующего раздражения.

Гистохимические корреляты эффектов сенситизации в командных нейронах оборонительного поведения. Использованный в наших опытах метод прижизненной спектрофотометрической регистрации флуоресценции окрашенных ХТЦ нейронов позволяет оценивать суммарное содержание Са-с со всего тела клетки или ее значительной части. Выявить распределение красителя по отдельным структурам клетки возможно лишь с помощью морфологических методов. Поэтому мы изучили перераспределение Са-с компонентов на срезах окрашенных ХТЦ командных нейронах через 30 и 90 мин после выработки сенситизации. Так как выработка новых навыков связана с активностью генетического аппарата, для окрашивания срезов нейронов использовали также другой флуоресцентный краситель - бисбензимид Хехст 33342. Известно, что интенсивность свечения этого флуорохрома отражает процессы деконденсации хроматина и находится в прямой зависимости от плотности его упаковки (Зацепина О.В. и др., 1989; БсЬаПег Р. е1 а1., 1990). Установлено также, что в таких деконденсированных участках хромосом происходит транскрибирование иРНК (Албертс Б. и др.. 1986).

Проведенные гистохимические опыты показали (Гончарук В.Д. и др., 1993), что у контрольных (несенситизированных) улиток наиболее интенсивно ХТЦ окрашивает содержимое ядра клетки. На 30 мин после нанесения сенситизирующего раздражения отмечено некоторое увеличение интенсивности флуоресценции ХТЦ зонда в ядре клетки, а на 90 мин ХТЦ окрашивал практически все ядро и значительную часть

цитоплазмы. У несенситизированных улиток участки, окрашенные Хехстом, располагаются в ядрах клеток и имеют вид крупных ярко светящихся "островков". На 30 мин происходит снижение яркости свечения флуоресцирующих "островков", а на 90 мин выявлялись лишь единичные небольшие светящиеся гранулы.

Таким образом, выработка сенситизации приводит, по-видимому, к активации значительных участков ДНК командных нейронов и выраженному увеличению количества белков, связанных с кальцием. Причиной увеличения содержания кальций-связанных белков в ядре может быть массированная транслокация в ядро белковых молекул и/или увеличение синтеза относительно небольшого числа регуляторных молекул, которые, проникая в ядро, вызывают связывание ионов кальция с большим количеством кальций-связывающих белков ядерного матрикса. В опытах in vitro обнаружено, что флуоресценция ХТЦ значительно возрастает в присутствии суммарных фракций негистоновых белков хроматина и снижается при внесении в эту среду хелатора ионов кальция EDTA (Гончарук В.Д. и др., 1993). Увеличение флуоресценции комплекса ХТЦ-негистоновые белки сравнимо с увеличением флуоресценции комплекса ХТЦ с кальмодулином, что позволяет предположить наличие значительного количества различных кальцийсвязываю-щих белков среди негистоновых белков хроматина. Следует отметить, что выраженное увеличение активности генетического аппарата командных нейронов к 90 мин после сенситизирующего раздражения совпадает по времени с окончанием процессов консолидации долговременной памяти (Davis Н.Р., Squire L.R., 1984; Goelet Р., et al., 1986) и возникновением синаптического облегчения в ответах командных нейронов на сенсорные раздражения.

Таким образом, гистохимические исследования с использованием флуоресцентных красителей хлортетрациклина и Хехст 33258 (индикатор активности ДНК в клетках) показали, что выработка сенситизации приводит к повышению генетической активности в командных нейронах. которая достигает наибольшей выраженности через 1,5 ч после нанесения ноцицептивного раздражения, т.е. в момент максимального синаптического облегчения при выработке сенситизации.

Результаты проведенных нами экспериментальных исследований позволяют предположить, что долговременные эффекты сенситизации, выражающиеся в избирательном изменении синаптических компонентов ответов нейронов, могут реализоваться на основе регуляции определенных синаптических входов через посредство активации генетичес-

кого аппарата клеток и синтеза специфических для этих входов белковых молекул.

Как долго синтезированные белки-регуляторы могут поддерживать синапс в измененном состоянии и могут ли они в связи с этим являться "субстратом" долговременной памяти? Наши результаты свидетельствуют, что однократно выработанный навык сохраняется у животных от нескольких часов до нескольких суток. Особо интересно, на наш взгляд наиболее короткое время сохранения долговременных эффектов, поскольку этот срок может быть сопоставим с продолжительностью жизни синтезированных белков-регуляторов. При выработке сенситизации минимальная длительность облегчения мВПСП в ответах на тактильные раздражения составляла около 1 ч (эффект появлялся через 1 ч после начала выработки навыков и исчезал примерно через 2 ч после него). Это время при раздражении слабым раствором хинина составляло 2-3 ч. Следовательно, можно предположить, что продолжительность жизни молекул-регуляторов синаптической передачи должна быть не более 1-3 ч. При этом молекулы-регуляторы си-наптических входов, возбуждаемых химическими раздражителями существуют несколько дольше, чем молекулы-регуляторы входов, активируемых тактильными раздражениями. Разная длительность сохранения синаптического облегчения может быть одним из механизмов важного физиологического феномена - неодинаковой значимости для инициации оборонительных реакций животных раздражителей различной сенсорной модальности. Большая эффективность химических раздражителей связана с тем, что они позволяют определять угрозу повреждающего (сенситизирующего) воздействия на расстоянии (до контакта), давая больше времени для избегания (Walters Е., 1991).

Блокатори синтеза белка вшивают нейрофизиологические эффекты, характерные для начального этапа долговременной сенсшизацш. Изложенные предположения о короткоживущих синаптических белках-регуляторах нашли подтверждение в экспериментах по изучению нейрофизиологических эффектов блокаторов синтеза белка. Установлено, что блокаторы процессов трансляции даже при глубоком подавлении синтеза белка вызывают сложные перестройки метаболизма клеток и, в частности, активацию синтеза иРНК (Sorrentino V. et al., 1985; Тодоров И.Н., 1986). Важно отметить, что среди этих иРНК выявлены транскрипты, вовлекаемые в регуляцию специфических функций клеток. Так, при действии ЦГ активируется экспрессия иРНК тирозина-

минотрансферазы (Киселева, 1990), некоторых онкогенов (Филиппова Г.Н. и др., 1989), актинового гена (Eider P.K. et al., 1984), гена бета-интерферона (Rlngold G.M. et al., 1984), генов, контролирующих синтез белков теплового шока (Perlman J.. Feldman J.F., 1982) и др. генов (Sorrentlno V. et al., 1985).

Изложенное позволяет предположить, что блокаторы синтеза белка могут быть использованы в качестве "инструмента" для исследования особенностей активности генома различных клеток организма и, в частности, генов нейронов, которые активируются при такой специфической деятельности, как обучение. Однако очевидно, что в присутствии блокаторов белковые молекулы не могут синтезироваться на рибосомах с матрицы этих иРНК. Поэтому для изучения эффектов синтезированных иРНК. необходимо либо удаление блокаторов из клеток, либо уменьшение их концентрации до уровня, при котором возможен хотя бы частичный синтез белков. С учетом этого обстоятельства мы изучили особенности влияния блокаторов синтеза белка - ЦГ и АН -на активность командных нейронов оборонительного поведения у виноградных улиток (Никитин В.П. и др. 1994).

Во время подведения блокаторов в дозе 30 мкМ к ЦНС улиток в течение длительного времени (более 2-х ч) не обнаружено выраженных изменений фоновой биоэлектрической активности и ответов командных нейронов на сенсорные тактильные и химические раздражения. Вместе с тем, после аппликации блокаторов трансляции в течение 30 мин в дозе 30 мкМ выявлены значительные изменения реакции командных нейронов на сенсорную стимуляцию. В частности, с 60-80 мин после начала подведения ЦГ или АН (30-50 мин после начала их отмывания) обнаружено облегчение ответов командных нейронов на тестирующие раздражения головы улитки, которое быстро нарастало, достигая максимума на 90-110 мин. Необходимо отметить различие длительности эффектов блокаторов по отношению к различным сенсорным раздражениям. Так, облегчение ответов на тактильные раздражения сохранялось приблизительно в течение 1ч, а на слабый раствор хинина - 2-3 ч. Кроме того, обнаружено, что облегчение реакций на тестирующие .раздражения возникало за счет изменения параметров синаптических компонентов ответов: увеличение амплитуды и длительности мВПСП и количества ПД на фоне его генерации. В то же время, показатели, характеризующие свойства электрогенной мембраны нейронов (уровень мембранного потенциала и возбудимость мембраны) , после подведения блокаторов не изменялись.

Длительное (более 2-х ч) подведение ЦГ не вызывало значительных изменений уровня Са-с в командных нейронах. Еместе с тем. через 1 ч после начала его подведения (30 мкМ) в течение 30 мин в нейронах отмечено увеличение уровня Са-с на 4-7%. которое сохранялось в течение 1-2 ч.

Введение блокаторов внутрь командных нейронов приводило к изменениям синаптических компонентов ответов, сходным с таковыми при их внеклеточном подведении. Из этого факта, а также из данных о изменении содержания Са-с при действии блокаторов следует, что по крайней мере часть эффектов ЦГ и АН связана с их действием на синтез макромолекул в командных нейронах.

Важно отметить, что по ряду характеристик описанные эффекты блокаторов трансляции совпадают с таковыми во время развития долговременной сенситизации. В обоих случаях эффекты выражаются в изменении синаптических компонентов ответов (мВПСП) командных нейронов при отсутствии изменений свойств электрогенной мембраны. Сходны величины латентных периодов начала синаптического облегчения. Кроме того, сопоставимы длительность облегчающих синаптических эффектов при действии блокаторов и минимальная продолжительность синаптического облегчения при выработке сенситизации: на тактильные раздражения она составляла около 1ч. а на раздражения слабым раствором хинина - 2-3 ч.

Таким образом, сравнение эффектов блокаторов синтеза белка и долговременной сенситизации позволяет предположить, что в их основе лежат сходные нейрофизиологические и молекулярно-клеточные механизмы. При кратковременном воздействии блокаторами, по-видимому, активируется синтез тех же короткоживущих белковых молекул, что и при долговременной сенситизации. В обоих случаях эти белки вовлечены в регуляцию эффективности синаптической передачи. Вместе с тем. следует отметить, что механизмы регуляции короткоживу-щими белками специфичны для различных синаптических входов, поскольку время сохранения облегчения синаптической1передачи неодинаково для разных видов тестирующих сенсорных раздражений, конвергирующих к командных нейронам. Кроме того выявлено, что блокаторы трансляции облегчали ответы командных нейронов ЛПл1 и ППл1 на тактильные раздражения головы улитки, в то время как реакции на стимуляцию середины ноги и мантийного валика не изменялись.

Существенным отличием действия блокаторов трансляции от сенситизирующего воздействия явилось различие длительности их зффек-

тов. Как уже упоминалось, синаптическое облегчение при действии блокаторов сохранялось 1-3 ч, тогда как при выработке сенситизации этот срок сохранения облегчения был минимальным: у большинства нейронов облегчение наблюдали до момента окончания эксперимента (4-5 ч). а также на следующий день после выработки сенситизации. По-видимому, при выработке сенситизации активируются механизмы, контролирующие долговременное, генетически регулируемое облегчение синаптической передачи. Одним из таких механизмов может быть синтез долгоживущих белков, участвующих в долговременном сохранении синаптического облегчения.

Механизмы выработки и воспроизведения ассоциативного навыка отвергания определенного вида пищи

Более "тонкая", по сравнению с ноцицептивной сенситизацией. специфическая регуляция определенных синаптических входов должна осуществляться при ассоциативном обучении. В проведенных нами экспериментах обнаружено, что при выработке ассоциативного оборонительного навыка отвергания определенного вида пищи в одних и тех же клетках - командных нейронах оборонительного поведения -происходят нейрофизиологические и метаболические (Са-с) изменения. характерные для ассоциативного обучения и сопутствующей сенситизации (Никитин В.П. и др., 1992; Никитин В.П.. 1993). По особенностям развития эти эффекты можно разделить на кратко- и долговременные. В кратковременный период обучения (приблизительно в течение 1 ч от момента начала его выработки) в командных нейронах регистрируются деполяризация плазматической мембраны, увеличение ее возбудимости и уменьшение параметров мВПСП в ответах на тактильные и химические раздражения. С 50-60 мин после начала выработки обусловливания развивались эффекты, характеризующие состояние долговременной сенситизации, - облегчение мВПСП в ответах на слабый раствор хинина и тактильные раздражения. Вместе с тем. реакции на предъявление условного стимула (морковный сок) появлялись в командных нейронах через 1,5 ч после первого сочетания стимулов, т.е. приблизительно на 30 мин позже момента возникновения долговременной сенситизации. Необходимо отметить, что динамика кратковременных и долговременных нейрональных эффектов, характерных для состояния сенситизации, была сходна с таковой, описанной в предыдущих исследованиях при выработке "чистой" сенситизации путем нанесения концентрированного раствора хинина на голову

улитки. Эти данные указывают на сходство в командных нейронах механизмов, обеспечивающих развитие сенситизации в процессе выработки как ассоциативного навыка, так и "чистой" сенситизации.

Электрофизиологическим эффектам, возникавшим при обусловливании, соответствовали выраженные изменения содержания Са-с в командных нейронах. В ответ на каждое предъявление сочетанных стимулов регистрировали временное уменьшение содержания Са-с на 2-3% с последующим восстановлением его исходного уровня. На 40-60 мин содержание Са-с самопроизвольно снижалось на 5-7% с последующей стабилизацией флуоресцентного сигнала; этот эффект совпадал по времени с синаптическим облегчением ответов на тестирующие сенсорные раздражения. Электрофизиологический ответ, вызванный предъявлением условного стимула (морковный сок), появлялся и усиливался одновременно с увеличением на 15-20% содержания Са-с, зарегистрированным с 80-й по 110-ю мин после первого сочетания раздражений. Необходимо отметить, что нейрофизиологические и кальций-зависимые метаболические эффекты, характерные для обусловливания, проявлялись в командных нейронах только после трех или более сочетанных предъявлений пищевого и подкрепляющего стимулов. Меньшее количество сочетаний приводило к возникновению эффектов, характерных для "чистой" сенситизации. Полученные факты дают основание предполагать, что в одних и тех же командных нейронах оборонительного поведения при обусловливании могут протекать различные метаболические процессы, одни из которых связаны с развитием собственно обусловливания, а другие - сенситизации.

Электрофизиологические и метаболические изменения в командных нейронах оборонительного поведения при обусловливании, так же как при выработке "чистой" сенситизации, по-видимому, инициируются системами вторичных посредников. При этом различие эффектов при обусловливании и сенситизации в одних и те же нервных клетках, вероятно, может обеспечиваться за счет участия в процессах формирования этих навыков разных систем вторичных посредников и/или особенностями взаимодействия нескольких систем посредников.

Так же, как при выработке "чистой" сенситизации, при обусловливании наиболее короткое время сохранения облегчения синаптичес-кой передачи на тактильные раздражения составляло около 1 ч, а на аппликации слабого раствора хинина - 2-3 ч. Для условного стимула это время составило приблизительно 1,5 ч. Можно предположить, что как при выработке сенситизации. так и обусловливания, в командных

нейронах оборонительного поведения активируется синтез сравнительно быстро обменивающихся молекул-регуляторов синаптической передачи.

Вместе с тем, ряд фактов свидетельствует о различиях механизмов активации и поддержания синтеза молекул-регуляторов при выработке этих навыков. (1) При ассоциативном обучении ответ на условный стимул появлялся в командных нейронах на 30 мин позже, чем синаптическсе облегчение, характерное для состояния долговременной сенситизации. (2) Условный рефлекс вырабатывался после предъявления нескольких сочетаний условного и подкрепляющего стимулов, тогда как для выработки сенситизации достаточно нанесения одного ноцицептивного раздражения. (3) Значительно отличалась динамика кальций-зависимого метаболизма при выработке сенситизации и обусловливания. (4) При ассоциативном обучении ответ на условный стимул специфичен по отношению к дифференцировочному раздражению; эта специфичность возрастала по мере упрочения условного рефлекса. При выработке сенситизации облегчались ответы на разные сенсорные раздражения с проявлением относительной сигнал-специфической синаптической пластичности (место- и модально-специфическая сенситизация). (5) После ноцицептивной стимуляции, не повреждающей тканей животного, эффекты сенситизации сохранялись как правило 1-3 дня. В то же время, ответы на условный стимул сохранялись у улиток недели. Таким образом, имеются основания полагать, что механизмы выработки и сохранения ответов на условный стимул качественно отличаются от механизмов облегчения ответов при сенситизации.

Участие негистоновых белков хроматина в механизмах воспроизведения навыков. Исходя из приведенных фактов, нами была предпринята попытка исследовать некоторые молекулярно-клеточные механизмы процессов хранения и воспроизведения выработанных ассоциативных навыков. Согласно современным представлениям, структурно-функциональная специфичность любого органа и ткани прежде всего связана с метаболизмом уникальных для них белковых молекул (Албертс Б. и др., 1986; БтсШГе ¿Г., 1988). Считают, что в мозге млекопитающих синтезируется несколько десятков тысяч мозгоспецифических (нейроспецифических) белков (БМсШГе ,1., 1988). Особый интерес среди них представляют так называемые мозгоспецифические негисто-новые белки хроматина (НГБХ). Полагают, что они играют ключевую

роль в инициации или модуляции активности генов, функционирующих только в нервной ткани (Караванов А.А.. Афанасьев Б.Н., 1983; На-llkowski М. et al., 1988)'.

Мы изучили (Козырев С.А. и др., 1991) влияние AT против НГБХ Np 3,5 и Нр 3,6 (Мехтиев A.A. и др., 1984) на поведенческие и нейрональные корреляты процессоь хранения и воспроизведения ассоциативных навыков отвергания определенных видов пищи у виноградной улитки. У животных вырабатывали условную оборонительную реакцию отвергания моркови или яблока. В качестве дифференцировочного раздражителя применяли один из видов пищи, не являющийся условным стимулом (яблоко в одних экспериментах и морковь - в других). Через 24 ч после обучения моллюскам вводили в висцеральную полость исследуемые AT в концентрации 0,05 мг/0,5 мл физиологического раствора и затем с интервалом в 15-25 мин тестировали сохранность выработанного навыка в течение 6-7 ч. Нейрофизиологические эксперименты проводили на нейронах, модулирующих . пищевое поведение (ЛМЩ, ПИЩ), и командных нейронах оборонительного поведения (ЛПл1, ППл1) предварительно обученных виноградных улиток. Через 24 часа после обучения у улиток тестировали сохранность выработанного навыка и затем приготавливали полуинтактный препарат. AT к Np 3,5 п Np 3,6 подводили в течение 30-40 мин в физрастворе, омывавшем ганглии животного, в концентрации 1 мкМ. Иммуногистохи-мические исследования проводили на фиксированных 5-микронных срезах ганглиев улиток с использованием AT к Np 3,5, коньюгированных с перок.сидазой хрена.

Обнаружено, что AT против Нр 3,5 подавляют поведенческие реакции и ответы исследованных нейронов, вызванные определенным условным стимулом - морковью. Действие AT к Нр 3,5 было специфичным, поскольку они не изменяли реакций улиток на другой услоннкй стимул - яблоко. Кроме того, AT к другим негистоновым белкам Np 3, 6 не оказывали действия на условные реакции отвергания яблока или моркови. Зффект AT к Np 3,5 развивался через, 1,5-2 ч после их введения и сохранялся в течение 80-110 мин с последующим полным восстановлением выработанного навыка. В момент максимального проявления эффекта AT к Ир 3.5 поведенческие и нейрональные резки 'И животных на предъявление моркови не отличались от таковых у необученных улиток. Кроме того обнаружено,' что AT к Нр 3,5 не оказывали влияния на 'лицевое поведение необученных виноградных улиток.

Восстановление условного рефлекса после действия AT к Нр 3. 5

позволяет предположить, что AT не нарушают механизмы хранения памятного следа. Поскольку негистоновые белки хроматина Np 3,5 в экспериментах in vitro оказывали действие на процессы транскрипции в клетках мозга (Мехтиев A.A. и др., 1984), наиболее вероятно допустить, что белки Np 3,5 избирательно вовлечены в молекуляр-но-генетические процессы, обеспечивающие нейрофизиологические механизмы извлечения информации из долговременной памяти.

В полученных результатах обращают на себя внимание следующие факты. Во-первых, при действии AT к белкам Np 3,5, так же, как при выработке ассоциативного навыка, изменяется эффективность определенных синаптических входов командных нейронов оборонительного поведения, опосредующих возбуждение от условного стимула; латентный период и длительность эффекта AT при этом приблизительно совпадают с латентным периодом появления ответа на пищевой условный стимул и длительностью наиболее короткого времени его сохранения при выработке пищевого аверсивного навыка. Поэтому можно допустить, что в процессы как формирования долговременной памяти, так и воспроизведения, вовлечены одни и те же молекулярные механизмы: при обучении активируется синтез короткоживущих белковых молекул, которые в последующем обеспечивают воспроизведение информации за счет поддержания эффективности синаптических входов, опосредующих возбуждение, вызываемое условным стимулом. Во-вторых, поскольку при действии AT к Np 3,5 после полного подавления выработанного навыка происходит его самопроизвольное восстановление, можно предположить, что синтез белка Np 3.5 контролируется какими-то иными, долгоживущими белковыми соединениями, синтез которых, по-видимому, также активируется при обучении. В третьих, белки Np 3,5 являются мозгоспецифическими, следовательно избирательность регуляции определенных синаптических входов обеспечивается при участии специфических для нервной ткани белковых молекул, синтезируемых в результате активации генов, функционирующих только в нервных клетках.

Нейрофизиологические эффекты AT к Np 3,5 хорошо коррелируют с результатами иммуноцитохимических экспериментов. Обнаружено, что AT к Np 3,5 метили цитоплазму командных нейронов оборонительного поведения у необученных улиток. В то же время, у улиток, обученных отвергать морковь, метка в значительном количестве выявлена в ядрах нейронов. Иммуноцитохимические данные дают основание полагать, что белки Np 3,5, по-видимому, постоянно синтезируются в

командных нейронах и только при выработке навыка отвергания пищи поступают в ядро клетки, оказывая специфическое регулирующее влияние на процессы транскрипции.

Таким образом, мозгоо.пецифические негистоновые белки хроматина Np 3,5 избирательно вовлечены в механизмы воспроизведения выработанных аверсивных пищевых навыков у виноградных улиток. Введение улиткам через 24 ч после обучения AT против этих белков приводит к специфическому и обратимому подавлению поведенческих реакций и ответов командных нейронов оборонительного поведения, вызванных определенным условным стимулом - морковью, не изменяя реакций на другой условный стимул - яблоко. Эффект развивается через 1,5-2 ч после введения AT к Np 3,5 и сохраняется в течение 80-100 мин с последующим полным восстановлением выработанного навыка. AT к другому негистоновому белку хроматина Np 3,6 не оказывали действия на воспроизведение навыка отвергания яблока или моркови.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведенных экспериментов свидетельствуют, что при выработке привыкания, ноцицептивной сенситизации и ассоциативного навыка отвергания определенного вида пищи в командных нейронах оборонительного поведения виноградной улитки возникают электрофизиологические и кальций-зависимые метаболические изменения, характерные для каждого из этих простых видов обучения. Кратковременные стадии сенситизации и обусловливания сопровождались изменением свойств электрогенной мембраны (деполяризация и изменение возбудимости), которые не избирательны по отношению к какому-либо из конвергирующих к командному нейрону возбуждений. В этой связи кратковременные перестройки активности командных нейронов можно отнести к общенейрональному типу пластичности.

В реализацию кратковременных эффектов обучения в командных нейронах оборонительного поведения улиток так же, как у других типов исследованных клеток позвоночных и беспозвдночных животных (Byrne J.. 1987; Hawkins R. et al.. 1993), вовлечены, по-видимому, системы вторичных внутриклеточных посредников. При этом разные формы обучения могут вовлекать в одних и тех же клетках различные системы вторичных посредников и/или различные их комбинации. В частности, в командных нейронах улитки кальций/кальмодули-новая система, вероятно, не участвует в механизмах привыкания к повторным тактильным раздражениям; в то же время она имеет решаю-

щее значение для выработки сенситизации. Более сложные взаимоотношения систем вторичных посредников в командных нейронах возникают, по-видимому, при выработке ассоциативного навыка.

Для понимания молекулярных основ долговременных пластических перестроек необходимо' изучить механизмы основных этапов вовлечения генома в клеточные механизмы обучения: передачи приходящих к нейрону возбуждений к геному, его активации и реализации функций синтезируемых белков. Некоторые молекулярные механизмы этих процессов исследованы для общенейронального типа пластичности на сенсорных нейронах моллюска аплизии (Byrne J., 1987; Hawkins R. et al., 1993). Исходя из полученных экспериментальных данных, можно предположить, что системы вторичных посредников включены в механизмы формирования не только кратковременных, но и долговременных пластических перестроек нейронов при обучении. 0 конкретных механизмах, посредством которых вторичные посредники регулируют экспрессию генома, известно сравнительно немного. По-видимому, они изменяют активность белков-регуляторов транскрипции путем их фосфорилирования (Goelet Р. et al.. 1986; Alberini С. et al., 1994). Модифицированные регуляторы транскрипции могут затем действовать на энханцерную последовательность "ранних" генов в сенсорных нейронах (Alberini С. et al.. 1994; Kühl D. et al., 1992). Полагают, что ядерные белки, являющиеся продуктом экспрессии некоторых ранних регуляторных генов, изменяют транскрипцию иРНК "поздних" генов, которая может сохраняться длительное время и являться молекулярной основой для поддержания долговременной памяти (Alberini С. et al., 1994). Синтезируемые белки поступают к "эф-фекторным компартментам" клетки, вызывая их долговременную модификацию. Конкретные механизмы эффекторного звена долговременной общенейрональной пластичности могут включать изменения ионных каналов (их свойств, распределения, количества и тд.) (Byrne J., 1987; Hawkins R. et al., 1993), активности систем вторичных посредников (Matzel L.D. et al., 1992), регулирующих эти каналы, количества синаптических контактов (Bailey С.Н., Kandel E.R., 1993). Основные механизмы долговременных эффектов обучения, выявленные у сенсорных нейронов аплизии. могут быть сходными для всех нейронов, обладающих общенейрональным типом пластичности.

Принципиально другими должны быть механизмы долговременной синапс-специфической пластичности при обучении, поскольку они должны обеспечивать специфичность участия генов в регуляции опреде-

ленных синаптических входов. Одна из наиболее интересных в этом отношении гипотез постулирует, что существует избирательная "проекция" синаптических входов на определенные генетические локусы нейрона (Анохин П.К., 1968; 1974; Соколов E.H., 1981). В основе генетической регуляции синаптических входов при обучении может лежать метаболизм специфических для данных синапсов белковых молекул ("белков-маркеров" и белков-регуляторов). В настоящее время имеются лишь единичные, в значительной мере косвенные данные, подтверждающие эту гипотезу. Есть основания полагать, что в механизмах специфической взаимосвязи генома и синаптических входов принимают участие системы внутриклеточного транспорта (Steward 0., Banker G.A., 1992). Показана возможность избирательного транспорта в определенные локусы клетки как белковых молекул, так и иРНК (Steward 0., Banker G.А., 1992). Одним из конкретных механизмов долговременной синаптической пластичности может быть локальный синтез белков в области, тесно примыкающей к постсинапти-ческой мембране (Feig S., Llpton P.. 1993).

Полученные нами данные позволяют расширить представления о механизмах долговременной синапс-специфической пластичности. Исходя из вышеизложенных результатов экспериментов, можно полагать, что переход кратковременной памяти в долговременную (консолидация) в командных нейронах оборонительного поведения виноградной улитки должен включать активацию синтеза короткоживущих специфических для определенных синаптических входов белковых молекул. При недостаточно упроченном навыке он может исчезать в момент распада этих белков, то есть через 1-3 ч. Достаточно сформированный навык сохраняется в течение суток и более длительное время. Можно предположить, что длительному сохранению навыка должен соответствовать самоподдерживающийся синтез белков ' (длительная или постоянная активность генов, специфичных для определенных синаптических входов). Являются ли эти белки теми же самыми короткоживущими молекулами, синтез которых запускается при обучении или это другие Молекулы, обладающие иными свойствами? Если это другие белки, то как запускается их синтез? Пока в экспериментах не удалось искусственно "стереть" памятный след, не прибегая к разрушению нейронов-хранителей энграммы. Например, блокаторы синтеза белка не нарушают память после ее консолидации (Davis Н.Р., Squire L.R., 1984). Полагают, что одной из основных причин неэффективности блокаторов является значительная длительность жизни белков, под-

держивающих памятный след (Davis Н.Р., Squire L.R., 1984; Ашмарин И.П.. Титов С.А., 1988). Для подавления синтеза этих белков необходимо длительное воздействие блокаторов трансляции/транскрипции, что может привести к гибели животного. Следовательно, существуют определенные основания (хотя и косвенные) утверждать, что долговременная память значительной длительности основана на синтезе долгоживущих белковых молекул.

На следующий из поставленных вопросов существует как минимум два ответа. Во-первых, синтез долгоживущих белков может быть инициирован короткоживущими белками. Этот гипотетический механизм описан в схеме взаимоотношений ранних и поздних генов, предложенной Кэнделом и коллегами (Goelet Р., 1986; Alberini С. et al., 1994). Применительно к нашим данным эта схема должна быть адаптирована следующим образом. При обучении одновременно активируется синтез двух разновидностей короткоживущих белков: белков-регуляторов синаптической передачи и белков-продуктов "ранних" генов, активирующих "поздние" гены. Альтернативное предположение: синтезируется один вид быстрообменивающихся белков, которые активируют "поздние" гены и регулируют эффективность синаптической передачи. Во-вторых, синтез долгоживущих белков может быть инициирован одновременно и параллельно (но не последовательно) с синтезом короткоживущих белков.

Некоторые выводы о возможных механизмах взаимоотношений активации синтеза короткоживущих и долгоживущих "белков памяти" следуют из наших данных об имитации эффектов сенситизации блокатора-ми синтеза белка. После кратковременного подведения АН или ЦГ возникает избирательное синаптическое облегчение в командных нейронах оборонительного поведения виноградных улиток. Длительность сохранения этого облегчения совпадает с наиболее коротким временем такового при выработке сенситизации. Эти данные позволили нам предположить, что в обоих случаях активируется синтез быстрообменивающихся белков-регуляторов синаптической передачи. Вместе с тем, существенным отличием действия блокаторов трансляции от эффектов сенситизации явилось то, что они не способны оказывать облегчающее влияние на синаптическую передачу, сохраняющееся сутки или более. Из этих данных следует, что активация синтеза коротко-живущих белков либо недостаточна, либо не является необходимой для активации синтеза долгоживущих белков. Возможно, для активации синтеза долгоживущих белков помимо продуктов синтеза "ранних"

генов необходимо сопутствующее воздействие иных факторов, таких как фосфорилпрование ряда белков хроматина определенными системами вторичных посредников, которые не активируются при действии блокаторов трансляции. Например, как указывалось вы:ие, при различных воздействиях на клетки (в том числе блокаторами трансляции) в них экспрессируется ряд ранних генов. Однако этой экспрессии во многих случаях недостаточно для увеличения синтеза специфических белков. Так для активации синтеза белка проэнкефалина необходима конвергенция на геноме двух видов воздействий - белкового продукта ранних генов (c-fos) и увеличение уровня цАМФ (Gall С.. Lanterborn J., 1991).

Таким образом, возможная схема долговременных изменений в командных нейронах оборонительного поведения виноградных улиток при выработке сенситизации может выглядеть следующим образом. После нанесения сенситизирующего раздражения в нейронах увеличивается концентрация вторичных посредников и изменяется активность белковых веществ, которые модулируют процессы транскрипции. В результате активации транскрипции синтезируются короткоживущие белковые молекулы, относительно избирательно регулирующие эффективность определенных синаптических входов нейронов. Одновременно или последовательно инициируется синтез долгоживущих белков, которые длительно поддерживают синаптическое облегчение.

Ряд важных, дополняющих предложенную схему данных и в то же время свидетельств о возможных отличиях механизмов сенситизации и обусловливания были получены при изучении роли мозгоспецифических негистоновых белков хроматина Np-3,5 в механизмах воспроизведения выработанных навыков. Введение AT против Np-3,5 обученным улиткам вызывало избирательное подавление воспроизведения навыка отвергания определенного вида пищи (моркови). Сходство ряда нейрофизиологических эффектов AT и особенностей динамики инициации долговременной пластичности при обусловливании позволили нам предположить, что как формирование долговременной памяти, так и воспроизведение вовлекают одни и тех же молекулярные механизмы в командных нейронах: при обучении активируется синтез короткоживущих белковых молекул, которые в последующем обеспечивают воспроизведение информации за счет поддержания эффективности синаптических входов, опосредующих возбуждение от условного стимула. Белки Np 3,5, по-видимому, не принимают непосредственного участия в поддержании эффективности синаптической передачи. Данные биохими-

ческих исследований свидетельствуют, что эти белки вовлечены в регуляцию процессов транскрипции (Мехтиев А.А. и др., 1984). Исходя из результатов иммуноцитохимических опытов, можно предположить, что белки Np 3,5 постоянно синтезируются и присутствуют в цитоплазме командных нейронов улиток. При обучении эти белки, вероятно, поступают в ядро клетки и оказывают специфическое регулирующее влияние на процессы транскрипции.

Экспрессия генов регулируется многочисленными транскрипционными факторами, действующими на множественные регуляторные элементы генома. Белки Np 3,5, по-видимому, относятся к обширной группе активирующих, промотер-специфичных транскрипционных факторов (Ал-бертс Б. и др., 1986). Полагают, что эти белки могут обеспечивать дифференциальную транскрипцию генов и активацию генома в ответ на экстраклеточные сигналы, в том числе при обучении. Типичная структура промотер-специфических факторов имеет несколько разных доменов (Альберте Б.и др., 1986), которые ответственны за: транслокацию белка в ядро; взаимодействие с транскрипционным комплексом; специфическое связывание с ДНК; взаимодействие с регулятор-ными белками, которые могут активировать или тормозить активность данного фактора.

Таким образом, следует допустить, что после обучения в командных нейронах возникают метаболические изменения, создающие условия для транспорта Np-3,5 из цитоплазмы через ядерные поры в ядро. Известно (Карновская A.M., 1993), что ядерные поры обладают механизмом активного переноса белков. Молекулярный механизм ядерных пор распознает определенные сигнальные последовательности переносимых белков или таковые у специфических транспортных белков, которые образуют комплексы с переносимыми белками. Эти факты позволяют предположить, что при обучении в командных нейронах синтезируются или активируются транспортные белки, которые образуют комплексы с Np 3,5, способные транспортироваться из цитоплазмы в ядро. Из логики представленных фактов следует, что этот гипотетический белок должен иметь определенные свойства. Он должен специфически взаимодействовать с Np 3,5 и быть специфичным для активируемых условным стимулом входов командных нейронов. В противном случае нельзя объяснить, почему в результате обучения изменяется эффективность синаптических входов только для определенного условного стимула. Поскольку латентные периоды появления ответа на условный стимул и эффектов AT к Np 3,5 приблизительно совпадают,

следует заключить, что транспортные белки не могут быть синтезированы в результате активации генома при нанесении сочетанных раздражений, т.к. для этого потребовалось бы дополнительное время в несколько десятков минут. Наиболее вероятно, что транспортные белки либо синтезируются, либо активируются непосредственно при воздействии .сочетанных раздражений в постсинаптических областях синапсов, опосредующих действие условного стимула. Перечисленным свойствам удовлетворяют вышеупомянутые гипотетические "белки-маркеры" синаптических входов. Не исключено, что эти белки образуются за счет механизма локального синтеза в постсинаптических областях нейронов. Однако вполне вероятен другой механизм образования "белков-маркеров". При изучении формирования долговременной потенциации в клетках гиппокампа млекопитающих получены данные о возможном значении протеаз и. в частности, кальпаинов в инициации долговременной синапс-специфической пластичности (Lynch G., Baud-ry М., 1987). Не исключено, что наряду с другими функциями проте-азы способны "выщеплять" белки-маркеры из более крупных молекул предшественников, локализующихся в постсинаптической области.

Резюмируя изложенное, можно представить следующую схему формирования и сохранения долговременных пластических перестроек в командных нейронах оборонительного поведения виноградной улитки при обучении. Подкрепляющее и условнорефлекторное возбуждения конвергируют на молекулярных субстратах в постсинаптический области "обусловливаемого" синапса. В результате этого воздействия происходит активация протеаз или локального синтеза белков с последующим образованием специфических для данных синаптических входов "белков-маркеров". Эти белки перемещаются в околоядерное пространство клетки (возможно за счет транспортных функций цитоскеле-та); где они образуют комплексы со специфическими белками-регуляторами процессов транскрипции типа Np 3,5. Образовавшийся комплекс поступает в ядро клетки и взаимодействует с энханцерными последовательностями генов, на которые "проецируются" "условно-рефлекторные" синаптические входы. В результате активации этих генов усиливается синтез ряда белков, в т.ч. белков-регуляторов транскрипции (типа Np 3,5) и белков-регуляторов синаптической передачи. Белки-регуляторы синаптической передачи транспортируются к синаптическим входам, опосредующим возбуждение от условного стимула, и изменяют эффективность синаптической передачи. Вполне правомерно предположить, что эти же белки могут служить субстра-

ГЕНОМ

| | | | | Ретуляторная обл | Транскрибируемая обл

1 т т

Синаптическое облегчение

Увеличение

А

* А

иРНК

пяп

Идерная мемЬрама

Г

)сООЭ

Б ^........

Белки-маркеры

б

> Белки

регуляторы

Схема молекулярно-клеточных событий, происходящих в командных нейронах оборонительного поведения при выработке ассоциативного навыка отвергания определенного вида пищи у виноградной улитки. УС - возбуждение, вызванное пищевым условным стимулом. БС - возбуждение, возникающее на предъявление безусловного (подкрепляющего/сенситизирующего) раздражения. Кр-3,5 -¡■;озгоспецифлческий негистоновый белок хроматина, специфически регулирующий транскрипцию гена, на который "проецируются" синапсы, опосредующие возбуждение в ответ на предъявление условного стимула. П - протеаза, "выщепляющая" "белки-маркеры" синапсов из молекул-субстратов - белков-регуляторов синаптической передачи. БД - долгоживущие белки, поддерживающие устойчивую транскрипцию гена, активированного при обучении. Р - рецептор нейромедиатора. КК - кальциевый канал, открывающийся при деполяризации мембраны, вызванной возбуждением в ответ на предъявление БС. ПЯМ - порд ядерной мембраны. Ри - рибосома.

том для ферментативного "выщепления" "белков-маркеров" синапсов. Как уже упоминалось, при действии АТ к Нр 3.5 после полного подавления выработанного наЕыка происходит его самопроизвольное восстановление. В связи с этим необходимо предположить, что синтез белков Ыр 3,5, и белков-регуляторов синаптической передачи контролируется какими-то иными, долгоживущими белковыми соединениями, синтез которых также активируется при обучении. Таким образом, описанная система обновления информационных соединений может обеспечить с одной стороны, высокую устойчивость молекулярных процессов, лежащих в основе долговременной ассоциативной памяти, а с другой - достаточную чувствительность этих процессов к действию возбуждений, приходящих на клетку.

Помимо описанного эффекта "подкрепляющее" возбуждение вызывает изменение свойств электрогенной мембраны нейрона (деполяризация и увеличение возбудимости), характерное для кратковременной стадии обучения, а также активацию обширных участков .ДНК. Эта активация является необходимым этапом для последующего воздействия на геном белков-регуляторов транскрипции типа Нр 3,5. Кроме того, она приводит к синтезу белков, вызывающих синаптическое облегчение, характерное для долговременной сенситизации.

Молекулярные механизмы быстрого генетического контроля синаптической передачи выявлены нами в нейронах системы оборонительного поведения. Можно предположить, что эта система отличается значительной скоростью пластических перестроек в нейронах, что может быть связано с обеспечением быстрого научения распознавать внешние повреждающие раздражители. Не исключено, что синтез быстрооб-менивающихся белков-регуляторов служит механизмом ускорения долговременных изменений и является "эволюционным приобретением" в дополнение к механизмам регуляции синаптической передачи долгоживущими белками. В других системах нейронов, обеспечивающих иные, более "медленные" виды обучения, эта система может отсутствовать. Например, положительный условный рефлекс на пищу (запоминание съедобной пищи) должен, по-видимому, закрепляться в памяти после ее переваривания при отсутствии отрицательных последствий (отравления). В такой системе слишком быстрое положительное запечатление образа пищи может привести к гибели животного. Следовательно, для некоторых типов нейронов и видов обучения отпадает необходимость наличия механизма быстрого генетически-опосредуемого изменения определенных синаптических связей.

ВЫВОДЫ

1. Выработка ноцицептивной сенситизации у улиток сопровождается кратковременными и долговременными изменениями нейрофизиологических и кальций-зависимых метаболических показателей активности командных нейронов оборонительного поведения. Кратковременная стадия развивается в течение 1 ч от начала выработки сенситизации и характеризуется деполяризацией плазматической мембраны, увеличением ее возбудимости и первоначальным нарастанием содержания Са-с. Долговременная стадия развивается через 1 ч после начала обучения, характеризуется облегчением ответов нейронов на тестирующие раздражения и повторным увеличением содержания Са-с.

2. Долговременное изменение ответов командных нейронов оборонительного поведения возникает при сенситизации за счет избирательного облегчения эффективности определенных синаптических входов. Более выраженное синаптическое облегчение выявлено в ответах на тестирующую стимуляцию участка тела, который подвергался сен-ситизирующему воздействию, по сравнению с таковым в ответах на раздражение других участков тела (местоспецифическая сенситиза-ция); кроме того, более выраженно облегчались ответы на тестирующее раздражение, которое совпадает по модальности с сенситизирую-щим стимулом, по сравнению'с увеличением выраженности ответов на тестирующее раздражение другой сенсорной модальности (модальнос-пецифическая сенситизация). Минимальная длительность синаптичес-кого облегчения на тактильные раздражения составила около 1 ч, а на химические раздражения слабым раствором хинина - 2-3 ч. Наиболее короткое время сохранения ответов на пищевой стимул составило около 1,5 ч.

3. Кальций/кальмодулиновая система вторичных посредников вовлечена в инициацию кратковременных и долговременных эффектов ноцицептивной сенситизации в командных нейронах оборонительного поведения, но не принимает непосредственного участия в реализации долговременных эффектов. Удаление ионов кальция из раствора, омывающего нейроны, или ингибирование кальмодулина с помощью Ш в момент нанесения ноцицептивного раздражения приводит к блокаде кратковременных и долговременных электрофизиологических и метаболических (Са-с) изменений, характерных для сенситизации. Ингибирование кальций/кальмодулиновой системы после нанесения сенсити-зирующей стимуляции не вызывает блокады долговременных эффектов.

4. Долговременные нейрональные эффекты сенситизации зависят от активности белок-синтезирущего аппарата. Блокаторы синтеза белка циклогекспмид и анизомицин при постоянном подведении к нейронам в дозах 30-100 мкМ подавляют развитие синаптического облегчения и повторное нарастание Са-с, являющихся характерными проявлениями долговременной сенситизации в командных нейронах оборонительного поведения. Гистохимическими методами с использованием флуоресцентных красителей хлортетрациклина и хехст 33258 (индикатор активности ДНК в клетках) выявлено, что выработка сенситизации приводит к повышению генетической активности в командных нейронах, которая достигает наибольшей выраженности через 1.5 ч после нанесения ноцицептивного раздражения, т.е. в момент максимального синаптического облегчения при выработке сенситизации.

5. Блокаторы-синтеза белка вызывают нейрональные эффекты, характерные для раннего периода долговременной сенситизации. С 65-75 мин после начала подведения циклогексимида или анизомицина в течение 30 мин в дозе 30 мкМ отмечено облегчение синаптических компонентов ответов командных нейронов оборонительного поведения на тестирующие сенсорные раздражения без изменения уровня мембранного потенциала и возбудимости мембраны. Эффекты блокаторов избирательны по отношению к сенсорным раздражителям: облегчение ответов на тактильные раздражения сохраняется около 1 ч, на слабый раствор хинина.- 2-3 ч и на морковный сок - 1,5 ч.

6. Выработка привыкания к повторным тактильным раздражениям поверхности тела виноградных улиток приводит к уменьшению выраженности электрофизиологического ответа командных нейронов оборонительного поведения, а также к снижению содержания Са-с в этих клетках. Антитела против белка Б-ЮО ускоряют уменьшение ответа на повторную стимуляцию, а антитела к белку кальмодулину не оказывают влияния на выработку привыкания в командных нейронах.

7. При ассоциативном обучении отверганию определенного вида пищи в командных нейронах оборонительного поведения возникают электрофизиологические изменения, характерные как для обусловливания - появление ответа на условный стимул, так и для сопутствующей сенситизации - деполяризация мембраны, увеличение ее возбудимости и облегчение синаптических компонентов ответов на тактильные и химические раздражения. Ответы на условный стимул возникают на 30 мин позже, чем синаптическое облегчение, характернее для долговременной сенситизации.

8. Выработка сенситизации и обусловливания сопровождается существенными различиями динамики кальций-зависимого метаболизма е командных нейронах оборонительного поведения. Кратковременная и долговременная стадии выработки сенситизации коррелируют с фазным увеличением содержания Са-с. При выработке обусловливания в кратковременную стадию отмечено уменьшение содержания Са-с ниже исходного уровня с последующей его стабилизацией, которая совпадает с синаптическим облегчением ответов на сенсорные раздражения. Появление электрофизиологического ответа на условный пищевой стимул совпадает с увеличением содержания Са-с.

9. Мозгоспецифические негистоновые белки хроматина Ир 3,5 избирательно вовлечены в механизмы воспроизведения выработанных аверсивных пищевых навыков у виноградных улиток. Антитела против этих белков, введенные через 24 ч после обучения, специфически и обратимо подавляют поведенческие реакции и ответы командных нейронов оборонительного поведения, вызванные определенным условным стимулом - морковью, не изменяя реакций на другой условный стимул - яблоко. Эффект развивается через 1,5-2 ч после введения антител к Ир 3,5 и сохраняется в течение 80-100 мин с последующим полным восстановлением выработанного навыка. Антитела к другому негисто-новому белку хроматина Ир 3,6 не оказывали действия на воспроизведение навыка отвергания яблока или моркови. Антитела против Мр 3.5 у необученных моллюсков метят цитоплазму командных нейронов оборонительного поведения, тогда как у улиток с выработанным ннэреивным навыком на морковь метка выявлена в ядрах этих клеток.

10. Предположено, что как процессы консолидации долговременной памяти, так и воспроизведения у виноградных улиток связаны с активацией синтеза короткоживущих белковых молекул, которые вовлечены в генетически опосредуемую специфическую регуляцию определенных синаптических входов командных нейронов оборонительного поведения.

Список основных работ по теме диссертации Никитин В.П., Самойлов И.О., Шерстнев В.В., Майоров В.Н. Динамика связывания Са 2+ в идентифицированных нейронах виноградной улитки//Нейрохимия. - 1985. - Т 4, N 2. - С.163-171.

Никитин В.П., Самойлов М.0. Динамика содержания мембрано-свя-занного кальция в командных нейронах виноградной улитки в условиях тактильной стимуляции//Доклады АН СССР. - 1986. - Т. 288, N 1.

- С. 253-256.

Eajlc И., Nikitin V. P., Lazetic В., Galeva N. N.. Sherstnev V.V. Brain-specific protein S-100 and neuronal mechanisms of simple forms of learning/VJugoslav. Physiol. Pharmacol. Acta.

- 198S. - V. 22, III. - P. 45-52.

Козырев С.А., Никитин В.П., Шерстнев В.В. Влияние гамма-глобулинов к мозгоспециФнческим негпстоновым белкам хроматина на воспроизведение выработанного навыка у виноградных улиток//Бюлл. эксперт'. биол. и медицины. - 1937. - Г. 104, N 8. - С. 139-141.

Никитин В.П., Лажетич Б., Бапч м., Шерстнев В. В. Участие моз-госпецифических белков группы S-100 в нейрофизиологических механизмах прпвыканпя//НейроФизиология. - 1987. - Т. 19, N 5. - С. 637-645.

Шерсткев В.В., Никитин В.П., Рылов А.Л. Молекулярные механизмы интеграткЕной деятельности нейронов. В кн.: Функциональные системы организма. - М.: Медицина, 1987. - С. 319-352.

Fillpovic D., Bajic !l, Sterio D., Konjevic D. ¡likitin V. P. Effect of brain-specific, protein of the group S-100 on neuronal activity in Aplysia depilans// Jugoslav. Physiol. Pharmacol. Acta. - 1987. - V. 23, HI. - P. 31-38.

Никитин В.П.. Самойлов И.О. Участие кальций-связывающих мембранных компонентов в нейрофизиологических механизмах привыкания у виноградной улитки//Нейрофизиология. - 1989. - Т. 21, !1 5. - С. 605-612.

Никитин В.П.. Шерстнев В.В., Баич И., Лажетич Б. ЫозгоспециФи-ческие белки S-100 в нейрохимической организации простейших Форм обучения у моллюсков. В кн.: Системные механизмы поведения. - И. : Медицина. 1990. - С. 215-230.

Никитин В.П.. Самойлов И.О. Хлортетрациклиновый флуоресцентный зонд-индикатор связывания ионов кальция кальций-связывающими бел-ками//Биофизпка. - 1990. - Т. 35. М 6. - С. 921-924.

Никитин В.П.. Козырев С.А. Динамика оборонительных и пищевых реакций при выработке сенситизации у виноградны: улиток// Жури, высш. нервн. деят. - 1991. - Т. 41. N 3. - С. 478-489.

Никитин В.П.. Козырев С.А., Самойлов М.0. Вовлечение внутриклеточного кальция в процесс сенситизации командных нейронов оборонительного поведения виноградной улиткн//НейроФизиология. 1991. - Т. 23, N 4. - С. 418-427.

Никитин В.П., Самойлов И.О., Козырев С.А. Участие кальция и

кальмодулина в механизмах выработки сенситизации у виноградной улитки//Докл. АН СССР. - 1991. - Т. 320, HI. - С. 236-241.

Козырев С.А., Никитин В.П., Шерстнев В.В. Избирательное участие мозгоспецифических негистоновых белков хроматина Np-3.5 в процессах воспроизведения оборонительного навыка на пищу у виноградных улиток//Журн. высш. нервн. деят. - 1991. - Т. 41, N 2. -С. 323-332.

Fillpovic D., Naumovic N.. Nikitin V.P., Konjevic D. Participation of brain-specific nonhistone chromatin proteins in neuronal mechanisms of defensive responses in Aplysia depilans//Matlca Srpska (Jugoslav!ja). - 1991. - V. 81. - P. 29-35.

Sherstnev V.V., DolgovO.N., Nikitin V.P. Brain-specific proteins in systems mechanisms of reinforcement. In: "Systems Research in Physiology". Vol. 4. "Reinfocement in functional systems" K.V.Sudacov (ed.). Gordon and Breach London. 1991. - P. 155-168.

Sherstnev V.. Nikitin V. Transsynaptic modulation by sensitization in snail. The role of calmodullne. XVeme conference en neurobiologie de Gif "Synaptogenesis and differentiation of synaptic areas". Gif Sur Yvette. 1990. - P. 51.

Никитин В.П., Самойлов М. 0., Козырев С.А. Механизмы выработки сенситизации у виноградной улитки: участие кальция и кальмодули-на//Журн. высш. нервн. деят. - 1992. - Т. 42. N 6. - С. 1250-1259.

Никитин Е.П.. Козырев С.А., Самойлов И.О. Обусловливание и сенситизация у виноградной улитки: нейрофизиологические и метаболические особенности//Журн. высш. нервн. деят. - 1992. - Т. 42, N 6. - С.1260-1270.

Никитин В.П., Козырев С.А.. Самойлов М.О. Нейрофизиологические изменения и динамика связанного кальция при выработке ассоциативного обучения у виноградной улитки//Нейрофизиология. - 1992. -Т. 24, N 6. - С. 691-701.

Никитин В.П. Молекулярно-клеточные механизмы обучения виноградной улитки//Журн. высш. нервн. деят. - 1993. - Т. 43, N 2. -С. 377-388.

Никитин В.П.. Козырев С.А. Действие блокаторов синтеза белка на нейрональные механизмы сенситизации у виноградной улитки// Нейрофизиология. - 1993. - Т. 1, N 2. - С. 109-115.

Никитин В.П.. Козырев С.А. Долговременное синаптическое облегчение при обучении у улитки: возможные механизмы формирования

долговременной памятн//Нейрофизиология. - 1993. - Т. 1. N 5. - С. 383-389.

Гончарук В.Д.. Козырев С.А., Никитин В.П. Выработка сенситизации у виноградной улитки: морфофункциональные корреляты в командных нейронах оборонительного поведения//Нейрофизиология. - 1993.

- Т. 1. No 2. - С. 150-157.

Самойлов М.0., Емельянов Н.А.. Никитин В.П.. Мокрушин A.A. Современное состояние проблемы молекулярно-клеточных механизмов обученпя/АТ'ИЗИол. журн. - 1993. - Т. 79, N 5. - С. 89-97.

Никитин В. П., Козырев С. А., Гвоздева М. М., Шевелкин A.B., Шерстнев В.В. Блокаторы синтеза белка воспроизводят влияние ноци-цептивной сенситизации на оборонительные и пищевые реакции у виноградной улитки//Журн. высш. нервн. деят. - 1994. - Т. 44, No 6.

- С. 1004-1015.

Никитин В.П., Козырев С.А. Блокаторы синтеза белка имитируют нейрофизиологические эффекты долговременной сенситизации у виноградной улитки//Нейрофизиология. - 1994. - Т. 26, N 1. - С. 68-75.

Подпись '/ , l В.П.Никитин'

г / .. <- t / -''

автора /