Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Изучение биологических свойств новых аналогов димефосфона

На правах рукописи

КАШАПОВ ЛЕНАР РАМИЛОВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ НОВЫХ АНАЛОГОВ ДИМЕФОСФОНА

14.03.06 — фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

5 ФсЗ 2015

Казань-2015 005558460

005558460

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Гараев Рамил Суфиахметович Официальные оппоненты:

Аляутдин Ренад Николаевич доктор медицинских наук, профессор, заместитель директора Центра экспертизы безопасности лекарственных средств Федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Шнловская Елена Владимировна кандидат биологических наук, доцент кафедры фармакологии фармацевтического факультета с курсом фармакогнозии и ботаники Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии им. В.В. Закусова»

Защита состоится 13 марта 2015 года в 930 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.034.03 на базе Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (420012, г. Казань, ул. Бутлерова, 49).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГБОУ ВПО Казанский ГМУ Минздрава России по адресу 420012, г. Казань, ул. Бутлерова, 49, www.kgmu.kcn.ru

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук, доцент

Хасанова Гульшат Рашатовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Изыскание новых лекарственных средств среди фосфорорганических соединений (ФОС) является одним из направлений научных исследований казанских ученых. Первые лекарственные препараты, созданные на основе ФОС в пятидесятые и шестидесятые годы прошлого столетия и внедренные в медицинскую практику армин (Алуф М.А., 1995) и нибуфин (Заиконникова И.В., 1962), были антихолинэстеразными средствами. Дальнейшие исследования показали, что ФОС проявляют широкий спектр биологической активности: противомикробную, включая и противотуберкулезную, противовирусную (Заиконникова И.В., Афонская JI.C., 1969; Ржевская Г.Ф., Берим М.Г., 1969), ангибластомную (Студенцова И.А., Ашаева JI.A., Зеленкова Н.П., 1996; Мокринская И.С., Хафизьянова Р.Х., и др., 1996; Гараев P.C., Залялютдинова Л.Н., Гильмутдинова В.Р., 2008), спазмолитическую (Березовская И.В. и др., 1969), психотропную (Ржевская Г.Ф., Семина И.И. и др., 1996; Хафизьянова Р.Х. и др., 1996), защитную при отравлении антихолинэстеразными средствами (Березовская И.В. и др., 1964; Гараев P.C., Студенцова И.А., 1968). Эти исследования проводились под общим руководством профессора И.В. Заиконниковой, итогом которых стало внедрение в медицинскую практику ряда оригинальных лекарственных средств: антибластомного (глицифон), антиалкагольного (фосфабензид), антиацидотического, церебропротекторного, нормализующего мозговое кровообращение, противовоспалительного (димефосфон).

Особенно широкое применение в клинической практике нашел препарат димефосфон, разрешенный в 1983 году в качестве антиацидотического средства. Препарат показан к применению при таких заболеваниях, как острые и хронические нарушения мозгового кровообращения, остеохондроз, рассеянный склероз, вегето-сосудистая дистония по парасимпатическому типу, мигрень, болезнь Меньера, заболевания органов дыхания, ацидозы и др. Накоплен более чем тридцатилетний опыт применения димефосфона в клинике. В течение этого длительного срока наблюдения не зарегистрировано каких-либо серьезных побочных эффектов препарата (Визель А.О., Гараев P.C., 2012). Разнообразие фармакологических эффектов и безопасность применения димефосфона привлекают внимание химиков в аспекте перспективности синтеза новых аналогов путем модификации его структуры, что предполагает создание оригинальных лекарственных веществ с заданными фармакологическими свойствами. Изучение их биологической активности и проведение анализа зависимости фармакологического действия от химической структуры является актуальной задачей.

Цель исследования — изучение токсичности и фармакологических свойств целенаправленно синтезированных аналогов димефосфона в опытах на животных и анализ зависимости «структура-действие».

В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Изучить роль эфирных радикалов у атома фосфора в молекуле аналогов димефосфона, синтезированных путем замены Р-0-СН3 фрагмента на Р-СНз группу (соединение 2а) и Р-(0-СНзЪ фрагмента на Р-(СН3)2 группу (соединение 4d и его гомологи — 4а, 4Ь и 4с), в проявлении токсических и фармакологических свойств.

2. Оценить влияние замены кетонного С=0 кислорода в 3-ем положении молекулы димефосфона на оксимную C=N-0-H группу (соединение За и его гомологи -ЗЬ и Зс) на проявление токсических и фармакологических свойств.

3. Определить токсичность и изучить фармакологические свойства аналогов димефосфона, содержащих в 3-ем положении молекулы вместо кетонной группы изоникотиноилгидразидный (соединение 8а) или никотиноилгвдразидный (соединение 8Ь) фрагменты.

4. Провести анализ взаимоотношения димефосфона и противотуберкулезного препарата изониазида, являющихся фрагментами молекулы соединения 8а.

Научная новизна работы. На основании изучения токсичности и фармакологических свойств различных аналогов димефосфона (прототипа), а также анализа зависимости «структура-действие» впервые доказано, что при замене в молекуле димефосфона одной из двух метоксильных групп у атома фосфора на метальную токсичность соединения (2а) для мышей уменьшается в 2 раза по сравнению с прототипом, ослабляется угнетающее влияние на ЦНС (отсутствие «бокового положения» у мышей при введении максимально переносимой дозы соединения, снижение противосудорожной активности при отравлении мышей коразолом), но сохраняются такие фармакологические свойства, как защитное действие при отравлении мышей антихолинэстеразным средством фосфаколом и противовоспалительная активность. Показано, что аналог, полученный путем замены двух метоксильных групп у атома фосфора на две метальные (соединение 4d), по токсичности относится к 6 классу («относительно безвредные вещества») по классификации К.К. Сидорова и практически теряет фармакологические свойства, характерные для прототипа.

Выявлено, что кристаллический аналог димефосфона (соединение За), синтезированный путем замены кетонного кислорода в 3-ем положении молекулы димефосфона на оксимную группу, имеет более высокую токсичность для мышей (по ЛД50 в 1,56 раз), чем димефосфон, но сохраняет основные фармакологические свойства прототипа. Доказано, что изоникотиноил- (соединение 8а) и никотиноил- (соединение 8Ь) гидразоны димефосфона - стойкие при хранении кристаллические вещества, менее токсичны для мышей и крыс, чем изониазид (по ЛД50 в 13,4 и 12 раз соответственно), не вызывают симптомы возбуждения ЦНС подобно изониазиду (судороги в токсических дозах), обладают противотуберкулезной (in vitro) и противовоспалительной активностью.

Установлено, что димефосфон при совместном применении с изониазидом предупреждает нейротоксический эффект последнего, подавляя судороги и снижая его токсичность по ЛД50 в 1,57 раз. Одним из компонентов механизма этого действия является способность димефосфона вступать в химическую

реакцию с изониазидом в организме животных (крыс) с образованием соединения 8а, что подтверждено исследованиями с использованием метода высокоэффективной жидкостной храматографии (ВЭЖХ). Разработан ВЭЖХ метод определения соединения 8а в водных и буферных растворах, а также биологических средах, позволяющий использовать его в фармакокинетических исследованиях. С использованием этого метода доказана стойкость вещества 8а при хранении в кристаллическом состоянии и в буферных растворах при рН 7,5 и 8,0 и его нестойкость в водном растворе и в буферном растворе с рН 1,5.

Научная новизна подтверждена двумя патентами РФ на изобретение (№ 2457212 от 27.07.2012 г. и № 2471787 от 10.01.2013 г.)

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты анализа зависимости «структура-действие» могут быть использованы для синтеза новых безопасных и высокоэффективных фармакологически активных аналогов димефосфона.

Обоснована целесообразность дальнейшего доклинического изучения соединения 2а как средства, потенцирующего действие основных антидотов, применяемых при отравлении антихолинэстеразными средствами, - м-холино-блокатора атропина и реактиватора холинэстеразы дипироксима; соединения За, представляющего интерес для разработки твердых лекарственных форм со свойствами прототипа; соединений 8а и 8Ь, перспективных для разработки на их основе менее токсичных и более безопасных, чем изониазид, противотуберкулезных средств.

Разработанный метод ВЭЖХ определения содержания вещества 8а в биологических средах может быть использован в дальнейшем в углубленных фармакокинетических исследованиях. Обоснована целесообразность дальнейшего изучения возможности совместного применения димефосфона с изониазидом для лечения туберкулеза с целью уменьшения токсичности последнего.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. При замене в молекуле димефосфона одной из двух метоксильных групп у атома фосфора на метальную (соединение 2а) токсичность снижается, а основные фармакологические свойства, такие как защитное действие при отравлении мышей антихолинэстеразным средством фосфаколом, потенцирующее влияние на антидотные эффекты м-холиноблокатора атропина и реактиватора холинэстеразы дипироксима, противовоспалительная активность на модели каррагенинового отека лапки у крыс сохраняются.

2. Кристаллический аналог димефосфона (соединение За), синтезированный путем замены кетонного кислорода в 3-ем положении молекулы димефосфона на оксимную группу (C=N-OH), сохраняет основные фармакологические свойства прототипа.

3. Изоникотиноил- и никотиноилгидразоновые производные димефосфона (соединения 8а и 8Ь) менее токсичны для мышей и крыс, чем изониазид, проявляют противотуберкулезную активность in vitro и противовоспалительные свойства на моделях острого экссудативного и хронического аутоиммунного воспаления. При совместном применении димефосфона с изониазидом в организме животных происходит химическое

взаимодействие между ними с образованием соединения 8а, что является одним из механизмов снижения токсичности изониазида.

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность полученных данных подкреплена проведением достаточного объема исследований с использованием оптимального числа животных и применением адекватных методик оценки эффективности и методов статистической обработки. Материалы диссертации доложены и обсуждены на 79, 80, 81, 83-й Всероссийских студенческих научных конференциях (г. Казань, 2005, 2006, 2007 2009 гг.), научно-практической конференции студентов и аспирантов «Актуальные проблемы городского хозяйства и социальной сферы города» (г. Казань, 2006 г.), II Российской научно-практической конференции «Здоровье человека в XXI веке» (г. Казань, 2010 г.), 86, 87, 88-й Всероссийских научно-практической конференциях «Молодые ученые в медицине» (г. Казань, 2012 2013, 2014 гг.), IV съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (г. Казань, 2012 г.), VI Российской научно-практической конференции, посвященной 200-леппо Казанского государственного медицинского университета «Здоровье человека в XXI веке» (г. Казань, 2014 г.)

Публикации материалов исследования. По теме диссертации опубликовано 19 работ, в том числе 2 в научных рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, получено 2 патента РФ на изобретение.

Личное участие диссертанта в получении научных результатов. Приведенные в работе данные получены лично автором или при личном участии автора во всех этапах работы: определение цели и задач, построение плана работы, выбор методов, организация и воспроизведение экспериментов, статистическая обработка полученных данных, написание публикаций по теме исследования. Выводы и положения, выносимые на защиту, сформулированы лично автором.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (1 глава), описания объектов и методов исследования (2 глава), изложения результатов собственных исследований (3, 4 главы), обсуждения результатов (5 глава) и выводов. Работа иллюстрирована 18 таблицами и 15 рисунками. Список использованных источников и литературы включает 186 источников, в том числе 148 отечественных и 38 иностранных авторов.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования явились синтезированные в ФГБУ «Институт органической и физической химии им. академика А.Е. Арбузова» КНЦ РАН аналоги димефосфона (таблица 1).

Таблица 1 - Аналоги димефосфона

О СН, Чс-сн.

II / 5

О-Р—с—сн,

/ II I

К2 о сн,

№ я2 Яз Лаб. шифр Агрегатное состояние Синтез осуществил

1 СН3 О-СНз О 2а (Мешм-ефин) Жидкость, хорошо растворимая в воде Вед. научи, сотр., кхн. ВшельА.О.

2 О-СНз О-СНз За (Мешм) Кристаллы, хорошо растворимые в воде

3 О-С2Н5 ОСоН5 ЗЬ Жидкость, трудно растворимая в воде*

4 О-С3Н7 0-СЗН7 //°"Н -N Зс Жвдахль, трудно растворимая в воде*

5 СНз СНз О 4й Жидоэсгь, хорошо растворимая в воде Проф^члеаь корр. РАН, дхя. Миронов В.Ф.

6 С2Н5 Сй О 4а Жидкость, хорошо растворимая в воде

7 СзН; С3Н7 о 4Ь Жидкость, хорошо растворимая в воде

8 С4Н9 С4Н9 о 4с Жидкость, хорошо растворимая в воде

9 О-СНэ О-СНз о II 11 1 1 8а (ВК-500) Кристаллы, хорошо растворимые в воде Проф,дхл. БузыкинБЛ

10 (КН, О-СНз й II н о 8Ь (ВК-502) Кристаллы, хорошо растворимые в воде

♦При хранении в условиях низких температур выпадает в кристаллы

Эксперименты по оценке токсических и фармакологических свойств изучаемых препаратов проводились на 870 белых беспородных мышах и 398 белых беспородных крысах. Проведено 380 биохимических анализов и 300 исследований общего анализа крови крыс. Животные содержались в условиях, соответствующих Приказу Минздравсоцразвития РФ от 23.08.2010 N 708н "Об утверждении Правил лабораторной практики".

1. Острую токсичность препаратов определяли методом Беренса (Беленький М.Л., 1963) при внутрибрюшинном и пероральном способе введения на 126 белых беспородных крысах и 330 белых мышах.

2. Влияние курсового введения на общее состояние и функции печени крыс на моделях изониазидного и изониазид-рифампицинового гепатита (М. Chitra, N. Muthusudha, R. Sasikala, 2003; Sude Eminzade, Fikriye Uras, Fikret V. Izzettin, 2008) изучали на 60 белых беспородных крысах. Показатели общего анализа крови оценивали на медицинском гематологическом анализаторе COULTER® Ас-Т di Ж™ (Beckman Coulter®), биохимические показатели - на полуавтоматическом биохимическом анализаторе Erba® Chem 7 (Erba Mannheim ). Внутренние органы животных (печень, почки, селезенка, надпочечники) тщательно выделялись после забоя и определяли их относительную массу (отношение массы органа в мг к массе тела в г).

3. Антидотное действие изучали на 374 белых мышах при отравлении их смертельной дозой фосфакола (подкожно) через 15 минут после профилактического введения изучаемого соединения (внутрибрюшинно).

4. Противосудорожное действие изучали на моделях коразоловых, никотиновых, стрихниновых судорог на 144 белых беспородных мышах. Изучаемые соединения вводили внутрибрюшинным способом за 15 мин до отравления судорожными агентами (коразол, никотин, стрихнин) в абсолютно-смертельной дозе (ЛД100).

5. Противовоспалительное действие изучали на моделях каррагенинового отека лап у крыс (Winter С. et al., 1962) и адъювантного артрита у крыс (Newbold В.В., 1963) на 174 белых беспородных крысах-самцах и 32 белых крысах-самках линии Wistar соответственно.

6. Для оценки бактериостатической активности в отношении микобактерий туберкулеза (штамм H37Rv) использовали стандартную ростовую систему ВАСТЕС MGIT 960 (Becton Dickinson®). Использовали питательную среду Мшщбрук 7 Н9 с обогатительной добавкой ВАСТЕС MGIT. Исследования проводили совместно с к.м.н., доцентом Честновой Р.В. на базе ГАУЗ «Республиканский клинический противотуберкулезный диспансер» (гл. врач Р.Ш. Валиев).

7. Антимикробную активность оценивали in vitro с использованием бактерий Е. coli, Ps. aeruginosa, St. aureus, S. paratyphi В и гриба С. albicans совместно с профессором, д.м.н. Поздеевым O.K., доцентом, к.б.н. Шулаевой М.П. на базе ГБОУ ДПО КГМА Минздрава России. Растворы испытуемых веществ готовили в дистиллированной воде и разливали в пробирки по 1 мл. Взвесь суточной культуры бактерий добавляли по 1 мл в пробирки с растворами препаратов. Конечные разведения изучаемых веществ были 1:50, 1:100, 1:1000 и 1:10000. Через 2, 24 и 48 часов с помощью платиновой петли делали высевы в пробирки, содержащие по 5 мл необходимой для выращивания данных бактерий среды. Пробирки термостатировали при 37°С и проводили наблюдение в течение 7 суток. Контролем служили посевы микробных культур, контактировавшие с аналогичным объемом дистиллированной воды. Индикатором антимикробной активности служило отсутствие роста в пробирке.

8. Стойкость при хранении водных растворов соединения 8а и фармакокинетику вещества 8а и изониазида исследовали методом ВЭЖХ на приборе LC-20 Prominence (Shimadzu®) совместно с д.б.н., профессором Валеевой

И.Х. и аспирантом Ситенковым А.Ю. в Центральной научно-исследовательской лаборатории ГБОУ ВПО Казанский ГМУ Минздрава России (Зав. ЦНИЛ д.м.н., профессор Семина И.И.).

Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием компьютерных программ Statistica 6.0, Mircosoft Excel, Grafula 3 с вычислением средней арифметической, ошибки средней, t-критерия Стьюдента, критерия Фишера, U-критерия Манна-Уитни. Критерием достоверности различий явилось значение р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Биологическая активность аналога димефосфона, содержащего вместо одной из двух метоксильных групп у атома фосфора метальный радикал

(соединение 2а)

Исследования острой токсичности показали, что модификация химической структуры димефосфона путем замены одной из двух метоксильных групп у атома фосфора на метальный радикал снижает токсичность соединения (по ЛД50) в 2 раза. Так, средне-смертельная доза (ЛД50) соединения 2а для мышей составила 4800±157 мг/кг (ЛД50 димефосфона - 2500±150 мг/кг). Параметры токсичности вещества приведены в таблице 2. По характеру токсического действия вещество 2а напоминает клинику интоксикации димефосфоном, но обладает меньшим угнетающим действием на ЦНС. Так, в максимально-переносимой дозе (2000 мг/кг) димефосфон вызывает состояние «бокового положения», а препарат 2а в эквитоксичной дозе (4000 мг/кг) не оказывал такого эффекта.

Таблица 2 - Параметры острой токсичности аналогов димефосфона

№ Лаб. шифр Вид животного Способ введения Дозы, мг/кг

МПД ДД50 ДЦ100

1 2а мыши в/б 4000 4800±157 6000

крысы в/б 4000 5065±162 6000

За мыши в/б 1200 1628±65 2000

2 крысы в/б 1200 1600±69 2000

3 ЗЬ мыши в/б 600 785±32 1000

4 Зс мыши в/б 150 26Ш:17 400

5 4d мыши в/б - >8000 -

6 4а мыши в/б 2000 2514±82 3000

7 4Ъ мыши в/б 500 661,1±31,7 900

8 4с мыши в/б 125 166,9±7,1 225

мыши в/б 1600 2005±60 2400

9 8а мыши п/о 800 1536,7±129,2 2400

крысы в/б 1700 2064±64 2500

10 8Ь мыши в/б 1600 1788±32 2000

крысы в/б 2000 2326,3±48,3 2600

Известно, что димефосфон обладает антидотным действием при отравлении антихолинэстеразными средствами (Студенцова И.А., Гараев P.C., 1968; Гараев P.C., 1970). Результаты исследования антидотных свойств соединения 2а показали, что препарат, как и димефосфон, обладает защитным действием при отравлении антихолинэстеразным средством фосфаколом. По результатам наших ранних исследований ЭД50 (средне-эффективная доза, способствующая выживанию 50% животных) димефосфона при отравлении мышей фосфаколом равна 750±75 мг/кг. Для исследуемого аналога эта величина составляет 787±43,7 мг/кг. Различия между результатами статистически не достоверны.

Оценка эффективности комбинированного применения соединения 2а с холиноблокатором атропином и реактиватором холинэстеразы дипироксимом при отравлении мышей антихолинэстеразным средством фосфаколом показала, что способность вещества 2а потенцировать эффекты известных антидотов выражены практически в равной степени с таковыми димефосфона (таблицы 3 и 4). Однако, препарат 2а в 2 раза менее токсичен, чем димефосфон, и обладает меньшим угнетающим действием на ЦНС, поэтому, возможно, он окажется и более перспективным средством для создания на его основе лекарственного препарата, проявляющего антидотные свойства при отравлении ФОС.

Таблица 3 - Эффективность антидотного действия соединения 2а, атропина,

№ Серия эксперимента ДЦ50 фосфакола, мг/кг Снижение токсичности фосфакола на фоне действия антидотов, ТИ (терапевтический индекс)

1 Контроль (без антидота) 0,8±0,03 _

2 2а, 500 мг/кг 0,8±0,03

3 Атропин, 2,5 мг/кг 1,06± 0,07* 1,3

4 Атропин , 2,5 мг/кг + 2а, 500 мг/кг 2,0±0,2* ** 2,5

5 Дипироксим, 2,5 мг/кг 1,57±0,07* 1,96

6 Дипироксим, 2,5 мг/кг + 2а, 500 мг/кг 2,66±0,18* *** 3,3

7 Атропин, 2,5 мг/кг + Дипироксим, 2,5 мг/кг 20,8±1,87* 26,0

8 Атропин, 2,5 мг/кг + Дипироксим, 2,5 мг/кг + 2а, 500 мг/кг 33,6±2,5* **** 42,0

* - р<0,05 по сравнению с контрольной группой

** - р<0,05 по сравнению с группой «атропин, 2,5 мг/кг»

*** - р<0,05 по сравнению с группой «дипироксим, 2,5 мг/кг»

**** - р<0,05 по сравнению с группой «атропин, 2,5 мг/кг + дипироксим, 2,5

мг/кг»

Таблица 4 — Эффективность антидотного действия димефосфона, атропина, дипироксима и их комбинации при отравлении мышей фосфаколом по данным _Гараева Р.С. (1990 г.) _

№ Серия эксперимента ДД50 фосфакола, мг/кг Снижение токсичности фосфакола на фоне действия антидотов, ТИ (терапевтический индекс)

1 Димефосфон, 500 мг/кг 0,8±0,03 -

2 Атропин, 2,5 мг/кг + Димефосфон, 500 мг/кг 1,26±0,06* 1,6

3 Дипироксим, 2,5 мг/кг + Димефосфон, 500 мг/кг 3,6±0,4* 4,9

4 Атропин, 2,5 мг/кг + Дипироксим, 2,5 мг/кг + Димефосфон, 500 мг/кг 29,0±3,2* 39,7

ТИ — отношение ЛД50 в опыте к ЛД50 в контроле * - Эффект влияния димефосфона достоверен

Одним из возможных механизмов антидотного действия димефосфона, наряду с его способностью повышать активность ингибированной холинэстеразы, считается его противосудорожная активность (Гараев P.C., 1994). Соединение 2а проявило слабую противосудорожную активность в отношении коразоловых судорог, лишь удлиняя латентный период и продолжительность жизни. На летальность животных изучаемый аналог не влиял, т.е. по противосудорожной активности вещество 2а сильно уступает димефосфону. Так, димефосфон в дозе 1000 мг/кг защищает всех мышей, отравленных смертельной дозой коразола (Студенцова И.А, Гараев P.C., 1969), а соединение 2а в эквитоксической дозе -только одно животное из шести. Ни в одной из изучаемых доз (100 и 1000 мг/кг) соединение 2а не проявило противосудорожную активность в отношении стрихниновых судорог. Так как антидотные свойства димефосфона и соединения 2а в отношении антихолинэстеразных ФОС сопоставимы, а вещество 2а уступает по противосудорожной активности, вклад противосудорожного компонента в механизмы защитного действия этих соединений при отравлении фосфаколом, по-видимому, не велик.

Одним из ценных свойств димефосфона является его противовоспалительная активность. Сравнительная оценка флоготропной активности соединения 2а и димефосфона в эквимолярных дозах на модели каррагенинового отека лап у крыс показала, что изучаемое соединение не уступает по противовоспалительной активности прототипу (уменьшение отека на 31,9 и 34,4% соответственно, разница статистически не достоверна), но имеет преимущество перед ним как вещество менее токсичное.

Биологическая активность аналогов димефосфона, лишенных эфирных связей у атома фосфора

Изучение аналогов димефосфона, где обе алкоксильные группы заменены на алкильные {4а, 4Ь, 4с, 4(1, таблица 1) показало, что наименее токсичным из них является соединение 4(1, которое оказалось «относительно безвредным веществом» по классификации Сидорова К.К. (1973 г.). Так, введение его мышам даже в дозе 8000 мг/кг не приводило к гибели животных. Дальнейшее повышение дозы было невозможным из-за ограничения максимально допустимого объема вводимого раствора изучаемого вещества. Удлинение радикалов в гомологичном ряду диалкилфосфиноксидов приводит к повышению их токсичности. Так, ЛД50 соединения 4а - 2514±82,1 мг/кг, 4Ъ - 661,1±31,7 мг/кг, 4с - 166,9±7,1 мг/кг (таблица 2). При введении диалкилфосфиноксидов в токе и ко-л стальных дозах через 2 мин наблюдается двигательное беспокойство, затем животное теряет способность передвигаться, возникает тремор конечностей. При переворачивании на бок - животное в исходную позицию не возвращается. Гибель их наступает от остановки дыхания.

Соединение 4(1 в дозе 850 мг/кг при внутрибрюшинном способе введения оказывает слабое антидотное действие при отравлении мышей ЛД100 фосфакола, достоверно удлиняя продолжительность жизни (26,6±6,62 мин), в контроле -14,5±2,17 мин, и не влияет на летальность отравленных животных. В указанной дозе оно не проявило противосудорожную активность при отравлении мышей ЛД,оо коразола (погибло 6 животных из 6, как и в контрольной группе).

Таким образом, замена обеих Р-0-СН3 групп на Р-СН3 фрагменты ведет к еще большему снижению токсичности и, одновременно, исчезновению основных фармакологических свойств прототипа. Для сохранения антидотного эффекта при отравлении антихолинэстеразными средствами и стимуляторами ЦНС, по-видимому, необходимо наличие хотя бы одной алкоксильной группы у атома фосфора в структуре аналогов димефосфона.

Биологическая активность аналогов Димефосфона, содержащих в 3-ем положении оксимную группу

Изучение острой токсичности аналогов-оксимов показало, что клиника отравления ими напоминает токсическое действие димефосфона: после 3-5 минутного двигательного возбуждения и атаксии животные переходят в состояние «бокового положения», на фоне которого у крыс возникают периодические вздрагивания, которые более интенсивны при стуке по клетке или при резком касании тела животного. Возможно, механизмы токсического действия новых соединений и димефосфона идентичны. Однако, оксимные аналоги более токсичны, чем прототип: ЛД^ препарата За для мышей составила 1600±74 мг/кг, ЗЪ - 785±31,8 мг/кг, а Зс - 260±16,6 мг/кг (таблица 2). Таким образом, введение оксимного фрагмента в 3-ем положении молекулы димефосфона вместо кетонного кислорода ведет к росту токсичности для мышей (по ДЦ50 в 1,56 раз), а удлинение эфирного радикала у атома фосфора в гомологичном ряду вызывает рост их токсичности. Агрегатное состояние

аналогов-оксимов также зависит от длины эфирных радикалов у атома фосфора (таблица 1).

Результаты исследований антидотного действия оксимных аналогов показали, что они проявляют антагонизм при отравлении фосфаколом, правда с удлинением алкоксильных радикалов у атома фосфора {ЗЬ, Зс) антидотное действие ослабевает (таблица 5) что согласуется с данными Гараева P.C. о том, что по антидотному эффекту при отравлении мышей фосфаколом наиболее активны эфиры 1,1-диметил-З-кетобутилфосфиновой кислоты с короткой углеродной цепью (Гараев P.C., 1969).

Таблица 5 - Антидотное действие азотсодержащих аналогов димефосфона За, ЗЬ и _Зс на мышей, отравленных ЛДюо фосфакола_

Серия эксперимента 1/2 МПД, мг/кг Число погибших/ выживших животных Антидотный эффект, % выживших

Контроль (диет, вода) - 10/0 0

Соединение За 600 2/8* 80

Соединение ЗЬ 300 4/6* 60

Соединение Зс 75 8/2 20

* - р<0,05 по сравнению с контрольной группой

Антидотный эффект препарата За сопоставим с таковым димефосфона, хотя мы ожидали, что введение оксимного фрагмента в структуру димефосфона усилит его антидотное действие, поскольку оксимы, как известно, являются реактиваторами холинэстеразы (Голиков С.Н., 1970). Полученные данные можно объяснить тем, что в кристаллической форме молекулы За образуют циклические димеры типа "голова к хвосту" за счет Н-связей 04-Н...01, что может нарушить комплементарность между соединением и фосфорилированным активным центром ацетилхолинэстеразы (Гараев Р.С и др., 2005).

В опытах на мышах соединение За, как и димефосфон, оказывало противосудорожное действие, проявляя антагонизм в дозе 700 мг/кг (1/2 МГЩ) в отношении коразоловых, а в дозе 50 мг/кг (1/24 МПД) — в отношении никотиновых судорог, и увеличивая продолжительность жизни и предупреждая гибель части отравленных животных.

Изучение противовоспалительной активности на модели каррагенинового отека лапы у крыс показало, что соединение За обладает антифлогогенным действием и достоверно не отличается по силе этого действия от димефосфона (таблица 6).

Таким образом, на примере соединения За показано, что кристаллические аналоги димефосфона могут сохранять его ценные фармакологические свойства.

Таблица 6 -Противовоспалительная активность соединения За и димефосфона в эквимолярных дозах на модели «каррагенинового отека» лапки у крыс

Серия опыта Разница между объемом воспаленной и здоровой лапы крыс, мл Снижение отека, %

Контроль (модель «каррагенинового отека») 0,700±0,041 -

Димефосфон, 200 мг/кг 0,439±0,038* 37,3

Соединение За, 223 мг/кг 0,491+0,021* 29,4

* - р<0,05 по сравнению с контрольной группой

Биологическая активность аналогов димефосфона, содержащих в 3-ем положении изоникотиноилгидразианый и никотиноилгидразидный

фрагменты

Определение острой токсичности соединений 8а и 8Ь показало, что гидразоны димефосфона малотоксичные вещества. Так, ЛД50 соединения 8а для мышей при в/б введении составила 2005±59,6 мг/кг, (соединение по ДЦ50 в 13,4 раза менее токсично, чем изониазид), при пероральном - 1536,7±129,2 мг/кг (таблица 2). Средне-смертельная доза соединения 8Ь для мышей при в/б способе введения составила 1788±32,3 мг/кг (соединение по ЛД50В 12 раз менее токсично, чем изониазид). Клиника интоксикации животных на фоне действия этих соединений характеризуется тем, что через 2-3 минуты после введения токсико-летальных доз у животных наблюдается угнетение дыхания (дыхательные движения совершаются с трудом, выслушивается «скрипящее дыхание»), через 45 минут — снижается мышечный тонус, что сопровождается резким угнетением двигательной активности и миорелаксацией. Перехода в боковое положение нет. Животные погибают от асфиксии в течение 60-90 минут. Таким образом, особенностью клиники интоксикации является отсутствие возбуждающего действия на ЦНС, характерного для изониазид а, вызывающего клонико-тонические судороги.

Результаты исследований противотуберкулезного действия in vitro показали, что минимальная ингибирующая концентрация (МИК) соединения 8а равна 10,0 и 8Ь — 1,0 мкг/мл. По активности они уступали шониазиду (МИК 0,5 мкг/мл), однако при этом они имеют преимущество как малотоксичные соединения. Интересно отметить, что никотиноилгидразон димефосфона (соединение 8Ь) в 10 раз превосходит по антимикобактериальной активности изоникотиноилгидразон димефосфона (соединение 8а) и только в два раза уступает изониазиду.

Сочетание противовоспалительной и контактной антимикробной активности у димефосфона стало основанием для внедрения препарата в клиническую практику для местного лечения гнойно-воспалительных заболеваний кожи, слизистых оболочек и инфицированных ран (Зиганшина Л.Е., Студенцова И.А. и др., 1992). Исследования противомикробной активности аналогов 8а и 8Ь, изониазида и димефосфона in vitro в отношении Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus и гриба Candida albicans

показали, что все изучаемые соединения проявляют сравнимую с изониазидом контактную противомикробную активность, уступая ему лишь в отношении С. albicans. Обнаруженная нами антимикотическая активность изониазида согласуется с литературными данными о противогрибковой активности некоторых производных изониазида в отношении грибка Histoplasma capsulatum (Rossana de Aguiar Cordeiro, Francisca Jakelyne de Farias Marques et al., 2014). Полученные данные открывают перспективы использования в клинической практике гидразонов димефосфона для санации кавернозных полостей с целью получения антимикобактериального действия и, одновременно, ликвидации сопутствующей банальной инфекции.

Туберкулез является инфекционным заболеванием, в патогенезе которого немаловажную роль играет воспаление, и сочетание противотуберкулезной активности с противовоспалительным действием у соединений 8а и 8Ь стало бы неоспоримым преимуществом для перспективных противотуберкулезных средств. Сопоставление противовоспалительной активности димефосфона, соединений 8а, 8Ь и изониазида в 1/2 от МПД показали, что эффективность этих веществ в отношении каррагенинового отека различается: так, димефосфон в дозе 1000 мг/кг угнетал развитие отека на 33,1%, 8а (800 мг/кг) - на 64,3%, 8Ь (800 мг/кг) -на 33,7% (р<0,05), а изониазид не проявил противовоспалительной активности. Уменьшение дозы соединения 8а (400 мг/кг) приводило к снижению противовоспалительной активности, его эффект составил лишь 31,7% (р<0,05). При введении препарата в еще меньшей дозе (200 мг/кг) противовоспалительное действие сохранялось - отек лапки уменьшился на 42,3% (р<0,05) по сравнению с контролем. Комбинация изониазида (160 мг/кг) с димефосфоном (240 мг/кг) дает больший противовоспалительный эффект (65,9%), чем введение соединения 8а в дозе 400 мг/кг (31,7%) (р<0,05). Димефосфон, введенный в отдельности (240 мг/кг) также уступает по противовоспалительной активности изучаемой комбинации (36,8%) (р<0,05).

Препарат 8Ь также обладает противовоспалительной активностью. Так, в дозе 400 мг/кг препарат проявил наилучшую противовоспалительную активность, уменьшая отек на 48,8% (р<0,05). Дальнейшее уменьшение (200 мг/кг) и увеличение (800 мг/кг) дозы приводило к снижению противовоспалительной активности - эффект составил 28,6% и 33,7% соответственно (р<0,05).

Пролиферативная тканевая реакция наиболее характерная и специфическая для туберкулезного воспаления (Струков А.И., 1995). Результаты изучения противовоспалительного действия соединения 8а на модели адьювантного артрита у крыс показали, что препарат подавлял пролиферативную реакцию на 40,7% и 36,6% соответственно на 50-е и 85-е сутки после введения полного адью ванта Фрейнда.

Сочетание противовоспалительной активности с низкой токсичностью у гидразонов димефосфона, обладающих противотуберкулезным действием, определяет их перспективы как противотуберкулезных средств.

Существенным недостатком изониазида является его гепатотоксичность. Гидразоны димефосфона (8а и 8Ь) при курсовом введении (30 дней) крысам в эквимолярных дозах не оказывают гепатотоксического действия. Курсовое

введение (16 дней) комбинации соединения 8а с рифампицином также не приводит к развитию выраженных гепатотоксических эффектов.

Соединение 8а — потенциальный противотуберкулезный препарат, и изучение вопросов стойкости вещества в разных средах является одним из этапов доклинических исследований. Химиками, синтезировавшими вещество 8а (Бузыкин Б.И., Татаринов Д.А), было высказано предположение, что в кислых средах соединение может разрушаться с образованием исходных продуктов -изониазида и димефосфона.

Разработанный нами ВЭЖХ-метод определения соединений 8а и изониазида позволяет определить соединения на одной хроматограмме. Исследовав водный раствор, приготовленный из субстанции-порошка соединения 8а, синтезированного 3 года назад в ИОФХ им. А.Е. Арбузова, методом ВЭЖХ было установлено отсутствие примеси изониазида, что говорит о стойкости субстанции.

В течение 3 месяцев изучали стойкость препарата 8а в водном растворе и фосфатных буферных растворах с рН 1.5, 7.5, 8.0. Выбор буферных систем обусловлен тем, что внутренняя среда организма представляет собой буферную систему, а рН 1.5 моделирует кислую среду желудка, рН 7.5 - кровь, рН 8.0 -кишечник. В кислой среде соединение 8а разрушается (т.к. на хроматограмме уже через 2 часа определяется пик изониазида без пика вещества 8а), возможно, этим объясняется более высокая токсичность препарата при пероральном применении, чем при внутрибрюшинном. Из рисунка 1 видно, что увеличение рН в буферных растворах ведет к увеличению стойкости препарата 8а. Водный же раствор 8а не стоек (через 3 месяца практически полностью разлагается на изониазид (рисунок 1)). Полученные результаты позволяют предсказать, что пероральное применение препарата 8а нерационально, т.к. в кислой среде желудка он будет разрушаться. Однако это не исключает возможность разработки твердых лекарственных форм, покрытых оболочкой для защиты от кислого содержимого желудка, в слабощелочной среде кишечника, по-видимому, препарат будет стабилен. Также не исключается возможность приготовления раствора субстанции непосредственно перед парентеральным применением.

■рН=7,5 рН=8,0

Водный раствор

Рисунок 1 - Динамика нарастания содержания свободного изониазида в водном и буферных (рН 7,5 и 8,0) растворах соединения 8а

Интересные результаты получены при изучении взаимоотношения димефосфона и изониазида, являющихся фрагментами молекулы вещества 8а. Ранее профессором Хафизьяновой Р.Х. (1991 г.) показано противосудорожное действие димефосфона при отравлении изониазидом. Нами определены ЭД50 димефосфона при отравлении мышей ЛД,оо изониазида и ЛД50 изониазида на фоне действия димефосфона. Расчет средней эффективной дозы показал, что ЭД50 димефосфона при отравлении мышей ЛДюо изониазида равна 866,7±32,4 мг/кг, а ЛД50 изониазида на фоне действия димефосфона составляет 235,5±8,3 мг/кг. Таким образом, димефосфон при совместном применении с изониазидом предупреждает нейротоксический эффект последнего, подавляя судороги и снижая токсичность по ЛД50 в 1,57 раза. Это обосновывает целесообразность дальнейшего изучения совместного применения изониазида и димефосфона в клинике с целью уменьшения токсических эффектов при сохранении противотуберкулезного действия.

В экспериментах на крысах изучено влияние димефосфона в дозе 200 и 1000 мг/кг на содержание изониазида (100 мг/кг) в сыворотке крови. Анализ фармакокинетических кривых показал, что во 2-ой («изониазид, 100 мг/кг + димефосфон 200 мг/кг») и 3-ей («изониазид, 100 мг/кг + димефосфон, 1000 мг/кг») группах содержание изониазида было достоверно ниже, чем в 1 -ой группе («изониазид, 100 мг/кг»). Причем, в 3—ей группе зарегистрированный эффект был более выраженным (рисунок 2). Таким образом, димефосфон дозозависимо уменьшает уровень изониазида в крови.

Для изучения влияния димефосфона на распределение изониазида в крови и внутренних органах крыс нами была использована методика определения изониазида в биологических средах. Две группы животных (первая - «изониазид, 100 мг/кг», вторая - «изониазид, 100 мг/кг + димефосфон, 1000 мг/кг») забивали через 1 и 2 часа после в/б введения препаратов. Во время забоя проводили забор крови, затем извлекали головной мозг и легкие, готовили гомогенаты органов, в надосадочной фракции количественно определяли в них содержание изониазида методом ВЭЖХ. Результаты исследования показали, что во второй группе концентрация изониазида в сыворотке крови и в органах достоверно ниже, чем в первой. Более того во второй группе регистрировался пик при длине волны 263 нм, по характеристикам, совпадающий с пиком соединения 8а (рисунок 3). В первой группе этот пик не определялся.___

120 100

—Пзониазвд, 100 мг/кг

ё S0

5 бо

■Изониазид. 100 мг/кг+

Димефосфон. 200 мг/кг

■Изониазид. 100 мг/кг+

Димефосфон. 1000 мг/кг

0 30 60 90 120150180210240270

Время, мин

Рисунок 2 -Влияние димефосфона на содержание изониазида в сыворотке

крови крыс

ВЭЖХ-анализ смеси водных растворов димефосфона и изониазида в условиях in vitro показал, что вещество 8а в таких условиях не образуется.

Полученные данные в условиях in vivo наводят на мысль, что снижение концентрации изониазида в крови и тканях при совместном применении соединения 8а с димефосфоном, по-видимому, связано с химическим взаимодействием этих препаратов с образованием нового продукта -изоникотиноилгидразона димефосфона (соединение 8а), что, предположительно, является одним из механизмов снижения токсичности изониазида. Ускорение метаболизма изониазида под влиянием димефосфона маловероятно, т.к. димефосфон в больших дозах (1000 мг/кг) при однократном введении угнетает метаболические процессы в печени (Гараев P.C., 1993).

Рисунок 3 - Хроматографический пик соединения 8а, полученный при ВЭЖХ-анапизе сыворотки крови крыс, получавших комбинацию «изониазид, 100 мг/кг + димефосфон, 1000 мг/кг»

В заключении можно отметить ряд перспективных направлений в дальнейших исследованиях аналогов димефосфона. Среди них: поиск менее токсичных аналогов с меньшим угнетающим действием на ЦНС; разработка твердых лекарственных форм на основе кристаллических аналогов димефосфона, сохраняющих его фармакологические свойства; дальнейшее исследование аналогов димефосфона с противотуберкулезной и противовоспалительной активностью и обладающих меньшей токсичностью, чем эталонные противотуберкулезные препараты.

ВЫВОДЫ

1. Замена в молекуле димефосфона одной из двух метоксильных групп у атома фосфора на метальный радикал (соединение 2а) ведет к двукратному снижению токсичности соединения для мышей по сравнению с прототипом, ослаблению угнетающего действия на ЦНС (отсутствие у мышей «бокового положения», снижение противосудорожной активности при отравлении мышей коразолом) при сохранении таких фармакологических свойств, как защитное действие при отравлении мышей антихолинэстеразным средством фосфаколом и противовоспалительная активность на модели каррагенинового отека лапки у

крыс. При замене двух метоксильных групп у атома фосфора на метальные (соединение 4d) происходит еще более выраженное снижение токсичности. Полученный аналог по токсичности относится к 6 классу («относительно безвредные вещества») по классификации К.К. Сидорова и практически теряет фармакологические свойства, характерные для прототипа.

2. Замена кетонного кислорода в 3-ем положении молекулы димефосфона на оксимную группу, приводящая к образованию кристаллического продукта, повышает токсичность соединения За для мышей по ЛД50 в 1,56 раза, но не влияет на проявление основных фармакологических свойств прототипа.

3. Изоннкотиноил- (8а) и никотиноил- (8Ь) гидразоны димефосфона — стойкие при хранении кристаллические вещества, менее токсичны для мышей и крыс, чем изониазид (по ЛД50 в 13,4 и 12 раз соответственно). Оба вещества, в отличие от изониазида, не вызывают симптомов возбуждения ЦНС и обладают противотуберкулезной (in vitro) и противовоспалительной активностью в опытах на крысах.

4. Димефосфон при совместном применении с изониазидом снижает его токсичность по ЛД50 в 1,57 раза и предупреждает нейротоксический эффект последнего, подавляя судороги.

5. Разработанный ВЭЖХ метод определения соединения 8а в водных и буферных растворах, а также биологических средах позволяет использовать его в фармакокинетических исследованиях.

Практические рекомендации

1. Рекомендуется изучить новый аналог димефосфона с одной эфирной связью у атома фосфора (соединение 2а) в качестве антидота при отравлении антихолинэстеразными средствами, а также средства, потенцирующего антидотные эффекты м-холиноблокатора атропина и реактиватора холинэстеразы дипироксима.

2. Продолжить изучение фармако-токсикологических свойств кристаллических аналогов димефосфона с целью разработки на их основе твердых лекарственных форм, удобных для употребления и транспортировки.

3. Рекомендуется продолжить доклиническое исследование соединения 8Ь, как оригинального малотоксичного потенциального противотуберкулезного средства.

4. Предлагается провести клинические исследования димефосфона в терапии туберкулеза для коррекции побочных эффектов изониазида.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кашапов, JI.P. Изучение новых аналогов димефосфона: токсичность и антидотные свойства при отравлении антихолинэстеразными ФОС / Л.Р. Кашапов // 79-ая Всероссийская студенческая научная конференция: тез. докл. — Казань, 2005. - С. 75.

2. Гараев, P.C. Синтез нового аналога димефосфона «Метим» и оценка его фармакологических свойств / P.C. Гараев, Л.Н. Залялютдинова, Л.Р. Кашапов и др. // Общество Здоровье Лекарство: материалы научно-практической конференции, посвященной памяти профессора Я.В. Костина. - Саранск, 2005. -С. 37.

3. Гараев, P.C. Разработка и внедрение новых лекарственных препаратов и форм. Этап 2005 г. Синтез новых аналогов димефосфона и изучение механизма их действия / P.C. Гараев, А.Г. Овчинникова, Л.Р. Кашапов и др. // Сборник аннотированных отчетов по НИР Академии наук Республики Татарстан. - Казань, 2005. - С. 89-92.

4. Кашапов, Л.Р. Изучение взаимоотношения метима с фосфорорганическими ингибиторами холинэстеразы / Л.Р. Кашапов // 80-ая Всероссийская студенческая научная конференция: тез. докл. - Казань, 2006. - С. 71-72.

5. Кашапов, Л.Р. Изучение фармакологических свойств новых аналогов димефосфона / Л.Р. Кашапов // Актуальные проблемы городского хозяйства и социальной сферы города: материалы научно-практической конференции студентов и аспирантов. - Казань, 2006. - С. 25-26.

6. Кашапов, Л.Р. Оценка фармакологических эффектов нового аналога димефосфона «метнмефина» / Л.Р. Кашапов // 81-ая Всероссийская студенческая научная конференция, посвященной 150-летию В.М. Бехтерева: тез. докл. — Казань, 2007. - С. 85-86.

7. Гараев, P.C. Синтез новых аналогов димефосфона. Сравнительное изучение биологических свойств димефосфона и его новых аналогов. Этап 2007 г.: Синтез нового аналога димефосфона - метимефина и изучение его противовоспалительных свойств / P.C. Гараев, А.Г. Овчинникова, Л.Р. Кашапов и др. // Сборник научных статей Академии наук Республики Татарстан. - Казань, 2007. - С. 70-72.

8. Гараев, P.C. Изучение роли функциональных групп в химической структуре димефосфона / P.C. Гараев, А.Г. Овчинникова, Л.Р. Кашапов и др. // Фармакология и токсикология фосфорорганических соединений и других биологически активных веществ, выпуск 4: материалы Российской конференции, посвященной 75-летию И.А. Студенцовой - Казань, 2008. - С. 26.

9. Кашапов Л.Р. Биологическая активность диалкилфосфиноксидов -новых аналогов димефосфона / Л.Р. Кашапов // 83-ая Всероссийская студенческая научная конференция: тез. докл. - Казань, 2009. - С. 84.

10. Гараев, P.C. Токсичность и противовоспалительная активность пиридиноилгидразонового производного димефосфона в сравнении с димефосфоном и изониазидом / P.C. Гараев, Б.И. Бузыкин, Л.Р. Кашапов и др. //

Инновации в современной фармакологии: Материалы IV съезда фармакологов России. - Казань, 2012. - С. 45.

11. Кашапов, J1.P. Малотоксичные пиридиноилгидразоны димефосфона, обладающие противотуберкулезной активностью / JI.P. Кашапов, Р.В. Честнова, Б.И. Бузыкин и др. // Инновации в современной фармакологии: Материалы IV съезда фармакологов России. - Казань, 2012. - С. 84-85.

12. Кашапов JI.P. Токсичность нового аналога Димефосфона ВК-500 с противотуберкулезной активностью / JI.P. Кашапов // Молодые ученые в медицине: материалы XVI Всероссийской научно-практической конференции. Казань, 2012. - С. 92.

13. Кашапов, JI.P. Изучение безвредности курсового введения ВК-500 и Изониазида в эксперименте / JI.P. Кашапов, Д.А. Ильин // 87-ая Всероссийской научно-практическая конференция студентов и молодых ученых, посвященной 155-летию со дня рождения Л.О. Даркшевича: тез. докл. - Казань, 2013. - С. 136137.

14. Бузыкин, Б.И. Синтез и строение пиридиноилгидразонов димефосфона, обладающих антимикобакгериальной активностью / Б.И. Бузыкин, P.C. Гараев, JI.P. Кашапов и др. // Химико-фармацевтический журнал. - 2013. - Т. 47, № 1. - С. 36-40.

15. Кашапов, JI.P. Изучение противовоспалительных свойств гидразонов димефосфона / JI.P. Кашапов, Д.А. Ильин // 88-ая Всероссийская студенческая научная конференция: тез. докл. - Казань, 2014. - С. 174-175.

16. Кашапов, JI.P. Оценка антимикробной активности гидразонов димефосфона ВК-500 и ВК-502 в сравнении с димефосфоном и изониазидом / JI.P. Кашапов, P.C. Гараев, O.K. Поздеев и др. // Микробиология в современной медицине: материалы второй ежегодной заочной научно-практической конференции. — Казань, 2014. - С. 27.

17. Миронов, В.Ф. Аналоги димефосфона: фармакологический аспект / В.Ф. Миронов, P.C. Гараев, JI.P. Кашапов и др. И Известия Академии наук. Серия химическая. - 2014. - №9. - С. 2114-2126.

18. Патент на изобретение 2457212 РФ мпк C07F9/40 (2006.01), А61К31/66 (2006.01), А61Р31/06 (2006.01) Изоникотиноилпадразон Димефосфона, обладающий противотуберкулезной активностью / Бузыкин Б.И, Гараев P.C., Кашапов JI.P. и др. Опубл. 27.07.12. - Бюл. № 21-8 с.

19. Патент на изобретение 2471787 РФ мпк C07D251/34 (2006.01), А61 КЗ1/662 (2006.01), А61Р31/06 (2006.01) Никотиноилгидразон Димефосфона, обладающий противотуберкулезной активностью / Бузыкин Б.И., Гараев P.C., Кашапов Л.Р. и др. Опубл. 10.01.2013. - Бюл. № 1 - 7 с.

Список сокращений

ФОС - фосфорорганические соединения ЦНС - центральная нервная система в/б — внутрибрюшинно п/о - перорально

ЛД50 —доза, вызывающая гибель 50% животных

ЛДюс — доза, вызывающая гибель 100% животных

ЭД50 - доза, вызывающая фармакологический эффект у 50% животных

МПД — максимально-переносимая доза

МИК — минимальная ингибирующая концентрация

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

MGIT — Mycobacterial Growth Indicator Tube (пробирка с индикатором роста

микобактерий)

GU - Growth Unit (единица роста)

Подписано в печать 13.01.2015. Форм. бум. 60x84 1/16. Печ. л. 1,4. Тираж 170. Заказ № 1301/1. Отпечатано с готового оригинал - макета в типографии «Весгфалика» (ИП Колесов В.Н.) 420111, г. Казань, ул. Московская, 22. Тел.: 292-98-92 e-mail: westfalika@inbox.ru