Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Координированное изменение экспрессии кавеолина-1 и других рафт-образующих белков в опухолевых клетках человека

На правах рукописи

АРХИПОВА Ксения Анатольевна

КООРДИНИРОВАННОЕ ИЗМЕНЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ КАВЕОЛИНА-1 И ДРУГИХ РАФТ-ОБРАЗУЮЩИХ БЕЛКОВ В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА

Специальность 14.01.12-онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

' 9 2010

Москва

2010

004616230

Работа выполнена в Лаборатории регуляции клеточных и вирусных онкогено. НИИ Канцерогенеза Учреждения Российской академии медицинских нау] Российский Онкологический Научный Центр имени Н.Н.Блохина РАМ! (директор - академик РАН и РАМН, д.м.н., проф. М.И.Давыдов)

Научные руководители:

Кандидат биологических наук Доктор медицинских наук

Зборовская Ирина Борисовна Харатишвили Теймураз Кобаевич

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук Доктор биологических наук член-корреспондент РАН Ведущая организация:

Лазаревич Наталья Леонидовна Четверин Александр Борисович

Учреждение Российской академии нау Научно-исследовательский институ

биоорганической химии имен М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

рО часо

Защита диссертации состоится «/3 »{Л1/(1с(р$, 2011 года в на заседании диссертационного совета (Д.001.017.01) РОНЦ имени Н.Н.Блохш РАМН по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24.

С текстом диссертации

в библиотеке РОНЦ имени Н.Н.Блохина РАМН

Автореферат разослан « 2010 года.

можно

ознакомите

Ученый секретарь диссертационного совета д.м.н., профессор

Ю.В. Шишкин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы.

В последние годы все больший интерес молекулярных биологов вызывает изучение лшшдных рафтов - мембранных микродоменов, обогащенных сфинголипидами и холестеролом, а также широким спектром белков. Отдельным типом липидных рафтов являются микродомены, стабилизированные рафт-образующими белками (РОБ). Единой картины о многообразии и взаимодействии различных семейств РОБ, существующих в клетках организма, на сегодняшний день нет, а имеющиеся данные о РОБ разных семейств представляют собой разрозненные публикации. Среди рафт-образующих белков наиболее изученными являются белки семейства кавеолинов. Важность исследования функций кавеолина-1 возросла после обнаружения факта изменения его экспрессии в процессе клеточной трансформации. Роль кавеолина-1 в канцерогенезе обусловлена его способностью формировать сишалосомы, т.е. не только поддерживать целостность липидных рафтов, но и, за счет непосредственного взаимодействия со многими сигнальными молекулами, координировать и регулировать передачу сигналов внутрь клетки. В результате этого кавеолин-1 может влиять на пролиферацию, программируемую гибель клеток, миграцию и другие процессы, важные при опухолевой трансформации клеток. В лавине информации о кавеолинах, другие рафт-образующие белки остаются в «тени» и их роль в канцерогенезе практически не изучена. Тем не менее, много общего с семейством кавеолинов имеют, например, ряд белков семейства ЭРБН (^(.отаПгй, РгоЫЬШпз, НоШНпэ, НАК/С). Они также широко экспрессируются в тканях человека, локализуются преимущественно в плазматической мембране клеток, имеют сходную топологию, способность к олигомеризации и принимают участие в регуляции сигнальных путей, некоторые из которых пересекаются с кавеолиновыми. Таким образом, различные рафт-образующие белки теоретически могут являться функциональными аналогами друг друга, что делает привлекательной идею о возможности их взаимозаменяемости. Однако такого рода исследований ранее не проводилось, так же как и не проводились совместные скрининговые исследования данных белков в опухолях человека различного гистогенеза.

В данной работе нами исследованы опухоли как эпителиального, так и мезенхимального происхождения. Среди эпителиальных опухолей лидирующие позиции по заболеваемости и смертности последние десятилетия занимает рак легкого. Идентификация молекулярных маркеров, определяющих риск возникновения или прогрессию рака легкого, представляется одной из наиболее актуальных проблем современной молекулярной онкологии. В то же время солидные опухоли мезенхимального происхождения, в частности, мягкотканые саркомы, с точки зрения молекулярной патологии, изучены недостаточно, вследствие их редкой встречаемости и большого разнообразия гистотипов. Однако тот факт, что данная категория злокачественных новообразований поражает преимущественно людей молодого возраста, а оперативное вмешательство, как правило, часто приводит к инвалидизации пациентов, молекулярно-генетические исследования мягкотканных сарком безусловно актуальны, а выявление новых факторов прогноза или мишеней для противоопухолевой терапии может иметь большую научно-практическую ценность. Именно поэтому данные группы онкопатологий были выбраны нами в качестве объектов исследования.

Цель и задачи исследования.

Цель данной работы — изучить экспрессию гена кавеолина-1 и других рафт-образующих белков в опухолевых клетках человека эпителиального и мезенхимального происхождения.

Для достижения цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Исследовать экспрессию гена САУ-1 на уровне мРНК и белка, и генов F¿OГ-^, РЮТ-2 и БТОМ на уровне мРНК в опухолях человека мезенхимального и эпителиального происхождения.

2. Провести корреляционный анализ уровней относительной экспрессии САУ-1, РЮТ-1 и 8ТОМ в группах опухолей различного гистогенеза.

3. Сопоставить изменения экспрессии мРНК и белка гена САУ-1, и мРНК генов РЬОТ-1, ¥ЮТ-2 и 5ТОМс клиническими показателями прогрессии опухолей у пациентов с различными типами новообразований.

4. Изучить изменения экспрессии рафт-образующих белков в клеточной линии рака легкого с подавленной экспрессией кавеолина-1.

Научная новизна.

В данной работе впервые проведено совместное скрининговое исследование рафт-образующих белков двух семейств: кавеолина-1, как главного представителя семейства кавеолинов, и белков семейства 8РРН — флотиллина-1, флотиллина-2 и стоматина в опухолях человека различного генеза. Более того, скрининговых исследований экспрессии РОБ семейства БРИН в опухолях человека ранее не проводилось. В ходе работы выявлена ранее не описанная сильная корреляционная связь между уровнями экспрессии генов БТОМ и РЮТ-1, характерная для всех исследованных типов опухолей, а также впервые показано статистически значимое различие профилей экспрессии мРНК РОБ солидных мезенхимальных опухолей и немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ). Совместные исследования рафт-образующих белков разных семейств на модельных системах в литературе также практически отсутствуют. В ходе работы получены приоритетные данные об изменении экспрессии РОБ семейства БРРН при подавлении экспрессии кавеолина-1 на модельной системе клеточной линии рака легкого.

Научно-практическая значимость.

Изучение рафт-образующих белков разных семейств и возможных путей их взаимной регуляции позволит расширить фундаментальные знания о механизмах опухолевой трансформации и прогрессии, что крайне актуально и представляет не только большой теоретический научный интерес, но, в связи с их активным участием в регуляции онкозависимых сигнальных путей, может широко применяться при решении проблем современной молекулярной онкологии. Результаты же исследования кавеолина-1 уже сегодня могут быть внедрены в повседневную клиническую практику.

Положения, выносимые на защиту.

1. Образцы НМРЛ и мезенхимальных опухолей характеризуются изменениями экспрессии мРНК РОБ. Для НМРЛ характерно снижение экспрессии мРНК всех четырех исследованных генов РОБ, в то время как в группе

мезенхимальных опухолей выявлены разные варианты изменений экспрессии. Профили экспрессии мРНК РОБ HMPJ1 и мезенхимальных опухолей статистически достоверно различаются.

2. Между уровнями экспрессиями мРНК РОБ существуют корреляционные взаимодействия; корреляционная связь между стоматином и флотиллином-1 самая сильная и характерна для двух исследованных групп опухолей.

3. Наличие взаимных регуляций между РОБ двух разных семейств подтверждено на модельной системе клеточной линии рака легкого.

Публикации и апробация работы

Диссертация апробирована и рекомендована к защите 28 сентября 2010 года на совместной научной конференции лабораторий регуляции клеточных и вирусных онкогенов, молекулярной биологии вирусов, онкогеномики, механизмов химического канцерогенеза, цитогенетики и механизмов канцерогенеза НИИ Канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Материалы работы докладывались на конференции «Петровские чтения» в 2009 г. (Санкт-Петербург), на международном симпозиуме в рамках Сибирско-Тайваньского Форума «Опыт и перспективы развития сотрудничества между российскими и тайваньскими учеными в области изучения молекулярно-генетических механизмов развития злокачественных новообразований и использования результатов фундаментальных исследований в онкологии» в 2009 г. (Томск) и на конференции «International life sciences students' conference» в 2010 (Ниймеген, Голландия).

По результатам диссертационной работы опубликовано 2 научные статьи и 4 тезиса докладов.

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста, содержит 25 рисунков, 13 таблиц. Состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы», «Список использованной литературы», «Приложение». Список литературы содержит 180 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

В работе использованы следующие методы исследования: выделение тотальной РНК из тканей, синтез кДНК на матрице мРНК, полимеразная цепная реакция (ПЦР), ПЦР в реальном времени, электрофорез нуклеиновых кислот, трансформация бактериальных клеток, выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток, трансфекция эукариотических клеток, инфицирование клеток лентивирусными векторами, выделение и анализ белковых фракций с помощью вестерн-блот гибридизации, анализ ферментативной активности протеиназ внеклеточного матрикса (субстрат-специфическая зимография в ПААГ), а также статистическая обработка данных.

В работе проводилось исследование операционного материала от больных раком легкого и опухолями мезенхимального происхождения, проходивших лечение в НИИ КО РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН. У каждого из пациентов из групп, анализируемых в данном исследовании, был взят образец опухолевой и условно нормальной тканей того же генеза.

Таблица 1. Характеристика исследованных образцов рака легкого.

Характеристика Количество пациентов (%)

Размер опухоли

рТ1 9(18)

рТ2 23 (46)

рТЗ 9(18)

рТ4 9(18)

Поражение регионарных лимфоузлов

р1Ч0 21 (42)

рМ 13 (26)

рШ 16(32)

Отдаленные метастазы

Отсутствуют 47 (94)

Присутствуют 3(6)

Стадия заболевания

I 14 (28)

П 13 (26)

Ш 20 (40)

IV 3(6)

Степень дифференцировки

Высокая 2(4)

Умеренная 31 (62)

Низкая 17 (34)

Группа НМРЛ включала в себя 50 образцов, 22 из которых составляли

аденокарциномы и 28 - плоскоклеточный рак легкого. Группа опухолей

мезенхимального происхождения включала в себя 39 образцов, 5

доброкачественных и 34 злокачественные опухоли. Более подробные

характеристики исследованных выборок представлены в таблице 1 и 2.

Таблица 2. Характеристика исследованных образцов мезенхимального происхождения.

Гистогенез опухоли Степень Количество

злокачествен- пацентов

ности

Доброкачественные 5

Липома 3

Шваннома 2

Злокачественные 33

Липосаркома 15

Низкодифференциро ванная г 3

Высокодифференциро ванная 1 9

Другая дифференцнровка 2

Синовиальная саркома г 1

3 5

Злокачественная фиброзная 2 1

гистиоцитома (ЗФГ) 3 6

Злокачественная шваннома 1 1 2

3

Лейомиосаркоиа 3 1

Веретеноклеточная саркома 1

Результаты исследования и обсуждение

Определение уровня относительной экспрессии мРНК генов СА V-!, РЮТ-1 и БТОМ методом ПЦР в реальном времени в образцах НМРЛ.

Значения относительной экспрессии генов СА У-1 и 8ТОМ были получены для 48 образцов опухолевой ткани исследуемой выборки и гена РЬОТ-1 для 47 образцов. Снижение относительной экспрессии кавеолина-1 в опухолевой ткани по сравнению с условно нормальной тканью выявлено в подавляющем большинстве случаев, а именно в 46 из 48 (95,8%) исследованных образцов (рис.1). В двух из исследованных образцов рака легкого количества мРНК С А У-1 в опухолевой и условно нормальной ткани не различались. Схожую картину мы получили и для

генов БТОМи РЮТ-1. Относительная экспрессия ЭТОМ и РЮТ-1 была снижена в 40 (83,3%) и 38 (79,17%) образцах, соответственно.

НМРЛ

50-1

Количество образцов 1—1 1И 1 1 п _ П

СМ Л ЭТОМ Р1-ОТ.1 Р1.0Т-2

Экспрессия мРНК в опухолевой ткани ЕЗ Повышена по сравнению с условно Ш Снижена

нормальной тканью: д равна

Рисунок 1. Профили относительной экспрессии мРНК генов САУ-1, БТОМ, РЬОТ-1 и ПОТ-2 в выборке НМРЛ.

Анализ экспрессии мРНК генов РОБ в образцах НМРЛ выявил, что в 5 из исследованных образцов рака легкого количества мРНК 5ТОМ в опухолевой и нормальной тканях были одинаковы, и в таком же количестве образцов не изменилась экспрессия и FLOГ-^. Повышение относительной экспрессии мРНК гена БТОМ было выявлено в трех образцах, в таком же количестве образцов было отмечено повышение относительной экспрессии мРНК и гена ЛОГ-У (рис.1).

Корреляционный анализ изменений относительной экспрессии мРНК генов СА Г-1, РЮТ-1 и БТОМ.

Следующим этапом нашей работы стал совместный анализ данных об изменениях относительной экспрессии РОБ в образцах НМРЛ, для чего использовался корреляционный параметр Спирмена, позволяющий оценить одновременные изменения экспрессии всех трех исследованных РОБ в одном образце и выявить корреляционные связи между их относительными экспрессиями в целом для группы. Коэффициент корреляции Спирмена может принимать значения от -1 до 1, положительные значения коэффициента говорят о том, что при изменении экспрессии одного из генов экспрессия другого изменится пропорционально и в ту же сторону. Чем больше значение коэффициента, тем выше вероятность такого синхронного изменения. Полученные результаты

статистической обработки приведены в таблице 3.

9

Таблица 3. Коэффициенты корреляции Спирмена между кавеолином-1, флотиллнном-1 и стоматином в группах согласно клннико-морфологннеским характеристикам.

Группы Коэффициент корреляции Спирмена

Кавеолин-1 и Кавеолин-1 и Стоматин и

стоматин флотиллин-1 флотиллин-1

Аденокарциномы 0.468 НС 0.853

Стадия заболевания

1-И 0.674 НС 0.790

ПНУ НС НС 0.936

Размер опухоли

Т1-Т2 0.584 НС 0.840

ТЗ-Т4 0.950 НС НС

Поражение регионарных

лимфоузлов

N1-2 НС НС 0.923

N0 НС НС 0.862

Степень дифференцировки

Средняя НС НС 0.851

Низкая НС НС 0.786

Плоскоклеточный рак 0.469 НС 0.839

Стадия заболевания

1-И 0.770 0.558 0.876

НС НС 0.809

Размер опухоли

Т1-Т2 0.799 0.751 0.933

ТЗ-Т4 НС НС 0.769

Поражение регионарных

лимфоузлов

N1-2 НС НС 0.844

N0 0.745 НС 0.909

Степень дифференцировки

Средняя НС НС 0.797

Низкая НС НС 0.767

Группы Коэффициент корреляции Спирмена

Кавеолин-1 и стоматин Кавеолин-1 и флотиллин-1 Стоматин и флотиллин-1

Рак легкого (объединенная выборка) 0.451 НС 0.849

Стадия заболевания

Ы1 0.680 0.451 0.861

III.IV НС НС 0.879

Размер опухоли Т1-Т2 0.676 0.509 0.891

ТЗ-Т4 НС НС 0.812

Поражение регионарных лимфоузлов

N1-2 НС НС 0.886

N0 0.575 НС 0.908

Степень дифференцировки

Средняя Низкая 0.382 НС НС НС 0,848 0,844

НС - нет статистической достоверности.

Как видно из таблицы, профили изменений уровней относительной экспрессии стоматина и флотиллина-1 имеют самую сильную корреляционную связь, как в группе аденокарцином, так и в группе плоскоклеточного рака легкого. В зависимости от клинико-морфологических показателей эта связь варьирует незначительно, за исключением группы аденокарцином большого размера, где эта связь пропадает. Корреляционная связь между кавеолином-1 и флотиллином-1 выявлялась только в группах, разделенных по клиническим критериям, а именно, в группе плоскоклеточного рака легкого малого размера (показательТ1-2, опухоль до 5 см в диаметре) и 1-П стадии заболевания (Т1-2М)М0). Причем сохранение этой связи в общей выборке рака легкого в таких же группах можно объяснить большим вкладом именно плоскоклеточного рака, потому что численные значения коэффициентов корреляции оказались ниже (0,751 против 0,509 и 0,558 против 0,451, соответственно). Наибольший интерес, на наш взгляд, представляет

11

корреляционная связь между уровнями относительной экспрессии кавеолина-1 и стоматина. Стоит отметить, что в обобщенной выборке рака легкого, она появляется в группах с наиболее «благоприятными» признаками, такими как малые размеры опухоли (К = 0,676), отсутствие поражений регионарных лимфоузлов (К = 0,575), умеренная и высокая степень дифференцировки опухоли (К = 0,382) и, соответственно ранняя стадия заболевания (К = 0,680).

Однако, если посмотреть на таблицу в целом, можно заметить, что все группы «благоприятных» признаков, за несколькими исключениями, характеризуются не только наличием корреляционных связей между исследованными РОБ, но и тем фактом, что они сильнее выражены. Это позволило выдвинуть гипотезу, согласно которой, синхронные, пропорциональные изменения экспрессии мРНК РОБ характеризуют наличие некой взаимосвязи между белками m vivo, в особенности на ранних стадиях развития онкопатологии, в то время как прогрессированис заболевания, ведущее к увеличению размеров опухоли, снижению степени дифференцировки, образовыванию очагов вторичного роста, приводит ко все большему дисбалансу внутриклеточных сигнальных путей и потере корреляционных взаимодействий между РОБ.

Определение уровня экспрессии гена FLOT-2 методом ОТ-ПЦР в образцах

НМРЛ.

Оценку количеств мРНК FLOT-2 в опухолевой и условно нормальной тканях (46 случаев) мы проводили методом ОТ-ПЦР (см. рис.1 и 2). В подавляющем большинстве образцов (в 36 из 46 образцов, 78,3%) мы также обнаружили снижение экспрессии FLOT-2 в опухолевой ткани. Только в одном образце аденокарциномы T2N1M0 (IIB) было выявлено повышенное количество мРНК флотиллина-2 (рис. 2). В оставшихся 9 образцах количества мРНК FLOT-2 в опухолевой и условно нормальной тканях не различались.

Анализ профиля экспрессии FLOT-2 с учетом клинико-морфологических показателей выявил, что снижение экспрессии характерно для опухолей, дающих метастазы в регионарные лимфоузлы, а сохранение нормального уровня экспрессии мРНК — для опухолей тех пациентов, у которых на момент

оперативного вмешательства не выявлено метастатических поражений регионарных лимфоузлов (р<0,05, критерий %2).

но но но но но

AK TINOMO(IA) ПКT4N1M1 (IV) AKT3N3M0(I1IA) ПКТ2№М0(111А) AKT2N1M0(I1B)

Рисунок 2. Примеры электрофореграмм, отображающих изменения экспрессии мРНК флотиллина-2 в опухолевой ткани по сравнению с условной нормой в образцах HMPJ1. АК - аденокарцинома, ПК - плоскоклеточный рак легкого, Н - условно нормальная ткань, О - опухолевая ткань. Дана характеристика образцов согласно TNM классификации, в скобках указана стадия заболевания. Две левые электрофореграммы -примеры неизмененной экспрессии флотиллина-2, следующие две — снижения экспрессии, крайняя правая - единственно зарегистрированное повышение экспрессии флотиллина-2 в опухолевой ткани по сравнению с условно нормальной.

Определение экспрессии белка кавеолина-1а методом Вестерн-блот анализа в

образцах НМРЛ.

Оценку количества белка кавеолина-1а в опухолевой и условно нормальной тканях проводили с помощью Вестерн-блот анализа, в качестве референсного белка использовали актин (рис. 3). В подавляющем большинстве образцов (34 из 48,71%) уровень экспрессии белка кавеолина-1а в опухолевой ткани был снижен.

ПК T2N0M0 (HB) AKTINOMO(IA) AK T2N2M0 <ША)

Рисунок 3. Вестерн-блот анализ экспрессии белка кавеолина-1а в образцах опухолей и условно нормальных тканей НМРЛ. АК - аденокарцинома, ПК - плоскоклеточный рак легкого, И - условно нормальная ткань, О - опухолевая ткань. Дана характеристика образцов согласно ТЫМ классификации, в скобках указана стадия заболевания.

Только в 14 образцах количества белка в опухолевой и условно нормальной ткани оказались равными. Одиннадцать из 14 (78,6%) образцов представляли опухоли малого размера (Т=1-2), однако из них 8 образцов (57%) получены от пациентов, с метастазами в регионарных лимфоузлах, что характеризует данные

опухоли как агрессивные, неблагоприятно текущие. Соотнесение экспрессии белка кавеолина-1а с клинико-морфологическими показателями опухолей статистически достоверных закономерностей не выявило.

Определение экспрессии рафт-образующих белков в мезенхимальных

опухолях.

В группе мезенхимальных опухолей мы также провели оценку уровней относительной экспрессий мРНК генов САУ-1, БТОМи РЮТ-1 и экспрессии белка кавеолина-1а в образцах опухолей и условно нормальных тканей. Анализ количества мРНК РОБ также проводили методом ПЦР в реальном времени. Полученные результаты приведены на рисунке 4.

Мезенхимальные опухоли

Экспрессия мРНК в опухолевой ткани О Повышена по сравнению с условно ЕЗ Снижена

нормальной тканью: □ Равна

Рисунок 4. Профили относительной экспрессии мРНК генов СА У-1, 5ТОМ и ГЬОТ-1 в выборке мезенхимальных опухолей.

Анализ данных с учетом гистогенеза исследованных опухолей показал, что для группы липосарком характерно снижение относительной экспрессии мРНК САУ-1, в то время как другие группы опухолей имеют разные варианты отклонений (рис. 5). Статистическая обработка полученных данных подтвердила, что группы липосарком и других опухолей мезенхимального происхождения характеризуются разными профилями экспрессии мРНК САУ-1 (р<0,05, критерий х2)- При разделении выборки на группы по локализации опухолевого очага (опухоли конечностей и забрюшинного пространства), мы выявили различия профилей относительной экспрессии гена САУ-1 в данных группах (р=0,0511, критерий х2)-

Соотнесение профилей экспрессии 5'ТОМ с локализацией опухолей или их гистогенезом статистически значимых различий не выявило, однако обращает на себя внимание тот факт, что для ЗФГ характерно именно повышение относительной экспрессии мРНК стоматина, так как из 7 имеющихся образцов ЗФГ, повышение наблюдали в 6.

Липосаркомы

1

0_аШ

Опухоли другого гистогенеза

Забрюшинная локализация

8 И

п

п ь

Опухоли конечностей

Экспрессия мРНК в опухолевой ткани по сравнению с условно нормальной тканью:

ЕЗ Повышена ЕЗ Снижена □ Равна

Рисунок 5. Профили относительной экспрессии мРНК генов САУ-1, $ТОМ и РЬОТ-1 в группах, выделенных по гистогенезу и локализации исследованных образцов мезенхимальных опухолей.

Анализ профилей относительной экспрессии РЬОТ~1 выявил статистически значимые различия в группах липосарком и опухолей другой гистологии, а также в группах опухолей конечностей и забрюшинного пространства (см. рис. 5).

Стоит отметить, что группу опухолей забрюшинного пространства на 80% составили липосаркомы, чем, видимо, и объясняются выявленные различия в профилях относительной экспрессии СА V-! и РЬОТ-1 в группах, выделенных по локализации исследованных опухолей.

Совместный анализ профилей относительной экспрессии всех трех РОБ с использованием корреляционного критерия Спирмена выявил довольно сильные корреляционные связи между уровнем экспрессии флотиллина-1 и стоматина (К =

0,668) и кавеолина-1 и флотиллина-1 (К = 0,5).

15

Оценку уровня экспрессии белка кавеолина-1а в опухолевой и условно нормальной тканях проводили методом Вестерн-блот анализа (рис. 6).

А Ь

и о нон о но но и о

тШ ••

но но но и о

Пакам» м <•** Шк***- ■

1 7 ' ' 8 ' <) 1(1

Рисунок 6. Экспрессия белка кавеолина-1а в образцах мезенхимальных опухолей по данным вестерн-блот анализа. 1,3 — низкодифференцированные липосаркомы; 2, 4 — высокодифферещированные липосаркомы; 5 — синовиальная саркома; 6 — лейомиосаркома; 7 — лейомиома; 8, 9 — липомы; 10 — шваннома; Н — условно нормальная ткань; О— опухолевая ткань.

А. Примеры опухолей со сниженным уровнем экспрессии белка кавеолина-1а. Б. Образцы с повышенной экспрессией белка кавеолина -1а. В. Экспрессия белка кавеолина-1а в группе доброкачественных опухолей.

В большинстве образцов (23 из 29, 79,3%) злокачественных опухолей мезенхимального происхождения мы зафиксировали снижение экспрессии кавеолина-1а. Увеличение количества кавеолина-1а в опухолевой ткани мы обнаружили в трех образцах. Равные количества кавеолина-1а в опухолевой и условно нормальной тканях были выявлены в двух образцах ЗФГ и высокодифференцированной липосаркоме. Мы также проанализировали изменения экспрессии белка кавеолина-1а в 5 образцах доброкачественных мезенхимальных опухолей (см. рис. 6),и ни в одном из 5 исследованных образцов мы не отметили снижения экспрессии кавеолина-1а (только в одном образце липомы количество кавеолина-1а в опухолевой ткани превышало содержание такового в нормальной ткани).

Сравнение групп НМРЛ и мезенхимальных опухолей по экспрессии РОБ.

Получив данные об относительной экспрессии мРНК РОБ и белка кавеолина-1а, мы сопоставили эти результаты для групп НМРЛ и мезенхимальных опухолей. Оказалось, что профили относительной экспрессии мРНК генов САУ-1, ЗТОМ и РЮТ-1 статистически достоверно различаются в двух исследованных группах (р<0,05, критерий х2, Рис- ?)• Группа НМРЛ характеризуется снижением относительной экспрессии мРНК РОБ в подавляющем большинстве образцов и крайне незначительным процентом повышения экспрессии, в то время как в группе мезенхимальных опухолей выявлено гораздо больше образцов с повышенной относительной экспрессией мРНК РОБ. Сравнение данных по экспрессии белка кавеолина-1а так же выявило статистически значимые различия (рис. 7).

НМРЛ Мбаенхимальные опухоли

в !* а о 30- 0 в г20' 1 10£ 1-1 га П РЯ Количество обрэоцое р г ? ? ? 5* * 9 п I 1 § # I п я £ 1 И в п

САУ-1 в ТОМ Р10Т-1 КавеолинИа ^ САУ-1 бТОМ Р^ТИ . Кавеолин-1а

мРНК Бело* мРНК Белок

Экспрессия в опухолевой ткани по сравнению с условно щ Повышена □ Снижена □ Равна нормальной тканью:

Рисунок 7. Сопоставление профилей экспрессии мРНК РОБ и белка кавеолина-1а в выборках НМРЛ и мезенхимальных опухолей.

Тем не менее, группы НМРЛ и мезенхимальных опухолей имеют и ряд общих черт. Так, экспрессия кавеолина-1 снижается в большинстве образцов двух групп, как на уровне белка, так и на уровне мРНК. В этих же группах нами была обнаружена сильная корреляционная связь между стоматином и флотиллином-1. Однако группа НМРЛ характеризуется наличием связи между изменениями экспрессии кавеолина-1 и стоматина, в то время как группа мезенхимальных опухолей - связью между кавеолином-1 и флотиллином-1.

Совместный анализ экспрессии кавеолина-1а и малой ГТФазы RalA в группе

НМРЛ.

В регуляции таких процессов как везикулярный транспорт (эндо- и экзоцитоз), перестройка цитоскелета, передача сигналов от фосфолипаз и формирование межклеточных контактов, где показано влияние экспрессии РОБ, важными участниками являются малые ГТФазы семейства Ral. Из данных научной литературы известно, что подавление экспрессии кавеолина-1 в линиях рака легкого Н1299 и Н358 приводит к снижению экспрессии малой ГТФазы RalA, но не RalB. Более того, ранее в нашей лаборатории в экспериментальной системе обнаружено, что экспрессия разных мутантных форм RalA влечет за собой изменение экспрессии кавеолина-1. Поэтому мы проанализировали имеющуюся выборку первичных образцов НМРЛ с точки зрения одновременных изменений экспрессий как RalA, так и кавеолина-1 а. Так как ранее в лаборатории изменения экспрессии RalA в образцах НМРЛ уже были оценены, то мы провели сопоставление результатов.

Уровень экспрессии RalA определен в 48 образцах НМРЛ. Большинство опухолевых образцов (31 образец, 64,6%) характеризовалось меньшим содержанием RalA по сравнению с нормальной тканью. В 13 образцах уровень экспрессии RalA в опухолевой и условно нормальной тканях был равен, и только в четырех образцах зафиксировано повышение экспрессии RalA. Совместный анализ экспрессии кавеолина-1 а и RalA показал, что одновременное снижение экспрессии двух белков характерно для 22 образцов из 44 (50%). При этом на фоне снижения кавеолина-1 а (33 образца), доля образцов со сниженной экспрессией RalA составила уже 67%. Таким образом, данные скрининговых исследований также подтверждают возможное существование регуляторных механизмов между экспрессиями кавеолина-1 и малой ГТФазой RalA. К сожалению, при соотнесении данных по экспрессии с клинико-морфологическими характеристиками исследованных образцов статистически достоверных закономерностей не выявлено

Определение активности протеаз в опухолях мезенхимального происхождения.

Кавеолы и кавеолин-1, в частности, участвуют в регуляции деградации внеклеточного матрикса. В кавеолах локализуются матриксные металлопротеазы МТ1-ММР, ММР-2, ММР-9, рецептор сериновой протеазы иРА, и цистеиновая протеаза катепсин В. Более того, кавеолин-1, взаимодействуя с перечисленными белками, регулирует их активность. Мы решили провести исследование активностей ММР2 и ММР9, а также урокиназо-подобного активатора плазминогена (иРА) и тканевого активатора плазминогена (1РА) в опухолях мезенхимального происхождения и сопоставить полученные результаты с данными по экспрессии белка кавеолина-1а.

В исследование активности желатиназ, иРА и 1РА были взяты 20 образцов мезенхимальных опухолей, три из которых составили доброкачественные опухоли, и соответствующих условно нормальных тканей. Примеры типичных зимограмм приведены на рисунках 8 и 10.

н о н о но

1 2 3

Рисунок 8. Определение активности желатиназ ММР2 и ММР9 в образцах мезенхимальных опухолей методом зимографии. 1 — синовиальная саркома, 2 — злокачественная шваннома, 3 — веретеноклеточная саркома. Н — условно нормальная ткань, О — опухолевая ткань, К+ — положительный контроль.

При анализе полученных данных оказалось, что не все опухолевые и условно нормальные образцы тканей характеризуются активностью ММР2 и ММР9 (рис. 9). Так, в 8 парах образцов, две из которых - доброкачественные опухоли, активность ММР2 выявлена не была. Активность ММР9 не была обнаружена в 6 парах образцов (одна пара - доброкачественная опухоль). Стоит отметить, что одновременное отсутствие активности ММР2 и ММР9 как в опухолевой, так и в условно нормальной тканях нами было зафиксировано в четырех злокачественных образцах (2 ЗФГ, синовиальной саркоме и липосаркоме) и одном доброкачественном образце липомы конечности.

Активность протеаз в опухолевой ЕЕЭ Повышена ткани по сравнению с условно ЕЯ Снижена нормальной тканью: □ Равна

Щ Не выявлена

■I Доброкачественные опухоли

Рисунок 9. Результаты исследования активности протеаз в образцах мезенхимальных опухолей.

В большинстве исследованных образцов (8 из 12), имеющих активность ММР2, выявлено повышение активности данной металлопротеазы. Снижение же активности ММР2 в опухоли по сравнению с нормальной тканью мы обнаружили в злокачественной лейомиосаркоме и доброкачественной шванноме. В двух образцах (веретеноклеточная саркома и липосаркома) активности ММР2 в опухолевой и условно нормальной тканях оказались равными.

Анализ активности ММР9, напротив, показал снижение активности данной металлопротеазы в половине образцов (7 из 13), из которых 2 образца представляли доброкачественные опухоли. Повышением активности ММР9 характеризовались 3 синовиальные саркомы, ЗФГ и веретеноклеточная саркома. Равная активность ММР9 в опухолевой и условно нормальной ткани была отмечена только в образце злокачественной шванномы (см. рис. 8).

Таким образом, одновременным повышением активности двух металлопротеаз характеризуются 2 синовиальные саркомы - наиболее агрессивный тип мезенхимальных опухолей. А одновременным снижением - доброкачественная шваннома и лейомиосаркома.

Соотнесение полученных данных по активности металлопротеаз в образцах мезенхимальных опухолей с данными по белковой экспрессии кавеолина-1а статистически значимых закономерностей не выявило.

Активность uPA и tPA также была обнаружена не во всех исследованных образцах, (рис.10)

Рисунок 10. Определение активности uPA и tPA в образцах мезенхимальных опухолей.

I, 2 — нпзкодифференцированные липосаркомы; Н — условно нормальная ткань, О — опухолевая ткапь, К+ — i-1 i_i положительный контроль (иРА).

I К+ I 2

Так, в двух образцах синовиальных сарком активность uPA не выявлена ни в опухолевых, ни в условно нормальных тканях. Активность tPA не была обнаружена в 6 парах образцов.

В большинстве образцов (11 из 18) мы зафиксировали повышение активности ! uPA, в то время как активность tPA оказалась сниженной в 12 из 14 (85,7%) исследованных опухолевых образцов. Повышение активности tPA выявлено в образце доброкачественной шванномы и синовиальной саркомы. Анализ результатов активности uPA показал, что 3 из 4 исследованных липосарком характеризуются равной активностью uPA в условно нормальной и опухолевой тканях. Равная активность также была показана для двух образцов доброкачественных опухолей. Снижение активности uPA в опухолевой ткани по сравнению с условно нормальной выявлено в двух образцах синовиальных сарком. Также, как и в случае, с активностью металлопротеаз, закономерностей между изменениями активностей uPA, tPA и экспрессией белка кавеолина-1а не выявлено.

Анализ экспрессии РОБ и белков семейства Ral на модели клеточной линии Н322 при направленном подавлении экспрессии кавеолина-1.

Для оценки возможного влияния кавеолина-1 на экспрессию других РОБ, мы решили моделировать снижение экспрессии кавеолина-1 в клеточной линии рака легкого человека Н322. Экспрессию кавеолина-1 подавляли, вводя в клетки вектор, кодирующий последовательность шпильки, которая в последствие формирует в клетке короткую двуцепочечную РНК (киРНК), комплементарную мРНК целевого гена, а именно, CAV-1. Помимо производных линий с двумя вариантами шпилек

tPA -пРЛ-

Ü

мы также получили линию Н322 с «контрольным» вектором, несущим киРНК к мРНК белка вБР (киОРР), не экспрессирующимся данными типами клеток

Результаты инфекции проверялись при помощи Вестерн-блот анализа тотальных клеточных лизатов с антителами к кавеолину-1а (рис. 11). Таким образом, были получены три линии, производные Н322, экспрессирующие 2 варианта киРНК и контрольную киРНК к вРР белку.

Рисунок 11. Вестерн-блот анализ экспрессии кавеолина-1 в производных клеточной линии Н322. В качестве референсного белка использовали ¡3-актин

котроль ки Сяг-1(1) ки Са\-1(2)

При исследовании опухолевых образцов были выявлены сильные корреляционные связи между уровнями относительной экспрессии разных рафт-образующих белков, характерные как для опухолей эпителиального происхождения, так и для мезепхимальных новообразований. Следующим этапом работы стало выяснение того, что происходит с экспрессией стоматина и флотиллинов на фоне снижения экспрессии кавеолина-1. Проведенный Вестерн-блот анализ показал, что в линии рака легкого Н322 при снижении кавеолина-1 количество белка стоматина снижается, а флотиллина-1 и -2 — повышается (рис. 12).

Полученные данные заставили нас вновь пересмотреть данные скрининговых исследований. С одной стороны, в группе НМРЛ нами выявлена корреляционная связь между кавеолином-1 и стоматином, а с другой стороны, подтверждения наличия очень сильной корреляционной связи между стоматином и флотиллином-1 на модельных системах клеточных линий мы так и не получили. Однако отсутствие корреляций между уровнем экспрессии белка и мРНК кавеолина-1 может говорить о том, что сравнивать данные по мРНК с данными по белку для генов РОБ не очень корректно. Однако, если принять во внимание, что флотиллины имеют ряд общих с кавеолином-1 сигнальных путей и, возможно, хотя бы частично дублируют его функции, то повышение экспрессии флотиллинов становится вполне

22

предсказуемым. Таким образом, мы получили первое подтверждение этой

контроль KHCav-l(l) ки Cav-1(2)

Рисунок 12. Вестерн-блот анализ уровня экспрессии сто.матина и флотиллинов в производных клеточной линии Н322, со сниженной экспрессией кавеолина-1. В

качестве референсного белка исполъзовачи /i-актин.

Мы также проверили, что происходит с экспрессией белков семейства малых ГТФаз Ral в полученных линиях. Оказалось, что при снижении экспрессии кавеолина-1 в линии Н322 происходит снижение экспрессии RalB. но не RalA (рис. 13).

Рисунок 13. Вестерн-блот анализ экспрессии Ral ГТФаз в клеточных линиях Н322 со сниженной экспрессией кавеолина-1. В качестве референсного белка использовали fi-актин.

контроль ки Cav-l(l) ки Cav-1(2)

В заключение можно сказать, что рафт-образующие белки играют чрезвычайно важную роль в жизнедеятельности клетки, регулируя активность большого числа сигнальных белков. Противоречие между ожидаемой смертью

нокаутных по гену САУ-1 животных и их реальной жизнеспособностью говорит лишь о малой изученности дублирующих механизмов и РОБ других семейств. В данной работе мы показали возможность существования таких взаимосвязей между РОБ семейств кавеолинов и БРБН-домен содержащих белков. Факт существования регуляторных структур в плазматической мембране открывает широкие перспективы для исследований, как дублирующих механизмов, так и совместного участия разных РОБ в регуляции ключевых1 клеточных процессов, и понимания того, как нарушения работы таких мембранных микроплатформ могут приводить к или ускорять опухолевую трансформацию. Кроме того, первые результаты о наличии закономерностей между экспрессией РОБ и клинико-морфологическими показателями опухолевой прогрессии дают возможность в будущем рассматривать их в качестве онкомаркеров.

Выводы

1. Впервые показано изменение экспрессии мРНК РОБ в опухолевой ткани по сравнению с условно нормальной тканью для НМРЛ и солидных мезенхимальных опухолей и выявлено статистически значимое различие профилей экспрессии мРНК РОБ солидных мезенхимальных опухолей и НМРЛ.

2. Впервые выявлена сильная корреляционная связь между уровнями экспрессии генов 5ГОМи РЬОТ-1, характерная как для НМРЛ, так и для солидных опухолей мезенхимального происхождения.

3. Впервые показано, что наличие корреляционных связей между экспрессиями мРНК РОБ характерно для групп образцов НМРЛ с благоприятными признаками (ранние стадии заболевания, малый размер опухолей, отсутствие метастатических поражений регионарных лимфоузлов, умеренная дифференцировка)

4. Выявлены различия между липосаркомами и опухолями другого гистогенеза по профилям экспрессии мРНК САУ-1 и FLOГ-^.

5. В образцах НМРЛ выявлена статистически значимая закономерность между снижением экспрессии мРНК гена РЬОТ-2 и наличием метастатического поражения регионарных лимфоузлов.

6. Показано снижение уровня продукции белка кавеолина-1 в подавляющем большинстве образцов как НМРЛ (72%), так и опухолей мезенхималыюго происхождения (79,3%). В исследованных образцах доброкачественных опухолей мезенхималыюго происхождения снижения продукции белка кавеолина-1 не отмечено.

7. На модельной системе клеточной линии Н322 впервые экспериментально подтверждено наличие регуляторных взаимодействий между РОБ разных семейств.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Архипова К.А., Тележкина А.Н., Зборовская И.Б., Роль кавеолина-1 в канцерогенезе// Молекулярная и прикладная генетика: сб. науч. тр. — 2008 — Т. 7 —С. 157-168.

2. Архипова К.А., Рыбко В.А., Землякова В.В., Близнюков О.П., Мартынков Д.В., Губина Г.И., Зборовская И.Б, Экспрессия кавеолина-1 в опухолях мягких тканей// Вестник РОНЦ им.Н.Н.Блохина — 2009г, — №1— С. 4-9.

3. Zborovskaya I., Lactionov К.К., Polotsky В., Yudin D., Favorskaya I., Musatkina E., Kochetkova M., Kovaljova O., Mochalnikova V., Arhipova K., Stepanova E., Ahmedov В., Telezhkina A. Underlying molecular alterations in progression of NSCLC // Anticancer Research — 2008— 28, 5C— 3550-3551.

4. Zborovskaya I.B., Arkhipova K. A. Telezhkina A.N., Musatkina E.A., Komelkov A.V.,Rybko V.A., Allahverdiev A.K., Polotzky B.E.,Expression of protein, associated with lipid rafts microdomains, in NSCLC // В сб. международного симпозиума в рамках Сибирско-Тайваньского Форума «Опыт и перспективы развития сотрудничества между российскими и тайваньскими учеными в области изучения молекулярно-генетических механизмов развития злокачественных новообразований и использования результатов фундаментальных исследований в онкологии» — 2009 г — С. 94-96.

5. Архипова К. А., Тележкина А.Н., Мочальникова В.В., Зборовская И.Б. Экспрессия кавеолина-1 и других рафт-образующих белков в мезенхимальных опухолях и немелкоклеточном раке легкого// Вопросы онкологии — 2009 — N6.

6. Telezhkina A., Arkhipova К., Zborovskaya I. The expression of lipid raft proteins caveolin-I, stomatin, flotillins-l and -2 in non-small cell lung cancer// International Life Science Students Conference, Nijmegen, Netherlands — 11-12 November 2010.

Подписано в печать: 15.11.2010

Заказ № 4527 Тираж - 75 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Актуальность. В последние годы все больший интерес молекулярных биологов вызывает изучение липидных рафтов - мембранных микродоменов, обогащенных сфинголипидами и холестеролом, а также широким спектром белков. Отдельным типом липидных рафтов являются микродомены, стабилизированные рафт-образующими белками (РОБ). Единой картины о многообразии и взаимодействии различных семейств РОБ, существующих в клетках организма, на сегодняшний день нет, а имеющиеся данные о РОБ разных семейств представляют собой разрозненные публикации. Среди рафт-образующих белков наиболее изученными являются белки семейства кавеолинов. Важность исследования функций кавеолина-1 возросла после обнаружения факта изменения его экспрессии в процессе клеточной трансформации. Роль кавеолина-1 в канцерогенезе обусловлена его способностью формировать сигналосомы, т.е. не только поддерживать целостность липидных рафтов, но и, за счет непосредственного взаимодействия со многими сигнальными молекулами, координировать и регулировать передачу сигналов внутрь клетки. В результате этого кавеолин-1 может влиять на пролиферацию, программируемую гибель клеток, миграцию и другие процессы, важные при опухолевой трансформации клеток. В лавине информации о кавеолинах, другие рафт-образующие белки остаются в «тени» и их роль в канцерогенезе практически не изучена. Тем не менее, много общего с семейством кавеолинов имеют, например, ряд белков семейства ЗРБН (^отайпэ, РгоЫЬШпб, ИоШНпб, НАК/С). Они также широко экспрессируются в тканях человека, локализуются преимущественно в плазматической мембране клеток, имеют сходную топологию, способность к олигомеризации и принимают участие в регуляции сигнальных путей, некоторые из которых пересекаются с кавеолиновыми. Таким образом, различные рафт-образующие белки теоретически могут являться функциональными аналогами друг друга, что делает привлекательной идею о возможности их взаимозаменяемости. Однако такого рода исследований ранее не проводилось, так же как и не проводились совместные скрининговые исследования данных белков в опухолях человека различного гистогенеза.

В данной работе нами исследованы опухоли как эпителиального, так и мезенхимального происхождения. Среди эпителиальных опухолей лидирующие позиции по заболеваемости и смертности последние десятилетия занимает рак легкого. Идентификация молекулярных маркеров, определяющих риск возникновения или прогрессию рака легкого, представляется одной из наиболее актуальных проблем современной молекулярной онкологии. В то же время солидные опухоли мезенхимального происхождения, в частности, мягкотканые саркомы, с точки зрения молекулярной патологии, изучены недостаточно, вследствие их редкой встречаемости и большого разнообразия гистотипов. Однако тот факт, что данная категория злокачественных новообразований поражает преимущественно людей молодого возраста, а оперативное вмешательство, как правило, часто приводит к инвалидизации пациентов, молекулярно-генетические исследования мягкотканных сарком безусловно актуальны, а выявление новых факторов прогноза или мишеней для противоопухолевой терапии может иметь большую научно-практическую ценность. Именно поэтому данные группы онкозаболеваний были выбраны нами в качестве объектов исследования.

Целью данной работы являлось изучение экспрессии гена кавеолина-1 и других рафт-образующих белков в опухолевых клетках человека эпителиального и мезенхимального происхождения.

В соответствии с указанной целью предполагалось решить следующие экспериментальные задачи:

1. Исследовать экспрессию гена СА V-! на уровне мРНК и белка, и генов ПОТ-1, ЕЬОТ-2 и 8ТОМ на уровне мРНК в опухолях человека мезенхимального и эпителиального происхождения.

2. Провести корреляционный анализ уровней относительной экспрессии САУ-1, РЬОТ-1 и ЭТОМ в группах опухолей различного гистогенеза.

3. Сопоставить изменения экспрессии мРНК и белка гена САУ-1, и мРНК генов РЬОТ-1, РЬОТ-2 и БТОМ с клиническими показателями прогрессии опухолей у пациентов с различными типами новообразований.

4. Изучить изменения экспрессии рафт-образующих белков в клеточной линии рака легкого с подавленой экспрессией кавеолина-1.

Научная новизна. В данной работе впервые проведено совместное скрининговое исследование рафт-образующих белков двух семейств: кавеолина-1, как главного представителя семейства кавеолинов, и белков семейства 8РБН — флотиллина-1, флотиллина-2 и стоматина в опухолях человека различного генеза. Более того, скрининговых исследований экспрессии РОБ семейства БРРН в опухолях человека ранее не проводилось. В ходе работы выявлена ранее не описанная сильная корреляционная связь между уровнями экспрессии генов БТОМ и ЕЬОТ-1, характерная для всех исследованных типов опухолей, а также впервые показано статистически значимое различие профилей экспрессии мРНК РОБ солидных мезенхимальных опухолей и НМРЛ. Совместные исследования рафт-образующих белков разных семейств на модельных системах в литературе также практически отсутствуют. В ходе работы получены приоритетные данные об изменении экспрессии РОБ семейства ЭРРН при подавлении экспрессии кавеолина-1 на модельной системе клеточной линии рака легкого.

Научно-практическая значимость. Изучение рафт-образующих белков разных семейств и возможных путей их взаимной регуляции позволит расширить фундаментальные знания о механизмах опухолевой трансформации и прогрессии, что крайне актуально и представляет не только большой теоретический научный интерес, но, в связи с их активным участием в регуляции онкозависимых сигнальных путей, может широко применяться при решении проблем современной молекулярной онкологии.

Список использованных сокращений.

АК аденокарцинома

ГТФ гуанозинтрифосфат

HMPJI немелкоклеточный рак легкого

ПК плоскоклеточный рак легкого

РОБ рафт-образующие белки

ЭПР эндо-плазматический ретикулум

САР ассоциированный с с-СЬ1 белок (от англ. c-Cbl-associated protein)

CBD домен связывания с кавеолином-1 (от англ. caveolin-1 binding domain) CSD caveolin scaffolding domain

EGF эпидермальный фактор роста (от англ. epidermal growth factor)

EGFR рецептор эпидермального фактора роста (от англ. epidermal growth factor receptor) eNOS эндотелиальная синтаза оксида азота (от англ. endothelial nitric oxide synthase)

ERK1/2 киназа регулируемая внеклеточными факторами 1/2 (от англ. extracellular signal-regulated kinase 1/2) FAK киназа фоакльных контактов (от англ. focal adhesion kinase)

GLUT транспортер глюкозы (от англ. glucose transporter)

GPI гликозилфосфоинозитол (от англ. glycosyl posphatidylinositol) HSP90 белок теплового шока (от англ. heat shock protein)

IGF-1 инсулино-подобный фактор роста (от англ. insulin-like growth factor 1)

МАРК

ММР PCNA

PDGF

PI3K РКВ РКС РР2А

PTEN

SLP

SPFH

TGF иРА uPAR

VEGF

VEGFR киназа, активируемая митогенами (от англ. mitogen-activated protein kinase) матриксная металлопротеаза (от англ. matrix metalloprotease) антиген пролиферирующих клеток (от англ. proliferating cell nuclear antigen) фактор роста, полученный из тромбоцитов (от англ. platelet derived growth factor) фосфо-инозитол-3-киназа (от англ. phospho-inositol-3-kinase) протеиновая киназа В (от англ. protein kinase В) протеиновая киназа С (от англ. protein kinase С) активатор фосфатазы 2А (от англ. protein phosphatase 2А activator) гомолог тензина и фосфатазы (от англ. phosphatase and tensin homolog) стоматин-подобные белки (от англ. stomatin-like-proteins) Stomatins, Prohibitins, Flotillins, HflK/C трансформирующий фактор роста (от англ. transforming growth factor) урокиназо-подобный активатор плазминогена (от англ. urokinase-type plasminogen activator) рецептор урокиназо-подобного активатора плазминогена (от англ. urokinase-type plasminogen activator receptor) эндотелиальный фактор роста сосудов (от англ. vascular endothelial growth factor) рецептор эндотелиального фактора роста сосудов (от англ. vascular endothelial growth factor receptor)

Выводы:

1. Впервые показано изменение экспрессии мРНК РОБ в опухолевой ткани по сравнению с условно нормальной тканью для HMPJI и солидных мезенхимальных опухолей и выявлено статистически значимое различие профилей экспрессии мРНК РОБ солидных мезенхимальных опухолей и HMPJI.

2. Впервые выявлена сильная корреляционная связь между уровнями экспрессии генов STOM и FLOT-1, характерная как для HMPJI, так и для солидных опухолей мезенхимального происхождения.

3. Впервые показано, что наличие корреляционных связей между экспрессиями мРНК РОБ характерно для групп образцов HMPJI с благоприятными признаками (ранние стадии заболевания, малый размер опухолей, отсутствие метастатических поражений регионарных лимфоузлов, умеренная дифференцировка).

4. Выявлены различия между липосаркомами и опухолями другого гистогенеза по профилям экспрессии мРНК CAV-1 и FLOT-].

5. В образцах HMPJI выявлена статистически значимая закономерность между снижением экспрессии мРНЕС гена FLOT-2 и наличием метастатического поражения регионарных лимфоузлов.

6. Показано снижение уровня продукции белка кавеолина-1 в подавляющем большинстве образцов как HMPJI (72%), так и опухолей мезенхимального происхождения (79,3%). В исследованных образцах доброкачественных опухолей мезенхимального происхождения снижения продукции белка кавеолина-1 не отмечено.

7. На модельной системе клеточной линии Н322 впервые экспериментально подтверждено наличие регуляторных взаимодействий между РОБ разных семейств.