Автореферат и диссертация по медицине (14.00.17) на тему:Участие пептидов семейства гастрин/холецистокинина в нейрохимических механизмах, обеспечивающих пищевое поведение виноградной улитки

: ОРДША ЛЕНИНА

АКАШШ1 МЕДШНСКИХ НАУК СШ' НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ НОИШЫЮЙ ФИЗИОЛОГ/У» ИМ. П.К.АНОХИНА

на прнши рукописи УДК о1Л!.81Г>.?:5У4.3й2:547.3б4.4

ВРАТШЕВ Петр Игоревич

УЧАСТИЕ ПЕПТИДОВ СЕМЕЙСТВА ГАСТРИН/ХОЛЕЦЦСТОКШША В НЕЙРОХИМИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМАХ, ОБЕСПЕЧИВАНИЯХ ПИЩЕВОЕ ПОВЕДЕНИЕ

ВИНОГРАДНОЙ УЛШ'КИ

14.00.17 - Нормальная физиология

Азторофорат диссертации на соискание ученой степени КШ1ДИД0Т8 модяцинских наук

МОСКВА-1989

Работе выполнена в

НИИ нормальной физиологии им. П.К.Анохина АМН СССР.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор В.В.ШЕРСТНЕВ

Официальные оппоненту:

доктор медицинских наук, профессор Т.А.АДЖИМОЛАЕВ кандидат биологических наук Е.И.СОЛНЦЕВА

Вздутая организация:

• Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии АН СССР.

Защита диссертации состоится "

часов на заседании Специализированного Ученого Совета Д.001.03.01 по нормальной физиологии при научно-исследовательском институте нормальной физиологии им. П.К.Анохинэ АМН СССР (Москва, 103009, ул.Герцена, д.6)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Автореферат разослан *ер,

е? " 1989 г.

Учоный секретарь Специализированного Совета' доктор биологических наук

Т./.ЕЕЛОЗА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований. Изучение нейрохимических

механизмов поведения является одной из наиболее актуальных проблем современной нойробиологии. Развитие указанной проблемы в последние года тесно связано с исследованием нового междисциплинарного неправления - изучением функциональной роли и механизмов действия физиологически активных олигопептидов- специализированного классе эндогенных регуляторов (Кругликов и др., 1983; Аьмарац и др., 1983; Шерсти ев и др., l'XiC; KrK»r,1983; Ш»у:и ¡1,10»0¡ ).

Очеьиднуп теоретическую и практическую значимость приобретает перспектива изучения цептидергических механизмов пищевого поведения и, в частности, участия ныпидов семейства гастрин/холммстокинина в его регуляции. В опытах, приведенных на млекопитающих ■ показано, что пептиды семейства

гастрин/холоиистокинина вовлечены в нейрохимическую организацию пищевого поведения (Шумилина идр.,1Ж; Анохин.I'JíO; Судаков в др..1930). в тохе время молекулярно-клеточные механизмы действия и роль этих пептидов в обеспечении нейрофизиологических механизмов пищевого поведения изучены недостаточно в связи с невозможностью функциональной идентификации нейронов, в их синаптических связей в рамках реализации определены! этапов конкретных форм поведения. В этой евкзи больиой интерес представляют моллюски с их относительно просто устроенной Ц1Ю, с функционально и нейрофизиологически идентифицированными пептидергическими нервными клетками и нейронами, синтезирующими классические нейромедиаторы, для многих из которых известны их мвето и роль в осущнспи;ь1ши олределекных видов шхшденческой деятельности (Kandoi,i976; Надпей.1900).

В настоящее время в ряде работ покарано наличие эндогенной гастрин/холецистокинин подобной иммунореактивностк в различных нейронах в Щ1С многих беспозвоночных и нескольких видов жаберных и легочных моллюсков (Grimmelikhuíjzen et al., 1980; Vigna et al. ,1936; Oiu, 19в6). В числе а тих нейронов клетки МнтШ . которые играют ванную роль в формировании пищевого мотивяцнонного

I

возбуждения и модулируют пищевое поподпнио у моллюсков (Галянинв и соавт., ШИП; Kupfcrannn et al., 1982; Gtraiw ot al. ,197Ь: ОяЬогпв et al., 1902; VlRjia ot а1.,19в<).

При изучении роли койропоптидов восьма плодотворным может явиться примонопио методологии системного подхода, в частности теории функциональной системы П.К./Шохина. Указанная концепция рассматривает поводенчоский акт как полостную динамическую организацию. развортывлщуюся в определенной временной последовательности от формирования потребности к ое удовлетворению, "имещую качественно очерченный приспособительный еффокт и, получающую непрерывную обратную информацию о полезном приспособительном результате". Вмосте с тем она позволяот определолить и индивидуальное "место" того или иного нейрохимического процосса в узловых нейрофизиологических механизмах функциональной системы (П.К.Анохин, ПСй; 1972).

Тшшм образом, изучение участия гастроинтеспшальных пептидов В обеспечении нейрофизиологических механизмов пикового поведения моллюсков весьма актуально в теоретическом плане для выяснения нейрохимических я молекулярных основ генетически 1Шторкинкровпкного ПОВ9Д01ШЯ. Исследования открывают определенные перспективы получонил пептидных цропвратсв для лечения таких распространенных заболеваний как анорексия к буломия, а также регуляция пищевого поведения сельскохозяйственных хивотных с целью увеличения их привеса (Судаков, 1988).

Проведение, выполненных в настоящей работе исследований предусмотрено научно-технической программой ГКНТ СССР и АН СССР по физико-химической биологии к биотехнологии, межотраслевой программой "Разработать и изучить научные основы использования физиологически активных пептидов в медицинской практика". Цель исследования. Целью исследования явилось изучение участия и роли олигопептидов - гастрина и холецистокинина в нейрохимическом обеспечении нейрофизиологических механизмов пищевого поведения виноградной улитки.

Задача исследования. I. Выявить локализацию

гастрин/ходоцистокиннн-подобной иммувореактивности в ЦНС моллюска Helix luoorum. 2. Изучить влияние пентагастрина и октопептида холегщстокинина (ХШ-8) иа пищевое поведение некормленных и

допривирошшних улиток. 3. Характеризовать взаимодействие серотонинв и указанных пептидов на уроцно пищевого поведения виноградных улиток. 4. Исследовать особенности биоэлектрическое активности модуляторных ней;юноа МетШ пищевого поведения моллюсков при изменении пищевого мотивационного состояния животного. Ь. Провести сравнительной анализ действия иектагастрина и Х11КИ на спонтанную и вызнанную биоэлектрическую нктипность UeTlU нейронов накормленных животных и улиток, содержавшихся в услого;их пищевой деприпации.

Научная новизна. В работо вперив установлено присутствие в цитоплазме нейронов пищевого поводоиия модуляторнош 'iv.au МетЦ1 и некоторых других нервных клетках Щ1С виноградной улитки иммунореактивности к нентагастрину. Продемонстрировано, что ХНК-8 и иантьгастрин избирательно вовлечены в нейрохимическое обеспеченно нейрофизиологических механизмов пищевого поведении у беспозвоночных. Выявлено, что действие исследованных пептидов на пищевое поведение виноградных улиток, а также спонтанную Я вызванную биоэлектрическую активлость нейронов МетШ связано с уровлом пищевой мотивации животных. Показана, что уровэнь мотквсционного состояния моллюсков находдт отражение в характерных особенностях отдельных показателей фоновой активности нейронов MotUI. В условиях пищевой де!фивации животных изученные понтиды в физиологических концентрациях вызывают противоположные по направленности изменения спонтанной биоэлектрической активности интернейрсжов, модули рущих пищевое поведение моллюсков и оказывают сходной действие на выраженность ответов нервных клеток МетШ, вызванных пищевым раздражителем. У накормленных улиток иепт.иш но оказывали влияния на спонтанную и вызнанную биоэлектрическую активности МотЩ. Обнаружено, что совместное введение сьротонина и пептидов вызывало изменении направленности действия ХШ-8 на пищевое цоводениа, тогда как эффект понтагастрина но изменялся.

Научно-теоретическое и практическое значение работы. Гизультаты проведенноа рабом имеют теоретаческое значение в вносят определенные вклад в понимание основ нойрохимичэской организации пищевого поведения, выяснение физиологической роли и

механизмов действия пептидов сочзйетва гасгрич/холецис;ин«нина.

•

Полуденные данные могут быть привлечены для изучения патогенеза расстройств ПИТ8ИИЯ, связанных с дисфункцией как холешстокининовых, так и гастриновых пвптидергических мвханизмов, в также являться основой для направленного поиска физиологически активных фрагментов гастрииа и холецистокинина, которые могут представлять интерес в качестве новых препаратов - регулятороз аппетита т! количества потребляемой пищи-

Результаты о наличии в ЦНС виноградной улитки нейронов, содержащих пентагастркк/ХДК-б-подобнуп иммунороактивность я чувствительных к синтетическим фрагментам пептидов семейства гастрин/холецистокининэ, позволяют применять использованную экспериментальную модель в качество тест-системы для изучения механизмов действия синтетических аналогов исследованных пептидов, применяемых в настоящее время в клинике.

Внедрение результатов исследования.В процессе выполнения работы в практику научных исследований НИИ нормальной физиологии им. П.К.Акохина АМН СССР внедрено иммуногистохимическоа определение мест связывания антксывороток пептидов в ЦНС моллюсков с помощью ввщцш-биотип-пероксидазного метода.

Результаты исследований представлены на экспозиции ВДНХ СССР в 1983-1984 гг. "Теория функциональных систем - практике". Полученные данные использованы в педагогичэском процессе: ва лекциях для слушателей повышения квалификации врачей I МММ им.И.М.Сеченова МЗ СССР и практических занятиях со студентами МВТУ ям. Н.Э.Баумана.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсухдоны во конференции молодых ученых Института фармакологии АМН СССР в 1984 г.; не симпозиуме "Система мозговых и внемозговых пептидов" (Ленинград, 1984); на Всесозной конференции "Перспективы клинического применения препаратов пептидной природы" (Москва,1987); на Всесоюзном симпозиуме "Физиология пептидов* (Ленинград, 1988); на международном симпозиуме, посвященном &С)-Л9тию П. К. Алехина "Икгограгавная деятельность нейрона : молекулярные основы" (Ялта,1988); ва 2-й Всесоюзной конференции по нэйроваукам (Киев,1988); на меадународном сателлитном 31 Конгрессу МСФН симпозиуме "Молекулярные основы действия биоактивных веществ на поведение" (Таллинн, 1939). По материалам диссертации

опубликовано 7 научных работ. Апробация диссертации состоялась на расширенном заседании отдела эмоций и эмицирнальных стрессов НИИ нормальной физиологии им. П.К.Анохина АМН СССР (Москва Г.вЭ). Обьеи и структура диссертации. Диссертадаонная работа содержит страниц машинописного текста, включая 25 рисунков и I таблицу. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методики исследований, пяти глав собственных результатов, обсуждения, заключения и выводов. Список литературы включиет отечественных и иностранных работ.

Материалы в методы исследования

Работа выполнена на ЗЬО виноградных улитках Helix luoorum массой 25-30 г, которые не менее двух недель находились в активном состоянии: животные содержались в специальном боксе, где постоянно поддерживали высокую влаашость, 12-чьсовой свотовой режим и ежедневно обновлялся корм (овощи).

Гастрин/ХШ-подобныо пептида в нервной системе моллюсков определяли с помощью иммуногистохимического метода. Применяли поликлональную антисыворотку, полученную в результате иммунизации кроликов синтетическим пьнтагастрином. Для выявления связавшихся антитол использовали авидин-биотин-пероксидазный метод (Паи et ai., 1981). В качестве контроля проводили реакции на срозах других тканей виноградной улитки (почань, пищевод), а такие применяли сшюротку крови неиммуиизированных кроликов.

С целы) исследования влияния на гащевое поведений улиток олнгопептидов применяли холоцистокюшн 26-33 в судьфатированной и несульфатированной форме и понтягастрин (dkrva, ФРГ). Эксперимента проводились на улитках, содврхавшихся в условиях 3-х суточной пищевой депривации, и животных,имевших свободный доступ к свежему корму (моркови). Пептида, расворенныо в физиологическом растворе для моллюсков (рН-7.6) (Сахаров, 1974), вводим перед началом кормления в висцеральную полость моллюсков в объеме 0.5 мл, ХЦК-8 в дозах - 5-ЗШ п^/улитку, пентагастрин- 2-400 г^/улитку. В качестве контроля использовали введение физиологического раствора для моллюсков Эксперименты по изучению взаимодействий серотэнина я указанных пептидов проводили слвдундим образом: вначале в полость тьла вводили серотонин (Serva, ФРГ) р дозе 0.2 fig/улитку в объека 0.25 мл. Через 3-5 мин инъецировали пентагастрин '¿ли ХДК-8 в

б

такому же оОгеме в дозе 6 ng/улитку. Контролем служилс изолированное введение нейромьдиатора и пептидов.

В поведенческих опытах регистрировали следующие показатели -количество стеленной пищи, и продолжительность ее приема. , производную от этих двух показателей - скорость потребления пищи.

Нейрофизиологические опыты проводились ва подуинтактно? препарате виноградной улитки но котором сохранялись все связ! нервной системы с периферическими оргенами и тканями, Осройозденного от раковины моллюска с расчлененной по средне! линии передней часть« ноги, но с сохраненным головным концом, обездвиживали с помощью игл в заполненной парафином камере и: оргстнкла. Нервные ганглии фиксировали в специально! "микровалночке", в которую постоянно поступал физиологически! раствор для моллюсков (Сахаров, 1974). Исследовали нейроны ПМетЩ ) ЛЫотШ, локализованные в цоробралышх ганглиях ЦНС моллюска, Нервные клотки идентифицировали по визуальным i ялоктрофизиологаческим критериям, в также ответам на пищево! раздражитель (Сахаров, 1974; Максимова, Балабан, 1983).

Биоалектричоскую активность нейронов регистрировал! внутриклеточно с помощью одноквнальных стеклянных капиллярны! мккроплектродов, имепцих дивметр кончике менее I мкм. Сопротивление микроэлектрода, заполненного 3 М раствором KCl, составляло 15-20 МОм. Отводимые от нейронов биопотенциаль подавались на вход усилителя HBZ-8I08, а звтим на двухлучево« зелоганавдий осциллограф vc-юа и быстродействующий прямопишущи« четырехканальный самописец "Reotioorder" JMG-4024 (все приборь фирмы Nlhon Kohden, Япония).

В качество пищевого раздражителя использовали нанесение каога свежеприготовленного морковного сока не хемурецепторную облает! губы моллюска, ипсилатеральную по отношению к решстрируемом! нейрону.

Внеклеточное подведение биологически активных вещосп производили путем аппликации в'физиологический раствор, омываю^ ЦНС улитки. Аппликация продолжалась 4 мин с поелоотмывание), чистым физиологическим раствором. В работе были кспользовань пентагэстрин и сульфатирозанный ХЩ-8 (SF.RVA, ФРГ) в концектрацм Ю'^-Ю-0!!. При анализе биоэлектрической активности нейронов МетШ

эценрвпли: уровень мембранного потенциала (МП), чвстоту генерации 1Д и ВПСП в мин, а также амплитуду я длительность волны деполяризации и частоты ПД в ответах, вызванных пищевым стимулом..

Полученные данные обрабатывались но Т-критерии Стгшштв на эач Ига 666 (ВИР), И персональном компгютеро "Aprloot" xkíj-1 xd 43 (Англия) lío программе "Buperoalo-3" и "Uioroatat" (Kloronoft Corpora t J orí, CiJIA).

Результаты исследований Иииуногистохииичвское определенна гвстрин/ХЦК-подобных пептидов в нервной системе Helix lucorum.

Нейроны, иммунореактивныо к сыворотка полученной против гастрин/холоцистокинина были обнаружены в различных ганглиях 101С Helix Lucorum. Ь большинстве случаев тела нейронов, содержащих гастрин/ХШ-Подооннй иммунореактивный материал, были равномерно рассеяны среди неокрашенных клеток, однако в буккнльных ганглиях наблюдали скоплоние мелких гастрин/ХЩ-позитивных нейронов. Диаметр гастрин/ХЦК-позитивных нейронов составлял 15-150 мкм. Гранулы продукта иммуногистохимической реакции локвлизовывались в цитоплазме нервных клеток и отсутствовали в ядрах.

В церебральных ганглиях оба гигантских метацоробральных нейрона ПМвтЩ и ЛмотЦ! проявляли иммуиореактивность к пентагастрину. Окрашивание было более выраженно на периферии перикариона, и особенно в аксонном полисе.

Инкубация контрольных срезов с нвимунной сывороткой не вызывала пероксидлзного окрашивания ни в одном из элементов нервной системы моллюска. Гастрин/ХЦК-подобная иммуиореактивность отсутствовала такзе на срезах ткани почени и пищевода виноградной улитки.

Таким образом обнаружено, что гигантские серотонинергические нейроны UutUI, а также ряд других неидентифичировянных нервных клеток Ш1С виноградной улитки обнаруживают гясурин/ХЩ-подобнув

иммуиореактивность.

Влияние пептидов семейства гветрин/холецистокашша не пищевое поведзние виноградных улиток.

В условиях свободного доступа к пище ьиноградаш улитки,

ПОДЛГфШуТЫО пищевой деприппиии потребляли в среднем 1.3*0.1 г моркови, а продолжительность ео потреблений составляла 50.0*9.0 мин.

Пантагастрин при введении в полость тела депривироваиных улиток в дозах 0.4 ^в, 40 в 5 од/улитку вызывает выраженное статистически достоверное увеличение количества потребляемой пищ» на Ш, 62% и 55%скорости ее потребления яа 12%, Бон и 435 соответственно, тогда, как продолжительность потребления пищи практически но меняется.

Сульфатированная форма ХЦК-8 в дозе 5 пе/улитку оказывал значимое действие на пищевое поведение подвергнутых пищевой депризации улиток. Пептид вызывал уменьшение количества потребляемой пищи в среднем на 36? и уменьшение скорости ее потробления на 55*. Продолжительность потребления моркови при атом Ее изменялась. ХЦК-8 в дозе 40 п^/улитку оказывает менее выраженное влияние на пищевое поведение и был не эффективен в дозе 0.3 /^/улитку.

Введение в висцеральную полость моллюска несульфатированного ХЦК-6 в дозах Б па - 0.4 ^улитку не вызывает достоверных изменений регистрируемых показателей пищевого поведения.

Улитки, имевшие до эксперимента постоянный свободный доступ к пища при тестировании потребляли в среднем 0.3*0.1 г' моркови. Продолжительность потребления пищи при атом составляла 13±1.5 мин. Введение исследуемых пептидов в указанных дозах не вызывало статистически значимых изменений пищевого поведения накормленных животных.

На основании приведенных данных можно заключить, что у голодных моллюсков пвнтагастрин вызывает статистически достоверное увеличение количества потребляемой пищи. Увеличение приема пищи происходит ее счет повышения скорости ее потребления, так как продолжительность потребления моркови практически не изменяется. Выраженность аффекта пептида ,на пищевое поведение зависит от количества введенного вещества. ХЦК-8 вызывает статистически значимое снижение количества сгеденной пищи и скорости ее потребления. У накормленных животных исследованные пептиды не оказывают влияния на регистрируемые показатели пищевого поведения.

Влйянио серотонинв, пентагвстринв и ХЦК-8 при сочетанных введениях на пищевое поведение моллюсков.

Исходя из имопцихся литературных денных о сосуществовании эндогенного гастрин/ХЦК-подобного пептида и соротонина в одних и тех жо нейронах, модулирующих пищевое поведение моллюсков (51;гаип ег а1.,1975; ОаЬогпе ^ а!..1902; ?1бпп,19в6), на 35 улитках, подвергнутых пищевой деприваиии, было изучоно влияние сочотанного введения указанных пептидов и нейромедиатора на показатели пищевого поведения. Учитывая факт влияния серотонина в высоких дозах на оборонительное поведение моллюсков (Чистякова, 1987) в наших опытах использовали низкие концентрации медиатора. Опыты показали, что соротонкн в дозе 0.2 ^/улитку но оказывал влияния не регистрируемые показатели пищевого поведения дрпривированннх животных. Однако, в тох случаях когда вслед за инъекцией ХЦК-8 вводили соро топил, наблюдалось выраженное статистически достоверное увеличение количества потребляемой пищи (на 40%). я также скорости (Ю%) и продолжительности [21%) ее потребления. С-очетанное введение пентвгастрица и серотонина не оказывало значимого действия не пищевое поведение депривированных улиток.

Результаты экспериментов свидетельствуют о взаимовлиянии серотонина и Х1Ж-8. При сочотанном введении медиатора и ХШ-8 действие пептида на пищевое поведение виноградных улиток изменяется на противоположное по сравнению с эффектом изолированной инъекши ХЦК-8. В тоже время поводончоский эффект полтагастрина при его инъекции с соротонином, но изменялся. Особенности биоэлектрической активности метацеребральных нейронов у накормленных и депривировагамх моллюсков.

При исследовании биоэлектрической активности 21 нейрона МотЩ оОнаруюно, что у моллюсков, находящихся в условиях пищевой деприваиии частота спонтанных ПЛ составляла 1.910.2/мин, а частота спонтанных ЬПСП достигала 1Б:2.5/мии.

В отличие от этого биоэлектрическая активность 17 исследованных нейронов у накормленных моллюсков характеризовалась более высокой частотой ПЛ. которая составляла 15.5±2.Ь/мин и сниженным количеством ВПСП - 0.35*071 /мин.

Полученные данные позволяют зашалить, что имеются определенные особенности биоэлектрической вктивности МотЩ

нейронов у накормленных и доправированных виноградных улиток. Биоэлектрическая активность нервных клеток у доприворованных моллюсков характеризуется сниженной чистотой спайковой активности и спонтанных ВПСП по сравнению с указанными показателями акта внос ти нейронов МетЩ, ^регистрированными у накормленных

животных.

Влияние исследуемых пептидов на биоэлектрическую активность нейронов ЫетЦ1

Перфузия ЦНС догфивировонных улиток, раствором пентагастрина в концентрации шгровождалась деполяризацией на 2-6 мВ

мембраны нейронов МетШ, увеличением в среднем на 892 частоты генерации ПД и количестве ВПСП на 212. Указанные эффекты возникали через 1-1.5 мин после начала, перфузии, достигали максимальной выриженкости через 5 мин и исчезали к 15 - 20 минуте от начала отмывания препарата.

У накормленных моллюсков понтагастрин в указанных концентрациях не вызывает достоверных изменений показателей биоэлектрической активности мвтацеребральных нойронов.

Перфузия ЦНС депривированных моллюсков физиологическим раствором, содержащим ХЦК-8 в концентрации вызывала

уволиченио уровня МП нейрона ЫетЩ на 3-5 мВ, уменьшение на 53? частоты генерации ПД и количества ВПСП на 34%. Эффекты развивались в течение I мин от начала перфузии, достигали максимальной выражьнности к 5 мин и исчезали к 20 мин от начала отмывания препарата чистым физиологическим раствором.

ХЦК-8 в концентрации Ю^-Ю"®!! не вызывал статистически значимых изменений регистрируемых в наших опытах показателей биоэлектрической активности НетЦ I нейронов накормленных виноградных улиток.

Полученные в проведенных экспериментах данные свидетельствуют о том, что у депривированных моллюсков ХЦК-8 в концентрациях 10~^-.Т0-8М повышает уровень Ш1, вызывает статистически значимое снижение частоты ПД и ВПиЛ. Пентагастрин в указанных концентрациях понижает уровень МП, приводит к достоверному увелкчоккю частоты генерации ПД и ВПСП нейронов МетЩ. У накормленных улиток как ХШ-8 так и иентагастркн (Ю~7-10_8М) не вызывают достоверных

ТО

Изчонокий регистрируемых показателей биоэлектрической активности нейронов МетШ.

Действие пентагастрина и ХЦК-8 на ответы метацеребральных нейронов, внзваююе предъявлением пищевого раздражителя у депривированных и накорилетшх моллюсков.

Аппликация свежего морковного сока нп хеморецепторные зоны губы деприпировйнной виноградной улитки сопровождалась быстрым нарастанием волны деполяризации, амплитуда которой составляла 10-1?, мВ, а длительность - 30-50 сек и увеличением частоты ПД нейронов МотШ. У накормлошшх моллюсков ответы мотацероброльных нейронов на пищевые раздражители быт более выряженными: количество ПД было выше но 10856, а длительность волны деполяризации на 40%, по сравнении с аналогичными показателями биоэлектрической активности нейронов депривированных улиточ.

Пентагастрин в концентрации выпивал статистически

достоверное увеличение количества ПД на 112%, амплитуда деполяризации - на 3056 и длиг чльности волны деполяризации - на 40% в ответах на пищевой раздражитель нейронов МетЦ1 у депривированных моллюсков. Указанные изменения развивались через 3-5 мин от начала подведения пептида и сохранялись в течение 15-20 мин.

У моллюсков, находящихся в условиях пищевой депривации аппликация ХШ-8 в концентрации 10_8М приводила к увеличению продолжительности волны деполяризации на 41% и амплитуда деполяризации на 12% ответов исследованных нейронов, вызванных прелгявлеиием пищевого стимула. Количество ГШ в ответах нервной клетки при этом статистически значимо но изменялось.

У накормленных виноградных улиток аппликации как петагастрина, так и ХЦК-8 в концентрации Т0~°М не вызывали изменения ответов нейронов МетШ на пищевой раздражитель.

Таким образом пентагастрин и ХИК-8 оказывали стимулирующее действие на вызванные пищевым раздражителем отвоты нервных клеток Мет',11 у депривиртванных моллпеков, тогда как у некормленных живо'.тых измононий, вызванных ответов нейрюнов при действии пептидов не отмочено. Влияние пентагастрина на регистрируемые показатели вызванных ответов нейронов у депривированных улиток б ало более выраженное по сравнению с действием ХШ-8.

П

Обсуждение результатов исследования

Результаты нашей работы продемонстрировали, что большинство гастрин/ХЩ-позитивных нервных клеток локализуются в буккальных и церобральных ганглиях, где в основном представлены моторные клетки и интерноароны, гомологичные для многих видов моллюсков, модулирущиепнщэвоо доведение (Kupferauinn et al.,1978; Woiaa et al., 1979 S Coldechmedin£ et al. ,1981; ОзЪогпе et al., 1982; Zimmerliig et al., 1988). Гастрин/ХЦК-подобная иммунореактивность выявлена и в нейронах пищевого поведения модуляторного типа -гигантских серотонинершческих метацеребральных нейронах (Oaborne et al.,198?). Данныо проведенных нами иммуногистохимических исследований согласуются с результатами, полученными рядом авторов на других представителях наземных н морских моллюсков (straua et al.,1975: Osborne et al.,1982; Vigna et al., 1986; Zimering et al., 198Я).

Нами обнаружено, что ХЩ-Û подавляет пищевое поведение улиток и угнетает биоэлектрическую активность нейронов МетЩ, в то время как понтагастрин стимулирует пищевое поведение и активирует Метацереоралыше клетки. Оба пептида оказывают наиболее выраженное влияние на пищевое поведение и биоэлектрическую ' активность нейронов МетЦ1 у депривированных моллюсков, то есть когда на основе доминирующей мотивации активно реализуется функциональная система пищевого поведения. Б тоже время при введении названных пептидов накормленным моллюскам, у которых значительно снижен уровень пищевой мотивации, не было обнаружено достоверных изменений регистрируемых в наших опытах показателей пищевого поведения. Приведенные экспериментальные данные свидетельствуют, на наш взгляд, об участии эндогенных гастрин/ХЦК-подобных пептидов в нейрохимической организации пищового поведения у моллюсков.

В экспериментах на млекопитающих были получены сходные данные. Понтагастрин, при внутрибршинном и внутрижедудочковом введении вызывал значительное увеличение приема пщи голодными кроликами, но не инициировал дополнительного приема пкщи у накормлзнных животных ^Судаков и др., 1907). Ш-<3, как при центральном, так и периферическом введениях вызывал прекращение приема пищи только у депривкрозанных животных (Balle et al.,1986;

Dian-Kin,* et al.,1986; Nieber et al.,1987; Анохии К. В. ,1982).

v Обращает внимание также обнаруженный нами факт тесной корреляции характеристик биоэлектрической активности нейронов МотЦ1 с уровнем пищевой мотивации моллюсков. В тоже время указанные нейроны содержали гестрин/ХЦК-подобнуп

иммунореактивпость, а физиологические концентрации указанных пепти/.ов аффективно изменяли показатели не только фоновой био.члоктрической активности, но и ответы нейронов вызванные специфическими пищевыми стимулами.

Анализ изложенных фактов с позиции теории функциональных систем (Анохин П.К.,19&9) позволяет полагать преимущественное участие гастрин/ХЦК-подобных пептидов в обоспечении процессов доминирующей пищевой мотивации. Высказанная точка зрения о функциональной роли исследованных пептидов согласуется с мнением ряда других ввторов (Судаков С.К.,1987; Орбячевскяя И.О.,1986; Аяохин К.В.,1982; Baile et al.. 1986; Nieber et al.,1987).

Имеющиеся данные не исключают, однако, возможности участия исследованных пептидов в регуляции других нейрофизиологических механизмов функциональной системы пищевого поведения. В частности механизма афферентного синтеза, о чем свидетельствуют результаты опытов, проведенных на млекопитающих (Crawley, 19В4; Xadar et al.,1905).

При изучении клеточных и молекулярных механизмов действия исследованных пептидов на пищевое поведение, нами обнаружено как сходство, так и различие их нейрональных эффектов В частности ХШ-8 угнетал фоновую биоэлектрическую активность метацеребральных нейронов, а пентагастрин - активировал ее. Вмосте с тем оба пептида увеличивали выраженность ответов нейронов на предъявление пищевого раздражителя. Эти данные позволяют полагать, что часть выяленных Н8ми поведенческих эффектов пентагастрипа и ХЦК-8 реализуются путем их действия на различные специфические роцепторы нейронов МетЦ I я клетки афферентные по отношению к ним. Уменьшение частота разрядов МетЦ I под влиянием ХЦК-8, по-видимому, обусловлено увеличением уровня. МП клетки, 8 возрастание частота генерации ПД при действии пентагастрипа -снижением уровня МП. Аналогичное прямое гиперполяризущве действие ХЦК-8 на мембрану ряда идентифицированных нейронов Helix asperse

обнаружено 1)ок1зь с соавт. (1ШЗ). Предположено, что эффект пептида может реализоваться путем его действия на проницаемость мембраны нейронов для одного или нескольких ионов, в частности Ли+. Сходство динамики и длительности эффектов ХЦК-8 и пентагастрина при различии их направленности дают основания полагать, что либо рецепторы пентагастрина связаны с теми же ионными каналими, что и рецепторы ХИК-8, однако влияние пентагастрина на каналы противоположно действию ХЦК-8, либо рецепторы пептидов на одном нейроне связаны с различными ионными каналами.

По-видимому, иной механизм действия пептидов на ответы нейронов МотЦ I вызванные пищевым стимулом. Усиление вызванных реакций нейронов может быть связано как с повышением медиаторной чувствительности МетЦ I под влиянием пептидов, так и увеличением выброса нойромедлвторов из нервных окончаний клеток, афферентных по отношению к МетЦ I. В ряде выполненных не моллгхжэх и млекопитающих работ показано, что ХЦК-й влияет на метаболизм некоторых мадиаторных веществ (Судаков, 1904; Вго<11е а!., 1987; Анохин и др.,1Ш»), на чувствительность нейронов к различным нейромадиаторам (Рок1вЬ ег а1.,1983), изменяет количество и аффинность медиаторных рецепторов.(Нчауопз о: и1.,1987). Кроме того не исключено, что описанные нами неирональные эффекты пептидов могут бить опосредованы системами вторичных внутриклеточных посредников. Показано, что ХЦК-8 изменяет уровень циклических нуклеотидов в ткани мозга млекопитающих (сьоийпигу ег а1., 198"/) и нервной системе моллюсков (Натлюпй ее а1., 1987).

Как свидетельствуют результаты биохимических исследований в МетЦ I синтезируется серотонин,- а также ХЦК/гастрин-подобный пептид (ОаЬогпв в1 а1.,198г). МетЦ I моносинаптически связаны с мотонейронами буккалышх ганглиев (Сои-еИ ег а1., 1971). Внутриклеточная стимуляция МетЦ I приводит- к уавличениа частоты ритмических жевательных движений и увеличению выраженности характерной активности буккальных мотонейронов, которую определяют как "вдевал моторная д, ..грамма" (0зу1з,1974; ЛчХаз еъ а1.,1975; КирГб1таапл,1974; Сгапго» аХ.,1981; Сго11 е( и!., 1935; ВаЫап1оп ее а1., 1987). Схожее модулирующее влияние не ьктавносг;ь истонойронов оказывали аппликации серотошша (ГСо1за а!. ,1979;

П;\т. оI а1.,1903). Вмосто с том на моллюске Кауапах показано, что Х1М - Я избирательно подавляет биоэлектрическую активность некоторых мотонейронов буквального ганглия 121тт 1тщ ог п1.,1увп). В наших поведенческих экспериментах при совместных введениях ХИК-8 и серотонипэ обнаружено инвертирование пЭДюктя пептида - моллюски съедали большее по сравнению с контрольными животными количество пищи и увеличивали скорость ее поедания. Эти"результаты" позволяют - - - -предтоложить, что действие нойрона МотП I на буккальные мотонейроны может претерпевать значительные изменения в зависимости от функционального состояния пищевой системы улитки. При сравнительно низкой частоте разрядов Мг.-тИ I сскротирупт преимущественно классический нейромедиатор - серотонин, который усиливает активность буккальных мотонейронов И' тем самым стимулирует пищевое поведение. При увеличении активности МетЦ I в процессе насыщения значительно возрастает выделение нейроном ХЩ-подобного пептида, что приводит к подавлению активности буккальных мотонейронов и прекращению пищевого поведения. При промежуточных уровнях насыщения эффекты серотонина и ХЦК-8, по-винимому, зависят от количественных взаимоотношений, в которых они выделяются на мотонейроны. Вместе с тем не исключено, что помимо упомянутых биологически активных веществ мотацоребральнпя клетка может секретировать пентагастрин-подобноо соединение также оказывающее стимулирующее действие на пищевое поведение. Эта возможность определяется тем, что пентагастрин является коночным продуктом процессинга ХЩ-8. Таким образом, пептиды семейства гастрина/холеиястокинина способны, по-видимому, оказывать избирательное модулирующее влияние на функционально различные нервные клетки обеспечивающие реализацию пищевого поведения улитки. Эффекты пептидов могут реализовыввться путем их прямого влияния на проницаемость мембраны нейронов для различных ионов, а такхо изменения эффективности синаптической передачи.

Результаты проведенной нами роботы, а также литературные данные, убедительно свидетельствуют об участии пептидов семейства гисдрин/ХШ в негрохимичоской организации пищевого поведения моллюсков и позволяют, на наш взгляд, высказать предположение о вовлечении понтогастрина и ХШ-8 в обеспечение процессов пищевой мотивации в функциональной системе пищевого поводония виноградной

улитки.

выводы

1. Гигантские серотонергические нейроны МотЦ I, а также некоторые другие неидентифицированные норвные клетки ЦНС виноградной улитки обнаруживают гастрин/ХЦК-подобную иммунореакгавность,

2. Пентагастрин [5 п« - 0.4 и5/улитку) и ХЦК-8 (Ьпв - 30 улитку) вызывают разнонаправленные изменения пищевого поведения

моллюсков, находящихся в условиях пищевой двпривации: количество съеденной пищи и скорость ее потреблении под влиянием пентагастрина увеличивались, а при действии ХЦК-8 - уменьшались. Указанные пептиды - пентагастрин (5 п^ - 0.4 ^в/улитку) и ХЩ-8 (5п& - 0.4 мв/улитку) не оказывали влияния на показатели пищевого поведения у накормленных виноградных улиток.

3. Серотончн (0.2 р^/улитку) не оказывал влияния на пищевое поведение депривированных виноградных улиток. При сочетанном введении серотонина и ХЩ-8 действио поптида изменялось на противоположное, тогда как эффект пентагастрина, при его инъекции с серотонином не изменялся.

4. Характер биоэлектрической активности нейронов МетШ зависит от уровня пищевого мотивационного состояния моллюсков: частота спайковой активности нервных клеток депривированных животных составляла 1.9Ю.2/мин, а частота спонтанных ВПСП - 18.012.Ь/мин; нейроны накормленных улиток имеют ч'астоту ПД 15.512.5/мин и количество ВПСП 0.35г0.1/мин.

5. Пентагастрин в концентрации Ю"7-10~°М вызывает у депривированных моллюсков достоверное снижение уровня МП на 2-6 мВ, увеличение частоты генерации ПД (893») и ВПСП (214), в ХЩ-8 в тех же концентрациях увеличивает уровонь МП на 3-5 кВ и сникает частоту ПД и ВПСП нейронов МетЦ1 соответственно на 53Ж и 34?. У накормленных улиток исследованные пептиды не изменяли характера биоэлектрической активности нервных клеток МетЩ

6. У моллюсков в состоянии пищевой депривации Х11К-8 (Ю"8М) и в большей степени пентагас .;ин (10"®М) вызывают увеличение амглитуды и длительности волны деполяризации нервных кльток МетЩ в ответ на предъявление пищевого раздражителя. У накормленных животных при действии пептидов вызванные ответы нейронов на изменяются.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Участие холешстокинина в центральных механизмах пищевого поведения моллюска. В сб. тозисов докладов симпозиума "Система мозговых и внемозговых пептидов", Ленинград "Наука", 1984, C.1B-I7.

2. Участие пептидов семейства гастрин/холтшстокинина в регуляции пищевого'поведения виноградной улитки. В республиканском сборнике научных трудов "Перспективы клинического применения препаратов пептидной природа", Москва ID87, с.127-129.

3. Участие нейропептидов в регуляции пищевого и оборонительного поведония виноградных улиток. В сб. тезисов докладов симпозиума 'Чиоиология пептидов". Ленинград ГГ <08, с. 25-2G. (Совместно с А.В. Иевелкиным).

4. Пептиды семейства гвстрин/холецистокилина в регуляции пшцзвого поведения виноградной улитки. Тезисы докладов международного симпозиума, поевлцснпого ЯО-лвтим со дня рождения П.К.Анохина "Интегративйая деятельность нойрогт: молекулярные основы", Москва 1988, с. 16-17.

5. Роль олигопептидов в механизмах взаимодействия пищевого и оборонительного поведения виноградных улиток. В сб. тозисов докладов 2 Всесоюзной конференции по нейронаукам, Киев 1938, с.159-160 (совместно с В.В.Шорстаовым и А.В.Шеволкикым).

6. Modulatory functions of gastrin and cholecystoklnin peptide3 in regulation of invertebrate feeding behaviour. Abstracts of satellite symponium of 31 Congrosa of WPG "Molecular basin of bioactive eubotnnees action on behavior", Tallinn 1909, p.12.

7. Oly/jopeptiden in organization of f«edinK and avoidance in garden snails. Biomedical •Г>о1епРеч,1990, v 1 ,n 1. Great Britain (in prose), (with A.V.Ghevelkin).

Подписано » печать I't.XI.1289г. Л.'»782Э Заказ 876 Тир»в 100 Типоггвфпя ЗТПО "КШРЦ"НТР"