Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Изменение состояния нейрональных популяций в постреанимационном периоде после остановки сердца у крыс

РГВ од 11 да

На правах рукописи УДК: 616.036.882-08-092.9

АВРУЩЕНКО Мария Шапсаевна

ИЗМЕНЕНИЕ СОСТОЯНИЯ НЕЙРОНАЛЬНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ В ПОСТРЕАНИМАЦИОННОМ ПЕРИОДЕ ПОСЛЕ ОСТАНОВКИ СЕРДЦА У КРЫС

14.00.23 — гистология, цитология, эмбриология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва — 1996

Работа выполнена в Научно-исследовательском Институте общей реаниматологии Российской Академии медицинских наук

Научный консультант:

академик РАМН В. Н. Ярыгин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Л. М. Герштейн, доктор медицинских наук, профессор В. П. Туманов, доктор медицинских наук В. В. Глинкина

Ведущее учреждение: НИИ морфологии человека РАМН

Защита диссертации состоится « . года

в ...часов на заседании диссертационного совета Д084.14.04 'при Российском государственном медицинском университете (117869, Москва, ул. Островитянова, д. 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РГМУ.

О ; У 1 Автореферат разослан «о » .

года.

Ученый секретарь

диссертационного Совета Д 084.14.04

■профессор А. Н. Тихомиров

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Полноценное восстановление функций центральной нервной системы является основной задачей реаниматологии, решение которой возможно лишь на основе глубокого изучения механизмов патологических и компенсаторных процессов, развивающихся в организме во время терминального состояния и в постреанимационном периоде ( В.А. Неговский, 1994).

Создание концепции постреанимационной болезни (В.А. Неговский с соавт., 1987) ознаменовало собой начало нового этапа в исследовании механизмов постреанимационных энцефалопатии. Стало очевидным, что клиническая смерть существенно отличается от изолированной ишемии мозга и прежде всего наличием патогенных экстрацеребральных факторов (A.M. Гурвич, 1974; A.B. Волков, 1985). Это вызывает необходимость изучения механизмов развития постреанимационной патологии мозга на моделях тотальной ишемии организма.

Высокая социальная значимость и актуальность проблемы постреанимационной патологии мозга обусловлены клиническими данными о развитии у 70% больных, перенесших терминальное состояние, неврологических и психических расстройств, приводящих к инвалидизации (Г.А. Акимов, 1991; Г.В. Алексеева, 1994). Широкое внедрение методов реанимации в медицинскую практику с особой остротой поставило вопрос о природе постреанимационных неврологических осложнений, возможностях их профилактики и терапии. В связи с этим большое значение приобретает изучение взаимосвязи между постреаннмационны-ми нарушениями функции мозга и изменениями его структуры. Особый интерес при этом представляет анализ природы скрытых и отсроченных нарушений функции мозга, формирующихся на фоне внешнего восстановления неврологического статуса ( Г.В. Алексеева, 1991; A.M. Гурвич с соавт., 1994). Отсутствие в литературе работ, посвященных этой проблеме, требует разработки новых методологических подходов, позволяющих длительно проследить и количественно оценить морфологические изменения, развивающиеся в мозге оживленных животных при полном внешнем восстановлении. Морфологические исследования ЦНС оживленных животных (Н.П. Романова, 1977; Г.Н. Миротвор-ская, 1980; В.В. Семченко, 1984; Н.К. Пермяков с соавт., 1986; Г.А.Акимов, 1991; Mossakowski, Zelman, 1992; Radovsky et al., 1996) позволили выявить ряд механизмов постреанимационных энцефалопатии. Однако, важнейшая проблема морфологической и функциональной гетерогенности нервной ткани и определения роли ее различных элементов в развитии постреанимационного процесса не получила должного разрешения. Исследования глии в постреанимационном периоде носят фрагментарный характер, а изменения состояния мозга на уровне ней-рональных популяций остаются не изученными. Диморфизм нейронов - наличие светлых и темных клеток в одной популяции - связывают с их различным функциональным состоянием (В.П. Туманов, 1983; Meitner,

1983; Д.С. Саркисов, 1994), однако мнения исследователей о природе этого феномена противоречивы. Выяснение особенностей реакции разных типов нейронов, анализ нейро-глиальных взаимоотношений, определение роли глиальных элементов нервной ткани в развитии постреанимационного процесса необходимы не только для изучения природы постгииоксических энцефалопатии, но и для выявления механизмов функционирования нейрональных популяций, что имеет общебиологическое значение ( В.Н. Ярыгин с соавт., 1990).

Согласно современным представлениям, среди механизмов постише-мичсского повреждения нейронов наряду с нарушениями энергетического метаболизма, воздействием свободных радикалов и/или перекис-ного окисления липидов, нарушениями ионного гомеостаза и обмена фосфолипидов, действием возбуждающих аминокислот (Benveniste et al.. 1984; Ueki et al., 1988; Kogure et al„ 1988; Siesjo, 1993; Watson, 1993), одними из наиболее существенных считаются нарушения белкового метаболизма (В.Л. Кожура, 1981; С.И. Пылова, 1982; Л.В. Молчанова, 1988; Hossmann, 1993). Однако, какова взаимосвязь постишемического повреждения нейронов с состоянием их белоксинтезирующей системы неизвестно (Нага et al., 1993). Совершенно не изучены постреанимационные изменения процесса синтеза белка на уровне транскрипции, не получила должного освещения проблема взаимосвязи интенсивности синтеза белка в мозге с неврологическим восстановлением животных; неизвестно, какие элементы нервной ткани вовлечены в процесс постреанимационных изменений уровня синтеза белка.

Актуальность изучения изменений состояния мозга на уровне нейрональных популяций для анализа природы постреанимационной патологии мозга у животных без внешних неврологических нарушений обусловила основные направления работы, касающиеся выявления динамики и закономерностей перестроек нейрональных популяций после остановки сердца разной длительности; оценки роли глии в постреанимационном процессе; определения взаимосвязи между уровнем синтеза белка в мозге и изменениями его структуры.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: изучение закономерностей и механизмов перестроек нейрональных популяций у оживленных животных с отсутствием внешних неврологических расстройств; выяснение патогенетической значимости изменений состояния мозга на уровне нейрональных популяций в развитии постреанимационного процесса.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Определить динамику изменений плотности и состава гетерогенных нейрональных популяций в течение 8 месяцев постреанимационного периода после 10 - и 15 - минутной остановки сердца.

2. Исследовать зависимость между состоянием нейрональных популяции и темпами неврологического восстановления оживленных животных.

3. Оценить чувствительность к ишемии исследуемых неГфональных популяций и их различных элементов.

4. Исследовать нейро-глиальные взаимоотношения и состояние астро-цитарной глии в постреанимационном периоде после остановки сердца разной длительности.

5. Изучить изменения транскрипционной активности хроматина ядер нейронов различных нейрональных популяций в динамике постреанимационного периода.

6. Определить интенсивность синтеза белка в ткани, нейронах и глие разных отделов мозга и исследовать взаимосвязь между уровнем синтеза белка в мозге, состоянием гетерогенных нейрональных популяций и неврологическим восстановлением оживленных животных.

7. Оценить эффективность применения некоторых нейропептндов и гормонов (окситоцин, меланостатин, эстрадиол с окситоцином, сома-тостатин) для улучшения состояния нейрональных популяций с целью коррекции постишемических нарушений неврологического статуса.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Впервые проведено комплексное исследование мозга на уровне нейрональных популяций в динамике постреанимационного процесса у животных с разными темпами неврологического восстановления. Обоснована существенная роль изменения состояния гетерогенных нейрональных популяций в патогенезе постреанимационной патологии мозга. Разработан новый методологический подход, позволяющий с использованием совокупности мор-фометрических, авторадиографических, иммуногистохимических методов оценить постреанимационные изменения не только в отдельных нервных клетках разных типов (светлые, темные, морфологически измененные нейроны; сателлитная и свободная глия), но и на популяци-онном уровне.

Впервые выявлены существенные изменения мозга на уровне нейрональных популяций при отсутствии у оживленных животных видимых расстройств неврологического статуса после остановки сердца разной длительности, дана количественная оценка обнаруженных сдвигов. Установлено, что перестройки нейрональных популяций формируются и развиваются в ходе постреанимационного процесса. Показано длительное течение постреанимационных изменений мозга и возможность улучшения состояния популяций в отдаленном периоде. Выявлены этапы и динамика перестроек нейрональных популяций после остановки сердца разной длительности. Установлено, что выраженность постреанимационных изменений в мозге коррелирует с длительностью ишемии и темпами неврологического восстановления животных.

Показана существенная роль макроглии в развитии постреанимационных изменений мозга. Наличие сателлитной глии способствует поддержанию гомеостаза нейронов, препятствуя их повреждению и/или выпадению. Обнаружены резкие сдвиги состояния астроцитарной глии разных отделов мозга.

Впервые выявлены изменения матричной активности ядрышкового и внеядрышкового хроматина различных типов нейронов, что свидетельствует о существенных постреанимационных изменениях процесса синтеза белка не только на уровне трансляции, но и на уровне транскрипции. Установлена взаимосвязь уровня синтеза белка в ткани мозга со степенью и темпами восстановления неврологического статуса оживленных животных; показана необходимость подъема уровня синтеза белка для полноценного неврологического восстановления. Выявлено, что выпадение и дистрофические изменения нейронов развиваются на фоне резкого снижения интенсивности синтеза белка. Обнаружена взаимосвязь селективной ранимости нейронов с реактивностью их белоксинтезирующей системы.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

Проведенные исследования раскрывают ранее не изученные механизмы функционирования мозга на уровне нейрональных популяций. Полученные результаты имеют значение не только для развития фундаментальных исследований природы постреанимационной патологии мозга, но и для разработки новых, патогенетически обусловленных принципов лечения и реабилитации больных, перенесших терминальное состояние.

Установленные в работе закономерности развития изменений нейрональных популяций свидетельствуют о повышенной уязвимости мозга после реанимации даже при отсутствии видимых нарушений неврологического статуса, что обусловливает необходимость проведения профилактики и реабилитации с учетом обнаруженных механизмов и этапов развития постреанимационного процесса. Выявление факторов, способствующих поддержанию метаболизма нейрональных популяций (наличие сателлитных глиальных клеток и повышение их числа; активация астроцитов; подъем уровня синтеза белка в мозге), дает основу для разработки методов патогенетически обоснованной терапии. Возможность влиять на состояние нейро-глиальных популяций, исход реанимации, темпы неврологического восстановления оживленных животных путем применения регуляторных пептидов и гормонов открывает перспективы для целенаправленного воздействия на состояние мозга в пострсанимациоипом периоде.

Разработанный метод морфометрического анализа нейро-глиальных популяции может быть использован в биологии и экспериментальной медицине для оценки состояния мозга при различных патологических состояниях и экспериментальных воздействиях. Полученные данные используются при чтении лекций по соответствующим разделам реаниматологии, на школах-семинарах "Актуальные проблемы современной анестезиологии и реаниматологии".

В результате проведенных исследований сформулировано новое научное направление, имеющее существенное значение для развития биологии, реаниматологии, теоретической и практической медицины: из-

учение роли изменений состояния мозга на уровне нейрональных популяций в развитии постреанимационного процесса, в формировании отсроченных постгипоксических энцефалопатии.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. У животных с отсутствием внешних неврологических нарушений в постреанимационном периоде возникают и длительно развиваются изменения плотности распределения и состава нейрональных популяций, выраженность которых зависит от продолжительности ишемии и коррелирует с темпами неврологического восстановления.

2. Исследуемые нейрональные популяции и разные типы нейронов характеризуются неодинаковой чувствительностью к ишемии.

3. Глиальные элементы нервной ткани вносят существенный вклад в развитие постреанимационного процесса, способствуют поддержанию гомеостаза нейрональных популяций.

4. В постреанимационном периоде на фоне внешнего восстановления животных развиваются изменения транскрипционной активности хроматина нейронов, имеющие фазный характер.

5. Постреанимационные изменения структуры и функции мозга взаимосвязаны с компенсаторно-адаптивными свойствами нервных клеток, которые определяются состоянием их белоксинтезирующей системы.

6. Применение окситоцина, меланостатина, окситоцина с эстрадиолом, соматостатина улучшает состояние нейрональных популяций в постреанимационном периоде, что коррелирует с ускорением темпов неврологического восстановления оживленных животных. АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации были доложены на: Международном симпозиуме "Итоги и перспективы развития современной реаниматологии" (Москва, 1986); Всесоюзной конференции "Методологические, теоретические и методические аспекты современной нейроморфолопш (Москва, 1987); Научном совете по молекуляр-но-биологическим исследованиям при Президиуме АН СССР (Иркутск, 1987); I Всесоюзной конференции "Фармакологическая коррекция гипоксических состояний" (Москва, 1988); Международном симпозиуме "Центральная нервная система и постреанимационная патология организма (Москва, 1989); IV Всесоюзном съезде патофизиологов (Кишинев, 1989); X Всесоюзном симпозиуме "Структура и функция клеточного ядра" (Гродно, 1990); Республиканской конференции морфологов (Тюмень, 1990); Международном симпозиуме "Проблемы реанимации и медицины катастроф" (Тбилиси, 1990); Международном симпозиуме по патофизиологии (Москва, 1991); II Всесоюзной конференции "Фармакологическая коррекция гипоксических состояний" (Гродно, 1991); Республиканской конференции морфологов (Омск, 1993); конференции "Актуальные проблемы патофизиологии экстремальных состояний" (Санкт-Петербург, 1993); Пленуме "Экстремальные и терминальные состояния" (Кемерово, 1994); Международном симпозиуме "Актуальные проблемы и перспективы разви-

тия современной реаниматологии" (Москва, 1994), I Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 1996).

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы "Материал и методы исследования", 5 глав результатов исследований, 4 глав обсуждения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 311 страницах, содержит 48 таблиц и 67 рисунков (12 монтажей микрофотографий, 55 графиков). Список литературы включает 609 источников, из которых 177 опубликовано в отечественных и 432 - в зарубежных изданиях. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. В работе использовано 269 белых половозрелых крыс-самцов массой 160-180 г (Табл. I). Остановку кровообращения на 10 или 15 мин вызывали у животных под эфирным наркозом путем внутриторакального пережатия сосудистого пучка сердца (В.Г. Корпачев с соавт., 1982). Оживление осуществляли непрямым массажем сердца в сочетании с искусственной вентиляцией легких воздухом. Неврологический статус крыс оценивали по шкале неврологического дефицита (С.П. Лысенков с соавт., 1982). В зависимости от темпов восстановления неврологического статуса животных разделяли на группы: с быстрым восстановлением (на 1-2-с сут после 10- или 4-7-е сут после 15-минутной остановки сердца) и с задержанным восстановлением (на 3-4-е сут после 10- или на 8-14-е сут - после 15-минутной остановки сердца). Контролем к каждой подопытной группе служили интактные крысы того же и возраста.

Морфометрический анализ плотности распределения и состава ней-рональных популяций пирамидных клеток V слоя сенсомоторной коры, клеток Пуркинье латеральной и медиальной областей мозжечка проводили на разных сроках постреанимационного периода у крыс с отсутствием внешних неврологических расстройств в сравнении с ин-тактными животными соответствующего возраста (Табл.1). Клетки подсчитывали под микроскопом при увеличении X 400 на срезах, окрашенных крезиловым фиолетовым по Нисслю или (для идентификации глиальных элементов) кислым фуксином (Л.М. Герштейн, Т.В.Балль, 1969). Определяли плотность распределения клеток на единицу площади коры или на 1 мм длины слоя клеток Пуркинье мозжечка. При это?.! идентифицировали нормальные - светлые и темные - и морфологически измененные клетки. Под "темными" понимали морфологически неизмененные нейроны с более темной окраской ядра и цитоплазмы. В группу "морфологически измененных" включали нейроны с различными видами патологии, согласно классификации изменений нервных клеток (А.Поликар, М. Бесси, 1970; Н.Е. Ярыгин, В.Н. Ярыгин, 1973). Отдельно учитывали свободные нейроны и нейроны с сателлитной глией.

Оценку транскрипционной активности хроматина проводили с помощью авторадиографического метода выявления активности эндогенных РНК-полимераз (Moore, 1978) в динамике постреанимационно-

го периода по числу зерен восстановленного серебра над ядрышком и внеядрышковой зоной ядра в светлых и темных нейронах III, IV, V слоев коры и клетках Пуркинье латеральной области мозжечка (Табл. 1). У каждого животного в исследуемых нейрональных популяциях подсчитывали интенсивность мечения 60 - 80 клеток.

Определение интенсивности синтеза белка в ткани мозга проводили на 4-е сут постреанимационного периода (Табл. 1) с использованием 3Н- лейцина (уд. активность 1370 ТБк/моль) in vivo (в/б по 7 мкКи/г) и in vitro (25 мкКи/мл среды). Для анализа включения меченой аминокислоты в белки пробы (по 2 из каждой области мозга) обрабатывали как описано ранее (В.Я. Бродский, Н.В. Нечаева, 1988). Радиоактивность кислоторастворимой и белковой фракций определяли на сцин-цилляционном счетчике SL-30 (Япония). Расчет интенсивности синтеза белка проводили в имп./мин/ мг, учитывая общий пул предшественника в ткани и проницаемость (Н.В. Нечаева,В.Я. Бродский, 1977). Авторадиографическое исследование синтеза белка в нейронах и глие разных отделов мозга (Табл.1) проводили с использованием 3Н- лейцина (в/б по 7 мк/г; уд. активность 1370 Тбк/моль). Интенсивность мечения оценивали под микроскопом с помощью квадратной сетки при увеличении ок. х 12,5; об. х 100 и выражали в условных единицах. Для этого подсчитывали число зерен восстановленного серебра в трех квадратах для каждой клетки и определяли среднее значение (концентрацию метки) в одном квадрате. Отдельно учитывали светлые и темные, а также свободные и имеющие сателлитную глию нейроны. В каждой нейрональной популяции подсчитывали интенсивность мечения 50-60 клеток.

Иммуноцитохимический анализ состояния астроцитарной глни разных областей мозга (Табл. 1) проводили непрямым пероксидазно-антиперо-пероксидазным (ПАП) методом (Sternberger et al., 1970) с использованием для выявления кислого глиального фибриллярного белка (КГФБ) поликлональных антител и ПАП-комплекса (Dakopatts). Иммунная реакция проявлялась после инкубации в 0,05% растворе 3,3-диа-минобензидина тетрахлорида (Sigma, USA) с добавлением 0,1 %-ной Н2О2,, после чего срезы окрашивались гематоксилином и заключались в Депекс (Serva, FRG). Иммуноцитохимическая реакция контролировалась инкубацией срезов со всеми реагентами кроме первичных антител. Применение нейропептидов и гормонов. Для исследования воздействия регуляторных пептидов и гормонов на состояние нейрональных популяций и неврологическое восстановление, животным после успешной сердечно-легочной реанимации подкожно вводили окситоцин (0,05 мг/кг), или меланостатин (меланоцитстимулирующийгормон-ин-гибирующий фактор - МИФ) (0,015 мг/кг), или окситоцин (10 Ед./кг) в сочетании с эстрадиолом (2 мг/кг), или соматостатин (0,5 мг/кг). Оценивали выживаемость, степень и темпы неврологического восстановления животных, а также с помощью морфометрического анализа

Таблица 1.

Сводная таблица исследованного материала.

Метол Длительность остановки сердца Срок после оживления Контроль (интактные животные) Объект исследования

Морфо-мстрический анализ 10 мин 4, 7, 14 дней, 1.2,8 мес. (по 7-9 крыс) п=48 По 5-6 крыс на каждый срок п=32 Кора V слой, КПМ1, КПМЗ

15 мин 4 дня п=б п=8 Кора V слой

15 мин 14 дн . 1,5 мсс., 8 мес. (по 7-8 крыс) п=23 По 5-7 крыс на каждый срок п= 19 Кора V слой, К11М1. КПМЗ

15 мин лечение (окситощш, или МИФ. или ок-СИТОШШ+ эстра-диол] 14 дн , 1,5 мсс. (по 5 крыс) п=30 п= 10 Кора Услой, КПМ1, КПМЗ

15 мин лечение соматостатином 8 мсс. п=6 п=6 КПМ1, КПМЗ

Иммуноцито-химичсскос исследование глин 10 мин , 15 мин 4, 7 дн. (по 4-6 крыс) п=20 п=6 Астроциты сенсомоторной коры, гиппокампа и латеральной области мозжечка

Оценка транскрипционной активности хроматина 10 М1 ш 1, 24 ч ,4, 7 дн (по 4-5 крыс) п= 18 п—6 Нейроны Ш, IV, V слоев сенсомоторной коры, клетки Пуркинье латеральной области мозжечка

Определение интенсивности синтеза белка в ткани мозга 10 мин 4 дн п= 15 п=6 Ткань сенсомоторной коры; гиппокампа; медиальной, интер-медиалыюй и латеральной областей мозжечка

Лпторадиогра-фичсскос исслс- 10 мин 4 дн п=5 п=5 Кора V слой, КПМЗ, пирамиды CAI и СА4 гиппокампа

сппности синтеза белка

Обозначения: КПМ1 - клетки Пуркимьс медиальной области мозжечка КПМЗ - клетки Пуркинье латеральной области мозжечка Кора V слой - нейроны V слоя сенсомоторной коры

исследовали состояние нейрональных популяций на разных сроках постреанимационного периода после 15-минутной остановки сердца (Табл. 1).

Статистическая обработка полученных данных проведена с помощью непараметрических критериев X Колмогорова-Смирнова и <р Фишера, а также критерия I Стыодента (У.В. Гублер, 1978).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ИЗМЕНЕНИЙ ПЛОТНОСТИ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ И СОСТАВА НЕЙРОНАЛЬНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ В ПОСТРЕАНИМАЦИОННОМ ПЕРИОДЕ ПОСЛЕ ОСТАНОВКИ СЕРДЦА У КРЫС С ВНЕШНИМ ВОССТАНОВЛЕНИЕМ НЕВРОЛОГИЧЕСКОГО СТАТУСА.

Морфометрический анализ позволил выявить динамику и определить этапы перестроек нейрональных популяций в постреанимационном периоде после 10- и 15-минутной остановки сердца, обнаружить взаимосвязь плотности распределения и состава популяций с темпами восстановления неврологического статуса оживленных животных, установить общие закономерности и особенности процесса перестроек популяций после остановки сердца разной длительности, выявить неодинаковую реактивность различных элементов гетерогенных нейрональных популяций и отличия в чувствительности к ишемии разных популяций даже в пределах одного отдела мозга.

Установлено, что у крыс, перенесших остановку сердца, даже при отсутствии внешних неврологических расстройств происходят существенные нарушения плотности и состава нейрональных популяций. Эти сдвиги имеют четкую динамику и неодинаковы в разных популяциях. На рисунках 1-3 отражены достоверные изменения общей плотности популяций и числа нейронов разного типа в каждой экспериментальной группе в сравнении с соответствующим контролем, что в совокупности позволяет оценить выраженность сдвигов в динамике постреанимационного процесса.

В популяции клеток Пуркинье медиальной области мозжечка крыс, перенесших 10-минутную остановку сердца (Рис. 1А), в течение 8 мес. после оживления общая плотность нейронов не изменяется, то есть выпадения клеток не происходит. Состав популяции нарушается только к 14-м сут постреанимационного периода, когда число светлых нейронов снижается, а морфологически измененных клеток - возрастает. Следовательно, между 7- и 14-ми сут развиваются дистрофические изменения светлых клеток (уменьшение долей в популяции светлых свободных и светлых с сателлитной глией нейронов - на 10,6 и 17,2%, соответственно; при увеличении долей свободных и имеющих глию морфологически измененных нейронов - на 34,3 и 38,9%, соответственно; Р<0,05). На 30-е сут постреанимационного периода дистрофически измененными были только свободные светлые клетки (снижение их числа в сравнении с контролем на 21,8% при увеличении числа сво-

А

Общая плотность популяции

Светлые клетки о о о о О

Темные клетки о

A-A-fr-*""""0- -й—____

Измененные клетки 6— -&

К 4 7 14 Общая ----- - - N - ■ 30 СО Б 240 Время после оживления (сут)

плотность " " * популяции

Светлые клетки 0 О О О

А-h- Измененные клетки

К 14 45 240 Время после оживления (сут)

Рис. 1 Плотность и состав популяции клеток Пуркинье медиальной области мозжечка в постреанимационном периоде после 10-минутной (А) и 15-минутной (Б) остановки сердца (в %% от контроля)

бодных морфологически измененных нейронов на 25,0% , Р<0,05). Спустя 2 мес. после реанимации состав популяции нормализуется, и в дальнейшем новых изменений не возникает в течение 8 мес. постреа-ннмационного периода.

После 15-минутной остановки сердца в популяции клеток Пуркинье медиальной области мозжечка (Рис. 1Б) также не происходит выпадения нейронов в течение 8 мес. после оживления. Нарушения состава популяции развиваются между 14-45-ми сут постреанимационного периода и выражаются в переходе части светлых нейронов в морфологически измененное состояние (снижение числа светлых нейронов с са-теллитной глией на 17,5%, при увеличение числа морфологически измененных нейронов с глией на 54,5% ; Р<0,025). Спустя 8 мес. после оживления живо 1 пых состав популяции нормализуется.

В популяции клеток Пуркинье латеральной области мозжечка после 10-минутной остановки сердца (Рис. 2 А) у крыс с быстрым восстановлением неврологического статуса плотность популяции и ее состав не

меняются. При задержанном восстановлении выявлен процесс выпадения нейронов, который развивается между 4-7-ми сут после оживления и в дальнейшем не прогрессирует. Выпадению подвергаются только светлые (свободные) и морфологически измененные клетки. Между 714-ми сут патологические нарушения углубляются: в процесс вовлекаются уже не только светлые, но и темные клетки, среди которых дистрофическим изменениям подвергаются свободные нейроны (снижение доли в популяции темных клеток за счет уменьшения доли

общая плотность популяции

Светлые клетки Темные клетки Измененные клетки

V .

з о о - -о О О о -ы-.- . ' с --

-----

60 240

Время после оживления (сут)

Общая плотность популяции

Светлые клетки1 Темные клетки

о- _

О :„-:

* ■ ■ т - - - -

1

Время после оживления (сут)

Рис. 2 Плотность и состав популяции клеток Пуркинье латеральной области мозжечка в постреанимационном периоде после 10-минутной (А) и 15-минутной (Б) остановки сердца у крыс (в %% от контроля)

Пунктирная линия - при быстрым неврологическом восстановлении; Сплошная линия -при задержанном

свободных темных нейронов на 20,1%, Р<0.05; при повышении доли морфологически измененных клеток на 17,6%, Р<0,001 за счет увеличения доли морфологически измененных нейронов с сателлитной глией на 20,3%, Р<0,005). В результате, через 14 дн после оживления у подопытных крыс в сравнении-с интактными число светлых и темных клеток снижено (Рис. 2А). При этом в популяции уменьшается число свободных нейронов (на 25,4%, Р<0,005), а число нейронов с сателлит-

мой глией соответствует контролю. Спустя 2 мес. после оживления выявленные нарушения сохраняются. Между 2 и 8 мес. постреанима-циошюго периода состояние популяции улучшается, о чем свидетельствует уменьшение числа морфологически измененных нейронов и подъем до контрольного уровня числа светлых клеток. Следовательно, можно полагать, что на этом этапе происходит обратный переход части морфологически измененных клеток в нормальные (светлые) нейроны. При этом обнаруживаются сдвиги нейро-глиальных соотношений, свидетельствующие об уменьшении числа сателлитных глиаль-пых клеток и трансформации светлых и темных клеток с глией в свободные нейроны (снижение числа нейронов с сателлитной глией на 12,9 %, Р< 0,025 ; за счет уменьшения числа светлых и темных нейронов с сателлитной глией на 11,6 и 18,8%, соответственно; Р< 0,05).

После 15-минутпой остановки сердца в популяции клеток Пуркинье латеральной области мозжечка (Рис. 2 Б) у крыс с быстрым восстановлением выпадения нейронов не происходит в течение 8 мес. наблюдения. Через 14 дн после оживления обнаруживаются нарушения состава популяции, которые сохраняются к 45-м сут и выражаются в переходе светлых п темных (но только свободных) нейронов в морфологически измененное состояние (уменьшение числа свободных светлых и свободных темных нейронов на 30,4 и 33,3% ; при увеличении числа свободных морфологически измененных клеток на 20,0% , Р<0,05). Спустя 8 мес. после оживления состав популяции нормализуется. При задержанном восстановлении неврологического статуса после остановки сердца той же длительности происходит процесс выпадения нейронов (снижение общей плотности популяции), который обнаруживается через 14 дн после оживления и далее не прогрессирует. Выпадению подвергаются и светлые, и темные, но только свободные нейроны (уменьшение числа свободных светлых и свободных темных нейронов па 27,8 и 34,8% , соответственно, Р<0,05).

В V слое сенсомоторной коры после 10-минутной остановки сердца (Рис. ЗА) у крыс с разными темпами восстановления неврологического статуса плотность и состав популяции не изменяются до 14-х сут по-стрсанимационного периода. На 14-е сут у животных с задержанным восстановлением выявлены сдвиги, свидетельствующие об увеличении числа сателлитных глиальных клеток около светлых нейронов (снижение числа свободных нейронов на 12,4% при увеличении числа нейронов с глией на 25.3% ; Р<0,025, за счет уменьшения числа светлых свободных нейронов и увеличения светлых нейронов с глией - на 16,5 и 34,0%, соответственно; Р<0,025). Между 14-30-ми сут развиваются нарушения состава популяции, выражающиеся б переходе части светлых нейронов в морфологически измененное состояние (снижение числа светлых клеток при увеличении числа морфологически измененных вследствие снижения числа свободных светлых и увеличения числа свободных морфологически измененных нейронов на 12,2 и 104,0%,

соответственно, Р<0,01). Спустя 2 мес. после оживления у животных с задержанным восстановлением обнаруживается выпадение нейронов (снижение общей плотности популяции), которому подвергаются только светлые свободные клетки (снижение числа светлых нейронов за счет уменьшения числа свободных светлых клеток на 16,1%, Р<0,05). При этом число свободных нейронов в популяции уменьшается на 14,2% (Р< 0,025), а нейронов с глией - сохраняется на контрольном уровне. В период 2-8 мес. после оживления дальнейшего выпадения клеток не происходит, а состояние популяции улучшается, о чем свидетельствует переход части морфологически измененных нейронов в нормальные светлые клетки.

После 15-минутной остановки сердца в V слое коры (Рис. 3 Б) на 4-е сут после оживления выпадения нейронов не происходит даже при наличии еще у животных неврологических расстройств. В это время развиваются нарушения состава популяции, заключающиеся в переходе

светлых клеток в морфологически измененное состояние (снижение числа светлых нейронов за счет уменьшения на 18,2% числа свободных светлых клеток, Р<0,001; при увеличении числа морфологически измененных нейронов за счет повышения числа свободных и имеющих глию клеток па 101,6 и 189,7%, соответственно, Р<0.005). При этом происходит изменение нейро-глиальных взаимоотношении, свидетельствующее об увеличении числа сателлитных глиальных клеток (снижение доли в популяции свободных нейронов на 15,0% при увеличении доли нейронов с сатсллитпон глией на 38,8%; Р<0,001).

Выраженность и глубина сдвигов, формирующихся к 14-м сут после оживления, коррелируют с темпами неврологического восстановления животных. При быстром восстановлении происходит выпадение нейронов (снижение обшей плотности популяции), которому подвергаются только свободные светлые клетки (уменьшение на 34,3% , Р<0,025). К этому же сроку развиваются дистрофические изменения светлых нейронов с сатсллптной глией (снижение их числа на 27,0% при повышении числа морфологически измененных клеток с глией на 120,0%, Р<0,025 ). При этом в популяции снижается число свободных нейронов (па 26,2%, Р<0,005), а число нейронов с глией сохраняется на контрольном уровне. При задержанном восстановлении процесс выпадения нейронов выражен сильнее (Рис. 3 Б), а выпадают не только свободные, но и имеющие сателлитную глию светлые клетки (уменьшение на 47,3 и 45,2% , соответственно, Р<0,01). В патологический процесс вовлекаются уже и темные нейроны, которые подвергаются дистрофическим изменениям (снижение числа свободных темных клеток на 32,7% , Р<0,025). При этом в популяции уменьшается число и свободных, и имеющих сателлитную глию нейронов (на 36,3 и 25,0%, соответственно; Р< 0,05). Между 14-45-ми сутками дальнейших изменений плотности и состава популяции не происходит.

Таким образом, в постреанимационном периоде после остановки сердца разной длительности у животных с отсутствием внешних неврологических расстройств развиваются существенные изменения плотности и состава нейронапьных популяций. Обнаруженные сдвиги возникают не сразу после оживления, а формируются и развиваются в ходе пост-рсашшацнонного процесса. Выпадение нейронов и перестройки состава нейронапьных популяций выявляются не ранее 7-х суток после оживления.

Несомненно, что у животных с выраженными нарушениями неврологического статуса в постреанимационном периоде могут развиваться и острые повреждения нейронов, приводящие к их ранней гибели. В частности, такие изменения выявлены у животных с. тяжелыми неврологическими расстройствами после клинической смерти разной этиологии ( М.Ш.Аврущенко, 1984; М.Ш. Аврущенко с соавт., 1988). Отсутствие в литературе работ по исследованию мозга животных с внеш-

ним восстановлением не позволяет сопоставить полученные результаты с данными других авторов.

Установлено, что сначала происходит только нарушение состава неи-рональных популяций, затрагивающее в первую очередь светлые (преимущественно свободные) клетки, которые переходят в морфологически измененное состояние. Затем развивается процесс выпадения нейронов, которому первыми подвергаются светлые (чаще свободные) клетки. Снижение числа темных (только свободных) нейронов обнаруживается позднее или может вообще не развиваться. Следовательно, светлые клетки более реактивны, чем темные, а нейроны с сателлитной глией устойчивее к переходу в морфологически измененное состояние и/или выпадению, чем свободные нейроны. Данные о повышенной реактивности светлых нейронов в сравнении с темными при постреанимационных перестройках нейрональных популяций получены и на других моделях клинической смерти (М.Ш.Аврущенко, 1984). При этом светлые клетки оказались более лабильными и при изменениях размеров ядра, цитоплазмы, сухой массы (М.Ш.Аврущенко, Т.Л. Маршак, 1983).

Согласно имеющимся в литературе данным, полученным без учета неврологического восстановления животных, увеличение продолжительности ишемии всегда приводит к более раннему возникновению из менений структуры мозга (По е1 а1., 1992; Vaagenes е1 а!., 1996). Некоторые авторы, однако, не обнаруживают различий в повреждении мозга после ишемии разной длительности (Моз5ако\Уз1и, 2е1тап, 1992), но отмечают вариабельность животных по выраженности морфологических изменений. Результаты настоящей работы свидетельствуют о том, что после остановки сердца разной длительности у крыс с отсутствием внешних неврологических нарушений в постреанимационном периоде развиваются однотипные и однонаправленные сдвиги плотности распределения и состава нейрональных популяций. Однако, существуют особенности реакции на более продолжительную ишемию, которые заключаются не в более раннем проявлении изменений, а в глубине обнаруживаемых сдвигов, в степени вовлечения разных элементов нейрональных популяций в постреанимационный процесс. После 15-минутной остановки сердца в сравнении с 10-минутной процессы выпадения и морфологического изменения нейронов выражены сильнее, при этом выпадению подвергаются не только светлые, но и темные клетки.

Наряду с этим выявлено, что после ишемии одной и той же длительности у животных с разными темпами неврологического восстановления имеются существенные различия в состоянии мозга: нарушения плотности и состава нейрональных популяций всегда выражены сильнее у крыс с задержанным восстановлением. Полученные данные свидетельствуют о том, что состояние нейрональных популяций в постреанимационном периоде зависит не только от длительности ишемии, но и коррелирует с темпами неврологического восстановления ожив-

ленных животных. Выявленная взаимосвязь указывает на существенное значение перестроек нейрональпых популяций в функциональном восстановлении мозга оживленных животных.

Результаты морфометрического анализа свидетельствуют о том, что существуют отличия в реакции на ишемию не только различных элементов нейрональных популяций, но и самих популяций в целом. Популяция клеток Пуркинье медиальной области мозжечка была наиболее устойчивой (отсутствие выпадения нейронов; переход в морфологически измененное состояние только светлых клеток; позднее возникновение нарушений состава и его полная нормализация в отдаленном периоде). Популяция клеток Пуркинье латеральной области мозжечка оказалась наиболее уязвимой (развитие выпадения нейронов даже после короткой ишемии; дальнейшее углубление изменений с вовлечением в процесс темных клеток). Популяция нейронов V слоя коры по своей чувствительности к ишемии заняла промежуточное положение (более позднее, чем в популяции клеток Пуркинье латеральной области мозжечка, развитие выпадения нейронов; вовлечение темных клеток в патологический процесс только у животных с задержанным восстановлением после длительной ишемии). Высокая чувствительность к ишемии клеток Пуркинье показана и на других моделях клинической смерти (Е.Д.Сергеева, 1995). При этом наиболее ранимыми были клетки Пуркинье латеральной области мозжечка ( М.Ш.Аврущенко, 1984).

Необходимо отметить, что хотя в настоящей работе морфометриче-ский анализ популяций нейронов гиппокампа не проводился, результаты гистологического исследования свидетельствуют о том, что у крыс с внешним восстановлением пирамидные нейроны сектора CAI остаются сохранными, однако обнаруживаются выраженные дистрофические изменения пирамидных клеток сектора СА4. Эти данные существенно отличаются от результатов, полученных на моделях изолированной ишемии мозга, указывающих на высокую селективную ранимость пирамидных нейронов сектора CAI гиппокампа (Pulsinelli et al., 1982; Kirino et al., 1990). Следовательно, полученные нами факты подтверждают концепцию постреанимационной болезни о существенном отличии клинической смерти от изолированной ишемии мозга.

При анализе изменений плотности и состава нейрональных популяций наиболее важными представляются данные об их отсроченном возникновении и длительном развитии у животных без видимых неврологических расстройств. Обнаруженные нарушения могут быть основой для развития отсроченных постгипоксических энцефалопатий, выявляемых как в клинике (Г.В. Алексеева, 1994), так и в эксперименте (A.M. Гурвич ссоавт., 1994; Г.И.Чехович. 1994). Взаимосвязь пострса-нимационных изменений структуры мозга с нарушениями его функции обусловливает необходимость поиска механизмов развития перестроек нейрональных популяций, развивающихся на фоне внешнего восстановления неврологического статуса.

ЗНАЧЕНИЕ ГЛНАЛЬНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ НЕРВНОЙ ТКАНИ В РАЗВИТИИ ПОСТРЕАНИМАЦИОННЫХ ИЗМЕНЕНИЙ МОЗГА.

По данным морфометрического анализа, в постреанимационном периоде после остановки сердца разной длительности нейроны с сатсл-литной глией более устойчивы, чем свободные нейроны. При нарушениях состава и плотности нейрональных популяций свободные нейроны всегда подвергаются переходу в морфологически измененное состояние и/или выпадению. Дистрофические изменения нейронов с глией происходят только на фоне морфологического изменения и/или выпадения свободных нейронов, а выпадение нейронов с глией - при выпадении свободных нейронов у животных с задержанным восстановлением неврологического статуса после длительной ишемии. Следовательно, сателлитная глия способствует поддержанию гомеостаза нейронов, препятствует их дистрофическим изменениям и выпадению.

В ходе постреанимационного процесса нарушается соотношение свободных и имеющих глию нейронов, что связано с преимущественным выпадением свободных клеток, а также с изменением числа самих са-теллитных глиальных элементов. В раннем периоде (4-14 сут) выявлены сдвиги состава нейрональных популяций, свидетельствующие об увеличении числа сателлитной глии. По данным морфометрического анализа, в V слое коры через 4 дн после 15 мин остановки сердца в сравнении с контролем доля нейронов с глией возрастает, а свободных нейронов - снижается (Рис. 4). Подсчет глиальных элементов нервной ткани показал, что при этом количество сателлитных олигодендроци-тов и астроцитов возрастает, а свободной макроглии не снижается (Рис. 5). Следовательно, увеличение числа сателлитной глии на этом этапе постреанимационного процесса происходит, очевидно, не за счет перераспределения глиальных элементов нервной ткани, а вследствие пролиферации.

В позднем постреанимационного периоде (1,5-8 мес.) при улучшении состояния нейрональных популяций выявлены сдвиги, свидетельствующие о нормализации числа сателлитных глиальных клеток (обратный переход части светлых и темных клеток с глией в свободные нейроны, а также морфологически измененных нейронов с глией - в свободные светлые и темные клетки).

Показано (Н.К.Пермяков с соавт., 1986), что обеспечение нормальным числом глиальных клеток создает условия для быстрого восстановления структурно-метаболических свойств нейронов после реанимации. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что на ранних стадиях постреанимационного процесса количество сателлитной глии существенно возрастает, и это способствует предупреждению выпадения и/или морфологического изменения нейронов.

Значение феномена увеличения числа сателлитных глиальных клеток

состоит, очевидно, в метаболическом обеспечении и предохранении нейронов, функционирующих в постишемических условиях. Известно, что макроглия вырабатывает нейротрофические факторы, способствующие выживанию и спраутипгу нейронов (Bakhit et al., 1991; Kempski, 1993). Показано защитное действие глии при аноксии (Vibulsreth ct al., 1987). Выявлено участие макроглии в регуляции действия возбуждающих аминоксилог и поддержании постоянства ионного состава внеклеточной среды, а также в обеспечении трофики нейрона (Van Eldik et al., 1991; Dusart et al., 1991; Gajkovvska et al., 1995).

Число клеток

18

на ед. площади

Рис. 4 Изменение соотношения свободных и имеющих глию нейронов в V слое коры через 4 дн после 15 мин остановки сердца

А - контроль, Б - опыт

Свободные нейроны ВЦ Нейроны с глией

Рис. Ь Плотность распределения сателлитной и свободной глии в V слое коры через 4 дн после15 мин остановки сердца.

□ Сателлитные олигодендроциты Я Сателлитные астроциты

□ Свободные олигодендроциты S СиС5сдно1ё ас i рици; ы

* -Р<0,005 " -Р<0,001 при сравнении с КОНТПОПРМ

Итак, сателлитная глия играет важную роль в поддержании гомеоста-за нейрональных популяций после тяжелого ишемического воздей-

ствия. Это соответствует классическим представлениям о функционально - метаболическом единстве нейрона и глии (Somjen, 1988; А.И. Ройтбак, 1993). Вместе с тем, исследование астроцитов серого и белого вещества мозга свидетельствует о существенном значении изменения состояния самих глиальных элементов нервной ткани в развитии постреанимационного процесса.

Согласно данным иммуноцитохимического анализа, в постреанимационном периоде происходит резкое увеличение иммунореактивности (ИР) к кислому глиалыюму фибриллярному белку (КГФБ) фиброзных астроцитов белого вещества мозга, и появляются ИР астроциты в сером веществе. На 4-е сут после 10 мин остановки сердца скопления ИР астроцитов выявлены в I, VI слоях коры, среди гранулярных клеток зубчатой извилины и пирамидных нейронов секторов САЗ-СА4 гиппо-кампа, в слое клеток-зерен мозжечка. После 15 мин остановки сердца изменения астроцитов были более резкими и распространенными.

Между 4-7-ми сут постреанимационного периода ИР астроцитов белого вещества мозга к КГФБ снижалась, но оставалась выше контрольного уровня. В сером веществе мозга немногочисленные иммуно-реактивные астроциты обнаруживались только в VI слое коры, секторе СА4 гиппокампа и в зернистом слое мозжечка.

КГФБ - компонент цитоплазматических филаментов астроцитарной глии, в норме выявляющийся только в фиброзных, но не в протоплаз-матических астроцитах (Schmidt-Kastner, Szymas,1990). Реактивная гипертрофия с увеличением ИР к КГФБ - наиболее характерное свойство глии , проявляющееся при различных экспериментальных воздействиях и патологических состояниях (Najos et al., 1990; Garrison et al., 1991; Landis, 1994), в том числе, и после изолированной ишемии мозга (Petito et al., 1990; Rischke, Kriegstein, 1991). Следовательно, наличие КГФБ -надежный маркер реактивных астроцитов при повреждении мозга.

Имеется много разных факторов, повышающих содержание КГФБ (Eccleston et al., 1989; Cavanaugh et al., 1990; Kato et al., 1991). Увеличение ИР к КГФБ возможно и без активации его синтеза: при соединении глиальных филаментов (что создает видимость повышения их концентрации) или при появлении в гипертрофированных астроцитах новых, ранее маскируемых эпитопов для соединения с антителом (Goldmuntzet al., 1986). В любом случае, резкое повышение ИР астроцитов к КГФБ в постреанимационном периоде - показатель изменения их состояния.

При некоторых патологических процессах ИР к КГФБ снижается, что связывают с активацией протеолиза, нарушением проницаемости мембран, накоплением ионов кальция, приводящим к деградации глиальных филаментов (Kimura, Budka, 1986). Следовательно, падение ИР к КГФБ следует, очевидно, расценивать как признак патологического изменения глии. О негативных последствиях таких сдвигов свидетельствует и наличие прямой корреляции между снижением ИР астроцитов

к КГФБ и формированием двигательных нарушении (Rcnau-Piqucrcs et al.,1989).

Приведенные факты дают основание полагать, что активация астроци-тов в постреанимационном периоде, проявляющаяся в увеличении их ИР к КГФБ, оказывает положительное действие на состояние мозга .

В связи с полученными результатами возникает вопрос об источниках появления новых КГФБ-позитивных астроцитов. Имеются данные о пролиферации КГФБ-экспрессирующих астроцитов через 3-4 дн после повреждения мозга (Miyake et al., 1989). Согласно результатам мор-фометричсского анализа, на 4-е сут постреанимационного периода - то есть па этапе появления ИР астроцитов в сером веществе мозга - число глиальных клеток возрастает, то есть происходит их пролиферация. Известно, однако, что хотя повреждение мозга при различных воздействиях действительно приводит к пролиферация глии, реактивные астроциты образуются без пролиферации путем трансформации уже существующих клеток (Reier, 1986; Janesko, 1989). Очевидно, в мозге действует единый механизм трансформации протоплазматических астроцитов в реактивное состояние с развитием экспрессии КГФБ и обратного перехода иммунореактпвных фиброзных астроцитов в про-топлазматические, КГФБ - негативные. В пользу таких представлений свидетельствует появление КГФБ - экспрессирующих астроцитов в сером веществе мозга оживленных крыс, а также данные о происхождении КГФБ - негативной глии Альцгеймера из фиброзных астроцитов, в норме содержащих этот белок (Kimura, Budka, 1986).

Причиной перехода нормальных астроцитов в реактивное состояние может быть проникновение иммуноглобулинов крови в ткань мозга (Nieto-Sampredo et al., 1988). В раннем постреанимационном периоде обнаружена экстравазация белков крови и пропитка ими ткани мозга, (M.LLI. Аврущенко, С. Краевский, 1989).Это свидетельствует о повреждение гематоэнцефалического барьера после реанимации, что подтверждается и данными других исследований (Pluta et al., 1994; Kapuscinski, Kapuscinski,1995). Следовательно, постреанимационные изменения ИР астроцитов связаны с их трансформацией, вызванной нарушением проницаемости гематоэнцефалического барьера.

В развитие представлений, сформировавшихся при исследованиях на модели изолированной ишемии мозга (Petito et al., 1990), полученные нами данные свидетельствуют о взаимосвязи феномена активации астроцитов с определенной стадией постреанимационного процесса: на 7-е сут в сравнении с 4-ми ИР астроцитов к КГФБ уменьшалась. Это, очевидно, не связано с нормализацией состояния мозга, так как по данным морфометрического анализа, изменения плотности и состава ненрональных популяций формируются к 7-м сут постреанимационного периода. Наиболее вероятной причиной снижения ИР астроцитов к КГФБ представляется нормализация состояния гематоэнцефалическо-

го барьера, которая происходит на 7-е сут после оживления (М.Ш. Аврущенко, С. Краевский, 1989).

В целом существует взаимосвязь выраженности морфологических изменений нейронов с уровнем иммунореактивности КГФБ. Однако, ИР астроциты далеко не всегда локализуются в областях множественных повреждений нейронов и, напротив, нередко выявляются рядом с нормальными клетками. Вероятно, изменения нейронов и глии могут протекать относительно независимо друг от друга. В пользу этого положения свидетельствует отсутствие нарушений плотности и состава нейрональных популяций на 4-е сут после оживления, а также увеличение числа сателлитной глии не только около морфологически измененных, но и около нормальных клеток. Следовательно, повышение ИР к КГФБ в постреанимационном периоде, очевидно, не может быть просто ответом астроцитов на повреждение нейронов, как полагают некоторые авторы (Diemer et al., 1992; Gadamski, Kroh, 1994), а является следствием прямого воздействия ишемии на глию.

Итак, в постреанимационном периоде происходят существенные изменения состояния астроцитарной глии, выраженность которых зависит от длительности ишемии и стадии восстановительного процесса.

В целом исследование глиальных элементов нервной ткани свидетельствует о важной роли макроглии в формировании постреанимационных изменений мозга: активно реагируя на ишемическое воздействие, глия способствует поддержанию гомеостаза нейрональных популяций, а изменения ее состояния вносят существенный вклад в развитие постреанимационного процесса.

ВЗАИМОСВЯЗЬ ПОСТРЕАНИМАЦИОННЫХ ИЗМЕНЕНИЙ НЕЙРОНАЛЬНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ С ТРАНСКРИПЦИОННОЙ АКТИВНОСТЬЮ ХРОМАТИНА И УРОВНЕМ СИНТЕЗА БЕЛКА

Установлено, что в постреанимационном периоде у крыс без внешних неврологических нарушений транскрипционная активность хроматина нейронов III, IV, V слоев коры и клеток Пуркинье (КП) мозжечка существенно изменяется. Анализ гистограмм распределения нейронов по интенсивности мечения (для примера приводятся гистограммы распределения КП по интенсивности мечения ядрышка - Рис. 6), позволил выявить динамику достоверных сдвигов матричной активности хроматина в постреанимационном периоде.

Изменения уровня мечения ядрышка нейронов коры (Рис. 7) начинаются уже через 1 ч после оживления, когда интенсивность мечения светлых нейронов III и V слоев возрастает, а темных нейронов всех слоев коры - снижается. Спустя 1 сут после оживления выявленные сдвиги в IV и V слоях коры сохраняются, а в III - усиливаются. Между 1-4-ми сут во всех слоях происходит увеличение интенсивности мечения ядрышка; в результате, на 4-е сут в сравнении с контролем интенсивность мечения ядрышка светлых нейронов III, V и темных нейронов V

Г А

i'l

Рис. 6 Распределение светлых и темных клеток Пуркинье по интенсивности мечения ядрышка на разных сроках после оживления в сравнении с контролем.

Белые столбики - светлые клетки, черные столбики - темные клетки. А - контроль , Б - 1 ч после оживления, В - 24 ч после оживления, Г - 4 сут после оживления, Д - 7 сут после оживления. По осям абсцисс - число зерен восстановленного серебра; по осям ординат - число клеток ( в %% )

слосв существенно повышена, а светлых нейронов IV и темных нейронов III, IV слоев - достигает контрольного уровня. Между 4-7-ми сут уровень мечения ядрышка нейронов всех слоев коры резко уменьшается; в результате, на 7-е сут после оживления в сравнении с контролем интенсивность мечения ядрышка нейронов IV и V слоев существенно снижена, а в III слое - опускается до контрольных значений.

Изменения матричной активности внеядрышкового хроматина нейронов разных слоев коры (Рис. 8) начинаются уже через 1 ч после оживления, когда всюду, (кроме темных клеток IV слоя) интенсивности ме-

Рис. 7 Динамика изменения интенсивности мечения ядрышка светлых и темных нейронов III,IV, V слоев коры в постреанимационном периоде.

Пунктир - светлые клетки, сплошная линия - темные клетки. К - контроль По оси абсцисс - время после оживления (в сут); по оси ординат - средняя интенсивность мечения (у.ед.)

чения возрастает. Между 1ч-1 сут в III и IV слоях выявленные сдвиги сохраняются, а в V слое интенсивность мечения светлых и темных нейронов снижается, опускаясь до контрольного уровня. Между 1- 4-ми сут средняя интенсивность мечения светлых нейронов IV, V и темных нейронов V слоев существенно увеличивается, а светлых нейронов III и темных нейронах III, V слоев - не меняется; в результате, на 4-е сут в сравнении с контролем уровень мечения светлых нейронов всех слоев коры и темных нейронов V слоя резко увеличен, а темных нейронов III и IV слоев - соответствует контролю. Между 4 -7-ми сут интенсивность мечения внеядрышкового хроматина нейронов всех исследованных слоев коры резко снижается, падая существенно ниже контрольного уровня всюду, кроме темных клеток III слоя.

Изменения транскрипционной активности ядрышкового хроматина клеток Пуркинье выявлены спустя 1 сут после оживления, когда рас-

метка °,

сутки

Рис. 8 Динамика изменения интенсивности внеядрышкового мечения светлых и темных нейронов 111, IV, V слоев коры в постреанимационном периоде.

Пунктир - светлые клетки, сплошная линия - темные клетки. К - контроль По оси абсцисс - время после оживления (в сут); по оси ординат - средняя интенсивность мечения (в у.ед.)

прсдсление светлых и темных нейронов по этому показателю изменяется (Рх<0,05): доля слабомеченых клеток возрастает, а средне- и сильномеченых - падает (Рф<0,05) (Рис. 6), что приводит к снижению средней интенсивности мечения ядрышка (Рис. 9А). Между 1-4-ми сут в связи с уменьшением в популяции доли слабо- и среднемеченых клеток и увеличением доли сильномечсных (Рф<0,001), средняя интенсивность мечения ядрышка резко возрастает. В результате, на 4-е сут постреанимационного периода в сравнении с контролем интенсивность мечения ядрышка существенно повышена, причем в светлых клетках сильнее, чем в темных (Рис. 9А). Между 4-7-ми интенсивность мечения ядрышка резко уменьшается и в светлых, и в темных нейронах, падая существенно ниже контрольного уровня (Рис. 9А).

Изменения матричной активности внеядрышкового хроматина клеток Пуркинье выявлены через 1 ч после оживления: интенсивность ме-

чения возрастает и в светлых, и в темных нейронах (Рис. 9Б). Дальнейшие изменения уровня мечения внеядрышкового хроматина КП развиваются аналогично сдвигам интенсивности мечения ядрышка: между 124-м ч - снижение, приводящее к уменьшению средней интенсивности мечения в сравнении с контролем и в светлых, и в темных клетках; между 24 ч - 4 сут - резкое повышение, с увеличением средней интенсивности мечения в сравнении с контролем в обоих типах нейронов; между 4 - 7-ми сутками - повторное снижение, приводящее к уменьшению средней интенсивности мечения на 7-е сут постреанимационного периода в сравнении с контролем и в светлых, и темных клетках, соответственно (Рис. 9 Б).

юо 75 5 0 ~ Д 1 1 \ ч 1 ч

75 -

0 i ! i ! I i | <12 3*567

ISO 04 ,70 С 'V \ >

-э -

0 4 12 3 * 5 6 7

Рис. 9 Динамика изменения транскрипционной активности хроматина светлых и темных клеток Пуркинье в постреанимационном периоде после остановки сердца у крыс. А - ядрышковый хроматин, Б - внеядрышковый хроматин. Пунктирная линия - светлые клетки, сплошная линия - темные клетки. К - контроль. По осям абсцисс - срок после оживления ( в сут); по осям ординат- средняя интенсивность мечения.

Итак, в постреанимационном периоде после остановки сердца у животных с внешним восстановлением неврологического статуса развиваются изменения транскрипционной активности ядрышкового и внеядрышкового хроматина нейронов III, IV, V слоев коры и КП, которые выявляются уже через 1 ч после оживления и носят фазный характер. При этом на 4-е сут во всех исследованных нейрональных популяциях

происходит значительное увеличение матричной активности хроматина ядер нейронов, а к 7-м сут - резкое падение.

Согласно современным представлениям, процесс синтеза белка при ишемии и в постишемичсском периоде подвергается существенным нарушениям (Нага et al., 1993). Генерализованную ингибицию синтеза белка связывают с расстройствами, происходящими на уровне трансляции, развивающимися в течение нескольких минут после ишемии (Hossmann, 1993). Полученные нами данные свидетельствуют о существенных посгрсанимациопных нарушениях процесса синтеза белка, развивающихся на уровне транскрипции.

Установлено, что время проявления и характер изменений матричной активности хроматина в раннем постреанимационном периоде (в пределах 1 сут после .оживления) неодинаковы в исследуемых нейрональ-ных популяциях и в разных типах клеток. Существенные отличия выявлены в характере постреанимационных сдвигов транскрипционной активности хроматина светлых и темных нейронов, исходно - то есть у интактных животных - не различающихся по уровню матричной активности. Аналогично результатам морфометрического анализа, данные по исследованию транскрипционной активности хроматина свидетельствуют о том, что как и в процессе перестроек нейрональных популяций, так и в отношении сдвигов матричной активности светлые клетки характеризуются как более реактивные в сравнении с темными.

Выраженные отличия по уровню транскрипционной активности хроматина, как у интактных, так и у оживленных животных, обнаружены также между нейронами III, IV и V слоев коры, что связано, очевидно, со спецификой выполняемой ими функции (A.A. Антонова, 1982). Вместе с тем, проведенные исследования свидетельствуют о принципиальном сходстве реакции нейронов III, IV, V слоев коры и КП на ишемию, вызванную остановкой сердца. Существенно, что несмотря на сохраняющиеся различия в выраженности сдвигов матричной активности хроматина, на более поздних сроках постреанимационного периода их направление и динамика практически одинаковы во всех слоях коры и КП мозжечка. Возможно, что на ранних этапах сдвиги транскрипционной активности хроматина определяются в основном функциональными особенностями нейронов, однако позднее реакция клеток унифицируется: на 4-е сут после оживления во всех нейрональных популяциях транскрипционная активность хроматина существенно возрастает, а на 7-е - резко падает. Сопоставление полученных нами результатов с данными других авторов затруднено, так как исследования состояния хроматина проводились при ишемии другой этиологии биохимическими или электронно-цитохимическими методами (Albrecht, 1977; B.B. Семченко, С.С. Степанов, 1983). Известно, что существенные колебания транскрипционой активности хроматина происходят при старении, в ходе онтогенеза, при различных экспериментальных воздействиях, (В.Л. Матреницкнй,

1989; В.Н. Ярыгин с соавт., 1990; О.В. Бульчук с соавт., 1994). Сдвиги матричной активности хроматина связывают с конкретным механизмом - изменением числа транскрибируемых участков ДНК, количество которых в геноме нейронов изменяется в течение всей жизни (А.В.Григорьева, В.Н. Ярыгин, 1981). Морфофункциональные изменения, развивающиеся в нервных клетках при дифференцировке, созревании, колебании функциональной нагрузки связаны с перестройками бслоксинтезирующей системы, приводящими к количественным и качественным сдвигам синтезируемых белков (Birder et al., 1991; Perry, Matyszak, 1993).

Приведенные факты свидетельствуют о том, что изменения матричной активности хроматина, являются, очевидно, одним из ключевых механизмов, вовлеченных в процесс адаптации клеток к новым физиологическим состояниям и патологическим воздействиям. Согласно результатам настоящей работы, существенные сдвиги транскрипционной активности хроматина развиваются и в постреанимационном периоде.

Исследования интенсивности синтеза белка в ткани мозга выявили прямую корреляцию постреанимационных изменений транскрипционной активности хроматина с уровнем синтеза белка. При этом обнаружена взаимосвязь интенсивности синтеза белка в ткани мозга с полнотой и темпами неврологического восстановления животных. Так, установлено, что на 4-е сут после оживления - то есть на этапе резкого подъема транскрипционной активности хроматина - у животных с быстрым восстановлением интенсивность синтеза белка существенно возрастает в сенсомоторной коре, гиппокампе, медиальной, интермедиальной и латеральной областях мозжечка (Рис. 10 А). К этому же сроку постреанимационного периода у крыс с задержанным восстановлением резкое увеличение интенсивности синтеза белка происходит только в гиппокампе, интермедиальной и латеральной областях мозжечка, а у животных с нарушениями неврологического статуса во всех исследованных отелах мозга изменения отсутствуют (Рис. 10 Б).

Следовательно, подъем уровня синтеза белка является, очевидно, необходимым этапом для полноценного восстановления неврологического статуса животных после клинической смерти.

Результаты авторадиографического исследования, также как и данные биохимического анализа, свидетельствуют об увеличении синтеза белка на 4-е сут после оживления у животных с быстрым восстановлением. При этом удалось установить, что существует градация вовлечения элементов нервной ткани в постреанимационный процесс, аналогично тому, как это было показано при морфометрическом анализе популяций. Так, в секторе CAI гиппокампа, где не было выраженных повреждений нервных клеток, интенсивность синтеза белка возрастала только в свободных светлых нейронах (на 35,3%; Pi <0,05), а в секторе СА4, где обнаружены дистрофически изменения, - и в свободных, и в имеющих сателлитную глию светлых нейронах (на 48,8% и 55,1%, со-

отетствснно; <0,05). В V слое коры, характеризующемся существенными нарушениями плотности и состава популяции, интенсивность синтеза белка возрастала не только в свободных и имеющих глию светлых нейронах (на 31,2% и 39,0%; соответственно; Р1 <0,05), но и в темных - свободных и с глией - нейронах (на 25,2% и 58,0%; соответственно; Р, <0,05). В наиболее ранимой популяции КП латеральной области мозжечка резкое увеличение уровня синтеза белка выявлено и во всех типах нейронов (в светлых свободных - на 76,3 % ; в светлых с глией - на 84,0% ; в темных свободных - на 77,9%); в темных с глией - на 78,1%; Р[ <0,025), а также в сателлитпой глие - как при

Рис. 10 Интенсивность синтеза белка в ткани различных отделов мозга у животных с разными темпами и степенью восстановления неврологического статуса после остановки сердца.

1 - сенсомоторная кора; 2 - гиппокамп; 3, 4, 5 - медиальная, интермедиальная и латеральная области мозжечка. А - Быстрое восстановление неврологического статуса Белые столбики - контроль, столбики со штриховкой - опыт. Б - Задержанное восстановление или неврологические нарушения Белые столбики - контроль, столбики со штриховкой - задержанное восстановление , черные столбики - нарушения неврологического статуса.

* - Р, < 0,05 при сравнении с контролем **-Р,< 0,025

светлых, так и при темных нейронах (на 55,4 и 69,9%, соответственно; Р( <0,05). Следовательно, одинаковая суммарная интенсивность синтеза белка в ткани мозга (о чем свидетельствуют данные биохимического анализа) в каждой популяции достигается разной ценой: чем больше ее элементов вовлекается в процесс, тем чувствительнее оказывается в дальнейшем популяция к развитию постреанимационных повреждений.

Полученные факты указывают на взаимосвязь селективной ранимости нейрональных популяций и их различных элементов с особенностя-

ми репаративных изменений, обусловленных состоянием белоксинте-зиругощей системы нервных клеток. Данные, полученные на модели изолированной ишемии мозга, подтверждают это положение: в наиболее ранимых областях уровень синтеза белка резко падал и, в отличие от нейронов, переживших ишемию, в дальнейшем не восстанавливался (Araki et al., 1990; Widmann et al., 1991). Предупреждение гибели клеток в селективно чувствительных областях мозга было связано с нормализацией синтеза белка (Miyazawa et al., 1991; Bonnekoh et al., 1992).

Итак, постреанимационные изменения нейронов связаны не только с нарушением синтеза белка, но и с особенностями реализации компенсаторных возможностей популяции. Активация синтеза белка является, очевидно, проявлением внутриклеточной репаративной регенерации -уникального механизма компенсации нарушенных функций ЦНС (Д.С. Саркисов, 1994). Подъем уровня синтеза белка позволяет на этом этапе постреанимационного процесса обеспечить сохранение плотности и состава нейрональных популяций.

Функциональное значение активации синтеза белка в постреанимационном периоде, возможно, связано с селективной экспрессией генов и синтезом специфических белков, способствующих репарации повреждений, аналогично тому, как это происходит после изолированной ишемии мозга (Gunn et al., 1990; Nowak et al., 1992; Abe, Kogure, 1993). О наличии таких сдвигов свидетельствует существенное изменение структурно-функционального состояния хроматина нейронов в постреанимационном периоде (М.Ш. Аврущенко с соавт., 1991), а также обнаруженное в настоящей работе появление новых иммунореак-тивных к КГФБ астроцитов. Следовательно, в постреанимационном периоде, очевидно, развиваются не только количественные сдвиги уровня синтеза белка, но и происходит изменение спектра синтезируемых белков.

Снижение транскрипционной активности хроматина к 7-м сут после оживления указывает на развитие новых отсроченных нарушений белкового метаболизма мозга даже при внешнем восстановлении неврологического статуса. По данным морфометрического анализа, именно к этому сроку выявляются нарушения состава и плотности нейрональных популяций. Взаимосвязь нарушений состояния белоксинтезируго-щей системы с процессами дистрофического изменения и гибели нейронов выявлена и при других экспериментальных воздействиях, а также при нейродегенеративных заболеваниях (Leigh et al.,1989; Welch et al.,1991). Установлено, что выпадение и деструктивные изменения нейронов развиваются на фоне снижения уровня синтеза белка (В.П. Туманов с соавт., 1994), а его активация приводит к уменьшению числа дистрофически измененных нейронов (Polezhaev et al., 1989; А.В. Тимонин, 1990).

Резкое снижение матричной активности хроматина может быть основой для формирования нарушений высшей нервной деятельности

оживленных животных. Показано, что чувствительность нейронов к мотивационным и сенсорным воздействиям, а также к биологически активным веществам определяется их белоксинтезирующей системой (К.В. Судаков, 1993). Выявлена взаимосвязь высшей нервной деятельности животных с уровнем матричной активности хроматина и интенсивностью синтеза белка (Pride et al., 1989; Л.M. Гершгейн с со-авт.,1991; В.Н. Мац, О.Л. Сегал, 1994).

Исследованные нами области мозга играют существенную роль в процессах обучения и формирования памяти (Winocur, Moscovitch, 1990; Golomb et al., 1993; Н.П.Балезина, В.Н. Мац, 1993). Следовательно, выявленные в постреанимационном периоде изменения функциональной активности генома нейронов могут быть причиной формирования нарушений высшей нервной деятельности даже при отсутствии у них внешних неврологических расстройств. Это подтверждают и данные, о появлении у оживленных животных нарушений памяти на фоне резкого снижения транскрипционной активности хроматина (М.Ш. Аврущенко, Е.А. Мутускина, 1990).

В отдаленном постреанимационном периоде происходит улучшение состава нейрональных популяций. Аналогичные сдвиги были обнаружены и у перенесших клиническую смерть собак, и были связаны с активацией синтеза белка, развивающейся не только в нормальных, но и в морфологически измененных нейронах (М.Ш. Аврущенко, 1984).

Итак, процесс синтеза белка играет ведущую роль в развитии постреанимационных изменений мозга: перестройки нейрональных популяций. полнота и темпы неврологического восстановления животных, селективная ранимость нейронов, тесно связаны с уровнем синтеза белка, с реактивностью белоксинтезирующей системы нервных клеток.

ВЛИЯНИЕ НЕЙРОПЕПТИДОВ НА СОСТОЯНИЕ НЕЙРОНАЛЬНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ В ПОСТРЕАНИМАЦИОННОМ ПЕРИОДЕ.

Установлено, что применение окситоцина, МИФ, эстрадиола с окси-тоципом существенно улучшает состояние нейрональных популяций. Так, окситоцин ускоряет нормализацию состава популяции КП медиальной области мозжечка; уменьшает нарушения состава популяции КП латеральной области мозжечка (у леченых животных в сравнении с нелечеными доля в популяции светлых нейронов выше, а морфологически измененных ниже - на 12,8 и 18,2%, соответственно; Pt<0,05); снижает выпадение нейронов и нарушения состава популяции нейронов V слоя коры (Рис. 11). У леченых животных в сравнении с нелечеными увеличено число сателлитной глии (на 13,1 % и 23,2% в КП медиальной области мозжечка и V слое коры, соответственно; Pt< 0,025).

Применение МИФ улучшает состав популяции и увеличивает число сателлитной глии в V слое коры (у леченых животных в сравнении с нелечеными число темных нейронов на 23,8% больше, а морфологически измененных - на 49,3% меньше, Р< 0,05; доля нейронов с глией повы-

Число нейронов/ ед. площади

А

□ Светлые клетки ■ Темные клетки И Измененные клетки И Общая плотность популяции

>1

• -Р<0,05 " -Р«0.025 — -Р<0.01

при сравнении с лечеными животными

Нелеченые Леченые

Рис.11 Влияние окситоцина на плотность и состав популяции нейронов V слоя коры у крыс, перенесших 15-минутную остановку сердца

шепа па 22,6% ; Pt< 0,01); предотвращает выпадение КП латеральной области мозжечка и изменения ее состава.

Сочстанное воздействие окситоцина и эстраднола снижает выпадение клеток и улучшает состав популяции в V слое коры (Рис. 12); предотвращает изменения состава популяции КП медиальной области мозжечка и выпадение КП латеральной области. Улучшение состояния нейрональных популяций происходит на фоне достоверного повышения количества сателлитной глии.

Соматостатнл полностью предотвращает выпадение нейронов даже высокочувствительных к ишемии КП латеральной области мозжечка: через 8 мес. после оживления леченые животные не отличаются от ин-тактных по плотности и составу популяции.

Существенно, что исследуемые нейропептиды достоверно улучшают структуру результатов неврологического восстановления животных, а соматостатин повышает также и их выживаемость.

Известно, что окситоцин, МИФ, эстрадиол и соматостатин играют важную роль во многих процессах, развивающихся в организме (И.П. Ашмарин, М.А. Каменская, 1988; Ong, Garey, 1990; Argiolas, Gessa, 1991). Установлено, что репродуктивные нейропептиды и гормоны существенно влияют на восстановление животных после клинической смерти (A.B. Волков с соавт., 1996). Так, применение окситоцина способствует более быстрому и полному неврологическому восстановле-

шпо крыс после 10 мин остановки сердца, причем в его действии ведущую роль играет фрагмент окситоцин 7.9 - (МИФ) ( Г.В. Мишарина, A.B. Волков, 1994). Согласно полученным нами данным, применение окситоцина, МИФ, окситоцина с эстрадиолом, соматостатина не только ускоряет неврологическое восстановление оживленных животных даже после длительной - 15-минутной- остановки сердца, но и способствует улучшению состояния мозга на уровне нейрональных популяций. При этом одним из механизмов действия этих нейропептидов оказалось повышение числа сателлитной глии, что согласуется сданными об их действии как факторов роста (Dalsgaard et al., 1989; Hanley, 1989).

Число

нейронов/ ...

ед.площади во ■k ¡Iii i"; 1, □ Светлые клетки ■ Темные клетки □ Измененные клетки

«Q В Общая плотность популяции

ю ¡1 li,1 А« -b • -Р<0,05 " -Р<0.025

20 | ••• -Р<0.01 при сравнении с непечеными животными

10 0 ш «1! Ii

Леченые Нелеченые

Рис.12 Влияние окситоцина с эстрадиолом на плотность

и состав популяции нейронов V слоя коры у крыс,

перенесших 15-минутную остановку сердца

Существенно, что используемые нейропептиды оказывали неодинаковое влияние на разные нейрональные популяции. Следовательно, необходим дифференцированный подход к выбору методов лечения с учетом функциональных, метаболических и медиаторных особенностей нейронов.

Итак, применение в раннем постреанимационном периоде окситоцина, МИФ, окситоцина с эстрадиолом, соматостатина существенно улучшает состояние нейрональных популяций и ускоряет темпы неврологического восстановления животных. Это свидетельствует о взаимосвязи функционального восстановления мозга с состоянием нейрональных популяций, о роли перестроек нейрональных популяций в постреанимационном процессе. Ранее нами было показано, что ускорение неврологического восстановления животных после клинической смерти с

помощью трентала или блокатора ионов кальция форидона также происходит на фоне улучшения состояния нейрональных популяций (Е.А.Мутускина с соавт., 1985; 1988), а применение сукцината натрия предотвращает выпадение и дистрофические изменения КП латеральной области мозжечка, что коррелирует с улучшением высшей нервной деятельности после оживления (Ю.В. Заржецкий и соавт., 1994).

Приведенные факты свидетельствуют о значении исследования нейрональных популяций и механизмов их перестроек для поиска путей направленного воздействия на состояние мозга, что открывает перспективы для разработки патогенетически обусловленной терапии постреанимационных энцефалопатий (применение нейро- и глие-трофических факторов, дальнейшее исследование действия регулятор-ных пептидов, активация синтеза белка в нервных клетках).

ВЫВОДЫ

1. В постреанимационном периоде после 10- и 15-минутной остановки сердца при внешнем восстановлении неврологического статуса животных происходят существенные изменения состояния мозга на уровне нейрональных популяций: нарушаются их состав и плотность, развиваются сдвиги нейро-глиальных взаимоотношений, меняется состояние астроцитарной глии серого и белого вещества мозга, выявляются изменения транскрипционной активности хроматина ядер нейронов и интенсивности синтеза белка в ткани мозга, нейронах и сателлитной глие.

2. Постреанимационные перестройки нейрональных популяций характеризуются определенной динамикой и этапами развития. Изменения плотности и состава нейрональных популяций формируются отсро-ченно (не ранее 7 сут) и длительно развиваются (до 2 мес.). В отдаленном постреанимационном периоде (8 мес.) состояние нейрональных популяций улучшается и может полностью нормализоваться.

Этапы перестроек нейрональных популяций заключаются в следующем: сначала происходят нарушения состава популяций, связанные с морфологическим изменением нейронов, которому в первую очередь подвергаются светлые нейроны - сначала свободные, а затем и имеющие сателлитную глию, - и только потом темные (свободные) клетки. Позднее развивается процесс выпадения нервных клеток, в который всегда вовлекаются светлые (чаще свободные) нейроны. Выпадение темных (причем только свободных) нейронов происходит позднее или может вообще не развиваться.

3. В постреанимационном периоде после остановки сердца разной длительности формируются однотипные и однонаправленные сдвиги плотности и состава нейрональных популяций. Глубина перестроек нейрональных популяций, степень вовлечения их различных элементов в постреанимационный процесс зависят от длительности ишемии и

коррелируют с темпами восстановления неврологического статуса животных.

4. Нейропальные популяции исследованных областей мозга имеют неодинаковую чувствительность к ишемии: независимо от длительности остановки сердца популяция клеток Пуркинье латеральной области мозжечка наиболее ранима, а популяция клеток Пуркинье медиальной области мозжечка - наиболее устойчива. Нейроны V слоя коры занимают промежуточное положение по выраженности постреанимационных изменений. Пирамидные нейроны сектора СА4 гиппокампа повреждаются сильнее, чем сектора CAI.

5. Различные элементы гетерогенных нейрональных популяций характеризуются неодинаковой реактивностью: светлые нейроны всегда участвуют в изменениях состояния нейрональных популяций, в то время как темные вовлекаются в пострсапимационный процесс только в определенных ситуациях, таких как более длительная ишемия или задержанное восстановление неврологического статуса животных.

6. Макроглия играет важную роль в формировании постреанимационных изменений мозга. Наличие сателлитной глии и повышение ее числа препятствует развитию дистрофических изменений и/или выпадению нейронов. Изменения состояния астроцитарной глии взаимосвязаны с длительностью ишемии, стадией процесса, полнотой неврологического восстановления животных.

Активно реагируя на шпсмическое воздействие, глия способствует поддержанию гомеостаза нейрональных популяций, а изменения ее состояния вносят существенный вклад в развитие постреанимационного процесса.

7. В иостреанимационном периоде развиваются фазные колебания транскрипционной активности как ядрышкового, так и внеядрышко-вого хроматина нейронов. Время проявления и характер изменений матричной активности хроматина в раннем постреанимационном периоде (в пределах первых суток после оживления) неодинаковы в исследуемых нейрональных популяциях и разных типах клеток. На более поздних этапах поел реанимационного периода, несмотря на сохраняющиеся различия в выраженности сдвигов матричной активности хроматина, их направление и динамика одинаковы во всех исследованных слоях коры и клетках Пуркинье мозжечка: на 4-е сутки после оживления происходит резкое увеличение транскрипционной активности хроматина, а на 7-е сутки - существенное снижение.

8. Для полноценного восстановления неврологического статуса оживленных животных необходим подъем уровня синтеза белка в мозге на определенном этапе постреанимационного процесса. Выявлена прямая взаимосвязь темпов и полноты неврологического восстановления оживленных животных с интенсивностью синтеза белка в ткани коры, гиппокампа, медиальной, интермедиалыюй и латеральной областей мозжечка.

9. Процесс синтеза белка играет существенную роль в развитии постреанимационных изменений нейро-глиальных популяций. Активация синтеза белка обеспечивает сохранение плотности и состава ней-рональных популяций в раннем постреанимационном периоде. Отсроченное развитие процессов выпадения и дистрофического изменения нейронов происходит на фоне снижения интенсивности синтеза белка. Селективная чувствительность нервных клеток к ишемии связана с реактивностью их белоксинтезирующей системы.

10. Применение в раннем постреанимационном периоде окситоцина, МИФ, окситоцина с эстрадиолом, соматостатина приводит к улучшению состава нейрональных популяций, предупреждает выпадение нейронов даже в высокочувствительных к ишемии областях мозга, ускоряет темпы неврологического восстановления животных. При этом одним из механизмов действия указанных пептидов является влияние на глиальные элементы нервной ткани, что приводит к увеличению числа сателлитной глии.

11. В постреанимационном периоде после остановки сердца даже при отсутствии у животных внешних неврологических нарушении в мозге на уровне нейрональных популяций формируется сложный комплекс изменений, которые обуславливают уязвимость мозга и могут стать причиной формирования постгипоксических энцефалопатии. Наряду с этим обнаружены факторы, способствующие компенсации нарушений, вызванных тяжелой ишемией (усиление синтеза белка, наличие сателлитной глии и повышение ее числа, активация астроцитарной глии), и показаны некоторые пути воздействия на состояние нейрональных популяций и неврологическое восстановление оживленных животных (применение регуляторных пептидов и гормонов). Выявленные закономерности, динамика и механизмы изменений состояния гетерогенных нейрональных популяций могут стать основой для разработки целенаправленной патогенетически обусловленной терапии и профилактики постреанимационных энцефалопатии.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Морфофункционапьный анализ состояния нейронов в постреанимационном периоде после клинической смерти различной этиологии и длительности // Итоги и перспективы развития современной реаниматологии: Материалы Междунар. симпоз. - М. 1986. - С. 57.

2. Патологические и компенсаторные изменения нейронов в постреанимационном периоде. // Механизмы повреждения и восстановления целостного мозга: Тез. докл. - Иркутск, 1987. - С. 5-6.

3. Морфофункциональная оценка состояния мозга крыс с различной степенью восстановления неврологического статуса после остановки системного кровообращения // Бюл. эксперим. биологин и медицины. - 1988. - Т. 105, № 1. - С. 87-90. (Соавт. Маршак Т.Л., Мутуски-на Е.А.)

4. Изменение структурно-функционального состояния хроматина нейронов коры больших полушарий крыс после остановки системного кровообращения // Центральная нервная система и постреапимацион-пая патология организма: Материалы Мсждунар. симпоз. - М., 1989. -С. 24-25. (Соавт. Бульчук О.В., Григорьева A.B.)

5. Морфофункциональное состояние глии и гематоэнцефаличсского барьера у крыс после остановки системного кровообращения // Центральная нервная система и постреанимационная патология организма: Материалы Мсждунар. симпоз. - М.,1989. - С. 26. (Соавт. С.Краевский)

6. Структурно-функциональное состояние хроматина нейронов коры большого мозга после остановки кровообращения у крыс // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. - 1990. - Т. 98, № 1. - С. 42-48. (Соавт. Бульчук О.В., Григорьева A.B., Маршак Т.Л., Мутускина Е.А., Ярыгин В.Н.)

7. Neuroglia in focal and global cerebral ischemia // Neuropathol. Pol. -1990. - № 3-4. - P. 121-126. (Соавт. Kraewski S., Mossakowski M., Rafalowska J.)

8. Изменение структурно-функционального состояния хроматина нейронов коры больших полушарий крыс в раннем постреанимационном периоде // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 1990,- Т. 79,№ 4. - С. 402-405. (Соавт. Бульчук О. В., Григорьева А. В., Ярыгин В. Н.)

9. Высшая нервная деятельность крыс в постреанимационном периоде и состояние белоксинтезирующей системы нейронов коры мозга // Экспериментальная и клиническая патофизиология экстремальных и терминальных состояний. - Новокузнецк, 1990. - С. 33-36. (Соавт. Мутускина Е.А).

10. Влияние некоторых регуля горных пептидов на восстановление после клинической смерти П Экспериментальная и клиническая патофизиология экстремальных и терминальных состояний. - Новокузнецк,

1990. - С. 13-16. (Соавт. Волков A.B., Болякина Г.К.)

11. Динамика изменения транскрипционной активности хроматина ядер нейронов коры мозга в постреанимационном периоде после остановки системного кровообращения // Материалы Междунар. симпоз. по проблемам реанимации, интенсивной терапии и медицины катастроф. - Тбилиси, 1990. - С. 9-12. (Соавт. Мутускина Е.А).

il. Изменение структурно-функционального состояния хроматина нейронов коры больших полушарий крыс после остановки системного кровообращения // Центральная нервная система и постреанимационная патология организма: Тр. Междунар. симпоз. - М, 1991 - С. 70-79. (Соавт. Бульчук О.В., Григорьева A.B.)

13. Some mechanisms of postresuscitation derangements in the central nervous system functions // Proc. Internat. Soc. for Pathophysiology - M.,

1991. - P. 336. (Соавт. Volkov A.V., Mutuskina E.A., Pylova S.I., Voronina T.A., Garibova T.L., Molchanova L.V.)

14. Динамика транскрипционной активности хроматина клеток Пуркинье мозжечка после остановки системного кровообращения // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 1991. - Т. 111, № 3. - С. 232-235. ( Соавт. Бульчук О.В., Григорьева A.B., Маршак Т.Л., Ярыгин В.Н.)

15. Возможность цитофотометрии ядрышковых белков. Перспективы исследования ядрышкового аппарата // Цитология, - 1991. - Т. 33, № 8. - С. 65-74. (Соавт. Бродский В.Я., Маршак T.J1., Дунгенова P.E.)

16. Сравнение характера Ag-окраски ядрышковых белков с непосредственно определенной интенсивностью транскрипции // Цитология. - 1991. - Т. 33, № 9. - С. 86. ( Соавт. Маршак Т.Н., Седкова H.A., Дунгенова P.E., Бродский В.Я)

17. Динамика транскрипционной активности хроматина нейронов в постреанимационном периоде после остановки системного кровообращения // Терминальные состояния и постреанимационная патология организма: патофизиология, клиника, профилактика и лечение: Сб. тр. -М., 1992,- С. 49-59.

18. Взаимосвязь восстановления неврологического статуса и интенсивности синтеза белка в ткани мозга крыс в постреанимационном периоде // Клинические аспекты постгипоксических энцефалопатий. Материалы конф., 14-17 дек. 1992 г., Москва. - М., 1992. - С. 8-10

19. Изменение состояния глии в различных отделах мозга крыс после остановки системного кровообращения // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 1992. - Т.114, № 8. - С. 176-179. (Соавт. Соломатина Т.М., Гурвич А.М., Викторов И.В.)

20. Интенсивность синтеза белка в различных областях мозга крыс, перенесших остановку системного кровообращения // Анестезиология и реаниматология. - 1993. - № 2. - С. 43-46. (Соавт. Маршак Т.Л., Фатеева В.И., Дунгенова P.E., Волков A.B., Бродский В.Я.)

21. Изменения мозга на уровне нейронной популяции в постреанимационном периоде после остановки системного кровообращения // Актуальные проблемы и перспективы развития современной реаниматологии: Материалы Междунар. симпоз. - М., 1994. - С. 5-7.

22. Морфометрическая оценка состояния мозга на уровне нейро-нальной популяции после остановки системного кровообращения разной длительности // Материалы Пленума пробл. комиссий Экстремальные и терминальные состояния" - Кемерово, 1994. - С. 3-5. ( Соавт. Волков A.B., Король Г.В.)

23. Изменение гетерогенных нейронных популяций в постреанимационном периоде после остановки сердца у крыс // Анестезиология и реаниматология. - 1994. -№5. - С. 41-44

24. Особенности терапии короткой и длительной остановки сердца у крыс регуляторными пептидами // Материалы Пленума пробл. комис. "Экстремальные и терминальные состояния" - Кемерово, 1994. - С. 2022. (Соавт. Волков A.B., Муравьев О.Б., Мишарина Г.В., Трубина И.Е., Заржецкий Ю.В., Васильева Т.Н.)

25. Изучение эффектов ряда регуляторных пептидов при реанимации и в эксперименте // Актуальные проблемы и перспективы развития современной реаниматологии: Материалы Междунар. симпоз. - М., 1994. - С. 16-17. ( Соавт. Волков A.B., Мишарина Г.В., Муравьев О.Б., Пылова С.И.,Трубина И.Е., Заржецкий Ю.В. )

26. Особенности адаптивного поведения, неврологическое восстановление и морфологический анализ коры мозга крыс в постреанимационном периоде // Анестезиология и реаниматология. - 1994. - № 2. - С. 56-59. (Соавт. Заржецкий Ю.В., Мутускина Е.А., Волков A.B., Гурвич A.M.)

27. Влияние натрия сукцината на функциональные и морфологические показатели восстановления ЦНС у крыс после 10-минутной остановки кровообращения // Актуальные проблемы и перспективы развития современной реаниматологии: Материалы Междунар. симпоз., Москва. - М., 1994. - С. 23-24. ( Соавт. Заржецкий Ю.В., Мутускина Е.А., Трубина И.Е.)