Автореферат и диссертация по медицине (14.00.17) на тему:Трансмембранные ионные токи изолированных нейронов виноградной улитки в условиях внутриклеточного действия циклических нуклеотидов и ингибиторов синтеза белка

1 К ' « 'г ■ Г

ОРДЕНА ЛЕНИНА АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ НОРМАЛЬНОЙ ФИЗИОЛОГИИ им. П. К. АНОХИНА

На правах рукописи

УДК 612.014.3:612.822.3/829 БОГОМОЛОВ Вадим Иванович

ТРАНСМЕМБРАННЫЕ ИОННЫЕ ТОКИ ИЗОЛИРОВАННЫХ НЕЙРОНОВ ВИНОГРАДНОЙ УЛИТКИ В УСЛОВИЯХ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО ДЕЙСТВИЯ ЦИКЛИЧЕСКИХ НУКЛЕОТИДОВ И ИНГИБИТОРОВ СИНТЕЗА БЕЛКА

14.00.17 — Нормальная физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1990

Работа выполнена в НИИ нормальной физиологии им. П. К. Анохина АМН СССР.

Научный руководитель: кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник Ю. Н. САМКО

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Т. А. АДЖИМОЛАЕВ, доктор психологических наук, профессор Г. Г. АРАКЕЛОВ

Ведущее учреждение: Институт биофизики АН СССР

Защита диссертации состоится 1990 г. в 10

часов на заседании специализированного Ученого совета Д 001.08.01 при Научно-исследовательском институте нормальной физиологии им. П. К. Анохина АМН СССР по адресу: 103009, Москва, ул. Герцена, д. 6, корп. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ нормальной физиологии им. П. К. Анохина АМН СССР.

I А

Автореферат .разослан « 1Ь » 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

Т. И. БЕЛОВА

• ' t

^cpTiUV^J ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ '' ■

Актуальность исследования. Одной из центральных проблем нейрофизиологии на протяжении последних лет является вопрос о молекуляр-но-клеточном механизме сопряжения мембранных и внутриклеточных процессов, лежащем в основе передачи и преобразования информации в мозге, его интегративной деятельности. Подход к решению этой проблемы наметился благодаря обнаруженному в последнее время факту метаболической внутриклеточной регуляции мембранных ионных каналов. Одним из широко исследуемых является механизм регуляции, в основе ко. торого лежит зависимое от циклического аденозишонофосфата СцАЫФ) фосфорилирование каналообразувщих белков. В настоящее время установлено, что для функционирования Са-каналов плазматической мембраны нервных клеток необходимо наличие во внутриклеточной среде цАМФ в микромолярных концентрациях. Что же касается потенциалозависимых каналов основных токопереносящих ионов, На- и К-каналов, то вопрос об их метаболической.регуляции пока остается открытым. Актуальность i решения этой проблемы определяется значительной ролью указанных ка- j налов в генерации электрической активности нервных клеток.

Непосредственное участие цАШ в процессах внутриклеточной per ■ гуляции ионной проводимости, по крайней мере кальциевой или Са-за-висимой, на сегодняпший день не вызывает сомнений. Вместе с тем, следует отметить отсутствие убедительных данных о роли в этих процессах циклического гуанозинконофосфата СцГ!<Й<). В связи с этим представляется актуальным исследование зависимости трансмембраншсс ионных токов от внутриклеточного цГМЙ.

Согласно современным представлениям, следствием повышения концентрации циклических нуклеотидов, вызванного горчрн-рецептор-ным взаимодействием, является фосфорилирование определенных белков. Причем, спектр направлений спеи^|}ических действий цАЬЙ весьма широк: от экспрессии целого ряда генов до изменения проводимости отдельных мембранных ионных каналов. Столь многообразные проявления эффекта повышения внутриклеточной концентрации цАМФ не могут не вызвать закономерного предположения о возможности непрямого, ' опосредованного внутриклеточными метаболическими процессами, действия цА1$. Так, нельзя исключить возможности относительно быстрой (в пределах I - 1,5 часов) цА'-!£-индуцированной экспрессии определенных генов, кодируюцих каналофюршруяцие белки или их регулятор-ные субъединицы, что нашло Сы отражение в изменении ионной проводимости. С цель?) разграничения прямых, связанных с непосредственным цЛМ£-завнс;;мь'м фосфорилированкзм компонентов ионных каналов, и опосредованных внутриядерными процессх-да эффектов цАМ£ целесооб-

разно применение ингибиторного анализа в условиях внутриклеточного введения того или иного блокатора синтеза белка с последующей регистрацией, изменений донных'токов. Вместе с тем, не менее актуальны! является вопрос о специфичности эффектов, вызываемых ингибиторами белкового синтеза.

Цель и задачи исследования. Основная цель исследования состояла в изучении роли циклических нуклеотидов в регуляции потениеало-зависимых ионных каналов плазматической мембраны нейронов. I Конкретными задачами в соответствии с основной целью являлись:

1. Изучение роли цАМФ в регуляции потенциалозависимых натриевых и калиевых каналов плазматической мембраны нейронов.

2. Определение компонентов интегрального тока, чувствительных к действию цГМФ. Исследование амплитудных, кинетических и фармако--логичес^их свойств цГМФ-чувствительного тока.

3. Исследование влияния блокаторов белкового синтеза на трансмембранные ионные токи изолированных нервных клеток.

Научная новизна работы. Впервые показано, что под действием внутриклеточного цШФ происходит повышение потешдаалочувствитель-ности натриевых каналов нейрональной мембраны. Обнаружен цА1й-чув-ствительный калиевый ток, обратимо и дозозависимо подавляемый при увеличении внутриклеточной концентрации цАМФ. Установлено, что при наличии во внутриклеточном растворе ионов магния (не менее I мМ) цГМФ оказывает активирующее действие на Са-каналы. Показано, что пуромищн в.концентрациях 10"® + Ю-4 М активирует Са-каналы, тогда как 6-азагуанин в тех же концентрациях вызывает их быстрое и необ-р?' :мое блокирование. Обнаружено, что при действии актиномицина Д

.¡уромиадна происходит необратимое ингибирование К*-каналов. Показано, что 8-азагуанин вызывает увеличение времени релаксации ¡^-каналов, тогда как амплитуда К^-тока при действии этого антибиотика остается неизменной. > '

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Внутриклеточный ц/ШФ повышает возбудимость соматической мембраны нейрона.

2. Внутриклеточный цАМФ ингибирует быстро инактивируициеся ТЭА-чувствительные К*-каналы,

' 8. Внутриклеточный цГМФ в присутствии иДМФ, АТФ и ионов магния активирует потенциалозависимые Са-каналы нейрональной мембраны.

4. Внутриклеточное действие как актиномицина Д, так и пуроми-цина характеризуется необратимым ингибированием каналов медленно инактивирующегося К^-тока.

5. Внутриклеточное действие как пуромицина, так и 6-азагуанина

на Са-каналы нейрональной мембраш носит неспеци^ический характер.

Научно-практическая значимости. Большая часть представление в работе данных и выводов имеет теоретическое значение. Они вносят вклад в понимание роли циклических нуклеотидов в регуляции потенци-алозависимых ионных каналов нервных клеток. Установленный нами факт непосредственного участия цАЖ и цГМ<5 в механизмах регуляции натриевых, калиевых и кальциевых каналов нейрональной мембраны расширяет существующие представления о возможных функциях циклических нуклеотидов в клетке и открывает новые перспективы для дальнейших исследований в этом направлении.

Некоторые результаты могут иметь практическое значение. К та- . ким результатам можно отнести данные, полученные с использованием ингибиторного анализа, позволяющие вскрыть некоторые неслецифически е эффекты антибиотиков, что может найти применение в фармакологии.

Апробация работы. Материалы диссертации долокены на совместных конференциях молодых ученых Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии АН СССР, НИИ нормальной физиологии им.П.К.Анохина АМН СССР и ША мозга ВНЦЕВ АМН СССР (Москва, 1965, I9B6, 196?), ' совместной конференции молодых ученых Института фармакологии АМН СССР, НИИ общей патологии и патофизиологии АМН СССР и НИИ нормальной физиологии им.П.К. Анохина АМН СССР (йосква, март, I9&6), заседании Московского физиологического общества '»январь, 1987), на итоговых сессиях НИЛ нормальной (физиологии им,П.К.Анохина АМН СССР (январь, 19Ьб; январь, I9L7), на УН Всесоюзном семинаре ''Развитие общей теории функциональных систем" (Москва), Х9с5), на ХУ съезде Всесоюзного физиологического общества им.И.П.Павлова при АН СССР СКишинев, сентябрь, 19ь7), на X Всесоюзной конференция по биохимии нервной системы (Горький, октябрь, 19Ь7), на международной школе-семинаре молодых ученых "Обучающийся мозг" (Репино, декабрь, ISb?), на международном симпозиуме "Транспорт ионов и механизмы его регуляции" (Тбилиси, ноябрь, 19Ь9). Диссертация апробирована на совместном заседании отдела системных -механизмов целенаправленного поведения, лаборатории молекулярной нейрофизиологии и биохимии и кафедры нормальной физиологии 1-го ÎBM им.И.М.Сеченова 28.декабря 1969г.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 142 страницах машинописного текста. Диссертация содержит Z9 рисунков и состоит и;? введения, обзора литературы, описания методов исследования, трех глав собственных результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы, который вклтчэет 2£5 источников, ис них 93 отечественных и 132 зарубежных.

МЗТОДКА ИССЛВДРВАШЙ

Эксперименты проводили на изолированных неидентифицированных нейронах виноградной улитки Hsliz pomatia при температуре 1В-20°С. Нейроны выделялись пипетированием после обработки окологлоточного кольца нервных ганглиев 0,05$ раствором проназы Р С SERVA , ФРГ) в течение I часа при температуре 4°С. ¿ермент растворяли в растворе Рингера для моллюсков /Д.А.Сахаров, 1974/ следующего состава {. в ыМ ): KaCl - 80, KCl - 4, СаС12 - 7, MgCl2 - 5, trio-HCl или

HEíES - 10; pH -7,4 . Изолированные нейроны диаметром 100 - 1£0 мкм переносили в прозрачную камеру объемом 2 мл, через которую непрерывно пропускали раствор Рднгера со скоростью 1-2 мл Даш. Дая внутриклеточной перфузии использовали бескальциевый раствор, содержавший при регистрации суммарного тока (в кМ): KCl - 90, HgCl2 - 2 , ЭГТА-3, № - 2, цАШ - 0,05, tris-HCl или KEPES - 10,рН-7,2 . Для регистрации электрической активности нейрона и контроля вне- и внутриклеточной среды был использован модифицированный метод фиксации потенциала и внутриклеточной перфузии /P.D.Bregestovski.V. i.lljin, .1930 /. Трансмембранные токи, измеренные в режиме фиксацм потенциала, записывали на цифровую машину дня биомеднвднских расчетов AH0PS(ПНР) или на регистрирую^й комплекс, включащий запоминающий осциллограф VC-10 и накопитель DAT-1100 1оба фмрш "Hihon Kohden", Япония), позволяющей производить с ионными токами операции сложения и вычитания. Все симметричные компоненты регистрируемого тока, как правило, автоматически отделяли путем суммирования ответов на равнее по величине гипер- и деполяризукяцие смещения мембранного потен-

.ала одинаковой амплитуды и длительности. Кривые трансмембранных токов выводили на графопостроитель фирмы "Brüel & К^мг" СДшия).

Идентификацию калиевых, натриевых и кальциевых токов осуществляли при их разделении с учетом следующих критериев: I) вольт-амперная зависимость тока; 2) его кинетика;. 3) фармакологическая чув- ' ствительность; 4) зависимость от концентрационного градиен?а ионов- . переносчиков тока; 5) метаболическая зависимость.

Блокирования К^-тока добивались либо применением ионов цезия, либо замещением ионов К* во внутриклеточном перфузате на эквимоляр-ное количество непроникающих ионов триса и применения ТЭА. Затем регистрировали суммарный входяций ток. Используя эквимолярную замену ионов lía+ на ионы трнса в наружном растворе, выключали натриевый ток. Применяя безнатркевый омывающий раствор и бескалиевый раствор для внутриклеточной перфузии, выделялч Са-ток. Устранение выходящего Потока достигалось за счет повышения внутриклеточного pH до 7,8. Если эта процедура не приводила к увеличению Са-тока, внутриклеточное значение pH воззращали к исходному. Цосле чего из записанной

ранее суммарной натрий-калы^евой компоненты'ионного тока вычитали кальциевую составляет^, что позволяло измерять чистый натриевой ток. V '

При изучении регуляция циклическим Aïlî Яп+-«жа сначала вызывали необратимую инактивации цАмФ-чувстш тельного Са-тска путем внутриклеточной перфузии нейрона раствором, не содержащим А1Ф и цАйФ /П.Г.Костяк, ISbô; S.A.Fedulova et al.,1935 /. При этом полное устранение цАМ$-чувствителыюго Са-тока в наших экспериментах наступало в течение 10 - 25 ш» перфузии. Показателем ккактивагсш всех цАМ^-зависимых Са-каналов в условиях эквинолярной закекы ионов :¡a+ в наружной среде на ионы триса являлось отсутствие входящих токов в ответ на деполяризуй"?*?? икгульс ¡¡егаоисиш от добавления во внутриклеточный перекат цАМФ и ЛТФ. Обратная замена ионов триса на ионы На+ позволяла регистрировать Яа+-ток.

В ходе опытов были зарегистрированы 8 нейронов, в которых Са-ток практически отсутствовал, что делало вышеуказанную процедуру разделения входящих токов ненужной.

Выделение ¡{''"-тока осуществляли двумя способами: * I) При регистрации суммарного тока за К'"-ток принимали выходящий компонент, который исчезал дри внутриклеточной перфузии нейрона раствором, содержащим 70 m'í CoOl ; К+-ток идентифицировали этим способом после каждой сиены внутриклеточного раствора. Остаточный компонент суммарного выходящего тока, который регистрировался после блокирования ¡С^-составля.ощей иока;ли Cs+ в условиях, когда цА1<Й-чувствителышй Са-ток был инактивирован описании;/, акае методом, принимали за неспецифлческлй выходящиР ток. Протсннуц природу этого тока проверяли повышением рН внутриклеточного раствора До 7,6.

2) 11а первом этапе добивались полной инактивации пдмф-зашеимого Са-тока как указано вше. Лош На+в акстраклеточном растворе замещали на экишолярное количество ионов триса. Учитывая измеренный . первым способом неелешфпческий виходяцай ток, оставшиеся выходящий ток считали калиевым.

С грим повышения амплитуды входящего Са-то2са при изучении его внутриклеточной регуляции знеклоточный раствор имел следуащий состав Св мМ): СаСХй - '¿о, ifcci,,' - 4 , трис- hci - 30, ри - 7,4 /П.А.Дорошенко и др.,19С1/. Вну^риклеточны" pacrEo¡; np.i регистрации Са-тока содержал С в цЦ) : i'Cl - 110, '¿ГГЛ -Зили ЭДГА - 3, UrOI, - 1, A'lí- - 2, цУй - рН - 7,2. Для приготовления растворов Hcno.T¿;ioB--jKi неорганически'! соли отечественного производства кваллфьптия ССЧ, а ч-гджи -у лочи Ш; и !<зСй производства фяр-

мы "V3B". (ГДР), органические вещества трис-(гидроксиыетил)-аминоме-тан, трисЧ гидроксиыетил) -аминометан-гидроглори д, iiepes (tí-2-гидро-ксиэтилшперааин- Н -зтаксульфоновая кислота), оГГА (этилонгликоль-бие-^5-ашноэти"овый афир)-Н,Н -тетрауксусная кислота), ТЭА-Вг (бромид тетраэтиламмония), проказа Р, цАШ-, if iäS, цУМ» йдалический ури-динмонофосфат), гИДК . циклический штидинконофосфат), суабаин, ве-раламил (все вещества фирмы "SSRVA" , ФРГ); цурошц:н, в2-ыонобути-рилгуанозин-3': 5' -циклическая монофосфорная кислота(ЫВцГ11®) (фир-f мы "Sigma" , США); натриевая соль АГ5, актиномицш Д (фирмы "Reanal", ВНР); 8-азагуашн (фирмы "Koch-Light bub." , Великобритания). Перед использованием этих реактивов в эксперименте была проверена их растворимость в физиологическом растворе. Низкой относгтельно остальных веществ растворимостью отличались 6-азагуанин и иГМФ. При концентрации последних свыше 10"'it они полностью не растворялись, образуя суспензию.

Есего исследовано 140 изолированных неидентифицированных нейронов виноградной улитки.

.. РЕЗУЛЬТАТЫ ЙССЛБДОАЙ-fí i

I. Регуляция натриевой и калиевой дроводимостей нейрональной мембраны щкдическим Ш&.

А. Действие внутриклеточного цАЙ* на натриевый ток изолиро-ванныл нейронов.

Цель экспериментов состояла в изучении влияния внутриклеточно- ; го цААФ на натриевый ток изолированных нейронов. Регистрацию токов осуществляли в условиях внутриклеточной перфузии нейрона раствора- ' м* с различной кокцентращей цАМФ. Поддерживаемый на нейрональной -змбране потенциал составлял -70 мВ. Том регистрировали в ответ на подачу командных прямоугольных импульсов напряжения (с амплитудой от IÜ до т30 мВ), подаваемых .на-мембрану через перфорирующую пипетку. Импульсы имели'длительность от 30 до 50 мс, а интервал между подачей имцульсов составлял от I до к. :лш. Интервал выбирал- , ся из расчета замены внутриклеточного раствора в объеме нейрона на новый раствор в прогессе внутриклеточной перфузии.

Действие внутриклеточного гАМФ на натриевый ток изучено у 19 нейронов, из- них у -8 клеток входящая компонента ионного тока не имела кальциевой составляющей. У 1£ клеток обнаружена однотипная чувствительность натриевого тока к внутриклеточному цАМ2, в том числе у 6 нейронов, б которых отсутствовал Са-ток. Натриевые токи остальных клеток (около 37¿ от числа исследованных) не проявляли видимой чувствительности к iyUí и характеризовались Острым сниже-

тем амплитуды при периодических тестирующих воздействиях в ходе внутриклеточной перфузии Спадение амплитуды натриевого тока примерно вдвое за 10 мин перфузии). БЬзможко, это связано с необратимым повреждением клеток, вызванным отрывом участка нейрональной мембраны.

В нейронах, в которых Са-ток фактически отсутствовал, эффект введения в раствор для внутриклеточной перфузии цАМФ проявлялся в изменении кинетики и погендаалозависимости натриевого тока. Наличие Са-тока проверяли заменой в наружном растворе ионов натрия на ионы триса и аналогичной заменой ионов К+ на иены триса во внутриклеточном перфузате. Эта процедура осуществлялась как до введен:?.- ", цДМ® г-4 нейрона), так после введения цАМ? в состав анутрихлего'-,-ного раствора СБ нейрсноЕ). Изменение кинетики натриевого тока выражалось в снижении постоянных времени акта ваши а инактиваши в области отрицательных значений тестирующего 'потеншала при внутриклеточной перфузии нервной клетки раствором, со„зрдащим цАМФ. Постоям, .ая времени активащи натриевого тока при деполяризадаи. нейрональной мембраны до -10 мВ в контроле составляла 19,6 * 2,1 мс^к , Сп*19); тогда как при.перфузии нейрона раствором, содержащим IQ~~*U

постоянная времени активащк натриевого тс а снижалась до 13,2 * 1,9 ысек Сп»12), Примерно тшшм же соотношением характеризовалось падение постоянной времени кнакткваши ^а+-тска в области отрицательных значений тестирующего потешкала. Однако в области положительных смещений мембранного потенщала картина менялась б противоположную сторону. Постоянная времени активации при1 деполяризации нейрона до +IC мВ в контроле составляла 2,1 * 0,9 мсек(п « =19); тогда как в присутствии зо внутриклеточном растворе цДй§ постоянная зремени активацш увеличивалась до 8,8 ± 2,0 мсек (п »'2). Еще в большей степени возрастала по сравнеьию с контр.дем постоянная времени инактивации, что отражает более медленною кинетику инактивации *та+-тока в присутствии пАМ5.

Наиболее выраженные изменения как в кинетических характеристиках, так и в потенциалозависимости ¡1а+-юлоз обнаружены при концентрации цАИФ Ю-4 Ы.

Построенные по пиковым значениям вольт-амперные характеристики СВАХ) На+-тока' в контроле Спрн отсутствии rAMS вй внутриклеточном растворе) и npji внутриклеточной перфузии нейрона растворы, содержащим цАЫФ, отличаются положением на оси потенШеаов минимумов вольт-амперцсй зависимости, соответствующих максимальной проворимости. Увеличение внутриклеточной концентрации цАлФ до

+ 10"* Л привода? к смецешю ВАл ¡¡и^-тока примерно на 30 мВ

на £9,1 ± 2,5 мВ прип»9) в область отрицательных значений тестирующего потенщала. При этом максимальная амплитуда тока оставалась неизменной. Эффект смещения ВАХ иа+-тока под действием внутриклеточного цАШ> был весьма стойким и характеризовался лиыь частичной обратимостью; при последующей внутриклеточной перфузии нейрона раствором, не содержащим цАМФ, происходило смещение ВАХ на 10 * 15 мВ в область положительных значений тестирующих потенциалов и постепенное ослабление Ла+-тока (падение амплитуды тока вдвое за ¿¿0 - 30 мин внутриклеточной перфузии в отсутствие ■ цАйФ). В тех случаях, когда перфузия нейрона внутриклеточным раствором, содержащим 5-Ю75 ¿1 цАУФ, не прерывалась, падение амплитуды Па^тока также имело место, однако с несоизмеримо меньшей скорость» Споловинное ослабление тока за I - 2 часа). При этом положение ВАХ на оси потенциалов и ее вид не претерпевали существенных изменений.

Особое внимание сьио уделено конкентра^онной зависимости эффекта смещения ВАХ под действием вАМФ. Зависимость величины смещения в сторону гиперполяризадаи ВАХ Иа^тока от внутриклеточной концентрации цАш$ может быть описана в полулогарифшческом масштабе Б -образной кривой, достигающей насыщения при концентрации ЫШ5 бо-. лее М. Зависимость доза-эффект для действия внутркклеточно-

гс цАШ на потенщалочувствительную натриевую проводимость аппроксимируется изотермой Лектора с кажущейся константой диссоциации . молекул цАИй с центрами связывания около т 4-10"^ М.

Полученные результаты свидетельствует о том, что внутриклеточный цАМФ регулирует потенпцадочувстштельность Па^каналов. Увели» чение внутриклеточной концентрации цАай до 5-10"^ Ц приводит к по* вьчаенищ возбудимости соматической мембраны нейрона вследствие снижения порога генерации На-токи в ответ на деполяризации клетки.

Б. Регуляция калиевой проводимости нейрональной мембраны внутриклеточным пАМЗ>.

Цель экспериментов состояла в изучении роли внутриклеточного гуШ в регуляцш К+-проводимости соматической мембраны нейрона. К*-токи были зарегистрированы у 44 клеток. Идентификация этих токов осуществлялась в Ь клетках при помощи ионов цезия, в остальных случаях - при помощи эквимолярной замены ионов К* во внутриклеточной среде на ионы триса и применения Т5А. Медленно инактивирующий-ся выходящий ¡С^-ток был зарегистрирован в 23 клетках. ВАХ этого тг-ка близка к линейкой зависимости. При увеличении дешлярнзации нейрональной мембраны на 10 мВ амплитуда медленно инактивдрующегося ¡й* тока возрастала примерно на 10 нА. Активацш этих токов отчетливо ' проявлялась при тестирующих потенциалах более -20 мВ. Следует под-

-ч

черкнуть, что активашя выходящих токов при низки,; значениях тести-рукцего потенциала часто обнаруживалась в ходе внутриклеточной перфузии нейрона раствором, содержащим«незначительные концентрации хе-лг.тирувцих ионы Са*"1" веществ - оГТА и 1?ДГА С менее I мМ и 3 мМ соот-ветс1_знно). Кинетика медленно инакгивирующихся К^-токов и их зависимость от конгетрак^й Са**+->.елатиру,я|их соединений позволяет предположить, что данные- токи обусловлены актива гаей Са-эависишх каналов. При деполяризации нейронзды-гой мембраны до +10 мВ спад медленно инактлвпрующихея К^-токов описывается двумя экспонентами с постоянными времен;:, составляющими 1,15 с для более быстрой компоненты спада и 2,26 с для более медленной компоненты.

Дня медленно инактивирующихся К*"-токов характерна стабильность амплитуда и гошетакн в ходе внутриклеточной перфузии неизменным по составу раствором на протяжения 1,5-2 часов при активации токов деполяризацией нейрональноЯ мембраны с частотой I имр/шн. Кроме того, даже высокие концентра!^!! Т1 \ (до 40 мМ), добавляемого одновременно как во вне-, так и во внутриклеточный раствор, полностью на блокирует эти токи.

Влияние цАЖ? на медленно инактиви ругающиеся К*"-тот был о изучено у 23 нзидентифи19фованных нейронов. Результаты экспериментов носили однотипный характер, состоящий в отсутствии изменений как в кинетике тока, так и в его потеншалочувствит .ости при перфузии нейронов внутриклеточными раетвораш, содержащими пАЖ' в дкапазоне концентрами Ю-0 т 10М. Существенных изменений этих токов, по сравнении с контролем, при внутриклеточной перфузии нейрона цАМФ-содеркащим раствором не происходило на протяжении I - 1,5 ч.

Помимо иДМЗ> в отдельной серии экспериментов было изучено действие и других циклических нуклеотидов на медленно инактязируащце-ся ;<+-токи. 1Сак и в случае перфузии клеток раствором, содержащим цАЛФ, ни раствор циклического уридинмошфосфата £г£;К>) а диапазоне кошзетрагий 10 * 1С-* М (проверено на б клетках),ш раствор циклического вдтадикыонофосфата СцЦи^) в том же концентрационном диапазоне (проверено на, 5 клетках) на оказывали влияния на медленно инажтивирунщиеся К^-токи. Что касается цГ«©, то у ряда клеток (33%) внутриклеточная перфузия раствором гГУФ вызывала небольшое увеличение амплитуды этих токов при тестирующих потенгиалах более +10 мВ. У остальных из 9 исследованных нейронов медленно икактик:-рующийся К+-юк чувствительности к внутриклеточному цП& (Ю-0 + Ю-1 М) н® проявлял.

Быстро инактивирующийся К^-ток был зарегистрирован у 21 нейрона (около от числа исследованных клеток). Постоянная времени

активации этого тока, составляющая несколько миллисекунд, близка аналогично:»/ параметру медленно инактивирующегося К''-тока. Однако инактивация быстро инактивирующегося К+-тока происходит по ыеныпей мере на порядок быстрее, чем у медленно инактивирулщегося К^-тока. Спад быстро инактивирующегося тска при длительности деполяризующего импульса 30 + 50 мс- может быть апдроксишровак одной экспонентой с постоянной времени, составляющей несколько десятков мс.

По степени чувствительности к ТЭА нейроны, генерирующие быстро ' инактивирующийся К+-ток, бьии разделены на два группы.'К первой группе, составившей 66';ь, были отнесены нейроны, проявляющие высокую чувствительность к ТЭА; К*-ток этих клеток полностью блокировался 'в течение ке более 5 мин 10 + 15 мЫ ТЭА, добавленного одновременно как во вне-, гак и во внутриклеточный растворы. Аппликация ТЭА одновременно по обе стороны нейрональной мембраны была использована с учетом того, что вне- или внутриклеточное применение ТЭА у разных нейронов не одинаково аффективно.

К второй груше были отнесены нейроны, быстро инактавирущий-ся К*-ток которых даже частично не блокировался ТЭА в диапазоне концентраций 10'+ 30 мМ. Блокирующий аффект ТЭА проявлялся у этих клеток при его концентрациях, превышающих 40 мМ.

В обеих грушах нейронов было изучено влияние внутриклеточного цАШ на К^-проводимость. К*"-то к нейронов второй группы не проявлял особой чувствительности к увеличению концентрации цАМй в клетке. Незначительные разнонаправленные изменения К''-проводимости при внутриклеточной перфузии раствором, содержащий 10"^ + 10"% пА1й, ' ».зли место у некоторых нейронов из этой группы, однако изменения во всех случаях не превыдали 10% от исходной амплитуда тока и не затрагивали ни .его кинетики, ни потешдаалочуветеительности.

Ярко выраженный характер носила изменчивость К*-токов под действием цАЖ у нейронов первой гитаны. В 'этих клетках аффект цАШ проявлялся в снижении амплитуды выходящего тока. Было обнаружено, что ингийирование К^-тока под действием цАЬй особенно резко проявлялось в первые минуты внутриклеточной перфузии нейрона цАИФ-содер-жащим раствором.. Спустя 20 - 40 шн иецрерывнсй перфузии нейрона этим раствором происходило постепенное частичное восстановление ¡С-тока, Что может свидетельствовать либо о снижения за счет активации ферментных систем действующей в примеыбранной области концентрации цА1®, либо о десенситиааиии пА13>-чувствительных участков К+-каналоз. Подавление К*-токов нейронов первой группы под действием цАШ оказалось' потяшзюлозависимым; быстро инактивирующийся К1"- -ток частично .восстанавливался при увеличении уровня деполяризации.

Ингибирование ^-каналов этого типа о'кло полностью обратимо; при последующей перфузии нейрона внутриклеточным раствором, не содержал^ цАМФ, К+-токи восстанавливались.

С целью установления концентрационной зависимости эффекта ин-гибировашя быстро инактивирующегося ТЭА-чузствительно'го К^-тока под действием цДМ4 регистрировал. К^-ток, вызванный тестирующим потенциалом 30 мВ, при каждой смене внутриклеточного раствора, проводимой в одной серии экспериментов с последовательным увеличением ¡соицентращн цАНФ от I0"7 до 10"^ М, а в другой о-рии - с последовательным уменьшением концентрации цАМФ с 10"^ до 10"^ М.

Зависимость величины снижения амплитуды этг^о тока от внутриклеточной концентрации цА® б полулогарифмических координатах шло- . ет S-образный характер, достигая насыщения при концентргхши цАМО свыше 10~%i. Зависимость "доза-эффект" для действия внутриклеточного цАМФ на ТЭА-чувствительный К*-ток может. Сыть описана изотермой Ленгмюра с кажущейся константой диссоикапии молекул цАМФ с центрами связывания К^-каналов около 5-10"^ М.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что внутриклеточный цАЫФ окалывает регулирующее влияние на функционирование пс-' тенциалочувствительных К*-каналов, блокируемых ТЭА в концентрации около 10 мМ. Повышение внутриклеточной концентрации цАМ$ свыше приводит к кнгиоированшо К -проводимости у нейроноЕ, в плазматической мембране которых преобладают каналы указанного типа, Кроме того, наряду с нейронами, обладающими регулируемой циклическим АМ5 К^-проводимост^ю, не менее 5С% клеток из окологлоточных нервных'ганглиев виноградной улитки, по-тзидлксму, игюкт К •"-каналы, не чувствительные к пАМФ.

II. Роль цГМФ в регуляции Са-проводимости нейрон,аль-ной мембраны.

Цель экспериментов состояла в изучении влияния внутриклеточного цГМФ на'Са-токи изолированных нейронов. На первом этапе главной задачей являлось установление наиболее цу зствителькой к цГМФ компоненты интдграчьного тока. Дйя ре:зэшя этой задачи регистрировали суммаргай. трансмембранный ток до и в ходе внутриклеточной перфузии нейрона раствором, содержащий «Г?й в концентрarjm 10"® + I0_I М. Из 10 нейронов, исследованных в первой серии экспериментов, 5 клеток проявляли чувствительность к иГ.'Й, проявляемся, во-первых, в увеличении амто:ктути входящих токов и, во-пторь'х, в небольшом усилении медленно инактивлру&щихся выходящих токов. С использовсяиеи двух яызеукозанньх спооосов кд чтфкашк выходящая комьоненча интегрального юш была отождествлена с ¿{+-током.

Входящая компонента суммарного тока не изменялась при уменьшении концентрации ионов натрия в наружном растворе по мере эквимолярной замены этих ион в на ионы триса, проявляла высокую зависимость от водтриклеточного содержания сДШ> и АТФ С в отсутствие этих соединений входящий ток необратимо угнетался) и устранялась блокатором Са-каналов верапамилом. На основами чего входящая компонента суммарного тока, чувствительная к цПд$,'была ьдентифишрована как Са-ток. Последующие эксперименты быта проведены в условиях регистрации чистого Са-тока при исключении возможности генерации калиевых и натриевых токов, а также при снижении до минимума Еероятности возникновзния неспешфического, в том числа протонного, тока.

•Развитие Са-тока во время деполяризующего смещения мембранного потсы^зла включает фазу активащь, сменяемую после достижения шхсвого значения фазой спада, или инактива^ш. ак-'иваг^я Са-тока представляет собой весьма быстрый процесс с постоянной времени порядка нескольких миллисекунд, йшеапка инакчивиСа-тока является двухзкспоненшальным прогесссм, состоящим из быстрой и медленной фаз: Постоянная времен« быстрой фазы инакшващи составляет десятки мз, в то время как аналогичнгй параметр кинетики медленной фазы находится в дкапазоье сотен мс.

сффект цГМФ, оказываемый на Са-ток, был изучен в следующей серии экспериментов на £.0 нейронах. Бьшо обнаружено, что Са-ток активируется циклическим ГЫФ при строгом соблюдении следующих условий: поддержание на фиксированном уровне содержания неорганических катионов (особенно ионов магния) во вне- и внутриклегочных растворах, наличие во внутриклеточном перфузате не менее З-ХСГ^М ЛКФ, I мй АГ& и 3 Ми! йГТА, поддершиме невысокой температуры растворов в измерительной камере (не выше 16°С), непродолжительная (не более 3 ч) инкубадая выделенных нейронов. При соблюдении этих условий активирующий эффект на Са-ток вызывался и негидррлизуемым гуанилатвдклайой монобутириловым производным цПЙ! (¡.¡ВгГ«В).

Действие верапашла на ыРйЖ-чувствительный входящий ток было проверено Как с наружной,- так и с внутренней стороны плазматической мембраны нейрона. Более эффективным дтя блокирования Са-тока оказалось внеклеточное применение верапашла, что хорошо согласуется с литературными данкымл/П.ГЛСосиок, 19Ь6/.

Активирующее действие как цИФ, так и ЫЗгГМФ на Са-ток носило непродолжительный характер. Эффект увеличения амплитуды Са-тока под действием цГЖ развивался за 5 - 10 мин, после чего, несмотря на непрерывную в^триклеточнуи перф.узиа нейрона раствором с той же концентрацией цПда, амплитуда Са-тока падала в течение Ю - 15

мин до стационарного исходного уровня, либо проявляла тенденции снижения до лего.

С иельч выявления концентрационной зависимости аффекта активации Са-тока под действием rfMi регистрировали Са-ток при тести-потенциале -10 мВ при каждой смене внутриклеточного раствора, проводимой у 4 нейронов первой грудпы с последовательным увеличением нояиеитраши гГМ5 от Ю-' до 10"'* М, а у 4 нейронов второй гругшк - с последовательичм уменьшением концентрации цГ'МЗ с

до Ю-^ М. Было установлено, что зависимость величины возра-сг&ния »'дгитуды Са-гска от внутриклеточной кондентрамш цГ>.0 опя-скйаотся кимвой с наоу-'ок teil в области концентраций цГМФ более 5-10"^ М. При таком содержании сГЬЙ в нейроне амплитуд Ci-тока ..,ок..и«1<хльнии жяатп:. ?дзсз древосхолшеЯ исходную, у С номронса, для внутриклеточной перфузии которых были использованы растворы, содержащие вместо SITA другой, но менее специфичный, хелатор ионов - 5ДГА или содержание менее I мМ ионов магния, наблюдалась иная реакция Са-тсков на цГМ5. В этих нейронах добавление во внутриклеточный изрфузат цГНФ приводило к противоположному еффекту: Са-ток в оде перфузии цГМФ-содер-жащим раствором ингибировался, причем у 4 нейронов необратимо. Полное иигибироваше Са-тока наступало sa 5 - J0 мин перфузии нейрона растг-ором, содержащим цП® в диапазоне кот.ентрашй 5-I0~D т 5Л0 М. В указанном концентрационном диапазоне скорость падения аь'ял«1?у4Ы C i-тока не проявляла дозозависикости.

Помимо пГ'МФ было и/3учецо влияние на Са-токи циклического UM?

——Л

Ii 1»лга»чесяоро УйФ, исиоль-овялных в концентрациях 10 f 10 Я. У исследованных с это»! целью 4 нервных клеток было установлено, чш ни 1{Ц1<1Ф, ни цУМФ не оказывают влияния на Са-ток этих нейронов при продолжительности внутриклеточной перфузии содержащим один из нуклеотидов раствором в течение 30 мин. В ходе-перфузии ¡¿кии (»«'гвором чувствительность Са-тока ни к цАМФ, ни к цП® не изменялась.

1аким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что внутрикле'1 ,>чшй цГ«& в присутствии цАМФ, АТФ и ионов магния оказывает активирующее действие на потенциалочувствительные Са-каналы нейрснальной мембраны. Повышение внутриклеточной концентрации i^i® до И и выше приводит к увеличении Са-проводи-мости, достигающей за несколько шнут перфузии цГИЯ^-содсгжчщим раствором максмума, после чего следует падете амплитуды Са-тска вплоть до исходного уровня. Отсутет глв ионов магния, либо их низкая концентрация (менее I мМ) во внутриклеточном растворе гызыва-

ет изменение знака эффекта на противоположный.

III. Действие блокаторов синтеза белка на ионные токи нейрональной мембраны.

А. Действие блокаторов синтеза белка на К^-проводимость.

Цель экспериментов состояла в изучении влияния на ^-проводимость нейрональной мембраны ингибиторов синтеза белка. Используя метод внутриклеточной перфузии, исследуемый блокатор белкового синтеза вводили внутрь нейрона. В ходе перфузии клетки раствором, содержащим ингибитор синтеза белка, регистрировали вызванные деполяризующими смещениями К*-токи и оценивали их вольт-амперную зависимость, кинетику и чувствительность к некоторым фармакологическим веществам. Было изучено действие трех блокаторов белкового синтеза, отличающихся как структурой, так и механизмом их спеглфическо-. го действия.

Действие актинами t?tna Д, высокотоксичного антибиотика полипе-птидноЧ природы, подавляющего синтез белка на стадии транскрипции, было изучено у б клеток. Эффект, оказываемый внутриклеточной перфузией содержащим актиномпгу.н Д в концентрами КГ® + 5-10"® М раствором на К*-токи изолированных нейронов, состоял в угнетении потенциалочувствительной К^-ироводимости. Развитие эффекта заключалось в постепешом ослаблении амплитуды К*-тока по мере перфузии нейрона содержащим указанный антибиотик раствором. У всех изученных клеток результаты экспериментов носили однотипный характер. Падение амплитуды К+-тока под действием внутриклеточной перфузии содержащим акткномиицн Д раствором наблюдалось уже через 10 мин после введения ингибитора в перфузат. Длительность подведения эк-тиномицана Д составляла от 3ö до 60 мин. Скорость падения амплитуды К*-тока под действием актиномидана Д при тестирующем потенциале 30 мВ составила 0,37 * 0,09 нА/мин (п=6). Амплитуда К*-тока падала и спустя 20 - 30 мин после окончания внутриклеточной перфузии содержащим актиномишн Д раствором, достигая в 4 случаях одной трети от исходной амплитуды К^-тока. В двух других случаях за I час перфузии раствором, содержащим актиномицик Д, и последующей получасовой отмывки от блокатора амплитуда К+-тока снизилась до половины исходной. 3 контроле, которым служили нейроны, перфорируемые тем же раствором, но не содержащим блокатора, ни амплитуда, ни кинетические' характеристики К*"-тока не претерпевали изменений в течение двух часов.

Следует отметить, что, судя по кинетике спада, К^-токи изученных нейронов являлись меленно иноктивирующимися. Как было показано выве, эти токи не проявляют чувствительности к цАЛЭ. Не возникало

реакции на пДМФ и после перфузии нейронов содержащим актинзмишн Д раствором. Таким образом, действие актиномишна Д на ^-проводимость нейрональной мембраны характеризуется необратимым ингибирова-нием медленно инактивирующихся К^-токов.

Действие пуромищна на К+-токи оказалось аналогична-! действию актиномишна Д. Ингибитор синтеза белка на стадии трансляции пуро-мишн в концентрации 5-Ю-^ 10"^ М вызывал падение амплитуды медленно инактивирующихся К^-токов. Эффект обнаруживался спустя 10 -15 мин после введения антибиотика в перфузат и характеризовался постепенным снижением амплитуды выводящих токов. Действие пуромицина было проверено на группе из 7 клеток. У всех нейронов из этой группы пуромииин вызывал сходный эффект: снижение амплитуды К*-токов на 40 - оО% за 15-25 шн. Так ?:е как и в случае с актиномигданом д эффект пуромицина был необратим. Однако, ингибкрующиЯ эффект пуро-мищна не развивался в последействии; отмена внутриклеточной перфузии содержащим пуромицин раствором останавливала падет;6 амплитуды К^-тока. В диапазон© концентраций 5-10"^ + Ю-4 И эффект цуромици-на не проявлял выраженной дозозависимости.

Помимо алтиномицина Д и пуромищна было изучено действие на К+-проводамость В-аэагуанина. В условиях внутриклеточной перфузии раствором, содержащим 10 + ю-4 М 6 -азагуанина, на 5 нейронах было установлзно, что этот ингибитор белкового синтеза не оказывает влияния на амплитуду медленно инактивирующихся Ке-токов. При перфузии нейрона раствором, содержащим 8-азагуанин, в течение 3050 мин К^-токк не претерпевали изменений.

С целью проверки специфичности действия рассмотренных блока-торов синтеза белка было изучено влияние внутриклеточного введений ингибитора мембранной На^-К^-АТв-азы оуабаина на К+-токи. На группе из 4 нейронов было показано, что за 15-20 мин внутриклеточной перфузии нейрона раствором, содержащим 10"^ М оуабаина, происходит половинное ослабление медленно инактивирующихся К^-токов. Это инги-бирование оказалось полностью обратимым. Полное восстановление токов происходило за 10-15 мин. В отличие от актакомивдна Д и лурони-щт, внутриклеточная перфузия которыми приводит к необратиноцу ин-гибировадав К+-токов, оуабаин вызывает полностью обратвиое снижение К^-проводиыости.

Несмотря на то, что 6-аэагуанин не оказывал влияния на амплитудУ К^-тока, было изучено влияние этого блонатора белкового синтеза на скорость релаксации канаюв после деполяризующих смещений мембранного потендаала. Время релаксации, представляющее собой время, необходимое для закрывания всех каналов данного типа после их

активации предыдущим стимулом, определяли по интервалу между окончанием первого стимула и началом второго, вызывающего идентичный первому ионный ток. Время релаксации К^-канелоз у нейронов, перфу-зируемых контрольным раствором, составляло 10 мс, тогда как введение во внутриклеточный перфузат 6-азагуанина, не изменяя амплитуды К*-тока, увеличивало время релаксации соответствующих каналов до 15 - 20 мс. Снижение скорости релаксации ^-каналов наблюдалось и при введении во внутриклеточныГ: раствор ТЭА. Перфузия клеток 20 иМ раствором ТЭА, не вызывающим изменения амплитуды медленно инакти-вирующихся К^-токов, приводила к увеличению времени релаксации К*-каналов до 20-30 мс. Введение ТЭА б наружной раствор подобного эффекта не вызывало. Скорость релаксацш К+-каналов была изучена и при введении в состав внутриклеточного раствора актиномвдна Д и цуромицина. Несмотря на падение амплитуды К*-тока под действием этих антибиотиков, время релаксации не изменялось, оставаясь близким к 10 мс.

Таким образом, внутриклеточное введение ингибиторов белкового синтеза снижает функциональную лабильность системы К^-каналов. Ак-тиномиидн Д и пуромищн вызывают необратимое ингибирование К*-про-водимости, в то время как 8-азагуанин, не кзменяя амплитуды К*-то-ков, увеличивает время релаксации К+-каналов нейрональной мембраны.

Б. Действие блокатороз синтеза белка на пэтеншалочувстви-тельные Са-каналы нейрональной мембраны.

Было изучено влияние пуроми^на и 8-азагуанина при их внутриклеточном введении на Са-токи нейронов, а также на чувствительность Са-токов к циклическим нуклеотидам. Введение антибиотиков во внутриклеточный перфуэат осуществляли после того, как регистрируемые Са-токи, вызываемые деполяризацией нейрональной мембраны с частотой I импульс в 2 мин, приобретали стацюнаркый характер, не изменяясь на протяжении 10-15 мин перфузии. Действие пурошщна на Са-токи было изучено у б клеток. Для каждой из них было характерно активирующее влияние этого антибиотика на Са-проводимость. Внутриклеточная перфузия нейрона раствором, содержащем 4- Ю-4 М пуромицина, вызывала увеличение амплитуды Са-тока уже спустя 1-2 мин после введения пуромищна в перфузат. Рост амплитуды Са-тока наблюдался в первые 10-15 мин после введения антибиотика. При последующей перфузии содержащим пуромищн раствором Са-токи не претерпевали изменений на протяжении 40-60 мин. Эффект активами Са-тока пурсмииином обнаруживал зависимость от концентрами последнего. Максимальное увеличение Са-тока (в 1,5 - 2 раза по сравнению с -исходной амплитудой) происходило при концентрации пуромии^на 4,Ю~4+

5-10"^ М. Правда, максимальные значения активированного пуромипи-ном Са-тока удавалось зарегистрировать в течение первых 5-10 мин после введения антибиотигм, вслед за чем, несмотря на перфузию нейрона раствором, содержащим высокую концентрации луродапдна, амплитуда Са-тока падала, оставаясь вое же на 20-30 % выше исходной. .1н-тивнруищий эффект пурошцина был полностью обратим.

Чувствительность Са-тока к циклическим нуклеотидам после перфузии клетки содержащим пурот^н раствором не изменялась. Устранение из внутриклеточного перфузата цА?,К5 приво.дило к падению амплитуды Са-тока, а увеличение внутриклеточной кон центрами цАМФ до 10""* Ы повышало амплитуду Са-тока на 40-60 %• Добавление «о внутрякле-точшй иорфузах щ'йФ после дейегяш пурошщна также сопровождалось возрастанием амплитуды Са-тока.

Противоположное действие оказывало на Са-ток внутриклеточное введение 8-азагуанина. Влияние этого вещества на Са-токи было изучено у 7 нервных плеток. Результаты опытов с внутриклеточной перфузией нейронов раствором, содержащим 5-10~® * 10"^ М 8-азагуанина, носили однотипный характер: под его действием Са-ток быстро ингиби-ровался. Игибирующий эффект 8-азагуанина состоял в снижении амплитуды Са-тока на 50-60 % от исходной величины за 10-15 мин перфузии клетки содержащим антибиотик раствором. Падение амплитуды Са-тока наояидалос- главным образом в области максимальной Са-проводимости, т.е. при потенциалах -20 т -10 мВ. Снижение амплитуды Са-тока происходило и в течение 10-20 гак после завершения перфузии содержащим 8-азагуанин раствором. Стационарный характер в последействии Са-токи приобретали, снизившись на 70-80 % от исходной величина. На этом фоне введение во внутриклеточный перфузат дополнительного количества цАМФ (до 10""^М) нз оказывало никакого влияния на оставшийся Са-ток. Тем не менее спустя 15-20 мин после действия £-азагу-анина сохранялась чувствительность Са-тока к иГМФ. Введение во внутриклеточный перфузат гП<® увеличивало амплитуду Са-тока, Однако исходный уровень Са-проводимости уже не восстанавливался, что свидетельствует о необратимом ингибированик части Са-каналов под действием 8-азагуанина.

Таким образом, пуромицин и 8-азагуашн оказывают противоположное действие на Са-токи. Пурокицин вызывает активацию Са-каналов, что проявляется в увеличении амплитуды Са-тока. Действие цуромици-на носит обратимый характер. 8-азагуанин, напротив, ингибирует Са-каналн нейрональной мзмбранн, что отражается в снижении величины входящего тока. Причем, в отличие от пуромпина действие 8-аэагуа-тиа обратимо лишь частично.

ОБОТДЕШЕ РЕЗУЛЬТАТОВ с Полеченные результаты свидетельстчуют о том, чтг в нейрональ-ной мембране существует целый спектр олектроуправляемых ионних каналов, функционирование которых в значительной степени зависит от циклических нуклеотидов. Проведенные нами опыты на изолированных нейронах показали, что вклад различных специфических ионных токов в суммарный ответ нейрона на деполяризующие воздействия во многом определяется внутриклеточными концентрациями цА!>® и цГМФ. Циклический ЛМФ является вторичным посредником с более широким спектром действия на ионные каналы нейрокальной мембраны, чем представлялось ранее/П.Г.Костюк,££86; Н.Кавшязеп,P.Q.Barrett, 1984 /. Если эффект цАМФ на потенпцалочувствительные каналы до недавнего в; змени главным образом сводился к поддержанию функционирования Са-каналов плазматической мембраны/П.Г.Костюк и др. ,1963; J.E.Chad.R.Eckejrt, 1984/, то обнаруженные нами факты свидетельствуют о том, что цАМФ принимает участие и в регуляции Ка+- и К^-каналов.

J Эксперимент льные данные об активации На-каналов и ингибиро-ьании К*"-каналов под действием цАМФ были получены и другими автора-ми/Ч.И.Коно.ченко, 1980; Р.F.Droke,S.H.Treietman,l9ai; ?.Strumwasser et al.,1932; P.Hockberger, J.Connor, 1983; H.I.Konónenko et al., |98з/.0дьико в их исследованиях отсутствовал ответ на вопрос, в какой степени цАМФ-индувдруемые эффекты были обусловлены изменением функционирования олектроуправляемых ионных каналов. Еще одним общим недостатком этих работ является отсутс: )ие сведений о внутриклеточной концентрации цАМФ, вызывающей указанные аффекты. Обнаруженная нами концентрационная зависимость активирующего действия цАЫФ на На+-ток, проявляющегося в смещении пика Nn+-проводимости в ■ область более отрицательных значений тестирующего потенциала, оказалась близка изотерме Леш-гора, что предполагает взаимодействие одной части I'm адсорбента с одним центром адсорбц^и/О. А. Крьшталь, 1979; M.Hoda et el., 198б/.Поскольку эффект цАЬ® на Ка+-проводи-' ■ мость нейрональней мембраны заключается в снижении порога генерации ца+-тока, то его можно интерпретировать и как повышение потенииало-чувствительности Нп+-мналов. Отсюда следует, что сенсор мембранного потенциала Иа+-каиала каким-то образом ассоциирован с цДМФ-чув-ствительной регуляторной су(5ьединицей каналформирующего белка. Эта связь может быть и опосредованной через изменение внутримекбранного распределения г- рядов вследствие конформашионной перестройки кана-• • ло о бракующей молекулы под влиянием цАМЗ.

Установленная ламп reiepoi енность К*"-проводимоети, заключшоща-яся в наличии в нейреналькой мембране К*-каналов с различными свой-

ствами, согласуется с известными на сегодняшний день сведетят о существовании в плазматической мембране нерзкых клеток нескольких классов Н+-каяалов/О.А.Крышталь,1979; П.Г.Косткя. , О.А.Крыиталь,1Ш1; А.Е.Мартынюк,К87; R.batогге, С.И111ег,1983; Х.Ыаао, Х.ПагЪу, 1587 /.Использованный в настоящей работе подход, связанный с анализом К+-провоцимости по кинетическим и фармакологическим критериям, позволил выделить 3 основных типа потешяалоэависили' К^-каналга. Зависимость от внутриклеточного цАМФ проявляли только каналы быстро и нал титрующегося К+-тока, блокируемое низкими концентрациями Т5А. цАМЗ обратило и дозозависимо ингибировал каналы этого типа.

Исходя из полученных результатов о повышении возбудимости каналов ¡. ингибировании бистро инактавируащихся К*"-каналов следует предположить, -¿то увеличение внугрш'леточно.'; концентрации цАЬ® в нативной клетке должно вызывать снижение порога возбудимости нейро ■ на и возрастание длительности потенциала действия. Именно к такг-ч результатам при водила инъекция цАШ или цАМФ-зависимых протеинкиназ в нейроны в ряде рабо т/Е. А. Ли б ерман и др. ,1975, 1968; Н.И.Кононенко С.Л. Миронов, 1980; С.В.Минина, 196.6; 7.?.Савге11исс1 at е1.,1980! Р. ЪоЪеггв в* а1. ,1931;М.Ю.е1п вt а1., 1932 /.

Обнаруженный наш стимулирующий эффект действия внутриклеточного на Са-токи носил непродолжительный и дозозависимый характер. Однако, .увеличение амплитуда Са-тока б 1,5 - 2 раза при чонцен-грациях позволяет отнести цГ№ к ге менее эффектив-

ным средствам эндогенной регулящи Са-проводимости, а также внутриклеточной концентрации ионов Са^*,по сравнению с цАМ$. Вместе о тем, если цДМ® необходим для поддержания функционирования потенц^алоза-висимых Са-каналов посредством их цАК^-зависимого фосфюрилирэвания, предотвращая тем самым инактивации Са-токов, то хтГ®, по-видимому, играет роль кратковременного активатора Са-проподимости, аффект которого проявляется в стимуляции ранее "молчавших" Са-каналов.

В настоящей работе использовалось сочетанноо введение цАМФ и цП®, поскольку в отсутствие цАМФ С^-т.к быстро инактивировался.Синергизм действия цАй5 н цГ>й был продемонстрирован как на хемочув-ствительных Са-каналах нейрональной мембраны/А.Р.Акопян и др.,1^9/ так и на потенп^алочувствительн*.х каналах/ 1378,1935 /.

каханизм действия иГМФ, вероятно, реализуется черпз цГУФ-зависимую серин-треонянову» протеинкиказу/ь'.Х. Палка вt а1.,1'>зз /.в этом случае иГМФ-зависимое фосфорилированио определенных белковых компонентов Са-каналов вызывает их предпусковую актазаиию, чго дэлыет возможным открывание каналов при изменении тр ксмесбр^нкого эл<ькт зиче-. ексго коля. Проявление ингибирующего эффекта цП© н-ч Г_я-ток в уело-

виях. внутриклеточной перфузии нейрона растворами, содержащими ЭДГА 'или низкие концентрами ионов магния, обусловлено, вероятно, тем, что ионы магния необходимы для функционирования Са-каналов. Сходный эффект, оказываемый ЭДГА и низким содержанием ионов магния, либо отсутствием этих ионов во внутриклеточном перфузате на реактивность Са-тока по отношению к 1$Ч®, объясняется тем, что ЭДГА является хелатором не только ионов кальция, но и ионов магьия.

В настоящей работе было изучено действие ингибиторов синтеза белка на медленно инактивдрующиеся К+-каналы и Са-какалы нейрональ-ной мембраны. Выбор с одной стороны наименее метаболически зависимых каналов диктовался необходимостью снижения вероятности проявления неспедафичаских оффектов антибиотиков. С другой стороны, исследование влияния блокаторов белкового синтеза на Са-проводимость определялось той важной ролью, которую играют ионы во всех внутриклеточных обменных процессах.

Эффекты, вызываемые на ¡С-токах актиномицином Д и пуромишном, несмотря на различные механизмы их специфического действия, были сходны. В том и другом случае наблюдалось иообратимое ингибирование К+-каналов. В пользу специфического действия этих блокаторов свидетельствует и характер зависимости амплитуды К+-тока, как интегрального показателя числа функционирующих 1С*"-каналов, от продолжительности внутриклеточной перфузии нейрона растворами, содержащими антибиотику. Спад К^-тока под влиянием этих веществ может отраж^ь скорость деградации каналообразующих белков в отсутствие синтеза новых- белковых молекул. Косвеным доказательством возможности специфического действия пуромицина и актиномицяна Д на К+-каналы являются эксперименты с оуабаинсм, специфическим ингибитором мембранной И а+/К+-А1'2-азы. В нашх опытах оуабаин, по-видимому, оказывал неспецифическое действие на Непроводимость, что выражалось во время-зависимом снижении величины К*"-тока. Однако, ого эффект был полно, стью обратим в отличие от эффектов, вызываемых блокаторами белкового синтеза. Вероятно, в основе отсутствия эффекта внутриклеточного введения 8-азагуанина на амплитуду К^-токов также лежит механизм действия этого антибиотика, цитотоксическое действие которого может быть непосредственно и не связано с ингибированием синтеза белка. Возможно, места связывания 6-азагуанина имеются на внутренней поверхности плазматической мембраны. Такого рода предположение находит обосновшие в обнаруженном наги ингибируклдем действии Ь-азагуанина на Са-каналы. Увеличение времени релаксации К*-каналов под действием этого антибиотика свидетельствует также в пользу его мембранного связывания.

В основе активирующего эффекта пуромицина на потеншалозависи-мые Са-каналы нейрональной мембраны, очевидно, лежит неспедафичес-кое действие антибиотика. Однако, учитывая возможность специфического действия пуроминина на К^-каналы, не лишенным основания представляется предположение об активации Са-проводимости вследствие появления в цитоплазме молекул пептидил-пуромищна, оказывающих, активирующее влияние на Са-каналы. Альтернативным вариантом увеличения Са-проводимости является ее активация под действием продуктов распада пуромицина, в частности ам:!нонуклеозида (9-(3'-аминорибофурано-зил)-пурин-6-диметилашша) .язлявщегося структурным аналогом аденози-на. Не исключено, что этот аминонуклеозид может актировать uAiS-заЕкс:т;,ыа ферменты /Д.Натане,1959; З.Гейл и др. ,1975/.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что внутриклеточный цА1® участвует в регулявди по-тенциалочувствительности Ка+ -каналов нейрональной мембраны. Увеличение внутриклеточной концентрации цА® приводит к повышению возбудимости соматической мембраны нейрона вследствие снижения порога генерации Иа+ -тока в ответ на деполяризацию клетки. Зависимость доза-эффект для активирующего действия цАЬ© на Па+-ток описывается изотермой Ленгмюра с кажущейся константой диссо1?1а:?ш(К ) 4-10""® М.

2. Установлено, что в плазматической мембране нейронов виноградной улитки существует три основных типа потенщалоэависишх К*-каналов, различающихся по кинетическим параметрам тока и фармакологической чувствительности.

3. Обнаружено, что цАМФ оказывает регулирующее влияние на функционирование потенциалоэависимых быстро инактивирующихся К+-каналов, блокируемых ТЗА в концентраши около 10 м£1. Повышение внутриклеточной концентрации цАМ$ свыше приводит к ингибированию каналов указанного типа. Зависимость доза-эффект для ингибирующего действия нАКФ на эти каналы аппроксимируется изотермой Лекгмара с Кд« ■5-10~®М. Ингибирование ¡^-каналов под действием цШЕ время- и по-тешдаалозавнеимо, а тал.*.; полностью обратимо.

4. Показано, что внутриклеточный цГМФ в присутствии цАА®, АТ$ и ионов lîg2+ оказывает активирующее действие на потеныиалочувстви-тельные Са-каналы нейрональной мембраны СКД»5-10~®М). Отсутствие ионов î>2+ ,либо их низкая концентрация (менее I мМ) во внутриклеточном растворе вызывает изменение на противоположный знака аффекта, оказываемого цГзИВ на Са-ток.

5. Ингибиторы белкового сишеза актииомицш Д и пуромищн вызывают сходный эффект на медленно инактивирующиеся Кт-токи. Действие этих антибиотиков характеризуется необратимым ингибированизм

sz

К+-токов указанного типа.

* 6. Установлено, что внутриклеточное введение 8-азагуанина не изменяет амплитуду медленно инактивирующихся К^-токов. В то же время 8-азагуанин увеличивает время релаксации К^-каналов, снижал лабильность возбудимой мембраны в целом.

7. Ингибитор белкового синтеза пуроминин вызывает активацию Са-каналов, что проявляется в увеличении амплитуды Са-тока. Действие луромицина полностью обратимо и дозозависимо.

6. Показано, что 8-азагуанин ингибирует Са-канаяы нейрональной мембраны. Действие 8-азагуанина частично обратимо. Под его влиянием Са-каналы утрачивают чувствительность к цШ5, тогда как чувствительность к ifíffi сохраняется.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ю.Н.Самко, В.И.Богомолов. Изменения потенииалочувствительности ионных каналов нейронов виноградной улитки при повторяющихся стимулах. - Тез.докл. 7-го Всесоюз. семинара "Развитие общей теории функциональных систем". М,, 1966. С. 9 - 10.

2. В.И.Богомолов, Ю.Н.Самко. Регуляция натриевых и калиевых каналов нейронов внутриклеточным цШФ. - Тез.докл. 10-й Всесоюз.конф.по биохимии нервной системы. Горький, 1967. С. 124.

3. Ю.Н.Самко, В.И.Богомолов. Повышение возбудимости нейронов виноградной улитки при повторяющихся стимулах. - Теэ.докл. 15-го съезда Всесоюз.физиол. об-ва им.И.П.Павлова. Л.:Наука. С. 213.

4. Ю.Н.Самко, В.И.Богомолов. Ионные каналы мембраны в механизмах интегративной деятельности нейрона. - Физиол.журн. СССР им.И.М.Сеченова. 1968. Т. 74, » I. С. 25 - ЗЬ

5. Ю.Н.Самко, В.И.Богомолов. Кальциевые каналы нейронов и механизм действия низкоинтенсивного лазерного излучения 337 нм. - Биофизика. 1968. Т. 33, вып. 3. С. 525 - 527.

6. Ю.Н.Самко, В.И.Богомолов, Н.В.Жуковский, В.В.Савранский. Изуче-

, ние активирующего действия деполяризации на внутриядерные и мембранные процессы нейрона методом лазерной микроскопии. - Тез.докл.международ. симпозиума "Интегративная деятельность нейрона: молекулярные основы". М., 1968. С. 107 - IC6.

7. В.И.Богомолов, Ю.Н.Самко. Регуляция калиевых каналов нейрональной мембраны циклическим АМР. - Биологические мембраны. 1969. Т. б, № 4.С.390 - 394-. *

8. В.И.Богомолов, Ю.Н.Самко. Циклические нуклеотиды в регуляции мембранных ионных каналов изолированных нейронов моллюска. - Теэ.докл. международ.симпозиума "Транспорт ионов и механизмы его регуляции". Тбилиси, 1969. С. 15 - 16. ;