Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Участие малой ГТфазы ARF6 в канцерогенезе

На правах рукописи

КНИЖНИК Анна Вадимовна УЧАСТИЕ МАЛОЙ ГТФАЗЫ А№6 В КАНЦЕРОГЕНЕЗЕ

Специальность 14.01.12-онкология

/

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2010

004601034

Работа выполнена в Лаборатории регуляции клеточных и вирусных онкогенов НИИ Канцерогенеза Учреждения Российской академии медицинских наук Российский Онкологический Научный Центр имени Н.Н.Блохкна РАМН (директор - М.И.Давыдов)

Научный руководитель:

Кандидат биологических наук Зборовская Ирина Борисовна

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук Красильников Михаил Александрович

Доктор биологических наук Крамеров Дмитрий Александрович

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт физико-

на заседании диссертационного совета (Д.001.017.01) РОНЦ имени Н.Н.Блохина РАМН по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24.

С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ имени Н.Н.Блохина РАМН

химической биологии им. А. Н. Белозерского, МГУ им. М. В. Ломоносова

Защита диссертации состоится «¿£> 2010

года

часов

Автореферат разослан М С^г^е— 2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета д.м.н., профессор

Ю.В. Шишкин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Процесс канцерогенеза представляет огромный интерес для фундаментальной молекулярной биологии и онкологии, поскольку причиной возникновения всех опухолевых заболеваний являются нарушения механизмов регуляции клеточной жизнедеятельности, до сих пор до конца не изученные даже в норме. Одной из наиболее актуальных проблем является идентификация белков, которые участвуют во внутриклеточных сигнальных путях, изменяющихся при прогрессии заболевания. Исследование таких нарушений может в будущем привести к разработке новых мишеней для направленной терапии.

В отношении большинства малых ГТФаз семейства Ras накоплен огромный экспериментальный материал, касающийся их участия в злокачественной трансформации клеток. Однако белок Arfó долго оставался «в тени» более известных G-белков. За последние годы появилось много данных, указывающих на важнейшую роль Arfó в ключевых аспектах жизнедеятельности клетки. Все больше внимания стало уделяться белкам Arf, в частности Arfó, и в аспекте канцерогенеза. Тем не менее, до сих пор опубликованы лишь единичные работы, исследующие участие Arfó в опухолевой прогрессии и метастазировании. Среди возможных механизмов, опосредующих участие Arfó в канцерогенезе, чаще всего рассматриваются Arfó-зависимое изменение цитоскелета и подвижности, а также регуляция эндоцитоза ряда белков и структуры мембраны. Менее понятной и остается роль Arfó в метаболизме липидов и участие этой ГТФазы во внутриклеточных сигнальных путях. Таким образом, исследование механизмов действия Arfó является крайне актуальным для понимания механизмов онкогенеза у человека.

Для изучения влияния Arfó на различные функциональные характеристики трансформированных клеток in vivo, а также на молекулярно-биологические характеристики клеток in vitro, была выбрана клеточная линия HET-SR ранее полученная в лаборатории противоопухолевого иммунитета НИИ Канцерогенеза РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН. Эта линия представляет собой эмбриональные фибробласты Сирийского хомяка (Mesocricetus auratus Waterh) трансформированные вирусом саркомы Рауса и характеризуется высокой туморогенностью, но низкой спонтанной метастатической активностью (СМА), что делает данную линию удобнг" ---

делью для исследования опухолевой прогрессии и изучения метастазирования in vivo на иммунокомпетентных животных.

Необходимо отметить, что при онкопаталогиях человека исследование экспрессии Arfó проводилось только на уровне мРНК в образцах глиом. Однако в контексте накопленных за последнее время данных на модельных системах о значительной роли Arfó в процессе канцерогенеза представляется чрезвычайно актуальным исследование экспрессии Arfó при других онкопаталогиях, в том числе при таком распространенном заболевании как немелкоклеточный рак легкого (HMPJI).

Цель и задачи исследования

Целью данной работы является исследование влияния малой ГТФазы Arfó на ключевые биологические свойства трансформированных клеток в культуре in vitro и метастатическую активность in vivo, а также на активацию отдельных белков и внутриклеточных сигнальных каскадов, ассоциированных с опухолевой профессией.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. На основе клеточной линии HET-SR (RSV трансформированные фиброб-ласты хомяка) получить производные линии, стабильно экспрессирующие различные формы белка Arfó: дикого типа, конститутивно-активную, доминантно-негативную, не способную взаимодействовать с PLD.

2. Изучить основные биологические свойства клеток HET-SR, экспресси-рующих различные формы Arfó, в культуре in vitro: скорость пролиферации, подвижность, инвазивность, клоногенность и способность к неприкрепленному росту.

3. Исследовать влияние различных форм Arfó на протеолитическую активность внеклеточных протеиназ ММР 1,2,9 и иРА, активность PLD, а также на статус фосфорилирования основных MAP киназ (ERK1/2, р38 и JNK1) и киназ Akt и S6KI.

4. Получить клеточные линии, экспрессирующие одновременно активные формы белков Ral (RalA и RalB) и белок Arfó как в активной, так и в доминантно-негативной форме.

5. Сравнить уровень спонтанной метастатической активности всех полученных клеточных линий in vivo.

6. Провести анализ экспрессии белков Arfó и RalA в образцах HMPJI человека.

Научная новизна и практическая значимость исследования

Полученные в работе результаты расширяют представления о роли малой ГТФазы Arfó в канцерогенезе. В результате проведенных исследований получены приоритетные данные о влиянии белка Arfó и его основного эффектора — PLD на многие характеристики клеток. В частности, впервые показано наличие сигнального пути Arfó—»PLD—»mTOR—»S6K1, а также Arfó-зависимая стимуляция активности киназы р38. До сегодняшнего времени исследования изменения экспрессии Arfó в человеческих опухолях практически не проводились. Полученные в представленной работе данные об экспрессии Arfó и белка RalA, необходимого для активации основного партнера Arfó — PLD, при HMPJI являются уникальными и одними из первых исследований такого рода.

Работа носит в первую очередь теоретический характер, полученные данные о роли Arfó в опухолевой прогрессии могут быть использованы при дальнейшем изучении участия Arfó как на модельных системах, так и в клинических исследованиях. Перспективным представляется дальнейшее исследование роли Arfó в прогрессии HMPJI. Полученные данные свидетельствуют о возможной роли Arfó в качестве потенциального маркера при комплексной диагностике и поиске мишеней для таргетной терапии HMPJI.

Публикации и апробация работы

Диссертация апробирована и рекомендована к защите 18 февраля 2010 года на совместной научной конференции лабораторий регуляции клеточных и вирусных онкогенов, молекулярной биологии вирусов, вирусного канцерогенеза, молекулярной эндокринологии и механизмов прогрессии эпителиальных опухолей НИИ Канцерогенеза РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН. Материалы работы докладывались на конференциях «European Small GTPase meeting» в 2007 г. (Умеа, Швеция), «Cancer Degradóme Symposium» в 2008 г. (Лондон, Англия), «Методы культивирования клеток» в 2009 г. (Санкт-Петербург), Beatson international cancer conference "Microenvironment, motility and metastasis" в 2009 г. (Глазго, Шотландия).

По результатам диссертационной работы опубликована 1 научная статья и 9 тезисов докладов.

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 46 рисунков, 4 таблицы. Состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы», «Список использованной литературы». Список литературы содержит 127 источников, в том числе 2 в отечественных рецензируемых изданиях.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

В работе использованы следующие методы исследования: трансформация бактериальных клеток, выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток, электрофорез нуклеиновых кислот, молекулярное клонирование, полимеразная цепная реакция (ПЦР), трансфекция эукариотических клеток, инфицирование клеток ретровирусными векторами, анализ количества мРНК методом ОТ-ПЦР, выделение и анализ белковых фракций с помощью вестерн-блот гибридизации, анализ ферментативной активности PLD и протеиназ внеклеточного матрикса (субстрат-специфическая зимография в ПААГ), анализ динамики роста клеток, анализ «зарастания раны» in vitro (wound healing assay), тест на образование колоний в условиях разреженной популяции (клоногенность), тест на образование колоний в полужидкой среде, тест на миграцию клеток по градиенту концентраций факторов роста, тест на инвазию in vitro, определение спонтанной метастатической активности (СМА) клеток на лабораторных животных, а также статистическая обработка данных.

Результаты исследования и обсуждение

1. Клеточные линии, использованные в работе

Для изучения влияния Arfó на характеристики трансформированных клеток получена панель стабильных клеточных линий производных HET-SR, экспресси-рующих последовательности Arfó в ретровирусном векторе pLXSN (см. рис. 1). Для проведения данного исследования использовались варианты гена Arfó человека, несущие следующие мутации (таблица I):

Аминокислотная замена Функциональное значение замены

Arfó Q67L (Gin—»Leu) конститутивная связь с ГТФ (конститутивно-активная форма)

Arfó WT дикий тип

Arfó N481 (Asn—>Ile) отсутствие взаимодействия с Р1ЛЭ

Arfó T27N (Thr—>Asn) конститутивная связь с ГДФ (доминантно-негативная форма)

Таким образом, были получены 5 стабильных поликлональных клеточных линий, производных HET-SR:

- HET-SR pLXSN (линия с «пустым» вектором, далее использовавшаяся в качестве контрольной для всех клеточных линий);

- HET-SR Arfó Q67L;

- HET-SR Arfó WT;

- HET-SR Arfó N481;

- HET-SR Arfó T27N.

Полученные клеточные линии далее были использованы в in vitro и in vivo экспериментах для сравнения влияния Arfó на изменение отдельных характеристик злокачественных клеток.

Z б —i Z

(D О 00 f Z г-pi Z со г— со О £ со -<J Z Is-СМ н-

(О СО со Ср х СО (О со со

t tí IE t _1 t t t: т=

< < < < Ol < < < <

ir а. а. о: о: tr а: а. а.

CO СО со со СО со СО СО

к н Ь- ь- н h— к— н к

LU ш ш ш ш Ш ш ш ш

X х X X X X X X X

Рисунок 1. Вестерн-блот анализ экспрессии экзогенного Arfó в клеточных линиях производных HET-SR. а) Антитела к Arfó, б) Антитела к НА. В качестве контроля использовались антитела к бета-актину.

2. Характеристики полученных клеточных линий in vitro и in vivo

Одной из основных характеристик трансформированных клеток является повышенная скорость деления. При исследовании влияния Arfó на пролиферацию клеток линии HET-SR оказалось, что активный мутант Arfó и Arfó дикого типа в

значительной степени ускоряют скорость деления клеток линии НЕТ-ЗИ. (см. рис.2).

HET-SR plXSN " HET-SR Arf6 Q67L HET-SR Ar(6 WT HET-SR Arf6 N481 • HET-SR Art6 T27N

//

Рисунок 2. Динамика роста исследованных клеточных линий Клетки, экспрессирующие доминантно-негативный мутант Arfó и мутант, не способный взаимодействовать с PLD, не отличаются от контрольной линии по этому показателю, что говорят о том, что влияние Arfó на пролиферативную активность реализуется через взаимодействие с PLD.

Одной из характеристик агрессивных культур трансформированных клеток in vitro является способность формировать колонии без стимуляции окружающими клетками (клоногенность), которая помимо разницы в пролиферации, отражает зависимость клеток от микроокружения. При проведении теста на клоногенность, оказалось, что среднее количество колоний увеличивалось во всех линиях, экс-прессирующих мутантные формы Arfó и Arfó дикого типа по сравнению с контрольной линией (см. рис. 3).

★

in О

/ с?*

/

«S- л-

//

Рисунок 3. Статистический анализ клоногенности полученных клеточных линий. Звездочка - статистически достоверное отличие от контрольной линии (р<0,05)

Таким образом. Arfó усиливает способность клеток к колониеобразованию независимо от того, находится ли он в ГТФ или ГДФ связанном состоянии, а также независимо от взаимодействия с PLD. По-видимому, для повышения клоногенно-сти достаточно присутствия большого пула молекул Arfó, в том числе дикого типа. Очевидно, что повышение клоногенности не может быть объяснено вкладом Arfó-зависимого усиления пролиферации, так как стимуляция пролиферативной активности наблюдалась только в линиях HET-SR Arfó Q67L и HET-SR Arfó WT.

Другой важнейшей характеристикой клеток, часто ассоциированной с более агрессивным фенотипом, является способность к миграции. Способность к миграции in vitro может проверяться в тесте «на зарастание раны», когда клетки прикреплены к подложке и зарастают рану на монослое, а также в камерах Бойдена, когда исследуется способность к направленной миграции сквозь поры мембраны по градиенту ростовых факторов. Исследование влияния Arfó на миграционную активность клеток проводилось с использованием обоих тестов (см. рис. 4,5).

Рисунок 4. Миграция клеток в среде с 10% сыворотки с добавлением 1,5 мкг/мл Митомицина С. Звездочка - статистически достоверное отличие от контрольной линии (р<0,05)

Мы не обнаружили стимуляции миграции клеток при введении активного мутанта Arfó, а также Arfó дикого типа ни в тесте «на зарастание раны», ни в камере Бойдена. В то же время, гиперэкспрессия мутантной формы Arfó, не взаимодействующей с PLD, приводила к снижению миграционной активности клеток в обоих тестах (см. рис. 4,5).

HET-SR pLXSN HET-SR Arf8 M7L HET-SR ArtB WT HET-SR Arf6 N481 HET-SR A/t6 T27N

f . - , • - ■. ■ .. - - - / V ■ ■ . . . . . . Щ V.J ; _ ..

;- ' ... .J"■ !f.; - ... . ' i'

V?'- iV?Av; ' ' '-v..v■■"'.. -V-'il ';•>'• v '

í'.Ví^-. ¡йл-í- ., Щ •• ■ ■■' ■ -i-i

Рисунок 5. Миграция клеток no градиенту сыворотки в камере Бойдена

Можно предполагать, что отсутствие возможности образования комплекса Arf6-PLD приводит к тому, что весь пул молекул активного Arfó, продуцирующийся при гиперэкспрессии в клетках, «перенаправляется» к другим эффекторам, взаимодействие с которыми и приводит в итоге к снижению подвижности клеток.

Способность трансформированных клеток in vivo проникать из опухоли в окружающую ткань является одной из основных характеристик, определяющих злокачественный фенотип опухолей. Инвазивность - это комплексная характеристика, оценивающая не только подвижность клеток, но и их способность ремоделировать внеклеточный матрикс. Для оценки инвазивных свойств клеток в культуре используется тест на инвазию in vitro с помощью камер Бойдена, дно которых покрыто матригелем, имитирующим внеклеточный матрикс. В данном тесте моделируется ситуация, при которой трансформированные клетки оказываются в состоянии голодания по факторам роста, и для того, чтобы их получить, клеткам необходимо преодолеть барьер, состоящий из матригеля. Такой тест отражает способность клеток к инвазии в целом, а также характеризует направленное движение и разрушение внеклеточного матрикса.

HET-SR pLXSN HET-SR Alffi Q67L HET-SR Alf6 WT HET-SR Arf6 N461 HET-SR Arf6 T27N

V" . ' л -a1

f 4 kT" &

Рисунок 6. Фотографии внешней стороны мембраны после проведения теста на

инвазию in vitro

При исследовании способности к инвазии оказалось, что контрольная клеточная линия HET-SR pLXSN обладает относительно слабым инвазивным потенциалом (см. рис. 6). Наглядная и воспроизводимая разница в данном эксперименте наблюдается только для линии HET-SR Arfó N481, которая была самой активной в данном тесте. Эти данные находятся в некотором противоречии с данными, полученными на моделях глиомы и карциномы молочной железы. Полученный результат представляется особенно интересным, поскольку в обоих тестах, оценивающих

движение клеток, данная линия обладала наименьшей активностью, что говорит о том, что высокая инвазивная способность линии HET-SR Arfó N481 не связана с миграционной активностью, а скорее может быть ассоциирована с повышенной способностью к ремоделированию матрикса. Для проверки этого предположения была проверена активность ряда протеиназ, деградирующих компоненты ВКМ, в тесте на субстрат-специфическую зимографию. При анализе матриксных металло-протеиназ, способных деградировать желатин (ММР1,2 и 9), мы не увидели значимых изменений (см. рис. 7а), что согласуется с литературными данными о влиянии Arfó на их активность. В тоже время, исследование активности другой важнейшей протеиназы, урокиназо-подобного активатора плазминогена (иРА), показало, что в линии HET-SR Arfó N481 активность этой протеиназы повышена по сравнению с другими исследованными линиями (см. рис. 76).

Рисунок 7. Зимография кондиционированных сред, полученных от клеточных линий, экспрессирующих различные формы Arfó, а) Анализ активности ММР. б) Анализ активности иРА.

Таким образом, по совокупности исследования подвижности и протеолитиче-ской активности можно предполагать, что присутствие в клетках большого количества белка Arfó, не взаимодействующего с PLD, перенаправляет основную активность Arfó на взаимодействие с другими эффекторами. Это взаимодействие с одной стороны, приводит к снижению подвижности клеток, как в условиях прикрепленного роста, так и направленного движения по градиенту факторов роста. С другой стороны, оно усиливает активность иРА, что, в свою очередь, приводит к стимуляции протеолитической деградации матрикса и повышению инвазивности данной линии в культуре ш vitro. Однако этого оказалось недостаточно для стимуляции метастатического потенциала опухолевых клеток in vivo. Определение спонтанной метастатической активности клеток проводилось спустя 8 недель после

подкожного введения 2104 клеток, экспрессировавших различные формы Аг56. В данном эксперименте имитировались практически все стадии прогрессии опухолевого заболевания, начиная с формирования первичной опухоли, заканчивая образованием очагов вторичного роста в отдаленных органах (легких). Так, при анализе уровня спонтанной метастатической активности всех исследованных линий оказалось, что статистически значимой разницы в количестве легочных метастазов при подкожном введении исследуемых линий экспериментальным животным нет (см. рис. 8).

Рисунок 8. Количество гистологически-верифицированных метастазов в легких спустя 8 недель после подкожного введения исследованных клеточных линий.

Ранее было показано, что введение активного RalA и RalB в клетки HET-SR приводит к стимуляции метастатической активности клеток. Одним из основных эффекторов белков Ral является PLD, кроме того, взаимодействие с PLD необходимо для Ral-зависимой стимуляции метастазирования. Поскольку известно, что активация PLD требует совместного участия белков Arfó и RalA, и, к тому же многие эффекты Arfó реализуются через активацию PLD, мы проверили, происходит ли изменение СМА при совместной экспрессии Arfó и Ral. Для этого мы экспрес-сировали Arfó (как активную, так и доминантно-негативную формы) в клетках, в которых ранее уже были экспрессированы экзогенные активные RalA и RalB (см. рис. 9).

ai 100-1

о

2 О

80-

С? со см го CN СП СМ

> > > >

< m СО со

Ш <0 я и

К Z tr СИ -I о: 2

* £ tr СИ со си ^ т Г41

Oí (t-iffz ее irj ffz (Ttf-iKzOÍCE-jarz

t ейе!; i iS ni [rttmoífcaícEka:!

(— (D H (P h- h ffl h (D X<X<XX<X< XX<X<XI<X<

OJ OJ со см со

> > > >

< < < СО

со СО СО ю

а СИ _J К Z а:

а. СИ m CÉ £ ь а.

со со о СО

н Н- ср 1- <р н-

ш ш t LU t ш

I X < X < I

<Л О и н

t- (р t'

ш t i

х < :

«и» «

Рисунок 9. Вестерн-блот анализ экспрессии экзогенного Arfó е производных линий HET-SR RalA V23 и HET-SR RalBV23. а) Антитела к Arfó, б) Антитела к НА. Антитела к бета-актину использовались в качестве контроля.

Проверка сохранения экспрессии экзогенных белков Ral после введения Arfó проводилась методом Вестерн-блот анализа тотальных клеточных лизатов с антителами к RalA и RalB (см. рис. 10).

X ¡Г -1 О. Z

х к « te й w w О и Í-

RalA ■ «РрЯШЩР RalB ** ч®* актин ^gft-^m ^т* актин

Рисунок 10. Вестерн-блот анализ экспрессии экзогенного RalA и RalB в производных линий HET-SR RalAV23 и HET-SR RalBV23.a) Антитела к RalA. б) Антитела к RalB. Антитела к бета-актину использовались в качестве контроля.

После анализа полученных линий в тесте на СМА (см. рис. 11), оказалось, что введение Arfó в линии HET-SR RalAV23 и HET-SR RalBV23 не привело к изменению уровня СМА по сравнению с линиями, экспрессирующими активные RalA и RalB.

o* / /

Рисунок П. Количество гистологически-верифицированных метастазов в легких спустя 8 недель после подкожного введения исследованных клеточных линий.

Следовательно, экспрессия Arfó сама по себе не приводит к изменению СМА и не влияет на повышение СМА, вызванное экспрессией экзогенных RalA и RalB.

3. Идентификация сигнального пути Arf6-PLD-mTOR-S6Kl и влияние Arfó на активацию основных МАРК

Следующим этапом нашей работы было определение молекулярных механизмов влияния Arfó на функциональные свойства клеток. Прежде всего мы исследовали активность PLD, которая согласно ряду литературных данных может быть стимулирована при активации Arfó. С помощью коммерческого набора для измерения активности PLD мы показали, что в исследуемой нами системе введение активного мутанта Arfó в клетки приводит к значительной стимуляции активности PLD, тогда как в линии HET-SR Arfó N481 активность PLD не отличается от контрольной линии (см. рис. 12), что строго согласуется с имеющимися литературными данными. При обработке в течение 24 часов всех исследованных линий ингибитором PLD, 1% бутанолом-1, наблюдалось статистически значимое уменьшение активности PLD по отношению к не обработанной бутанолом-1 контрольной линии HET-SR pLXSN.

25000-1

>- 20000-Q

а 15000-

★

I

ю

8 10000-

í 5000-

л

0-U-r1-

бутанол-1

Рисунок 12. Анализ активности PLD в полученных клеточных линиях до и после обработки бутанолом-1. Звездочка - статистически достоверное отличие от контрольной линии (р<0,05)

До сих пор мало что известно о том, как происходит дальнейшая передача сигнала после стимуляции PLD Arf6. На сегодняшний день есть данные о том, что PLD стимулирует активность ERK1/2 через основные метаболиты PLD, РА и хо-лин, регулирует экзоцитоз и эндоцитоз, а также участвует в активации киназы mTOR. Мы предположили, что киназа mTOR может быть одной из мишеней Arfó-зависимой активации PLD. Одним из маркеров активности mTOR часто служит уровень фосфорилирования одного из основных ее эффекторов — S6K1. Мы исследовали уровень фосфорилирования S6K1 по 389 треонину и показали, что Arfó влияет на активность S6K1 (см. рис. 13а). Так, введение активного мутанта Arfó приводит к стимуляции активности S6K1, тогда как введение остальных форм Arfó не вызывает изменений уровня фосфорилирования этой киназы. Таким образом, для активации S6K1 в нашей системе требуется активный, ГТФ-связанный Arfó. Поскольку при введении Arfó N481 не наблюдалось активации S6K1, мы предположили, что на фосфорилирование S6K1 влияет PLD. При анализе уровня фосфорилирования S6K1 в лизатах клеток, в которых активность PLD была подавлена бутанолом-1, оказалось, что фосфорилированная форма S6K1 в них практически исчезает, что говорит о том, что активация S6K1 зависит от активности PLD (см. рис. 13а).

а

бутанол-1 P-S6K1

S6K1

б

рапвмицин

P-S6K1

S®« ЩИ ЩМи--------- i"'4Mé чцт. «ев»' ам»

Рисунок 13. Вестерн-блот анализ влияния бутанола-1 (а) и рапамицина (б) на уровень фосфорилирования и экспрессии S6K1. Антитела к S6K1 использовались для определения общего уровня S6K1. Антитела к PT389-S6KI использовались для определения фосфорилированной S6K1

Далее для подтверждения того, что активация S6K1 вызывается активностью mTOR, все исследованные клеточные линии были обработаны ингибитором mTOR, рапамицином (см. рис. 136). Рапамицин оказал действие, схожее с бутанолом-1 -после обработки им клеток фосфорилированная форма S6K1 не детектировалась. Таким образом, впервые показана Arfó-зависимая активация mTOR, причем доказано, что это происходит через активацию PLD.

Поскольку считается, что основным путем активации mTOR является PI3K-Akt сигнальный каскад, мы проверили потенциальную возможность влияния Arfó на активацию Akt. Для этого мы сравнили уровень фосфорилированной по 473 аминокислотному остатку серина киназы Akt в исследованных клеточных линиях и оказалось, что он не изменяется при введении различных форм Arfó (см. рис. 14).

-1 — Z

со О Z Ol h-

£ со со £

< < < <

er (Г an СП

to

h- ь- н- н

ш I ш X ш X ш X

P-Akl

Ml

Рисунок 14. Вестерн-блот анализ уровня фосфорилирования и экспрессии Akt. Антитела к Akt использовались для определения общего уровня Akt. Антитела к PS473-Akt использовались для определения фосфорилированной Akt

Следовательно, в нашей системе Arfó—>PLD—>mTOR—»S6K1 вероятно является основным сигнальным путем, связывающим Arfó и S6K1.

В нескольких недавних работах показана Arfó-зависимая активация ERKI/2, однако, влияние Arfó на активацию остальных основных МАРК - р38 и JNK1 до сих пор практически не изучено. Мы проверили уровень активности ERK1/2, р38 и JNK1 в полученных клеточных линиях.

Оказалось, что ни количество JNK1, ни уровень ее фосфорилирования по 183 треонину, не изменяются ни в одной из исследованных линий, что согласуется с имеющимися литературными данными (см. рис. 15).

о 5 z Р

£ ? Ч £

< < < <

о: а: о: or

Рисунок 15. Вестерн-блот анализ уровня фосфорилирования и экспрессии JNK1. Антитела к JNK1 использовались для определения общего уровня JNK1. Антитела к PT183-JNK1 использовались для определения фосфорилированной JNK1

В отличие от JNK1, степень фосфорилирования р38 различается между производными линии HET-SR при неизменном общем количестве белка р38. Так, уровень фосфорилирования р38 по 182 тирозину и 180 треонину значимо повышается в линии HET-SR Arfó Q67L и в меньшей степени в линии HET-SR Arfó WT, что говорит о том, что активная форма Arfó необходима для активации р38. Arfó дикого

типа, по-видимому, за счет гиперэкспрессии в клетке, частично «оттягивает» клеточные GEF на себя и также несколько стимулирует р38. При этом в линии НЕТ-SR Arfó N481 наблюдается самая низкая степень фосфорилирования р38, что говорит о том, что активация р38 также зависит от взаимодействия Arfó с PLD (см. рис. 16а).

а g § 5 ! £ 6 g о 5 z £

I % % % % 2 i I i !

к а о: а: о: с с с о: а:

СЛ СО СО СД СЛ со со со со со

lil I

ц. к i- ь ь н h н н н

UJ Ш Ш Ш Ш ШШШШШ

м^м rilMh

^^^^ ^^^^

Рисунок 16. Вестерн-блот анализ уровня фосфорилирования и экспрессии р38 (а) и ERK1/2 (б), а) Антитела к р38 использовались для определения общего уровня р38. Антитела к PT180+YI82-p38 использовались для определения фосфорипированной р38. б) Антитела к ERKI/2 использовались для определения общего уровня ERKI/2.

Антитела к P(T202+Y204/TI85+Y187)-ERKl/2 использовались для определения фосфорилированных ERK1/2.

При проверке возможности Arfó-зависимой активации ERK1/2 в нашей системе оказалось, что как и в случае р38, наибольшая степень фосфорилирования ERK1/2 наблюдается в линиях с активным Arfó и Arfó дикого типа (см. рис. 166). При этом уровень экспрессии ERK1/2 оставался неизменным во всех исследованных клеточных линиях. При этом уровень фосфорилированных ERK1/2 в линиях HET-SR Arfó N481 и HET-SR Arfó T27N оказался несколько ниже, чем в контрольной линии. Этот факт согласуется с литературными данными о том, что активность ERK1/2 зависит от PLD.

4. Анализ экспрессии Arfó и RalA в образцах НМРЛ

Отдельным фрагментом данной работы было исследование Arfó и RalA в образцах НМРЛ. Известно, что некоторые эффекторы и регуляторы Arfó гиперэкс-прессированы в инвазивных опухолях различных локализаций. Экспрессия же собственно Arfó при онкопаталогиях человека исследовалась только на образцах глиом. Несколько больше данных имеется относительно экспрессии RalA при различных онкопаталогиях. Так, показано, что уровень экспрессии RalA повышен в об-

разцах опухолей мочевого пузыря и предстательной железы по сравнению с условно-нормальной тканью, а также в образцах периферических опухолей оболочки нерва. Однако исследования RalA в контексте НМРЛ также до сих пор не проводилось.

В данной работе впервые проведен анализ экспрессии мРНК Arfó в первичных опухолях НМРЛ методом ОТ-ПЦР, а также исследование экспрессии белков Arfó и RalA методом Вестерн-блот анализа.

Образцы тканей двух основных типов НМРЛ: ПКРЛ (плоскоклеточный рак легкою) (29 образцов) и АК (аденокарцинома) (24 образца), а также прилегающих к опухолям морфологически нормальных тканей, т.н. «условных норм», были получены от пациентов, оперированных в 2005-2008 гг. по поводу рака легкого в НИИ КО РОНЦ им H.H. Блохина РАМН.

Первичный анализ экспрессии Arfó на выборке из 20 образцов методом ОТ-ПЦР показал, что экспрессия мРНК Arfó снижается в 90% опухолевых образцов по сравнению с «условной нормой» (см. рис. 17). Возможно, снижение экспрессии мРНК Arfó в опухолевых образцах по сравнению с «условной нормой» при НМРЛ может служить потенциальным маркером заболевания, однако, для подтверждения этого факта требуется дальнейшее расширение анализируемой выборки.

Рисунок 17. Анализ экспрессии мРНК Arfó в опухолевой и нормальной ткани легкого методом ОТ-ПЦР. Н - "условная норма", О - опухолевый образец.

При анализе уровня экспрессии белка Arfó в тех же образцах оказалось, что количество белка не коррелировало с экспрессией мРНК Arfó. Мы расширили выборку и проанализировали изменение экспрессии белка Arfó в 53 образцах НМРЛ с целью поиска возможных корреляций с основными гистологическими типами НМРЛ (АК и ПКРЛ), стадией заболевания, степенью дифференцировки опухоли и наличием регионарных метастазов в лимфатические узлы на момент оперативного вмешательства (см. рис. 18).

анонононо бнонононо^

Щ т> «31 * r¡ tm

мв щр,ттщт — Цу «у

|Щ I щи Щ-Щ-ШГ- * RalA ÜP jps®. —*

пкрл ак

Рисунок 18. Анализ экспрессии Arfó и RalA в опухолевой и нормальной ткани легкого методом Вестерн-блот анализа * - миристилированная форма Arfó, а) Образцы ПКРЛ б) образцы АК. Антитела к Arfó и RalA. Антитела к бета-актину использовались в качестве контроля. Н - "условная норма ", О - опухолевый образец.

Хотя статистически значимых корреляций между проанализированными характеристиками опухолей и экспрессией белка Arfó выявить не удалось, был зафиксирован ряд интересных закономерностей. В образцах с повышенной экспрессией Arfó чаще наблюдалась экспрессия миристилированной формы Arfó (59%), тогда как в образцах, где экспрессия Arfó не изменялась, доля образцов с наличием миристилированной формы составила лишь 22%. Наличиие миристилированной формы Arfó статистически значимо (р=0,0185) связано с повышенной экспрессией Arfó. Учитывая, что миристилирование белков Arf важно для мембранной локализации и взаимодействия с эффекторами, этот факт представляется интересным при дальнейшем изучении экспрессии Arfó при HMPJI.

Анализ уровня экспрессии белка RalA в образцах первичных опухолей HMPJI показал, что снижение продукции белка RalA наблюдается практически во всех образцах ПКРЛ, полученных от пациентов без метастазов, в то время как при наличии верифицированных метастазов в регионарные лимфоузлы снижение экспрессии белка RalA наблюдалось реже (в 50% исследованных образцов этой группы). Таким образом, в данной выборке снижение экспрессии белка RalA статистически значимо (р<0,01) связано с отсутствием метастазов у пациентов с ПКРЛ.

В заключение можно сказать, что Arfó несомненно оказывает существенное влияние на важнейшие биологические характеристики трансформированных клеток и вносит значительный вклад в изменение внутриклеточных сигнальных путей. Одним из важнейших наблюдений, с нашей точки зрения, является необходимость взаимодействия Arfó с PLD для стимуляции миграции клеток и активации киназ р38 и ERK1/2. Несомненно интересными являются полученные данные об участии

Arfó в передаче сигнала по пути Arfó—»PLD—>mTOR-+S6Kl, которые открывают перспективы для дальнейшего исследования ассоциированных с Arfó сигнальных каскадов на других моделях и на клиническом материале, в частности при HMPJI.

Выводы

1. На основе линии HET-SR получена панель новых клеточных линий, экс-прессирующих различные формы белка Arfó: дикого типа, конститутивно-активную, доминантно-негативную и не способную взаимодействовать с PLD. Кроме того, получены линии с одновременной экспрессией белков Ral (RalA и RalB) с Arfó (конститутивно-активной и доминантно-негативной формой).

2. Обнаружено, что экспрессия всех исследованных форм Arfó приводит к усилению клоногенности клеток; активная форма Arfó, также как и Arfó дикого типа, увеличивает скорость пролиферации.

3. Отсутствие взаимодействия между Arfó и PLD снижает подвижность клеток, но стимулирует их инвазивность в экспериментах in vitro, что коррелирует с увеличением протеолитической активности иРА.

4. Впервые показана Arfó-зависимая активация киназы S6K1 и идентифицирован Arfó—>PLD—»mTOR—>S6K1 сигнальный путь.

5. Впервые обнаружено Arfó-зависимое фосфорилирование киназы р38; показано, что Arfó приводит к PLD-зависимой активации ERK1/2.

6. Показано, что экспрессия различных форм Arfó не изменяет уровень СМА полученных клеточных линий in vivo и не влияет на Ral-зависимое повышение СМА при одновременной экспрессии с белками RalA и RalB.

7. Впервые исследована экспрессия мРНК Arfó при HMPJI и показано, что в 90% образцов (как АК, так и ПКРЛ) наблюдается падение уровня мРНК в опухоли по сравнению с «условной нормой».

8. Обнаружена статистически значимая корреляция снижения экспрессии белка RalA с отсутствием регионарных метастатических узлов при ПКРЛ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Рыбко В.А., Книжник А.В., Каинов Я.А., Комельков А.В., Чевкина Е.М. Активность протеиназ внеклеточного матрикса в экспериментальной модели опухолевой прогрессии.// Вестник РОНЦ. - 2008 - т. 19., №4— с. 16-21.

2. Kainov Y., Rybko V., Tchevkina Е., Knizhnik A., Komelkov A. Modulation of extracellular matrix remodelling system associated with different metastatic phenotype of v-src transformed cells.// Molecular Mechanism in Signal Transduction and Cancer, Spetses, Greece - 16-24 августа 2009.

3. Рыбко B.A., Книжник A.B., Комельков А.В., Чевкина Е.М., Зборовская И.Б. Исследование молекулярных механизмов Ral-опосредовакной стимуляции метастазирования.// Материалы 13-го Российского онкологического конгресса, Москва - 17-19 ноября 2009.

4. Kovaleva O.V., Knizhnik A.V., Mochalnikova V.V., Favorskaya I.A., Zborovskaya I.B. RalA, Arf6 and Birc5 comparative protein expression analysis in NSCL.// Международный симпозиум в рамках Сибирско-Тайваньского Форума «Опыт и перспективы развития сотрудничества между российскими и тайваньскими учеными в области изучения молекулярно-генетических механизмов развития злокачественных новообразований и использования результатов фундаментальных исследований в онкологии», Томск - 16-17 сентября

5. Knizhnik A., Rybko V., Kovaleva О., Kainov Y., Komelkov A., Tchevkina E. Arf6-dependent signaling contributes to cancer progression in in vivo animal model and lung cancer.// Beatson international cancer conference "Microenvironment, motility and metastasis", Glasgow, Scotland - 5-8 July, 2009.

6. Книжник A.B., Рыбко В.А., Каинов Я.А., Комельков А.В., Чевкина Е.М. Модуляторы активности фосфолипазы D белки RalA и Arf6: влияние на различные характеристики трансформированных клеток.// Цитология. - 2008 - т.50, №9 - с. 807.

7. Tchevkina Е.М., Knizhnik A.V., Rybko V.A., Kainov Y.A., Komelkov A.V. Extracellular Proteases Activity In Tumor Progression Experimental Model.// Anticancer Research. - 2008 - 28, 5C - 3513.

8. Knizhnik A.V., Rybko V.A., Kainov Y.A., Komelkov A.V. and Tchevkina E.M. ARF6 and ECM protease activity in hamster tumor progression experimental model.// Cancer Degradome Symposium, London, UK - 8-9 October 2008.

9. Зборовская И.Б., Аксельрод M.E., Фаворская И.А., Рыбко В.А., Книжник А.В. Молекулярные маркеры метастазирования рака легкого в лаборатории и клинике.// «СПИД, рак и общественное здоровье». - 2008 г. - Т. 1

10. Knizhnik A., Rybko V., Aushev V., Kainov Y., Komelkov A., Tchevkina E. Arf6 participates in modulation of cell metastatic activity in vivo.// European Small GTPase meeting, Umea, Sweden - 29-31 August, 2007.

2009.

Подписано в печать:

12.03.2010

Заказ № 3386 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Белок Arf6 относится к семейству малых G-белков Arf, входящему в состав суперсемейства малых ГТФаз Ras. В то время как в отношении большинства малых ГТФаз накоплен огромный экспериментальный материал, доказывающий их участие в злокачественной трансформации клеток, Arf6 долго оставался «в тени» более известных G-белков. Однако за последние годы появилось множество данных, указывающих на важнейшую роль Arf6 в ключевых аспектах жизнедеятельности клетки, таких как везикулярный транспорт, реорганизация цитоскелета, цитокинез, изменение липидного состава мембран и др. Все больше внимания стало уделяться белкам Arf, в частности Arf6, и в аспекте канцерогенеза. Тем не менее, до сих пор опубликованы лишь единичные работы, исследующие участие Arf6 в опухолевой прогрессии и метастазировании и механизмы, это участие опосредующие. Так, роль непосредственно Arf6 в процессе метастазирования исследовалась лишь в одной работе на линии меланомы человека LOX, где показано, что сигнальный каскад Arf6—>PLD—^ERKl/2—>Racl регулирует процесс инвазии клеток меланомы in vivo (Muralidharan-Chari et al, 2009b). Среди возможных механизмов, определяющих участие Arf6 в канцерогенезе, чаще всего рассматривается АгГб-зависимое изменение цитоскелета и подвижности, а также изменения в эндоцитозе ряда белков, например pi-интегринов, р-катенинов и ряда GPCR. Менее понятной остается роль Arf6 в метаболизме липидов и участие этой ГТФазы во внутриклеточных сигнальных путях. Одним из основных кандидатов на роль эффектора Arf6, влияющего на изменение внутриклеточной передачи сигнала, является PLD (фосфолипаза D). Участие Arf6 в активации PLD показано в нескольких работах последнего времени (Grodnitzky et al, 2007; Begle et al, 2009). PLD продуцирует важнейшие вторичные мессенджеры, РА (фосфатидную кислоту) и холин, которые участвуют в регуляции многих процессов, таких как эндоцитоз, реорганизация мембраны, миграция и др. Таким образом, активация PLD представляется одним из важнейших механизмов, опосредующих участие Arf6 в самых различных аспектах канцерогенеза и опухолевой прогрессии.

Данная работа посвящена исследованию роли Arf6 в изменении основных биологических характеристик трансформированных клеток, а также участия этой малой1 ГТФазы в модуляции внутриклеточных сигнальных путей, ассоциированных с опухолевой прогрессией. В последние годы появилось несколько работ, обнаруживающих Аг£6-зависимую активацию ERK1/2, ключевой MAP киназы Ras-Raf-MAPK сигнального пути, где показано, что Arf6 активирует ERK1/2 PLD-зависимо (Li et al., 2006; Muralidharan-Chari et al., 2009a, b). В то же время, до сих пор не исследовалось влияние Arf6 на активацию других MAP киназ, а также на другие сигнальные пути, связанные с активностью PLD.

В данной работе впервые исследовано влияние Arf6 на MAP киназу р38, а также на киназу S6K1. Для изучения влияния Arf6 на различные функциональные характеристики трансформированных клеток in vivo, а также на молекулярно-биологические характеристики клеток in vitro, была выбрана клеточная линия эмбриональных фибробластов сирийского хомяка (Mesocricetus auratus Waterh) HET-SR. Ранее на данной клеточной линии в лаборатории регуляции клеточных и вирусных онкогенов ГУ РОНЦ им Н.Н. Блохина РАМН показано, что основным, путем, опосредующим модулирующие метастазирование свойства H-Ras, является Ras-RalGDS-Ral зависимый путь (Tchevkina et al., 2005). PLD является одним из эффекторов Ral (Jiang et al., 1995), и, как ранее показано в нашей лаборатории, взаимодействие PLD с Ral является необходимым для Ral-опосредованной стимуляции метатазирования (диссертация н.с. В.А. Рыбко, 2009). Согласно некоторым литературным данным, активация PLD требует совместного участия белков Arf6 и RalA.

В отличие от RalA, экспрессия которого исследовалась при некоторых онкопаталогиях, данные об экспрессии Arf6 в опухолях человека практически отсутствуют. Для исследования возможной роли Arf6 в патогенезе опухолей человека нами проведен анализ его экспрессии в образцах HMPJI (немелкоклеточный рак легкого).

Таким образом, поскольку Arf6 влияет на многие важнейшие внутриклеточные процессы, претерпевающие перестройки в ходе злокачественной трансформации, изучение роли Arf6 в регуляции внутриклеточной передачи сигнала и патогенезе опухолей человека, в частности при таком распространенном заболевании как HMPJI, представляет большой интерес и научно-практическую значимость.

Целью данной работы являлось: Исследование влияния малой ГТФазы Arf6 на ключевые биологические свойства трансформированных клеток в культуре in vitro и метастатическую активность in vivo, а также на активацию отдельных белков и внутриклеточных сигнальных каскадов, ассоциированных с опухолевой прогрессией.

В соответствии с указанной целью предполагалось решить следующие экспериментальные задачи:

1. На основе клеточной линии HET-SR (RSV трансформированные фибробласты хомяка) получить производные линии, стабильно экспрессирующие различные формы белка Arf6: дикого типа, конститутивно-активную, доминантно-негативную, не способную взаимодействовать с PLD.

2. Изучить основные биологические свойства клеток HET-SR, экспрессирующих различные формы Arf6, в культуре in vitro: скорость пролиферации, подвижность, инвазивность, клоногенность и способность к неприкрепленному росту.

3. Исследовать влияние различных форм Arf6 на протеолитическую активность внеклеточных протеаз ММР1,2,9 и иРА, активность PLD, а также на статус фосфорилирования основных MAP киназ (ERK1/2, р38 и JNK1) и киназ Akt и S6K1.

4. Получить клеточные линии, экспрессирующие одновременно активные формы белков Ral (RalA и RalB) и белок Arf6 как в активной, так и в доминантно-негативной форме.

5. Сравнить уровень спонтанной метастатической активности всех полученных клеточных линий in vivo.

6. Провести анализ экспрессии белков Arf6 и RalA в образцах HMPJI человека.

Выводы

1. На основе линии HET-SR получена панель новых клеточных линий, экспрессирующих различные формы белка Arf6: дикого типа, конститутивно-активную, доминантно-негативную и не способную взаимодействовать с PLD. Кроме того, получены линии с одновременной экспрессией белков Ral (RalA и RalB) с Arf6 (конститутивно-активной и доминантно-негативной формой).

2. Обнаружено, что экспрессия всех исследованных форм Arf6 приводит к усилению клоногенности клеток; активная форма Arf6, также как и Arf6 дикого типа, увеличивает скорость пролиферации.

3. Отсутствие взаимодействия между Arf6 и PLD снижает подвижность клеток, но стимулирует их инвазивность в экспериментах in vitro, что коррелирует с увеличением протеолитической активности иРА.

4. Впервые показана АгАб-зависимая активация киназы S6K1 и идентифицирован Arf6—»PLD—»mTOR—>S6K1 сигнальный путь.

5. Впервые обнаружено АгАб-зависимое фосфорилирование киназы р38; показано, что Arf6 приводит к PLD-зависимой активации ERK1/2. I

6. Показано, что экспрессия различных форм Arf6 не изменяет уровень СМА полученных клеточных линий in vivo и не влияет на Ral-зависимое повышение СМА при одновременной экспрессии с белками RalA и RalB.

7. Впервые исследована экспрессия мРНК Arf6 при HMPJI и показано, что в 90% образцов (как АК, так и ПКРЛ) наблюдается падение уровня мРНК в опухоли по сравнению с «условной нормой».

8. Обнаружена статистически значимая корреляция снижения экспрессии белка RalA с отсутствием регионарных метастатических узлов при ПКРЛ.