Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Идентификация внутриклеточных сигнальных путей и функций белков, модулирующих процессы метастазирования и опухолевой прогрессии



На правах рукописи

ЧЕВКИНА ЕЛЕНА МАКСИМОВНА

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ СИГНАЛЬНЫХ ПУТЕЙ И ФУНКЦИИ БЕЛКОВ, МОДУЛИРУЮЩИХ ПРОЦЕССЫ МЕТАСТАЗИРОВАНИЯ И ОПУХОЛЕВОЙ ПРОГРЕССИИ

Специальность 14.01.12 - онкология

(V

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

005554838

Москва — 2014

005554838

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина» Российской академии медицинских наук

(директор - академик РАН и РАМН, дм.н., проф. Михаил Иванович Давыдов)

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук., профессор, ФГБУ «НИИ Эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заместитель директора по научной работе

Доктор биологических наук., профессор, ФГБУ «Медико-Генетический Научный Центр» РАМН, заведующий лабораторией молекулярной генетики сложно наследуемых заболеваний

Боженко Владимир Константинович Доктор медицинских наук, заслуженный врач России, профессор,

ФГБУ «Россйиский научный центр рештенрадиологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующий отделом патоморфологии и лабораторной диагностики

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Инсттут молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта» РАН.

Народицкий Борис Савельевич

Карпухин Александр Васильевич

Защита диссертации состоятся 2014 года в /V часов

на заседании диссертационного совета Д 001.017.02 Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24) или на сайте http://www.ronc.ru

Автореферат разослан «_»_2014 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Юрий Андреевич Барсуков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования.

Диссертационная работа посвящена одной из важнейших задач экспериментальной онкологии - идентификации роли различных белков и сигнальных путей, регулирующих злокачественный потенциал опухолевых клеток. Как известно, в процессе селекции опухолевые клетки (или клоны клеток) за счет генетической нестабильности приобретают дополнительные качества, позволяющие им выживать в условиях гипоксии, проникать в окружающую ткань и в кровоток, выживать в кровяном русле, противостоять атакам со стороны иммунной системы, прикрепляться и проникать в органы-мишени и, в конечном счете, пролиферировать в новом микроокружении, создавая очаги вторичного роста, то есть метастазы. Несмотря на появление новых методов диагностики, онкологические заболевания часто обнаруживают уже в ходе процесса метастазирования. Очевидно, что это клинически значимое явление невозможно предотвратить без понимания фундаментальных механизмов, определяющих процесс метастазирования на молекулярном и клеточном уровнях. Перечисленные выше характеристики клеток, приобретаемые ими в процессе отбора, являются результатом многочисленных изменений активности как отдельных генов и их продуктов, так и целых каскадов, передающих внутриклеточные и дистанционные сигналы. Несмотря на достижения последних лет, касающиеся роли отдельных белков и внутриклеточных сигнальных каскадов, имеющиеся данные в значительной степени противоречивы и фрагментарны и далеко не в полной мере объясняют картину событий, происходящих в процессе приобретения трансформированными клетками высоко агрессивного фенотипа. Этим во многом объясняется тот факт, что таргетная терапия злокачественных новообразований, направленная на подавление отдельных онкогенов и регулируемых ими процессов, в ряде случаев оказывается недостаточно эффективной, поскольку зачастую направленное подавление активности одного белка (и активируемого им сигнального каскада) вызывает активацию альтернативных сигнальных путей, которые приводят к приобретению опухолевой клеткой дополнительных селективных преимуществ. Иногда такая терапия приводит к отбору еще более агрессивных клонов, и после короткой ремиссии происходит стремительное прогрессирование заболевания. Поэтому все активнее развиваются идеи одновременного (параллельного или последовательного) подавления нескольких белков и сигнальных путей, вовлеченных в процесс трансформации и опухолевой прогрессии.

Очевидно, что такой комплексный подход требует понимания всей совокупности событий, происходящих в опухолевой клетке, и, прежде всего, четких представлений о функциях и механизмах регуляции отдельных белков, их взаимосвязи с другими белками и внутриклеточными сигнальными путями, а также их роли в различных аспектах процесса

злокачественной трансформации и опухолевой прогрессии. Данная работа посвящена выявлению белков, участвующих в регуляции важнейших в аспекте канцерогенеза внутриклеточных сигнальных путей, таких как Ha-Ras-, PLD-mTORCl- и Erkl/2-ассоциированные каскады, и исследованию функциональной роли в опухолевой прогрессии и метастазировании малых ГТФаз суперсемейства Ras: RalA, RalB, Arfó, а также белка, связывающего ретиноевую кислоту, CRABP1. Идентификация и функциональный анализ новых белков и сигнальных каскадов, задействованных в регуляции опухолевой прогрессии и процесса метастазирования, является важнейшей фундаментальной задачей молекулярной биологии и экспериментальной онкологии.

Цель исследования.

Целью данной работы является поиск и исследование функциональной роли новых внутриклеточных сигнальных путей и белков, участвующих в регуляции процессов опухолевой прогрессии и метастазирования.

Задачи исследования.

1. На экспериментальной модельной системе клеток трансформированных фибробластов сирийского хомяка исследовать влияние экспрессии онкогена H-Ras на уровень метастатической активности клеток.

2. Идентифицировать основные эффекторные белки и сигнальные пути, реализующие прометастатическую активность онкогена H-Ras.

3. Определить функциональное значение активации и подавления активности малой ГТФазы Ral для модуляции спонтанной метастатической активности клеток данной экспериментальной системы.

4. Провести сравнительный анализ влияния изоформ RalA и RalB на характеристики клеток in vivo и in vitro, ассоциированные с опухолевой прогрессией.

5. Определить важнейшие молекулы-эффекторы белков RalA и RalB, задействованные в Ral-зависимом усилении метастатической активности. Изучить влияние белков RalA/RalB на продукцию и активность ряда белков, вовлеченных в различные аспекты опухолевой прогрессии, таких как протеиназы внеклеточного матрикса, MAP киназы, белки CD24, Cav-1, Cyclin DI и др.

6. Определить влияние экспрессии малой ГТФазы Arf6 (а также совместной экспрессии белков Arfó, RalA и RalB) на уровень спонтанной метастатической активности исследуемых клеток. Определить значение экспрессии Arfó для пролиферативной и инвазивной активности клеток.

7. Идентифицировать сигнальные пути и молекулярные механизмы, реализующие промитогенную активность Arfé, Исследовать роль данной ГТФазы в отношении активности

фосфолипазы PLD, комплекса mTORCl и его мишеней: рибосомальной киназы S6K1, рибосомального белка S6, белка, связьгеающего фактор инициации трансляции eIF-4E, 4Е-ВР1, а также MAP киназ Erkl/2, р38 и Jnk.

8. Провести анализ экспрессии генов Ral и Arfó в клинических образцах немелкоклеточного рака легкого. Сопоставить полученные данные с клинико-морфологическими характеристиками исследуемых образцов.

9. Определить функциональную роль экспрессии белка CRABP1 в формировании высокоагрессивного фенотипа клеток на модели трансформированных фибробластов сирийского хомяка. Изучить влияние данного белка на туморогенность и метастатический потенциал клеток in vivo.

10. Исследовать экспрессию мРНК CRABP1 в образцах сарком мягких тканей. Исследовать продукцию белка CRABP1 в монофазных синовиальных саркомах.

Научная новизна исследования.

В ходе работы были получены результаты, свидетельствующие о значительном влиянии онкогена H-Ras на усиление метастатического потенциала трансформированных клеток, и определены основные мишени и сигнальные пути, реализующие про-метастатическую функцию H-Ras. Результаты, полученные в процессе данной работы, являются одними из первых в мире опубликованных доказательств первостепенной значимости H-Ras/RalGDS/Ral сигнального пути в H-Ras-зависимой стимуляции метастазирования, а также роли собственно малых G-белков, RalA и RalB, в данном процессе. В работе первые показано, что среди двух гомологичных белков, RalA и RalB, активация RalB в большей степени усиливает спонтанную метастатическую активность клеток in vivo. Ранее аналогичных работ по сравнению влияния гомологов RalA и RalB на спонтанную метастатическую активность клеток не проводилось. При этом обнаружено, что про-метастатическая активность белка RalB осуществляется за счет взаимодействия с фосфолипазой D (PLD). Также впервые показано, что малая ГТФаза Arf6, также относящаяся к суперсемейству малых G-белков Ras, активируя PLD, потенцирует один из ключевых в аспекте канцерогенеза белков, киназу mTOR, стимулируя PLD/mTORCl/-S6Kl-S6 и PLD/mTORCl/-4E-BPl сигнальные пути, приводящие к активации комплекса инициации трансляции. Кроме того, экспрессия Arf6 стимулирует важнейшие митоген-активируемые киназы (MAP киназы) Erkl/3 и р38, причем активация последней также приводит к активации компонентов комплекса инициации трансляции. Ранее данных об Arfó-зависимой активации киназы р38 опубликовано не было. Полученные данные также впервые свидетельствуют о промитогенной функции Arfó, реализуемой за счет активации Arfó/PLD/mTOR- и Arfó/p38-зависимых сигнальных путей.

Еще одним исследуемым в работе белком является связывающий ретиноевую кислоту белок СКАВР1, значение которого в процессах опухолевой прогрессии и метастазирования ранее не изучалось. Автором впервые показано, что в рамках данной экспериментальной модели экспрессия СГ1АВР1 прямо коррелирует с уровнем спонтанной метастатической активности клеток. Более того, впервые обнаружено, что экспрессия СИАВР1 усиливает туморогенность опухолевых клеток, а подавление экспрессии СЯАВР1 - снижает как туморогенность, так и метастатическую активность клеток. На основании полученных на экспериментальной модели результатов в рамках данной работы было впервые проведено исследование экспрессии гена СКАВР1 в образцах опухолей человека мезенхимального происхождения - саркомах мягких тканей.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Проведенные исследования привели к обнаружению новых внутриклеточных сигнальных путей, приводящих к приобретению трансформированными клетками высоко агрессивного фенотипа и метастатической активности. Получен ряд приоритетных данных, свидетельствующих о ранее не известных функциях в опухолевой прогрессии отдельных белков (таких, как белок, связывающий ретиноевую кислоту, СЯАВР1) и внутриклеточных путей передачи сигналов. Так, представленные в работе результаты выявили важнейшую роль Н-11а5Л1аКЮ5/11а1 сигнального пути в приобретении высоко-метастазного фенотипа трансформированными клетками. Также большое значение имеет обнаружение про-митогенной активности малой ГТФазыАгГб и ее участия в регуляции таких ключевых в канцерогенезе белков, как киназы тТОЯ и Егк1/2. Идентификация новых сигнальных путей, Айб—>Р1Л5—»тТ(ЖС 1 —>86К1—>86, А1*6-»Р1ЛЭ->тТ(ЖС1->4Е-ВР1 и р38->56, приводящих к активации компонентов комплекса инициации трансляции, также является крайне значимым как для понимания молекулярных механизмов регуляции тТОЯ и процесса инициации трансляции, так и для направленного изменения активности комплекса тТСЖС 1 при разработке новых таргетных препаратов.

Основная масса полученных результатов опубликована как в отечественных, так и в известных международных научных журналах и имеет большое теоретическое значение, существенно расширяя уровень знаний о фундаментальных аспектах молекулярных нарушений и функциональных изменений трансформированных клеток, лежащих в основе опухолевой прогрессии и метастазирования. Полученные данные будут служить основой для дальнейших фундаментальных исследований в области молекулярных механизмов канцерогенеза. Ряд данных (в частности, новые механизмы регуляции тТОЯ и Егк1/2, а также обнаружение про-туморогенной активности СЯАВР1 и его убиквитарной экспрессии в синовиальных саркомах) имеет также и практическое значение, и может быть использовано в клинических исследованиях для оценки агрессивности, дифференциальной диагностики, прогнозировании течения и

разработки мишеней для направленной трансляционной терапии злокачественных опухолей человека. На основании полученных результатов предложено дальнейшее исследование белка CRABP1 в патогенезе синовиальных сарком (в частности, ИГХ анализ данного белка в образцах бифазных синовиальных сарком) и злокачественных фиброзных гистиоцитом в качестве потенциального диагностического и прогностического маркера.

Апробация работы.

Диссертация апробирована 28 октября 2013 г. на совместной научной конференции отдела трансформирующих генов опухолей, лаборатории регуляции клеточных и вирусных онкогенов, лаборатории механизмов канцерогенеза, лаборатории механизмов химического канцерогенеза, лаборатории механизмов прогрессии эпителиальных опухолей НИИ Канцерогенеза ФГБУ РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН.

Публикации результатов исследования.

По итогам исследования опубликовано 33 научные работы (21 в зарубежной печати), из них 15 статей в ведущих рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Основные положения, выносимые на защиту.

l.H-Ras является стимулятором метастатической активности трансформированных фибробластов сирийского хомяка in vivo и реализует про-метастатическое действие посредством активации внутриклеточного сигнального пути: H-Ras—RalGDS—Ral.

2.0сновными мишенями H-Ras, увеличивающими метастатический потенциал клеток данной экспериментальной модели, являются малые ГТФазы RalA и RalB, причем RalB обладает большей про-метастатической активностью.

3.Как RalA-, так и RalB-зависимое увеличение метастатического потенциала исследуемых клеток in vivo сопровождается сходным повышением показателей уровня малигнизации клеток in vitro, однако про-метастатическое действие RalA и RalB опосредуется различными сигнальными путями.

4.Малая ГТФаза Arfó активирует PLD и усиливает активность киназы mTOR и ее мишеней (рибосомальной киназы S6K1, рибосомального белка S6, белка, связывающего фактор инициации трансляции eIF-4E, 4Е-ВР1), а также активирует MAP киназы Eikl/2 и р38. Идентифицированы акгавируемые белком Arf6 сигнальные пути: PLD—>mTORC 1 —>S6K 1 —>S6, PLD—»mTORC 1 —>4E-BP1, p38—»S6, приводящие к активации комплекса инициации трансляции.

5.Arf6 усиливает пролиферативную активность трансформированных фибробластов и их способность к автономному росту, однако не оказывает значимого влияния на метастатическую активность исследуемых клеток. Молекулярные механизмы, реализующие промитогенную активность Arfó, включают активацию сигнального пути PLD—mTORC 1 и усиление активности р38.

6.Белок, связывающий ретиноевую кислоту (CRABP1) обладает протуморогенной и прометастатической активностью в отношении трансформированных фибробластов.

7. мРНК CRABP1 дифференциально экспрессируется в злокачественных опухолях мягких тканей в зависимости от гистологического типа опухоли. Белок CRABP1 убиквитарно и на высоком уровне экспрессирован в монофазных синовиальных саркомах.

Степень достоверности результатов исследования.

Представленная работа выполнена с использованием современных методов молекулярной биологии и экспериментальной онкологии. Результаты иллюстрированы рисунками, таблицами, схемами и фотографиями. Выводы вытекают из полученных результатов, полностью доказаны и адекватно отражают содержание диссертации. Достоверность результатов обеспечивается использованием современных методов исследования, наличием адекватных положительных и отрицательных контролей, проведением всех экспериментов в трех и более независимых повторах, применением современных способов статистической обработки данных. Все непосредственно изложенные в работе результаты опубликованы в ведущих отечественных и международных журналах.

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 294 страницах машинописного текста, состоит из введения, 5 глав, заключения, 11 выводов, списка сокращений и списка литературы, содержащего 643 источника. Материал диссертации иллюстрирован 13 таблицами и 97 рисунками.

Содержание работы Материалы и методы исследования

Материалы исследования'.

1.Панель клеточных линий мезенхимального происхождения — фибробластов сирийского хомяка, трансформированных штаммом Шмидг-Руппин Д вируса саркомы Рауса (система линий HET-SR), либо спонтанно трансформированных в культуре in vitro (линии STHE), принципиально -отличающихся между собой по уровню органоспецифического метасгазирования в легкие при введении экспериментальным животным. Панель включает: исходно низкометастазные варианты — линии HET-SR, STHE; исходно высокометастазные линии: HET-SR-1, HET-SR-8; линии, приобретшие высокометастазный фенотип в ходе селекции in vivo: HET-SR-LNM, STHE 83/20, STHE LNM8. Данная модель позволяет исследовать причины и молекулярные механизмы, определяющие различия в метастатической активности клеток единого происхождения, другими достоинствами данной модели являются возможность проведения теста на спонтанную метастатическую активность (СМА), органоспецифический характер метасгазирования и использование иммунокомпетентных экспериментальных животных.

2.Для исследования влияния экспрессии, активации, подавления или модификации отдельных белков на исследуемые клеточные линии были использованы следующие кодирующие генетические последовательности дикого типа или несущие точечные замены: Ha-RasV12, На-RasV12G37, Ha-RasV12C40, Ha-RasV12S35, RalAG23V, RalBG23V, RalAS28N, RalAG23VD49N, RalAG23VD49E, RalAG23VANll, RalBG23VD49N, RalBG23VD49E, RalBG23VANU, Arf6Q67L, Arf6WT, Arf6T27N, Arf5N48I, CRABP1WT. Для введения данных последовательностей в клетки использовались ретровирусные векторы pLXSN, pBabe-puro, лентивирусные векторы pLV-CMV и pLKO.l-puro. Для получения псевдо-ретровирусных частиц использовали клетки GP293. Для получения псевдо-лентивирусных частиц использовали клеточную линию 293FT.

3.Клинические образцы опухолей и условно-нормальных тканей, включая немелкоклеточный рак легкого (аденокарциномы и плоскоклеточные раки) и саркомы мягких тканей (синовиальные саркомы, злокачественные гистиоцитомы, липосаркомы и злокачественные шванномы.

4.Парафиновые блоки опухолевых тканей монофазных синовиальных сарком. Методы исследования

1. Работа с культурами эукариогических клеток, фенотипирование in vitro: анализ пролиферации, подвижности, инвазивносга, клоногенности, способности к неприкрепленному росту и др.).

2. Трансфекция бактериальных и эукариотических клеток.

3. Ретровирусная инфекция эукариотических клеток.

4. Лентивирусная инфекция эукариотических клеток.

5. Выделение нуклеиновых кислот из культур клеток и клинических образцов с последующим их анализом с помощью различных модификаций ПЦР (прямой ПЦР, ОТ-ПЦР, ПЦР в реальном времени).

6. Получение кДНК и молекулярное клонирование.

7. Получение малых шпилечных РНК.

8. Выделение белков из культур клеток и клинических образцов с последующим анализом методом иммуноблоттинга.

9. Анализ активности белков: субстрат-специфическая зимография, анализ фосфорилированных форм белков, анализ ГТФ-связанных форм G-белков (Pull-down assay), флуоресцентный анализ ферментативной активности фосфолипазы Д.

10. Иммуногистохимический анализ.

11. Фенотипирование клеток in vivo: анализ туморогенности (трансплантационный тест), спонтанной (СМА) и экспериментальной (ЭМА) метастатической активности.

12. Статистическая обработка результатов. Для определения значимых различий в случае сравнения двух выборок применялся двухсторонний критерий Манна-Уитни. Для определения

значимых различий при сравнении трех и более групп применяли критерий Крускала-Уоллиса. Расчеты производились с помощью программы GraphPad Prizm версия 5.02 (GraphPad Software Inc.) и IBM SPSS Statistics ver. 21 (IBM). Для определения статистической значимости взаимосвязи между клиническими характеристиками опухолей и экспрессией исследуемых белков использовался двухсторонний точный критерий Фишера. Уровень достоверности определялся как р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Анализ влияния онкогена H-Ras на метастатическую активность трансформированных фибробластов и идентификация H-Ras-зависимых сигнальных путей, обеспечивающих усиление метастатического потенциала

1.¡.Экспрессия активированного онкогена H-Ras увеличивает спонтанную метастатическую активность трансформированных фибробластов посредством активации H-Ras/RalGDS/Ral сигнального пути.

Одним из основных подходов к изучению механизмов метастазирования и опухолевой прогрессии являются исследования in vitro и in vivo на экспериментальных моделях. Одна из таких моделей представляет собой систему стабильных клеточных линий общего происхождения — первичных трансформированных эмбриональных фибробластов сирийского хомяка (Mesocricetus auratus). Часть линий этой системы была получена с помощью трансформации путем инфекции разными изолятами штамма Schmidt-Ruppin D (SR-D) вируса саркомы Рауса (RSV) (линии группы HET-SR). Другая группа линий была получена при спонтанной трансформации эмбриональных фибробластов в культуре in vitro (линии группы STHE) (рис. 1А). Описываемая панель линий была получена в лаборатории противоопухолевого иммунитета НИИ Канцерогенеза РОНЦ РАМН им. Н.КБлохина, ранее подробно охарактеризована и многократно использовалась в работах российских ученых и зарубежных коллег, посвященных исследованию процесса метастазирования. Клетки всех линий данной панели обладают типично трансформированным фенотипом и выраженной туморогенностью при подкожном введении сингенным животным, но при этом принципиально различаются по уровню органоспецифического метастазирования в легкие в тесте на спонтанную метастатическую активность (рис. 1Б). Так, в состав описываемой коллекции входят исходно высокометастазные линии, приобретшие метастатический фенотип в процессе трансформации, низкометастазные линии, а также линии, приобретшие высокий уровень метастатической активности в ходе селекции in vivo на экспериментальных животных (рис. 1А). К основным достоинствам этой модели следует отнести: а - возможность исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе различий в уровне метастазирования клеток единого происхождения; б - исследование процессов метастазирования in vivo с использованием иммунокомпетентных животных; в -возможность изучения метастазирования с использованием теста на спонтанную метастатическую

активность (СМА). Данный тест моделирует все этапы прогрессии - возникновение первичной подкожной опухоли, интравачию и распространение опухолевых клеток по кровотоку, выживание в кровотоке, экстравазию в органы-мишени и пролиферацию в очаге вторичного роста в условиях активного противоопухолевого иммунитета. Таким образом, данная модель представляется чрезвычайно перспективной для изучения механизмов опухолевой прогрессии и обнаружения потенциальных маркеров мегастаэирования, поскольку позволяет наиболее адекватно моделировать процессы развития первичной опухоли и метастазирования, имеющие место в естественных условиях.

Для исследования влияния Ras на СМА клеток данной экспериментальной системы мы экспрессировали последовательность H-rasV12 в составе ретровирусного вктора pLXSN, содержащую типичную мутацию, приводящую к замене глицина на валин в 12 положении, которая кодирует конститутивно-активный белок. В отобранных после селекции на антибиотике G418 клетках HET-SRH-RasV12 была проанализирована экспрессия H-Ras (рис. 2А). Далее клетки HET-SRH-RasV12, а также клетки контрольной линии HET-SRpLXSN, были тестированы на уровень СМА. Для этого исследуемые клетки вводили хомякам подкожно в концентрации 2х104. Через два месяца животных усыпляли и проводили макроскопический визуальный подсчет количества легочных метастазов. Для каждого опыта использовали 10 хомяков. Здесь и далее каждый эксперимент проводили в трех независимых повторах.

Клеточные линии

СМА

Спонтанная

Введение подкожно

hamste' embryo fibroblasto)

STHE 83/20

2 недели

первичная

—опухоль

HET-SR-LNM ¡

I Высокое метастаэирова!

i I Низкое

метастазировэние

8 недель

метастаз* в легких

Рис. I.A. Схема получения используемых в работе клеточных линий; Б. Схема анализа спонтанной метастатической активности (СМА) клеток in vivo.

а 5 б 160 в

Рис. 2. А. Анализ экспрессии Н-Кав методом Вестерн блот гибридизации. Б. Сравнение СМА линий НЕТ-81Ш-11а5У12 и контрольной линии; приведены средние значения количества метастазов на одного хомяка (ДСМА); В. Фотографии легких экспериментальных животных через 8 недель после введения клеток НЕТ-БЛ Н-ЯавУП.

Результаты анализа СМА здесь и далее приводятся в виде среднего значения количества

метастазов в легких на одного хомяка (параметр ДСМА). Введение Н-Яа$1'12 в линию НЕТ-ЗЛ вызвало увеличение ДСМА со значения 1,7 (контроль) до ДСМА = 107,2 (рис 2Б). Это означает, что экспрессия активированной формы Н-Яав усиливает метастатическую активность исследуемой линии почти на два порядка.

Для идентификации Н-Каэ-ассоциированных сигнальных путей, ответственных за усиление метастатической активности клеток, мы использовали так называемые эффекторные мутанты активированного Н-га$У12. Благодаря точечным аминокислотным заменам в эффекторном домене белка Н-11азУ12, эти мутанты не способны взаимодействовать с отдельными эффекторами. В данном случае дефектные белки были не способны к связыванию двух из трех основных (Яа^ Р13К или ЯаЮОБ) эффекторов. Гиперэкспрессия в клетках каждой из таких последовательностей за счет блокирования взаимодействия с двумя мишенями значительно активирует сигнальные пути, которые проходят через неблокированные эффекторы. Схематично функциональная активность используемых эффекторных мутантов белка Н-Яаэ в отношении белков-мишеней представлена в таблице 1.

Последовательности мутантаых форм Н-Яа? в ретровирусном векторе рЬХвЫ были трансдуцированы с помощью ретровирусной инфекции в низкометастазную линию НЕТ-8И. В полученных после отбора клетках НЕТ-81Ш-Ка5У12, НЕТ-81Ш-Ка5У12835, НЕТ-81Ш-Ка5У12С37 и НЕТ-81Ш-Ка8У12С40 была проведена проверка экспрессии белка Н-Каэ методом вестерн блот анализа (рис ЗА). Как видно на рисунке ЗБ, введение конструкций, экспрессирующих Н-НаэУ 12835 и Н-11а5У12С40, достоверно не изменило СМА по сравнению с контролем - линией НЕТ-ЭЯ, экспрессирующей «пустой» вектор: значения ДСМА составили 1,8 и 1,0 соответственно.

12

Аминокислотные замены в эффекторном домене белка Н-RasV12 Способность взаимодействовать с эффекторами

Raf PI3K RalGDS

H-RasV12 (Gly—>Val) + + +

H-RasV12S35 (Ser->Tre) + - -

H-RasV12C40 (Cys-«Tyr) - + -

H-RasV12G37 (Gln->Gly) - - +

Таблица 1. Используемые мутантные формы белка Н-Яаз. В линии ННТ-5КН-КаяУ 12С37 метастазирование статистически значимо отличалось от контрольной группы (р<0,05). При этом значение СМА увеличилось почти на два порядка по сравнению с клетками контрольной линии и оказалось на уровне СМА клеток линии НЕТ-ЗЯН-

Яаглаг.

i S ^

Рис. 3. А. Экспрессия белка H-Ras в производных линии HET-SR с различными мутантными формами H-Ras. Приведены значения денситометрического обсчета разницы в экспрессии (по сравнению с контрольной линией) Б. Анализ СМА соответствующих производных линий.

Поскольку мутант H-RasV12G37 преимущественно проводит сигнал в направлении

RalGDS, можно предположить, что в данной модели именно RalGDS является ключевым

эффектором H-Ras, опосредующим его про-метастатическую активность. RalGDS является

основным фактором обмена нуклеотидов малой ГТФазы Ral.

1.2 Роль малой ГТФазы RalA в H-Ras-зависимой стимуляции метастатической активности клеток

Для проверки гипотезы о том, что именно H-Ras-RalGDS-Ral каскад является основным

сигнальным путем, реализующим про-метастатическое влияние Ras в данной модели, далее мы

исследовали участие малой ГТФазы Ral в метастатической активности клеток. Мы сравнили

уровень активности белка RalA в клетках, экспрессирующих мутантный H-RasV12G37, с

таковым в родительских клетках (рис 4А, приведен в следующем подразделе для того, чтобы не

13

разделять блоты на иллюстрации). Уровень активности RalA определяли методом, основанном на методике "pull down assay", с помощью коммерческого набора реактивов для определения активности RalA ("Ral Activation Assay", Upstate Biotech). Метод основан на иммунопреципитации RalA с его эффектором, белком RalBPl, с которым он образует комплекс, находясь в активном ГТФ-связанном состоянии. Проводимый после преципитации вестерн блот анализ выявляет только активную форму RalA. На рисунке 4А видно, что экспрессия мутантного H-RasV12G37 приводит к увеличению активности RalA. Далее для проверки роли RalA в обнаруженном эффекте стимуляции СМА при экспрессии эффекторного мутанта Н-RasV12G37 мы попытались «скомпенсировать» H-Ras-зависимое повышение метастазирования в линии HET-SRH-RasV12G37 подавлением активности Ral с помощью экспрессии в клетках доминантно-негативного мутанта RalA, RalAS28N. Последовательность RalAS28N была переклонирована в лентивирусный вектор pLV-CMV и трансдуцирована в клетки с помощью лентивирусной инфекции. На иллюстрациях и далее в тексте клеточные линии, экспрессирующие доминантно-негативный мутант RalAS28N, обозначены как Ral(-). Анализ активности RalA показал, что экспрессия доминантно-негативной формы RalA снижает активность этого белка в клетках HET-SRH-RasV12G37. Анализ СМА полученной клеточной линии - HET-SRH-RasV12G37-RalA(-) - выявил резкое снижение метастатической активности: значение ДСМА снизилось с уровня контрольной линии HET-SRH-RasV12G37pLV-CMV ДСМА =112 до ДСМА=7 (рис. 4В). То есть подавление активности RalA в клетках с активированным H-Ras-RalGDS сигнальным путем привело к реверсии метастазирования до уровня исходных клеток HET-SR (р<0,05). Таким образом, можно заключить, что именно активность белка Ra!, а не какого-либо другого потенциального эффектора RalGDS, обуславливает повышение метастазирования клеток HET-SRH-RasV12G37.

1.3 Значение активации RalA в усилении метастатической активности фибробластов, трансформированных вирусом саркомы Рауса, спонтанно трансформированных фибробластов и трансформированных фибробластов, прошедших селекцию in vivo.

Для проверки значения RalA для метастатической активности клеток исследуемой экспериментальной модели мы, в первую очередь, проанализировали уровень экспрессии и активности эндогенного RalA в высоко-метастазных (В/М) клетках. Для сравнения были выбраны две В/М линии: исходно В/М линия HET-SR8 и линия HET-SR-LNM, приобретшая высокую СМА при селективном отборе на животных. В качестве контроля использовали линию HET-SRpLXSN (негативный контроль) и линию HET-SRH-RasV12G37 (позитивный контроль, в котором RalA был активирован под воздействием гиперэкспрессии Н-RasV12G37) (рис. 4А). В результате было обнаружено, что при равном количестве белка

RalA во всех клеточных линиях, в культурах HET-SR8 и HET-SR-LNM, как и в линии НЕТ-SR-H-RasV12G37, уровень экспрессии активного RalA выше, чем в линии HET-SRpLXSN. Это свидетельствует о том, что эндогенный RalA активирован в обеих В/М линиях клеток наравне с клетками, в которых активность RalA увеличилась вследствие экспрессии мутанта H-RasV12G37. Важно отметить, что в линии HET-SR-LNM в ходе селекции in vivo параллельно с усилением СМА увеличилось количество активной формы RalA. Чтобы проверить, насколько уровень СМА клеточных линий HET-SR8 и HET-SR-LNM зависит от активности эндогенного RalA, мы экспрессировали в них RalAS28N в составе лентивирусного вектора pLV-CMV. Как видно на рисунке 4Б, повышение общего количества RalA в клетках, экспрессирующих его доминантно-негативный мутант, сопровождалось снижением количества активной формы данного белка. Далее в производных обеих линий был исследован уровень спонтанной (рис. 4В) и экспериментальной (рис. 4Г) метастатической активности (ЭМА), поскольку исходно обе исследуемые линии обладали высокими показателями активности в обоих тестах.

150

120 т ■

Ol

»' > i|f§|

90 ЗЙ V щи

ШМ а

60 Ч о? а f (Г ц

t^-f- -

$3 Ш м ХО X

30

* *

0

Т

Н

Ш ■

■ -

300

250

¡200

liso

»100 I

I 50

USsa

Рис. 4. Исследование активности RalA и влияния подавления активности RalA на спонтанную и экспериментальную метастатическую активность клеток. А. Анализ продукции и количества активной формы белка RalA в исходных линиях с разным уровнем СМА и в клетках HET-SRH-Ras V12G37 со стимулированным H-Ras/RalGDS сигнальным путем. Б. Анализ продукции и количества активной формы белка RalA в клетках, экспрессирующих доминантно-негативный мутант RalAS28N (обозначены как Ral(-)). В. Влияние подавления активности RalA на СМА клеток. Г. Влияние подавления активности RalA на ЭМА клеток.

15

Линия HET-SR-LNM-Ral(-) продемонстрировала существенное снижение обоих показателей - ЭМА (с ДЭМА>300 до ДЭМА=17,2, р < 0,01) и СМА (с ДСМА=143 до ДСМА=4,4, р < 0,001). В производной линии HET-SR8RalA(-) по сравнению с контрольной HET-SR8pLV-CMV также принципиально снизились как СМА (со значения ДСМА=130 до ДСМА=5), так и ЭМА (со значений ДЭМА>300 до ДЭМА=5,6) (р < 0,01). Провести точный подсчет количества метастазов в легких, превышающего значение 300, практически не представлялось возможным, поэтому здесь указываются приблизительные значения. Из полученных результатов можно заключить, что уровень активного RalA играет принципиальную роль как в поддержании высокой метастатической активности, так и в формировании В/М фенотипа в ходе in vivo селекции.

Далее мы исследовали влияние экспрессии экзогенного активного RalA на метастатический потенциал Н/М клеток. Для этого мы использовали последовательность ralA крысы с точечной мутацией, кодирующую конститутивно активный (связанный с ГТФ) белок с аминокислотной заменой глицина на валин в 23 положении (G23V) в составе ретровирусного вектора pLXSN. Трансдукдию вектора в Н/М клетки HET-SR проводили методом ретровирусной инфекции. Результаты анализа показали, что количество активной формы RalA в линии HET-SR RalA-G23V было больше, чем в родительской линии, и соответствовало уровню линии HET-SR H-Ras V12G37 (рис. 5А). Анализ метастатической активности клеток HET-SR-RalAV23 выявил, что экспрессия конститутивно активной формы RalA статистически достоверно повышает СМА линии HET-SR: со значения ДСМА=1,7 до ДСМА=145 (р < 0,05) (рис. 5Б).

белок RalA

активный белок RalA

150

1 90 О

| 60

т $

§ 30 -

*

(С ??

ж " Ш. W&

= 3

Рис. 5 А. Анализ уровня продукции белка RalA и количества его активной формы в линиях НЕТ^рЬХЭМ, HET-SRH-RasV12G37 и НЕТ^ RalA-G23 V. Б. Анализ СМА тех же линий.

Аналогичные результаты, свидетельствующие о значении белка RalA для СМАбыли получены и на системе спонтанно трансформированных в культуре in vitro эмбриональных фибробластов хомяка - панели линий STHE (рис 1 А).

2.Сравнение роли гомологичных белков RalA и RalB в приобретении трансформированными фибробластами высоко агрессивного фенотипа и метастатической активности

2.1 RalB в большей степени, чем RalA, стимулирует спонтанную метастатическую активность трансформированных фибробластов.

Для сравнения влияния активности белков RalA и RalB на СМА клеток описанной выше экспериментальной модели необходимо было получить стабильные производные линии HET-SR, экспрессирующие активированные формы данных белков. Последовательности конститутивно активных мутантов RalA (RalAG23V) и RalB (RalBG23V) были переклонированы из вектора для транзиентной трансфекции pSRa в ретровирусные векторы pLXSN и pBabe-puro соответственно. Необходимость использования различных ретровирусных векторов (с генами устойчивости к различным антибиотикам - гентицину (G418) и пуромицину) для экспрессии генов RalA и RalB диктовалась дальнейшими планами по осуществлению совместной экспрессии в одной и той же линии клеток обеих изоформ Ral. Последовательности были экспрессированы в клетках HET-SR методом ретровирусной инфекции. Проверка экспрессии белков RalA и RalB представлена на рисунке 6.

RalA

#

«МШЩМИМ —

... -

6,1

ш и

1 ' Г^П ш

HET-SR HET-SR pLXSN RalA

RalB

Рис. 6. Вестерн блот анализ экспрессии белков RalA и RalB в производных линии HET-SR и денситометрический анализ экспрессии в сравнении с контрольными линиями, экспрессирующими соответствующие «пустые» векторы.

В отличие от данных СМА, представленных выше, где приводились результаты визуального макроскопического подсчета метастазов, здесь и далее количество легочных метастазов определяли гистологически. Для этого фиксированные в формалине легкие экспериментальных животных заключались в парафиновые блоки, с которых получали серийные ультратонкие срезы (72 среза с одной и той же доли каждого легкого). Срезы окрашивали гематоксилин-эозином, после чего проводили микроскопический подсчет метастазов с одной доли легкого каждого животного. Результаты анализа показали, что обе линии клеток, экспрессирующие изоформы Ral, статистически значимо отличались от соответствующих контролей по уровню СМА. При этом экспрессия активированного RalB привела к значимо большему увеличению СМА, чем экспрессия активированного RalA. Так, значение ДСМА клеток, экспрессирующих RalB, составило 63,7 при аналогичном значении 7,2 для клеток контрольной линии HET-SR pBabe, в то время как значение ДСМА клеток, экспрессирующих RalA, составило 20,4 при значении ДСМА 4,2 для клеток контрольной линии HET-SRpLXSN (рис.7).

HET-SR HET-SR HET-SR HET-SR pLXSN RbIA pBabe RalB

Рис. 7. Сравнение ДСМА клеток, экспрессирующих белки RalA и RalB. *р<0.05 2.2 Совместная экспрессия RalA и RalB не приводит к дополнительному усилению СМА.

Чтобы понять, насколько два гомолога Ral кооперируют в стимуляции метастатической активности клеток, мы проанализировали эффект одновременной экспрессии RalA и RalB на уровень СМА клеток HET-SR. Для этого мы экспрессировали активированный мутант RalBG23V в составе регровирусного вектора pBabe-puro в клетках HET-SR RalA, уже экспрессирующих активированную форму RalA, с помощью ретровирусной инфекции. Анализ СМА проводили по описанной выше методике. В качестве контроля использовали линию клеток HET-SR RalApBabe. СМА полученных клеток достоверно не изменилась по сравнению с контрольным уровнем и, соответственно, совместная экспрессия двух белков Ral не оказала синергичного эффекта на метастатическую активность клеток.

2.3 Сравнение влияния белков RalA и RalB на характеристики роста, подвижности и инвазивной активности исследуемых клеток.

Для выявления Ral-зависимых фенотипических изменений клеток, ассоциированных с увеличением метастатического потенциала, был проведен сравнительный анализ влияния белков RalA и RalB на основные характеристики роста клеток в культуре и in vivo. Исследование динамики пролиферации клеток in vitro, а также туморогенности (минимальной прививочной дозы, инициирующей рост подкожного ксенографта), динамики роста и размера формируемых первичных опухолей не выявило Ral-зависимых изменений. Также не было обнаружено влияния экспрессии гомологов Ral на способность клеток к неприкрепленному росту. В тоже время, было выявлено влияние белков Ral на способность к автономному росту в тесте на клоногенность. Способность к формированию колоний из единичных клеток отражает снижение потребности опухолевых клеток в ростовых факторах, секретируемых клетками микроокружения. Таким образом, рост в условиях сильно разреженной популяции является одной из важнейших характеристик автономного роста, присущих наиболее агрессивным клеткам. Статистический анализ полученных результатов выявил значительное увеличение среднего размера колоний в линиях с экспрессией активных форм как RalA, так и RalB, по сравнению с соответствующими контрольными линиями (р<0,01) (рис. 8). Экспрессия RalA увеличивала размер колоний в 1,9 раза, a RalB - в 2,6 раза. Интересно, что результаты анализа данной характеристики хорошо соотносятся с данными анализа СМА, что может свидетельствовать о важности Ral-зависимого стимуляции автономного роста клеток для формирования высоко метастатического потенциала.

Р<0Д1

р<0,01 г

• 1000т

500-

HET-SR HET-SR HET-SR HET-SR pLXSN RalA pBabe

Рис. 8. Средняя площадь колоний, формируемых клетками, экспрессирующими RalA и RalB

Следующим этапом было исследование возможного участия белков Ral в приобретении инвазивных свойств. Оценку инвазивной активности in vitro проводили с использованием камер Бойдена, покрытых матригелем (искусственным аналогом внеклеточного матрикса (ВКМ). На рисунке 9А видны окрашенные кристаллическим фиолетовым красителем клетки,

преодолевшие покрывающий дно камеры слой матригеля и поры в мембране. Результаты анализа показали (рис. 9Б), что обе линии клеток, НЕТ-811 Яа1А и НЕТ-ЭЯ ЯаШ, инвазируют лучше, чем соответствующие контрольные линии НЕТ-8Я-рЬХ8М и НЕТ-8Я-рВаЬе (р<0,05).

2500 2000 КОО !«Ю SOо о

р<О,05

HET-SR нет-ев pUÍSN R«A

р<0,05

HET-SR RaB

p<0,QS

Рис. 9. Анализ инвазивной активности in vitro клеток, экспрессирующих белки RalA и RalB. А. Пример окрашивания клеток в камерах Бойдена. Б. Среднее значение количества инвазировавших клеток.

При этом клетки линии HET-SR RalB показали значительно большую инвазивную активность и по сравнению с клетками HET-SR RalA (р<0,05). Таким образом, оба белка способствуют усилению инвазивной способности клеток, но RalB более активен в этом отношении. Этот результат хорошо соотносится с данными анализа СМА и свидетельствует, по-видимому, о том, что про-метастатичеекая активность данных белков реализуется, как минимум отчасти, за счет их участия в усилении инвазивной активности клеток. Способность клеток преодолевать барьер из матригеля во многом определяется активностью секретируемых протеиназ, ремоделирующих ВКМ. К наиболее известным семействам секретируемых эндопептидаз относится семейство матриксных металлопротеаз (ММР) и система активации плазминогена, в которой большое значение в контексте канцерогенеза отводится урокиназа-подобному активатору плазминогена (иРА). Поэтому далее мы исследовали потенциальное влияние экспрессии белков RalA и RalB на активность ММР и иРА с помощью субстрат-специфичной зимографии электрофоретического разделения белков в полиакриламидном геле с сополимеризованным субстратом для эндопептидаз (рис. 10).

НЕТ-Э« рЬХЭЫ

НЕТ-ЭЯ

НЕТ-БЯ рваЬе

-ММР9

рго-ММР1: 1 Б

6,3

рго-ММР1:1

0,9

НЕТ-ЗИ НЕТ-ЭИ

НЕТ-вя НЕТ-ЙЯ

рВаЬе йа®

-иРА-

2,8

1

0,9

Рис.10. Анализ активности секретируемых протеиназ внеклеточного матрикса в клетках, экспрессирующих Г<а1Л и ИаШ. А. Анализ активности ММР с желатиназной активностью. Б. Анализ активности иРА. Желатиназная и казеин-плазминогеновая зимограммы соответственно приводятся со значениями денситометрического рассчета.

Для анализа использовали кондиционированные культуральные среды исследуемых клеток. Активность ММР оценивали с помощью желатиназной зимографии. Результаты денситометрического обсчета результатов анализа показали, что 11а1А, в отличие от Ка1В, увеличивает секрецию про-энзима и количество активной формы ММР-1 (рис. 10А). Анализ активности иРА проводился методом казеин-плазминогеновой зимографии. Сравнение активности данной протеиназы вьшвило ее значительное увеличение (в 2,8 раза) в клетках, экспрессирующих Яа1А (рис. 10Б). Таким образом, мы обнаружили значимые изменения в активности секретируемых протеиназ внеклеточного матрикса (ММР-1 и иРА) только в клетках НЕТ-БЙ. Яа1А.

Поскольку полученные данные не объясняли обнаруженных различий в инвазивной активности между клетками, экспрессирующими Яа1А и Яа1В, мы предположили, что эти различия могут быть результатом различия клеток в способности направленному движению по градиенту ростовых факторов. Для проверки этого предположения мы использовали тест на направленную миграцию в камерах Бойдена без покрытия матригелем. Результаты анализа показали, что клетки, экспрессирующие как Яа1А, так и Яа1В, обладали значительно большей способностью к направленной миграции, чем соответствующие контрольные клетки (р<0,05) (рис.11). Более того, мы обнаружили, что Яа1В значительно сильнее стимулирует направленную миграцию, чем Яа1А (р<0,05). Эти данные хорошо согласуются с результатами исследования инвазивной активности клеток, а также с результатами анализа СМА.

А

HET-SR plXSN HET-SR RalA

Б

p<0,0S

g 5000

4000

p<0.05

p<0,GS

X

HET-SR pBabe HET-SR RalB

T

HET-SR HET-SR pixSN RafA

H£T-Sft KST^R

Рис.11. Анализ направленной миграции исследуемых клеток в камерах Бойдена.

А. Пример эксперимента Б. Среднее количество мигрировавших клеток по результатам трех

независимых повторов,

2.4 Анализ изменения экспрессии белков: Cyclin DI, CD-24, Cav-1, а также активности белков Erkl/2, Jnk, р38 и Stat3 под влиянием экспрессии экзогенных белков RalA и RalB.

Одной из задач данного исследования было проведение сравнительного анализа влияния гиперэкспрессии активированных RalA и RalB на уровень экспрессии или статус фосфорилирования ряда белков, ассоциированных с опухолевой прогрессией и метастазированием. Результаты анализа экспрессии поверхностного высоко-гликозилированного белка CD24, который ассоциирован с метастазированием, (в частности, за счет усиления адгезии опухолевых клеток к эндотелию сосудов), выявили более чем трехкратное повышение его продукции в клетках HET-SR RalA по сравнению с HET-SRpLXSN. Таким образом, RalA, в отличие от RalB, способствует усилению экспрессии CD24. Сравнение уровня белка CyclinDl выявило, что обе изоформы Ral усиливают его продукцию, при этом RalB-зависимое увеличение белка CyclinDl в 2,5 раза превышало RalA-зависимое изменение. Учитывая литературные данные о функциональной роли CyclinDl в качестве мотогена (помимо известной промитогенной активности), эти данные хорошо согласуются с Ral-зависимым усилением подвижности и с метастатической активностью клеток. Результаты сравнения экспрессии компонента липидных рафтов, белка Cav-1, в исследуемых клетках показали более, чем трехкратное снижение его продукции в клетках, экспрессирующих RalB. Экспрессия RalA не повлияла на уровень Cav-1. Таким образом, снижение количества Cav-1 в исследуемых клетках коррелирует с более агрессивным метастатическим потенциалом. Анализ влияния белков RalA и RalB на активность MAP киназ не выявил существенных изменений в экспрессии и статусе фосфорилирования киназ Erkl/2 и р38. В то же время, уровень активирующего фосфорилирования киназы Jnkl (Thrl80/Tyrl82) был увеличен в клетках, экспрессирующих как RalA, так и RalB. Сравнительный анализ продукции и уровня фосфорилирования (по Туг705) транскрипционного фактора Stat3

выявил значительное и сопоставимое между собой увеличение активной формы белка Stat3 в клетках, экспрессирующих как RalA, так и RalB .

2.5 Определение эффекторных мишеней белков RalA и RalB, взаимодействие с которыми необходимо для реализации их про-метастатической функции.

Для определения Ral-зависимых сигнальных путей, реализующих обнаруженную нами про-метастатическую активность Ral, последовательности, кодирующие мутантные варианты белков RalA и RalB с аминокислотными заменами или делениями, блокирующими взаимодействие с одной из мишеней, были экспрессированы в линии HET-SR. Таким образом анализировали вклад одного из эффекторов (точнее, его потери) в изменение СМА. Для исследования были выбраны основные эффекторы белков Ral: Ral связывающий белок RalBPl, компонент комплекса экзоциста Sec5 и фосфолипаза PLD. В таблице 2 приведены использованные варианты белков Ral :

Аминокислотные замены в белках RalA и RalB Способность взаимодействовать с эффекторами

PLD RalBPl Экзоцист

Ral А/В V23 (Gly->Val) + + +

Ral А/В V23 delta N11 (делеция 11 N-концевых а.о.) - + +

Ral А/В V23 D49N( Asp->Asn) + - +

Ral А/В V23 D49E (Asn->Glu) + + -

Таблица 2. Исследованные мутантные формы белков RalA и RalB Мутантные последовательности RalA были переклонированы из исходного вектора pRK5 в ретровирусный вектор pLXSN, a RalB - из вектора pSRa в ретровирусный вектор рВаЬе-риго. Результаты ретровирусной инфекции проверялись при помощи Вестерн-блот анализа (рис.12).

^ г ш S 1 z щ

__ сЧ "55 ^а- SÜ "53 Я S

z -S <n a > -ё <=>

£2 SE ;5 á -gems®

—¡JSSS:Э ДЗ m iS <g ДЗ Д2

сеогсссесе cecccccgcg

со о? ся со со со со со со со

~a3 "S "ÍS "33 к ~а> аЗ "Й> о _аэ

п= 3= 3= =п з: =п ni

Рис. 12. Вестерн-блот анализ экспрессии мутантных форм RalA и RalB в полученных клеточных линиях.

Далее клетки полученных производных и контрольной линий вводили в количестве 2 х 104 подкожно экспериментальным животным для оценки СМА. Результаты гистологически

верифицированного микроскопического подсчета метастазов в виде среднего значения количества метастазов на одну долю легкого одного животного представлены на рисунке 13. Было обнаружено, что все эффекторные мутанты RalA, наряду с активированной формой без эффекторных мутаций, значимо (р < 0,05) повышают, хотя и в разной степени, СМА клеток по сравнению с контрольными клетками, экспрессирующими «пустой» вектор. В то же время, СМА клеток, экспрессирующих RalB V23 delta N11, оказалась значительно ниже СМА клеток, экспрессирующих RalB V23, и практически не отличалась от СМА клеток контрольной линии. Это означает, что утрата возможности взаимодействовать с PLD приводит к потери про-метастатической активности белка RalB. Полученные результаты свидетельствуют о различиях в молекулярных механизмах, опосредующих RalA- и RalB-зависимое усиление СМА, и демонстрируют, что PLD является основным партнером RalB в реализации его про-метастатической активности.

100

i 60

т

90 « 80 I 70

I 60

§ 50

i40 I 30 * 20 10 0

. Í L

jl

HET-SR HET-SR HET-SR HET-SR HET-SR pLXSN RalAV23 RalAANH RalAD49N RalAD49E

<£• o?"/!?-

& ^

^

Рис. 13. Сравнение СМА клеток, экспрессирующих различные эффекторные мутанты RalA и RalB. *р<0,05

3. Роль малой ГТФазы Arf6 в пролиферации, инвазин и активации ключевых в аспекте канцерогенеза внутриклеточных сигнальных путей.

3.1 Сравнение влияния экспрессии экзогенного Arf6, а также его совместной экспрессии с белками RalA/RalB на метастатическую активность клеток

На основании изложенных в предыдущей главе результатов, указывающих на необходимость взаимодействия белка RalB с фосфолипазой PLD для осуществления RalB-зависимой стимуляции СМА, а также на основе литературных данных, свидетельствующих о том, что активация PLD достигается с помощью совместного действия малых ГТФаз Ral и Arfó, мы предположили, что гиперэкспрессия белка Arf6 (одного или в сочетании с белками RalA/B) так же (или в большей степени) может приводить к изменению метастатического потенциала клеток. Для анализа влияния Arfó на СМА и другие характеристики, определяющие злокачественный потенциал исследуемых клеток, были получены производные линии HET-SR с

24

конститутивной экспрессией различных вариантов гена Аг/6 человека. Приведенные в таблице 3 последовательности Аг/б, меченые гемагглютинином, были переклонированы в ретровирусный вектор рЬХЗЫ-пео из панели векторов рБЯа.

Аминокислотная замена Функциональное значение замены

Arf6Q67L (Gin—>Leu) конститутивная связь с ГТФ

Arfó WT дикий тип

ArfóN48I (Asn—>Ile) отсутствие взаимодействия с РЬО

ArfóT27N (Thr—>Asn) конститутивная связь с ГДФ

Таблица 3. Последовательности Arf6, трансдуцируемые в линию HET-SR.

Результаты инфекции проверялись при помощи вестерн блот анализа с антителами к АгГб и НА (рис. НА и 14Б). Необходимо отметить, что из-за гемагглютининовой метки экзогенные формы белка АгГб обладали большей молекулярной массой по сравнению с эндогенным АгГб.

Рис. 14. Вестерн блот анализ экспрессии экзогенного Arfó в клеточных линиях производных HET-SR. А. Антитела к Arfó. Б. Антитела к НА.

Сравнение СМА линий, экспрессирующих различные мутантные формы Arfó, с контрольной линией HET-SRpLXSN показало, что ни одна из форм Arfó не оказала значимого влияния на метастатический потенциал клеток. Также не было выявлено изменений СМА клеток, экспрессирующих совместно активированные RalA или RalB с активной или доминантно-негативной формами Arfó.

3.2 Arfó-зависимая стимуляция пролиферации и активация фосфолипазы D

На следующем этапе исследования мы протестировали влияние экспрессии Arfó, ее активации, а также способности к взаимодействию с мишенью PLD на основные характеристики клеток в культуре in vitro, ассоциированные с усилением злокачественного потенциала. Анализ динамики роста (рис.15) показал, что экспрессия Arfó дикого типа и активированной формы, в отличие от мутанта, не связывающего PLD, приводит к достоверному увеличению пролиферации клеток HET-SR (р<0,05 для сравнения обеих линий с контролем). Таким образом, нами впервые показано, что экспрессия Arfó увеличивает

25

пролиферативную активность клеток, и эта про-митогенная активность опосредуется РЬО-зависимым сигнальным путем.

НЕТ-БЙ р1Х5К ■ Н8Т-5К Аг»в 0671. НЕТ-ВЙ АгШ *¥Т мет-вя Агп N481 ИЕТ-вЯ АМ Т27Ы

гаюао"

Время, дни

Рис. 15. Динамика роста производных клеток HET-SR, экспрессирующих различные формы Arfó. Каждая точка - среднее значение по результатам трех независимых повторов ± стандартное отклонение.

Результаты анализа клоногенности показали увеличение количества колоний в линиях с

экспрессией всех мутантных форм Arfó, а также Arfó дикого типа (р<0,05). Таким образом,

экспрессия Arfó вне зависимости от активности и взаимодействия с PLD усиливала

способность клеток к автономному росту.

Инвазивную активность определяли в камерах Бойдена, покрытых матригелем.

Результаты анализа (рис.16) показали, что клетки HET-SR Arf6N48I обладали статистически

достоверно большей инвазивной активностью по сравнению с контрольной линией. При этом

остальные производные линии не отличались от контрольных по этому параметру.

HET-SRpLXSN

ГШ

А. •

HET-SRArfS Об

8М * „ •

я

А

HET-SRArf6 N481

g S

С Э

tu m

I I

§ I

« s

HET-SR HET-SR HET-SR HET-SR pLXSN Arf6 Q67L ArtS WT Arf6 N481

Рис. 16. Анализ инвазивной активности клеток in vitro. А. Сравнение количества инвазировавших клеток * - р<0,05; Б. Характерный пример фотографии внешней стороны мембраны камеры Бойдена после проведения теста.

Анализ активности движения по градиенту ростовых факторов определяли в камерах Бойдена. Как видно на рисунке 17, единственной культурой, которая продемонстрировала значимое (р<0,05) увеличение направленной миграции, оказалась линия HET-SRN48I. Этот результат оказался неожиданным, однако хорошо согласовывался с данными, полученными в тесте на инвазивность in vitro.

Б

HET-SRpLXSN

1501

9 Z юс gi <D

Ш «

35 m

ша ш

§ ° soi х

CL

s г

■¡Я

■Н

HET-SRArf6 N48i

' ' ' -*. V "> , У. A' ■ - •• ■ ■..

HET-SR HET-SR HET-SR HET-SR pUSN Af(5Q67L Arf6WT ArK N48I

Рис, 17 Анализ направленного движения клеток. А. Сравнение количества мигрировавших клеток. * - р<0,05; Б. Характерный пример фотографии внешней стороны мембраны

В связи с полученными данными по инвазивной активности, представлялось интересным проанализировать влияние экспрессии различных форм Arf6, и в особенности Arf6N48I, на секрецию протеиназ ВКМ, в частности, матриксных металлопротеиназ (ММР) и урокиназа-подобного активатора плазминогена (иРА). При этом оказалось, что активность ММР1, ММР2 и ММР9 не отличалась между исследованными клеточными линиями (рис. 18А). Таким образом, экспрессия различных форм Arf6 практически не повлияла на активность ни одной из исследованных секретируемых ММР.

В то же время, в клетках HET-SR Arf6N48I активность uPA оказалась значительно повышена по сравнению с остальными линиями (р<0,05) (рис. 18Б). Это позволяет предположить, что усиление инвазивных свойств линии HET-SR Arf6N48I in vitro может объясняться увеличением протеолитической активности иРА, позволяющей клеткам этой линии более активно расщеплять матригель.

HET-SR HET-SR HET-SR HET-SR pLXSN ArfS Q67LArf6 WT Arf6 N481

HET-SR HET-SR HET-SR HET-SR pLXSN Arfô Q67L Arf6 WT Arf8 N481

MMP9

proMMP 2 IMMP2 „proMMPI "MMP1

to HET-SR HET-SR HET-SR HET-SR pLXSN Arf6 Q67L Ari6 WT АП6 N481

Рис. 18. Анализ активности секретируемых протеиназ внеклеточного матрикса. А. Анализ активности ММР; Б. Анализ активности иРА с денситометрическим анализом результатов сравнения с контрольной линией. * - р<0,05.

3.3 Идентификация Arf6/PLD/mTORCl/S6Kl/S6 и Arf6/PLD/mTORCl/4E-BPl сигнальных путей, приводящих к Аг/6-зависимой активации комплекса инициации трансляции

Полученные данные о влиянии Arfó на пролиферативную активность исследуемых клеток поставили вопрос о молекулярных механизмах промитогенной активности данного белка, а необходимость взаимодействия с PLD послужила отправной точкой при поиске дальнейших мишеней и сигнальных путей. На первом этапе уровень активности PLD был проанализирован во всех имеющихся производных линиях, экспрессирующих различные варианты Arfó с помощью коммерческого набора для флуоресцентного определения активности PLD (Amplex Red Phospholipase D assay kit, Molecular probes, Invitrogen) (рис. 19A).

25000

PLD

р-актин

HET-SR HET-SR HET-SR Arf6 067L Art6 WT Arf6 N481

Рис. 19 А. Анализ активности РЬО в клеточных линиях, экспрессирующих различные формы АгГб, * - р<0,05; Б. Анализ продукции белка РЬО методом вестерн блот анализа; в качестве контроля нанесения здесь и далее использовались антитела к Р-актину.

Результаты анализа показали, что экспрессия активной формы Arfó (рис. 19А) статистически значимо увеличивала активность PLD по сравнению с контрольной линией НЕТ-SR pLXSN (р < 0,05), что говорит о том, что активность PLD зависит от ГТФ-связанного состояния Arfó. При этом уровень продукции белка PLD в исследуемых клетках не отличался (рис. 19Б). Клетки HET-SRArf6N48I демонстрировали уровень активности PLD, аналогичный контрольной линии, что подтверждает необходимость взаимодействия Arfó с PLD для ее активации. На основании отдельных литературных данных о механизмах активации mTOR мы предположили, что Arfó-зависимая стимуляция активности PLD может приводить к активации данной киназы в составе комплекса mTORCl. В первую очередь, мы исследовали уровень активной S6K1 (статус фосфорилирования остатка Thr389, который является общепринятым критерием активности mTORCl). Вестерн блот анализ исследованных клеточных линий показал, что, хотя уровень экспрессии S6K1 был равным во всех исследованных клеточных линиях, уровень фосфорилированной формы S6K.1 был в четыре раза повышен в линии HET-SR Arf6Q67L (рис. 20).

HET-SR HET-SR HET-SR HET-SR plXSN Art6Q67L Art6WT Arfó N481

¡¡¡¡и

pS6K1 (Thr389) S

в 5

5 2 4

S 3

S6K1 ß-актин

2

Ё x с

Iii

*

4V4 гЗ— шогщ

\\> я Ш

£ ш o HET-SR HET-SR HET-SR HET-SR pLXSN Arte Q67L Arf6 WT ArtB N48I

Рис. 20. Анализ количества активной формы и продукции белка S6K1 в клетках, экспрессирующих различные формы Arfó. Приведен денситометрический анализ результатов сравнения с контролем, * - р<0,05

Чтобы подтвердить, что Arfó-зависимая активация S6K1 происходит по PLD-mTORCl

зависимому пути, мы подавляли активность каждой из молекул и анализировали влияние этого

подавления на уровень фосфорилирования S6K1. Для этого клеточные линии инкубировали с

селективными ингибиторами PLD и mTORCl комплекса, бутанолом-1(1%) и рапамицином (100

нМ) соответственно (рис.21). Как видно на рисунке 21, обработка рапамицином, также как и

бутанолом-1, приводит к снижению количества активной формы этой киназы. Таким образом,

мы показали, что Arfó активирует S6K1 посредством активации Arfó—»PLD—>mTOR—»S6K1

сигнального пути. Поскольку в настоящее время считается, что основным путем активации

mTOR является PI3K-Akt сигнальный каскад, мы проверили возможность влияния Arfó на

активацию данного сигнального пути, для чего провели анализ фосфорилирования,

активирующего Akt (Ser473). При этом мы обнаружили, что количество фосфорилированной

za

киназы Akt, также как и общий уровень белка Akt, не изменился в АПб-экспрессирующих клеточных линиях по сравнению с контрольной линией (рис. 21 Г). Этот результат подтверждает, что Arfó активирует киназу S6K1 независимо от PI3K-Akt сигнального пути.

В

20000

ai

со О 15000

-J

Ol

| 10000

О X

ш

5000

нет«! PLXSN

HET-SR HET-SR Arm 0671 Arf6 WT

HET-SR Arm N481

-

il

-

+ рапамицин [ S6K1 (Thr389)

S6K1

бутанол-1

HET-SR pLXSN

HET-SR HET-SR HET-SR Arf6Q67L Ari6Wr Aíf6 N481

HET-SR HET-SR HET-SR HET-SR pLXSN Alfö Q67L Arf6 WT Arfß N48t

HET-SR HET-SR HET-SR HET-SR pLXSN Art6Q67L Artll«T Ar« N48!

S6K1

Рис. 21. Количество активной формы киназы S6K1 в зависимости от подавления активности

PLD и mTORCl. А. Проверка подавления активности PLD при инкубации клеток с бутанолом-1.

Б. Анализ количества активной формы S6K1 в зависимости от обработки бутанолом-1. В.

Анализ количества активной формы S6K1 в зависимости от инкубации клеток с рапамицином.

Г. Анализ количества активной формы и продукции белка Akt * - р<0,05.

Для определения дальнейшего сигнального пути и поиска мишеней, участвующих в

Arfö-зависимой стимуляции пролиферации, мы исследовали статусы фосфорилирования

эффекторов mTOR сигнального пути: белка 4Е-ВР1(мишени mTOR) и рибосомального белка

S6 (мишени S6K1). Оба белка участвуют в mTOR-зависимом контроле инициации

трансляции. Белок 4Е-ВР1 функционирует как репрессор "сар-зависимой" трансляции,

поскольку связывает эукариотический фактор инициации трансляции 4Е (eIF4E).

Фосфоршшрование Thr70 считается необходимым условием для необратимого

высвобождения 4Е-ВР1 из комплекса с eIF4E. Рибосомальный белок S6 (или rpS6) является

компонентом 40S субъединицы рибосом и одной из основных мишеней активированной S6K1

и также участвует в контроле инициации трансляции. Предполагается, что фосфоршшрование

четырех остатков серина Ser235/236 и Ser240/244 может осуществляться как рибосомальными

киназами группы RSK, так и S6K1 киназой, хотя данные относительно фосфорилирования

30

каждого из этих сайтов достаточно противоречивы. Чтобы проследить дальнейшие изменения в АП6-зависимой активации РЬБ-тТСЖ сигнального пути, мы исследовали уровень фосфорилирования белков 4Е-ВР1 (по остаткам Птг37/46 и ТЬг70), и Б6 (по остаткам 8ег235/236 и 5ег240/244) (рис. 22).

HET-SR HET-SR HET-SR HET-SR pLXSN Ar¡6 Q67L Arf6 WT Arf6 N481

P4E-BP1 (Thr37/46)

p4E-BP1 (Thr70)

4E-BP1

р-актан

HET-SR HET-SR HET-SR HET-SR pLXSN Atf6 Q67L Arf6 WT Atf6 N481

pS6

(Ser235/236)

1 PS6

1 (Ser240/244)

S6

Р-актин

С 5

ti 2

& 11.5

Si

1

■ I 0=5

II 0

Щ1

1,5

Я -r

ДЛ

HET-SR HET-SR HET-SR HET-SR pücsn ñrfsosTi Алеют шит

гч 1

¡¡0,5

la 0 is

i

в

HET-SR HET-SR HET-SR HET-SR pLXSN Aíf6Q67L A/16WT Ari6N48l

VO ф

<o с 0

1 1,5

SI 0.5

I o u

ж с

h2

"11,5 I» 1

I ¡0,5

II 0

A

HET-SR HET-SR HET-SR HET-SR PLXSN Atraen. A«fSwT Aifswa

ES

A

HET-SR pLXSN

HET-SR HET-SR HET-SR Ai«Q67L aiffiwt Arí5 N4SI

Рис. 22. Влияние экспрессии различных форм Arfó на активность мишеней mTORCl.A. Анализ статуса фосфорилирования 4Е-ВР1. Б. Анализ статуса фосфорилирования rpS6. Приведен денситометрический анализ сравнения количества каждой из фосфорилированных форм белков с контрольной линией * - р<0,05

Анализ показал, что все клеточные линии, включая родительскую культуру HET-SR,

отличались высоким уровнем фосфорилирования белка 4Е-ВР1 по остаткам Thr37/46, и

экспрессия различных форм Arf6 принципиально не повлияла на этот показатель. В то же

время, уровень фосфорилирования Thr70 оказался значительно выше в клетках,

экспрессирующих Arf6Q67L. Анализ rpS6 также показал статистически значимое повышение

уровня фосфорилирования по сайту Ser235/236 в линии HET-SRArf6Q67L. В то же время,

фосфорилирование сайта Ser240/244 осталось неизменным во всех исследуемых линиях. Полученные результаты подтвердили наше предположение о том, что Arfó посредством активации PLD может стимулировать mTOR - зависимый сигнальный путь и активировать важнейшие белки, участвующие в процессе инициации трансляции. Роль идентифицированного сигнального пути Arfó—»PLD-»mTORCl—>S6K1—»Só/mTORCl—>4Е-BP1 в описанном выше эффекте Arfó-зависимой стимуляции пролиферации была проанализирована в последующих экспериментах.

3.4 Влияние Arfó на активацию MAP киназ Erkl/2, Jnk и р38. Arfó активирует МАР-киназы Erkl/2 и р38, и эта активация зависит от взаимодействия Arfó с PLD.

Поскольку обнаруженный нами эффект стимулирования пролиферации наблюдался под воздействием как активированной формы Arfó, так и белка дикого типа, а активация PLD—»mTORCl сигнального пути осуществлялась только активированной формой Arfó, мы предположили, что про-митогенная функция Arfó опосредуется и другими белками. Предполагаемым кандидатом на роль посредника Arfó в стимуляции пролиферативной активности клеток была широко известная в контексте канцерогенеза MAP киназа Erkl/2. Для прояснения возможности Arfó-зависимой активации Erkl/2 мы сравнили уровень фосфорилирования данной киназы по сайту Туг202/204, который является показателем ее активации (рис. 23А).

HET-SR HET-SR HET-SR HET-SR pLXSN Arts Q67L Arte WT ArIB N481

PERK1/2 (ТЬг202Луг204)

ERK1/2

HET-SR HET-SR HET-SR Arf6 Q67L ArteWT AIÍ6N48I

HET-SR HET-SR HET-SR HET-SR pLXSN Arf6 QS7LArf6 WTArfS N48I

<oS S¡

1 s1

? a

Z n:

a 8-o

2 о HET-SR

pLXSN

pp38

(Thr180/Tyrl82) p38

~г 1 * ш Г'

jbSML

HET-SR HET-SR HET-SR Art6 Q67L Arts WT ArfS N48]

Рис. 23 А. Анализ продукции белка и количества активной формы киназы Егк1/2. Б. Анализ уровня фосфорилирования киназы р38. Приведен денситометрический анализ сравнения количества фосфорилированных формы белков с контрольной линией. * - р<0,05.

Результаты выявили достоверное увеличение (р<0,05) количества фосфорилированной формы Егк1/2 как в клетках НЕТ^ АгГ6С>67Ь (в 3,5 раза), так и в клетках НЕТ-БЯ АгГ6\¥Т (в 3

32

раза) по сравнению с контрольной линией. В отличие от этих линий, в клетках HET-SR Arf6N48I уровень фосфорилирования Erkl/2 был даже ниже, чем в контрольной линии, что указывает на PLD-зависимый путь активации Erkl/2. Мы проверили возможность влияния Arfó на статус фосфорилирования двух других киназ из параллельных МАР-киназных сигнальных каскадов, Jnkl и р38. Результаты анализа показали отсутствие Arfó-зависимых изменений в уровне фосфорилирования Jnkl и значительное увеличение фосфорилирования киназы р38 в клетках, экспрессирующих как активированную форму (4-х кратное увеличение), так и дикий тип Arfó (2-х кратное увеличение) (рис. 23Б). Как и в случае с киназой Erkl/2, в клетках HET-ST Arf6N48I уровень фосфорилированной р38 был даже несколько ниже, чем в контрольной линии клеток. Полученные результаты свидетельствуют о том, что Arfó активирует MAP киназы Erkl/2 и р38, при этом активация Arfó дает лишь слабый дополнительный эффект относительно действия Arfó дикого типа, в то время как возможность взаимодействия с PLD является принципиальной.

3.5.Молекулярные механизмы Aifó-зависимой стимуляции пролиферации включают активацию комплекса mTORCl и MAP киназы р38

В результате описанных выше экспериментов нами обнаружены три сигнальных пути и три белка, которые могут опосредовать промитогенную функцию Arfó, а именно, mTORCl (посредством активации белков-мишеней S6K1-S6 и 4Е-ВР1), MAP киназ Erkl/2 и р38. Следующим этапом нашей работы было исследование значения каждого из этих сигнальных путей в реализации эффекта стимуляции пролиферации. Для решения этой задачи клетки линии ArfóQ67L, которые показали наибольший эффект изменения динамики пролиферации, инкубировали в среде с добавлением селективных ингибиторов, специфичных для каждого из белков. Для подавления mTORCl, Erkl/2 и р38 использовали, соответственно, рапамицин (lOOnM), CI-1040 (2 mM) и SB-SB203580 (25 тМ). Анализ действия ингибиторов в разной концентрации на количество активной формы (уровень активирующего фосфорилирования) Erkl/2 и р38 методом вестерн блотинга представлен на рисунке 24А.

График динамики пролиферации, представленный на рисунке 24 Б, показывает, что подавление mTORCl-SóKl- и (в меньшей степени) р38-зависимого сигнальных путей достоверно снижает пролиферативную активность клеток HET-SR Arf6Q67L. В то же время, подавление активности киназы Erkl/2 не повлияло на динамику пролиферации клеток. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в отличие от Erkl/2, оба сигнальные пути, опосредованные белками mTORCl-SóKl и р38, задействованы в Arfó-зависимом усилении пролиферативной активности. Исследуя возможные механизмы участия р38 в Aró-зависимом усилении пролиферации, мы предположили, что данная MAP киназа наряду с mTORCl-зависимым сигнальным путем, может участвовать в регуляции сборки комплекса инициации трансляции.

А

Б

НЕТ-ЗЯ С1-1040, мкМ

Аг1Б С!б71_ о,5 1 2

рЕгк1/2 Егк1/2

НЕТ-ЭЛ вВ-2030. мкМ Аг<6С!671_ 10 25 50

Ш РР38

Щ" 1

Ш р38

250000

§

| 200000 | 150000

$ 100000 £

с;

8 50000

о

Рис. 24. Анализ влияния подавления активности белков тТ(ЖС1, Егк1/2 и р38 на динамику пролиферации клеток, экспрессирующих активированный АгГб. А. Проверка эффекта действия и подбор концентрации ингибиторов С1-1040 и 8В203580 активности белков Егк1/2 и р38 соответственно. Б. Динамика пролиферации клеток HET-SRArf6Q67L при инкубации с соответствующими ингибиторами.

Для проверки этой гипотезы, а также для подтверждения роли АгГб-зависимой активации

тТСЖС 1 в этом процессе мы далее исследовали влияние подавления тТСЖС1 и р38 на статус

фосфорилирования представленных выше белков, регулирующих инициацию трансляции, грвб

и 4Е-ВР1. Мы также проанализировали эффект подавления киназы Егк1/2, которое не вызвало

снижение пролиферации исследуемых клеток, поскольку, согласно литературным данным,

Егк 1/2-регулируемые и шТОЯС!-зависимые сигнальные пути имеют множество «точек

пересечения» и могут совместно регулировать отдельные белки комплекса инициации

трансляции. Результаты исследования показали, что, как и в случае оценки динамики

пролиферации, подавление активности Егк1/2 не отразилось на статусе фосфорилирования ни

одного из белков (рис. 25). В то же время, как и ожидалось, ингибирование тТ(Ж-86К1

сигнального пути привело к значительному снижению фосфорилирования 86, причем как по

сайту 8ег235/236, так и по остаткам 8ег240/244. Количество соответствующих

фосфорилированных форм белка сократилось в 10 и 5 раз соответственно. Интересно, что

подавление активности киназы р38 также достоверно (р<0,05) снизило (в 2,5 раза)

фосфорилирование 86 по остаткам 8ег23 5/236 и не повлияло на уровень фосфорилирования по

сайту 8ег240/244. Важно отметить, что ингибирование р38 привело к снижению

фосфорилирования именно тех остатков серинов, фосфорилирование которых повысилось в

результате активности Аг56. Этот сайт фосфорилируется преимущественно киназами ЯЭК.

Полученные данные, по-видимому, означают, что АгйЗ-зависимая активация Б6 опосредуется

34

2

время, сутки

НЕТ-вЯ АЛ6 0671. НЕТ-ЭРгАПб 0671_+0-1040, мкМ НЕТ-БЯАйб 0671+88203580 мкМ НЕТ-вЯ Мб 0671_п»тамицин

двумя путями: р38—»ЯБК—»Бб, реализующим преимущественно фосфорилирование остатков 8ег235/236, и тТ<ЖС1->86К1-»86, фосфорилирующим оба сайта, 5ег235/236 и 8ег240/244. Что касается белка 4Е-ВР1, то, как видно на рисунке 25, на его фосфорилировании сказалось только подавление тТ(ЖС1 -зависимого сигнального пути. При этом, так же, как и в случае белка Э6, преимущественное снижение фосфорилирования наблюдалось по остатку треонина ТЬг70, фосфорилирование которого было Айб-зависимым. Уровень снижения фосфорилирования по этому остатку после обработки рапамицином составил четыре раза. То есть АгГб-зависимое фосфорилирование 4Е-ВР1 осуществляется строго посредством активации комплекса тТСЖС 1.

Ш

_1 2 сс да о

20 3

г— (О

Ш 'с -А КО

2 2

а

<д

г

П1 с:

а

......„ ~ш

—— ——»

-----

рЭ6

(3ег235/236) рвб

(&гг240/244) Б6

р-актин

-г р4Е-ВР1 (ТИг37/46)

Р4Е-ВР1 №70)

4Е-ВР1

р-актин

р86К1 (ТЫ389)

86К1 р-актин

Рис. 25. Анализ влияния подавления киназ Егк1/2, р38 и тТСЖ (под действием ингибиторов С1-1040, 8В203580 и рапамицина соответственно) на статус фосфорилирования мишеней тТОЯС1, белков Эб, 4Е-ВР1 и Э6К1 в клетках НЕТ-ЭЯ AIf6Q67L. Приведен денситометрический анализ количества фосфорилированных форм белков в сравнении с таковым в контрольной линии НЕТ-8Я АгГ6С>67Ь * - р<0,05.

З.б.Анализ экспрессии Arfó и RalA в клинических образцах опухолей немелкоклеточного рака легкого.

В целях определения потенциальных изменений в исследуемых белках Ral и Arft при злокачественных новообразованиях человека нами проанализирована экспрессия мРНК Arfó и продукция белков Arfó и RalA в образцах двух основных гистологических типов немелкоклеточного рака легких (НМРЛ) — плоскоклеточного рака (ПКРЛ) и аденокарциномы (АК).

Образцы опухолей и условно нормальных тканей (24 образца АК и 29 образцов ПКРЛ) были получены от больных, оперированных в 2005-2008 гг. по поводу РЛ в НИИ КО РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН. Весь материал проходил двойную гистологическую верификацию согласно последней классификации ВОЗ (Histological Typing of Lung and Pleural Tumors третьего пересмотра, IARC Press, Lyon, 2004) в отделе патологической анатомии опухолей человека НИИ КО ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН и охарактеризован в соответствии с TNM классификацией шестого пересмотра (версия 2003 г.). Вкратце, результаты исследования показали, что в 64% образцов НМРЛ, независимо от их морфологической структуры, продукция белка RalA снижена по сравнению с условно нормальной тканью. Для образцов ПКРЛ обнаружена связь (р=0,01) между снижением уровня белка RalA и отсутствием регионарных метастазов. В 55% образцов НМРЛ уровень белка Arfó повышается, причем при плоскоклеточном раке легкого такое увеличение встречается чаще (в 62%). Обнаружено статистически значимое снижение уровня белка RalA (р = 0,015) и повышение уровня белка Arfó (р = 0,049) по сравнению с образцами условно нормальной легочной ткани в группах так называемых "малых раков" плоскоклеточного генеза (Ti_2NoMo и Ti_2Ni_2Mo соответственно).

4. Белок, связывающий ретиноевую кислоту, CRABP1, в усилении высоко агрессивного фенотипа трансформированных клеток

4.1.Корреляция экспрессии CRABP1 с уровнем спонтанной метастатической активности трансформированных фибробластов.

Ранее при сравнении профилей экспрессии белков высоко- и низко-метастазных линий из вышеописанной экспериментальной системы клеточных линий трансформированных фибробластов сирийского хомяка методом двумерного гель-электрофореза было обнаружено отсутствие продукции белка CRABP1 в Н/М линии HET-SR и высокий уровень данного белка в В/М линии HET-SRI. Этот результат поставил вопрос о связи CRABP1 с метастатической активностью клеток и о возможном его участии в приобретении трансформированными клетками агрессивного фенотипа. Для проверки этого предположения уровень продукции данного белка был исследован в клетках с различной метастатической активностью. В анализ были включены исходно В/М линии HET-SR1 и HET-SR8, а также линия HET-SR-LNM,

приобретшая высокий уровень СМА в ходе селекции клеток HET-SR in vivo (после двух последовательных подкожных введений животным и последующего отбора клеток из метастаза в лимфоузле) (см.рис.1 А). Результаты анализа показали, что продукция CRABP1 отсутствует в клетках HET-SR, в то время как во всех В/М линиях данной панели (рис.26), включая линию, полученную путем отбора in vivo, данный белок экспрессируется на высоком уровне. Это означает, что в процессе селекции in vivo клетки приобрели параллельно высокую СМА и высокий уровень экспрессии CRABP1. Полученные данные позволяют говорить о наличии корреляции между экспрессией CRABP1 и уровнем СМА исследуемых клеточных линий.

Рис. 26. Сравнение продукции белка CRABP1 в линиях с различной СМА

4.2.Модуляция туморогенности и метастатической активности клеток при активации и подавлении экспрессии CRABP1

Для определения роли белка CRABP1 в формировании высоко-метастазного фенотипа клеток была выбрана следующая стратегия: а - гиперэкспрессировать экзогенный CRABP1 в Н/М линии HET-SR, в которой отсутствует экспрессия эндогенного белка; б — подавить экспрессию эндогенного CRABP1 в В/М линии (была выбрана HET-SR-1); в - оценить влияние экспрессии CRABP1 на важнейшие характеристики злокачественности клеток in vivo, включая туморогенность и СМА. Чтобы получить производную линии HET-SR, стабильно экспрессирующую экзогенный CRABP1, кодирующая последовательность Crabpl хомяка была клонирована в ретровирусный вектор pLXSN. Подавление экспрессии эндогенного CRABP1 проводили с помощью экспрессии малых шпилечных РНК (shRNA). Поскольку геном сирийского хомяка на момент исследования не был секвенирован, использовали праймеры, подобранные на консенсусные последовательности, фланкирующие кодирующую область мРНК CRABP1 мыши и крысы. В качестве матрицы для ПЦР использовали кДНК из линии HET-SR1, поскольку мРНК CRABP1 экспрессируется там на высоком уровне. Все манипуляции проводили в двух независимых повторах и осуществляли секвенирование каждого повтора. Полученная кодирующая последовательность CRABP1 сирийского хомяка была опубликована в открытой базе последовательностей GenBank, ей был присвоен регистрационный номер GQ139546.1. Анализ аминокислотной последовательности CRABP1 показал, что она идентична

CRABP1

HET-SR HET-SR1 HET-SR-LNM HET-SR8

аналогичным последовательностям крысы и мыши. Ретровирусный вектор с кодирующей последовательностью CRABP1 был экспрессирован в клеточной линии HET-SR. Проверка экспрессии белка CRABP1 представлена на рисунке 27А.

Далее мы провели анализ in vivo двух основных клеточных характеристик линии HET-SR CRABP1 - туморогенности и СМА. Анализ туморогенности или опухоль-инициирующей способности клеток полученной линии, определяемой как частота инициации роста опухолей в зависимости от количества прививаемых клеток, проводили с помощью трансплантационного теста на сингенных животных. Для эксперимента использовали по 25 животных экспериментальной и контрольной групп. Для анализа клетки в суспензии в четырех последовательных разведениях (прививочные дозы: 2х104, 2х103, 2x102 и 2x10 клеток) прививались подкожно каждому экспериментальному животному. Количество опухолей, сформированных на месте введения клеток, подсчитывали спустя восемь недель после привития. На рисунке 27Б представлены результаты анализа - количество животных из обеих групп с отсутствием опухолей, наличием опухоли (прививочная доза 2х104), 2-х опухолей (прививочные дозы 2х104 и 2х103) и так далее. Результаты анализа показали, что экспрессия CRABP1 статистически значимо (р<0,05) увеличивает туморогенность (уменьшает минимальную прививочную дозу) клеток HET-SR.

г«*- *

HET-SR HET-SR pLXSN CRABP1

Рис. 27. А. Вестерн блот анализ экспрессии CRABP1 в производной линии HET-SR СКЛВР1. Отрицательный контроль - клетки HET-SRpLXSN, экспрессирующие «пустой» вектор; положительный контроль - клетки линии HET-SR1. Б. Сравнение туморогенности производной линии HET-SR С1^АВР1 и контрольной линии. * - р<0,05)

При анализе СМА статистически значимые отличия (р<0,05) были получены лишь в трех из пяти экспериментов, в двух других экспериментах исследуемые выборки значимо не отличались (р<0,1). Полученные данные позволяют говорить лишь о тенденции к повышению

СМА клеток HET-SR при гиперэкспрессии CRABP1. Для подавления экспрессии CRABP1 в В/М были созданы лентивирусные конструкции на основе вектора pLKO. 1-puro, кодирующие предшественники малых шпилечных РНК к кодирующей последовательности мРНК CRABP1 хомяка. В качестве контроля использовали вектор pLKO. 1-puro с последовательностью, кодирующей shRNA к мРНК зеленого флуоресцентного белка eGFP (pLKO.l-shGFP). В эксперименте были использованы три варианта малых шпилечных РНК CRABP1. Как видно на рисунке 28, наибольшей эффективностью подавления обладали конструкции shB (более 90% снижения CRABP1) и (в меньшей степени) HET-SRlshA.

*noj -

«j«o г—■—

1 90 I SO'

ЦВЗЗГ ' ^ crabpi I з ■

1 «J

^^^^ ß-актин | ..... ........11111 — 110/ / f / / / / / / / " / / / / / ^ # /

Рис. 28. Сравнение продукции CRABP1 в производных линии HET-SR1, экспрессирующих shRNA к CRABP1. Положительный контроль - клетки HET-SR1. Приведен денситометрический анализ экспрессии CRABP1 в сравнении с контрольной линией HET-SRlshGFP.

В трансплантационном тесте обе производные линии продемонстрировали статистически достоверное (р<0,05) снижение туморогенности по сравнению с контролем (рис. 29А). Сравнение иза СМА вьивило достоверное снижение метастатической активности клеток линий HET-SR1 shA и HET-SR1 shB. Интересно, что линия HET-SR1 shB продемонстрировала наименьший уровень СМА, то есть снижение метастазирования коррелировало с уровнем подавления экспрессии CRABP1 (рис. 29Б). Поскольку линия HET-SR1 обладает высоким уровнем экспериментальной метастатической активности (ЭМА), мы далее изучали, насколько подавление экспрессии CRABP1 влияет на этот показатель. В отличие от анализа СМА, в тесте на ЭМА клетки напрямую водятся в кровяное русло (суспензию, содержащую 1х105 клеток каждой линии, вводили хомякам внутриорбитально), соответственно, этот тест моделирует поздние стадии процесса метастазирования - способность клеток к выживанию в кровотоке и вторичному росту в чужеродном микроокружении.

жухат ШШ 2 йгтшя» í^Z'j 1 опухоль

ш

8 ю-й)

о

О во-

40-

HET-SR1 ShGFP

HET-SR1 shA

HET-SR1 shB

20-

X

X

HET-SR1 shGFP

HET-SR1 shA

HET-SR1 shB

Рис. 29. Анализ характеристик полученных клеток in vivo. А. Сравнение туморогенности клеток HET-SR1 с подавленной экспрессией CRABP1. Б. ДСМА исследуемых линий

Проведенный анализ не выявил значимых отличий среднего количества экспериментальных легочных метастазов между двумя группами экспериментальных животных и контрольной группой. Однако в процессе гистологической оценки были обнаружены принципиальные отличия в размерах метастатических поражений. Для стандартизации оценки размеров метастатических узлов была использована трёхбалльная шкала: «1» - крупный метастаз, «2» -средний метастаз, «3» — микрометастаз, состоящий из нескольких клеток. Для статистического анализа крупные и средние метастазы были объединены в группу макрометастазов (рис. ЗОА), которую сравнивали с группой микрометастазов (рис. ЗОБ).

HET-SR1 HET-SR1 shGFP shA

HET-SR1 shB

с 40-

I u

s 204

а

1 о-

2

HET-SR1 shGFP

HET-SR1 HET-SR1 shA shB

Рис. 30. Сравнение размера экспериментальных метастазов, формируемых производными линиями НЕТ-8К1 со сниженной экспрессией СКАВР1. А. Среднее количество макрометастазов. Б. Среднее количества микрометастазов.

Обнаруженное значимое снижение количества макрометастазов, формируемых клетками с подавленной экспрессией эндогенного СИАВР!, свидетельствует о важности данного белка для успешного роста клеток во вторичных очагах в условиях чужеродного микроокружения.

40

Таким образом, мы впервые показали, что CRABP1 обладает про-туморогенной и про-метастатической активностью.

4.3 Анализ экспрессии мРНК и продукции белка CRABP1 в клинических образцах опухолей

мезенхимального происхождения - мягкотканых сарком различного генеза.

4.3.1 Изучение экспрессии мРНК CRABP1 и CRABP2 в образцах опухолей мягких тканей

человека

Поскольку ранее аналогичных исследований не проводилось, на первом этапе мы изучили экспрессию мРНК обоих гомологов - генов CRABPIh CRABP2 - в небольшой выборке злокачественных опухолей мягких тканей различных гистологических типов. Далее, выявив тип опухолей, в которых будут обнаружены изменения экспрессии CRABP, мы планировали провести ИГХ анализ образцов соответствующих новообразований. Исследование операционного материала от больных (образцы опухолевой и условно нормальной тканей того же гистогенеза от каждого пациента), проходивших лечение в НИИ КО РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН, проводили методом ПЦР в реальном времени с использованием TaqMan-зондов. Весь полученный материал проходил гистологическую верификацию в отделе патологической анатомии опухолей человека НИИ КО РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН и был классифицирован по системе FNCLCC (мезенхимальные опухоли). Всего было проанализировано 28 образцов (10 липосарком, 7 злокачественных фиброзных гистиоцитом (ЗФГ), 6 синовиальных сарком и 5 злокачественных шванном). Выравнивание количеств внесенных кДНК опухолевой и условно нормальной тканей проводилось по значениям Ct и эффективности для референсных генов, в качестве которых использовали три гена, кодирующих белки «домашнего хозяйства»: Nup85 (белок комплекса ядерной поры), GARS( глицил-тРНК-синтетаза) и HPRT (гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансфераза). Анализ данных изменения экспрессии референсных генов показал, что разброс значений этих изменений составляет 0,6-1,87. В качестве условной границы изменения экспрессии изучаемых генов приняли значение, равное двум. Проведенный анализ выявил частые изменения экспрессии исследуемых генов. Повышение количества мРНК CRABP1 наблюдалось в 21% обшей выборки исследуемых образцов, а понижение - в 39% случаев. Повышение количества мРНК CRABP2 наблюдалось в 25% исследуемых образцов, а понижение - в 18% случаев. Важно отметить, что характер изменений экспрессии существенно зависел от гистологического типа опухоли. Так, повышение экспрессии как CRABP1, так и CRABP2, было характерно исключительно для 1руппы синовиальных сарком и злокачественных фиброзных гистиоцитом. Среди образцов этой группы повышение экспрессии CRABP1 и CRABP2 было обнаружено в 46 и 54% случаев соответственно. В сумме повышение экспрессии одного или обоих генов было обнаружено в 4 из 6 образцов СС (66%) и в 4 из 7 образцов (57%) ЗФГ. В двух образцах СС и трех ЗФГ наблюдалось параллельное увеличение экспрессии обоих

генов. Соответственно, в группе СС и ЗФГ повышение экспрессии белков CRABP1 и/или CRABP2 было отмечено в 8 из 13 (61,5%) образцов. В отличие от СС и ЗФГ, в липосаркомах и злокачественных шванномах не было отмечено ни одного случая повышения экспрессии CRABP1 либо CRABP2. Более того, для 40 и 37% данных опухолей было характерно снижение количества мРНК CRABP1 или CRABP2 сответственно. Полученные результаты свидетельствуют о том, что изменения экспрессии данных генов характерны только для СС и ЗФГ. поэтому на следующем этапе мы провели анализ продукции белка CRABP1 в образцах синовиальных сарком с помощью иммуногистохимического (ИГХ) анализа. 4.3.2 Анализ экспрессии белка CRABP1 в образцах синовиальных сарком

ИГХ реакция проводилась на ультратонких срезах с парафиновых блоков послеоперационного материала. Коллекция парафиновых блоков послеоперационного материала от 27 пациентов с гистологически верифицированным диагнозом «монофазная синовиальная саркома» была предоставлена архивом Отдела патологической анатомии опухолей человека НИИ КО РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН, анализ проводился в сотрудничестве со с.н.с. отдела, Г. Ю. Чемерис. В зависимости от морфологии клеток, монофазные синовиальные саркомы делились на веретеноклеточные, круглоклеточные и смешанные варианты. Гистологически все эти опухоли были оценены в соответствии с FNCLCC классификацией и отнесены к новообразованиям высокой (третьей) степени злокачественности (G3). Результаты ИГХ анализа экспрессии CRABP1 показали высокий уровень данного белка (интенсивность реакции от «умеренной» (2 балла) до «высокой» (3 балла)) в 100% исследованных образцов синовиальных сарком. Процент опухолевых клеток, демонстрирующих позитивную реакцию, варьировал в диапазоне от 50 до 90% и не зависел от морфологического строения опухоли. Позитивная реакция наблюдалась как в ядрах, так и в цитоплазме опухолевых клеток (ядерно-цитоплазматическая реакция). При этом окружающие нормальные ткани не окрашивались, то есть были CRABP1-негативны (рис.31).

А Б В

Рис. 31. Экспрессия белка СЯАВР1 в образцах монофазных синовиальных сарком. А. Характерный пример положительной реакции в опухолевых клетках и отсутствия специфической реакции в окружающих клетках; Б. Характерный пример «умеренной» интенсивности реакции; В. Характерный пример «высокой» интенсивности реакции.

Нами не было обнаружено каких-либо корреляций между уровнем экспрессии CRABP1 и клиническими характеристиками. Это объясняется как гетерогенным характером выборки, и достаточно гомогенным (преимущественно высоким) уровнем экспрессии CRABP1 во всех изучаемых образцах. Кроме того, как уже говорилось, все образцы относились к низкодифференцированным (G3) опухолям. В целом, результаты впервые проведенного анализа свидетельствуют об убиквитарном характере экспрессии белка CRABP1 в монофазных синовиальных саркомах.

Выводы:

1. Показано, что онкоген H-Ras является активатором метастатической активности трансформированных фибробластов in vivo. Идентифицирован основной внутриклеточный сигнальный путь, опосредующий прометастатическую активность H-Ras: H-Ras—RalGDS—Ral. Основными мишенями H-Ras, стимулирующими метастатическую активность, являются малые ГТФазы RalA и RalB.

2. Доказана роль обоих гомологов Ral, малых ГТФаз RalA и RalB, в усилении метастатического потенциала трансформированных фибробластов. Показано, что RalB обладает большей про-метастатической активностью. Одновременная экспрессия обоих гомологов Ral не приводит к синергическому эффекту в отношении метастатической активности клеток.

3. Обнаружено, что основным белком-эффектором RalB, задействованным в RalB-зависимой активации метастазирования, является фосфолипаза PLD. В отличие от RalB, RalA-зависимая стимуляция метастазирования требует участия всех основных эффекторов: комплекса экзоциста, белка RalBPl и фосфолипазы D.

4. Ral-зависимое увеличение метастатического потенциала исследуемых клеток in vivo сопровождается изменением ряда характеристик трансформированных клеток, являющихся показателями уровня малигнизации in vitro: а — усилением способности клеток к автономному росту; б - увеличением инвазивной активности; в - активацией направленного движения по градиенту факторов роста.

5. RalA и RalB обладают сходным эффектом в отношении ряда белков, ассоциированных с опухолевой прогрессией: активация MAP киназы Jnk и транскрипционного фактора Stat3, а также усиление экспрессии белка CyclinDl. При этом RalA, в отличие от RalB, усиливает экспрессию молекулы адгезии CD24 и активность протеиназ внеклеточного матрикса, ММР-1 и uPA. RalB в большей степени, чем RalA, усиливает экспрессию CyclinDl и снижает продукцию компонента липидных микродоменов, белка Cav-1.

6. Показано, что малая ГТФаза Arfó усиливает пролиферативную активность трансформированных фибробластов и их способность к автономному росту, однако не

оказывает значимого влияния на метастатическую активность исследуемых клеток. Arfó-зависимая стимуляция пролиферации опосредуется PLD-зависимым сигнальным путем. Отсутствие возможности взаимодействия Arfó с PLD приводит к отмене эффекта стимуляции пролиферации, но усиливает клеточную подвижность, инвазивную активность и способность деградировать внеклеточный матрикс.

7. Arfó активирует PLD и усиливает активность киназы mTOR и ее мишеней: рибосомальной киназы S6K1, рибосомального белка S6, белка, связывающего фактор инициации трансляции eIF-4E, 4Е-ВР1. Идентифицированы активируемые белком Arf6 сигнальные пути: PLD—»mTORC 1 —*S6K 1 —>S6, PL D—»mTORC 1 -»4 Е-В Р1, p38->...-»S6, приводящие к активации комплекса инициации трансляции.

8. Arfó активирует MAP киназы Eikl/2 и р38. Молекулярные механизмы, реализующие промитогенную активность Arf6, включают активацию сигнального пути PLD—mTORCl и усиление активности р38.

9. Показано, что в 64% образцов немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) продукция белка RalA снижена по сравнению с условно нормальной легочной тканью. Обнаружена связь между снижением уровня белка RalA и отсутствием регионарных метастазов при плоскоклеточном раке легкого (ПКРЛ). Уровень белка Arfó повышен в 55% образцов НМРЛ, при ПКРЛ повышение обнаружено в 62%. Среди образцов «малых раков» ПКРЛ обнаружено значимое снижение уровня белка RalA в группе Ti_2NoMo и повышение уровня белка Arfó в группе T1-2N1-2M0.

10. Обнаружена корреляция между экспрессией бежа, связывающего ретиноевую кислоту CRABP1 и уровнем спонтанной метастатической активности трансформированных фибробластов. Доказана роль CRABP1 в стимуляции туморогенности и метастатической активности клеток.

11. Показан дифференциальный характер экспрессии мРНК CRABP1 в злокачественных опухолях мягких тканей в зависимости от гистологического типа опухоли. Белок CRABP1 убиквитарно и на высоком уровне экспрессирован в монофазных синовиальных саркомах. Рекомендовано дальнейшее исследование белка CRABP1 для использования в качестве маркера дифференциальной диагностики синовиальных сарком.

Список работ по теме диссертации Список научных работ, опубликованных в журналах, рекомендованных ВАК РФ:

1 .Tchevkina, Е. М. Suppression and restoration of v-src expression in RSV transformed cells after transfection with N-ras and its antagonists / E. M. Tchevkina, N. P. Kisseljova, M. S. Shtutman, E. A. Musatkina, O. A. Mizenina, A. Tavitian, F. L. Kisseljov // Int. J. Oncology . — 1995. — V.7., №3. — P. 453-459.

2.3уева, Э. Ш. Снижение метастатического потенциала v-src-трансформированных клеток в результате активности DAP киназы / Э. Ш. Зуева, Е. М. Чевкина, A. Kimchi, А. Г. Татосян // Молекулярная биология клетки. — 2002. — Т. 36., №3. — С.472-479.

3. Tchevkina, Е. The small G-protein RalA stimulates metastasis of transformed cells / E. Tchevkina, L. Agapova, N. Dyakova, A. Maitinjuk, A. Komelkov, A. Tatosyan // Oncogene. — 2005. — V.24., №3. — P. 329-335.

4.Рыбко, В. А. Активность протеиназ внеклеточного матрикса в экспериментальной модели опухолевой прогрессии / В. А. Рыбко, А. В. Книжник, Я. А. Каинов, А. В. Комельков, Е. М. Чевкина // Вестник РОЩ им. H. Н. Блохина РАМН. — 2008. — Т. 19. — С. 16-22.

5.Любченко, Л. Н. Рак молочной железы и/или яичников в составе наследственного онкологического синдрома / Л. Н. Любченко, Н. И. Поспехова, А. А. Пароконная, А. А. Лушникова, Е. М. Чевкина // Опухоли женской репродуктивной системы. — 2009. — Т. 1., № 2. — С.59-63.

6. Книжник, А. В. Белки Arf6, RalA и BIRC5 при немелкоклеточном раке легкого/ А. В. Книжник, О. В. Ковалева, К. К. Лактионов, В. В. Мочальникова, А. В. Комельков, Е. М. Чевкина, И. Б. Зборовская // Молекулярная биология клетки. — 2011. — Т. 45., №2. — С.307-315

7. Боярских, Ю.А. Прогнозирование чувствительности клеток немелкоклеточного рака легких к действию цисплатина и паклитаксела на основании уровня экспрессии маркерных генов / Ю. А. Боярских, Ю. В. Коцдрахин, И. С. Евшин, Р. Н. Шарипов, А. В. Комельков, Е. А. Мусаткина, Е. М. Чевкина, М. А. Сукоян, Ф. А. Колпаков, К. R Кашкин, М. Л Филиппенко // Молекулярная биология клетки. — 2011. — Т. 45., №4. — С.600-607.

8.Rybko, V. A. Different metastasis promotive potency of small G-proteins RalA and RalB in in vivo hamster tumor model / V. A. Rybko, A. V. Knizhnik, A. V. Komelkov, V. N. Aushev, L. S. Trukhanova & E. M. Tchevkina //Cancer Cell International. — 2011. — Vol. 11., №22. — P.l-12.

9.Каинов, Я. А. Роль белка CRABP1 в формировании высокометастазного фенотипа RSV-трансформированных фибробластов сирийского хомяка / Я. А. Каинов, И. А. Фаворская, E. Е. Антошина, Т. Г. Горькова, А. В. Комельков, E. М. Чевкина // Российский биотерапевтический журнал. — 2011. — Т. 10., №2. - С. 37-44.

10. Ковалева, О. В. Сурвивин и его роль в патогенезе злокачественных опухолей / О. В. Ковалева, А. Н. Шнейдерман, E. М. Чевкина // Саркомы костей, мягких тканей и опухоли кожи. - 2011. — № 4. -С. 62-72.

1 l.Knizhnik, А. V. Arf6 promotes cell proliferation via the PLD-mTORCl and p38MAPK pathways / A. V. Knizhnik, О. V. Kovaleva, A. V. Komelkov, L. S. Trukhanova, V. A. Rybko, I. B.Zborovskaya & E. M. Tchevkina //Journal of Cellular Biochemistry. — 2012. — Vol. 113., №1. — P.360-371. 12.Kaminsky, V.O. Suppression of basal autophagy reduces lung cancer cell proliferation and enhances caspase-dependent and -independent apoptosis by stimulating ROS formation/ V. O. Kaminsky, T.

Piskunova, I. В. Zborovskaya, E. M. Tchevkina, B. Zhivotovsky // Autophagy. — 2012. — Vol. 8., №7. — P. 1032-1044.

13,Kaminsky, V.O. Upregulation of c-FLIP-short in response to TRAIL promotes survival of NSCLC cells, which could be suppressed by inhibition of Ca2+/calmodulin signaling / V. O. Kaminsky, О. V. Surova, T. Piskunova, I. B. Zborovskaya, E. M. Tchevkina, I.Andera, B. Zhivotovsky // Cell Death and Disease. — 2013.—'Vol. 4, —P. 1-10.

14.Чевкина, E. M. Экспрессия CRABP1 и CRABP2 в саркомах мягких тканей / Е. М. Чевкина, И. А Фаворская, Я. А Каинов, Г. Ю. Чемерис, А. В. Комельков, Н. А Дьякова // Саркомы костей, мягких тканей и опухоли кожи. - 2013.—№ 1. — С. 47-53.

15.Kainov, Y. CRABP1 provides high malignancy of transformed mesenchymal cells and contributes to the pathogenesis of mesenchymal and neuroendocrine tumors / Y. Kainov, I. Favorskaya, V. Delektorskaya, G. Chemeris, A. Komelkov, A. Zhuravskaya, L. Trukhanova, E. Zueva, B. Tavitian, N. Dyakova, I. Zborovskaya, E. Tchevkina // Cell Cycle. — 2014. — Vol. 13, №10— C. 1530-2539.

Статьи, опубликованные в монографиях: 1. Tchevkina, Е. Protein Phosphorylation as a Key Mechanism of mTORCl/2 Signaling Pathways / E. Tchevkina, A. Komelkov // Chapter in book: Protein Phosphorylation in Human Health. Editor Cai Huang; Publisher InTech, Open Access Publisher—2012. — Ch. 1. — P. 5-50.

Другие опубликованные научные работы:

1. Tchevkina, Е. Modulation of signal transduction protein expression in v-src-transformed cells with different level of metastatic potential / E. Tchevkina, I. Rodina, E. Musatkina, A. Martinuk, A. Tatosyan // 17th EACR meeting, 8-11 June 2002, Granada, Spain // Revista de Oncologia. — V. 4/1. — P.48-49

2. Zueva, E. Exogenous DAP-kinase gene activity suppresses metastatic potential of RSV-transfromed fibroblasts and induces changes in signal transduction pathways and in the transcription of several genes involved in carcinogenesis / E. Zueva, E. Tchevkina, A. Kimchi // 17th EACR meeting, 8-11 June 2002, Granada, Spain // Revista de Oncologia. — V. 4/1. — P.46-47

3. Tchevkina, E. Ha-ras oncogene induces the metastatic ability of transformed cells in vivo through RalGDS downstream signalling pathway / E. Tchevkina, A. Martinjuk, A. Komelkov, A. Tatosyan // ECCO 12 - the European Cancer Conference, 21-25 September 2003, Copenhagen, Denmark // European Journal of Cancer. — 2003. — V. 1, №5. — P. 180

4. Rybko, V. RalA and RalB proteins contribute to metastasis stimulation through distinct pathways / V. Rybko, K. Ukraintsev, A. Martinjuk, N. Dyakova, A. Komelkov, O. Kovaleva and E. Tchevkina // Second International Congress on Molecular Staging of Cancer, 22-26 June 2006, Heidleberg, Germany // European Journal of Cancer. —2006. — V. 4 № 6. — P. 31-32

5. Knizhnik, A. ArfiS participates in modulation of cell metastatic activity in vivo / A. Knizhnik, V. Rybko, Y. Kainov, A. Komelkov and E. Tchevkina // European Small GTPase meeting, 29-31 August 2007, Umea, Sweden // Abstracts. - 2007 - P. 59

6. Tchevkina, E. Extracellular Proteases Activity In A Tumor Progression Experimental Model/ E. Tchevkina, A. Knizhnik, V. Rybko, Y. Kainov, A. Komelkov // Eighth international conference of anticancer research, 17-22 October 2008, Kos, Greece// Anticancer Research—2008.-V. 28, № 5C. — P. 3513.

7. Книжник, А. Модуляторы активности фосфолипазы D белки RalA и Arf6: влияние на различные характеристики трансформированных клеток / А. В. Книжник, В. А. Рыбко, Я. А. Каинов, А. В. Комельков, Е. М. Чевкина // Школа-конференция «Методы культивирования клеток», 6-10 октября

2008, Санкт-Петербург, Россия // Цитология. — 2008. — Т.50. — С.807.

8. Knizhnik, A. Extracellular matrix proteases activity in hamster tumor progression experimental model/ A. Knizhnik, V. Rybko, Y. Kainov, A. Komelkov and E. Tchevkina // Cancer Degradóme Symposium, 8-9 October 2008, London, UK.// Abstracts- 2008. - P. 28

9. Knizhnik, A. Arf6-dependent signaling contributes to cancer progression in in vivo animal model and lung cancer / A. Knizhnik, V. Rybko, O. Kovaleva, Y. Kainov, A. Komelkov and E. Tchevkina // Beatson international cancer conference "Microenvironment, motility and metastasis", 5-8 July 2009, Glasgow, Scotland // Abstracts - 2009. - P. 98

10. Kainov, Y. Modulation of extracellular matrix remodelling system associated with different metastatic phenotype of v-src transformed cells / Y. Kainov, V. Rybko., E. Tchevkina, A. Knizhnik, A. Komelkov // International cancer conference "Molecular Mechanism in Signal Transduction and Cancer", 16-24 August

2009, Spetses, Greece // Abstracts - 2009 — P. 43

11. Чевкина, E. Участие фосфолипазы D в RALB и ARFó-зависимой стимуляции опухолевой прогрессии трансформированных фибробластов сирийского хомяка / Е. М. Чевкина, О. А. Ковалева, А. В. Комельков, А. В. Книжник, В. А. Рыбко, Е. Е. Антошина, Т. Г. Горькова// Евразийский форум по диагностике злокачественных опухолей, 9-10 июня 2011, Киев, Украина // Тезисы докладов. -2011,- С.40

12. Каинов Я. А. Роль белка CRABP1 в формировании высокометастазного фенотипа RSV-траесформированных фибробластов сирийского хомяка /Я.А. Каинов, И.А. Фаворская, JI.C. Труханова, А.Ю. Журавская, А.В. Комельков, Е.М. Чевкина // Евразийский форум по диагностике злокачественных опухолей, 9-10 июня 2011, Киев, Украина // Тезисы докладов. - 2011.- С.26

13. Kainov, Y. CRABP1 stimulates tumorigenicity and metastasis of RSV-transformed fibroblasts / Y. Kainov, I. Favorskaya, L. Trukhanova, G. Chemeriz, A. Komelkov, E. Tchevkina // 40th congress of the International society of oncology and biomarkers, 13-17 Oktober 2012, Jerusalem, Israel // Tumor Biology. - 2012. - V. 33, Suppll. - P.l 13.

14. Tchevkina, E. PLD is a downstream partner of Arf6 and RalB in stimulation of transformed hamster fibroblasts proliferation and metastasis / E. Tchevkina, O. Kovaleva, A. Knizhnik, I. Zborovskaya, V. Rybko // 40th congress of the International society of oncology and biomaikers, 13-17 Oktober 2012, Jerusalem, Israel // Tumor Biology. - 2012. - V. 33, Suppl. 1. - P. 115.

15. Журавская, А. Влияние экспрессии малой ГТФазы ARF6 на mTOR- и МАРК-зависимые сигнальные пути в опухолевых клетках человека различного гистогнеза // А. Ю. Журавская, О. В. Ковалева, Е. М Чевкина // II Евразийская онкологическая конференция для молодых исследователей, 25 апреля 2013, Москва, Россия // Тезисы докладов. -2013. - С.20

16. Фаворская, И. Участие CRABP1 в формировании агрессивного фенотипа расформированных мезенхимальных клеток человека / И. А. Фаворская, Я. А. Каинов, А. В. Комельков, Е. М. Чевкина, И. Б. Зборовская // VIII Всероссийский съезд онкологов, 11-13 сентября 2013, Санкт-Петербург, Россия//Вопросы онкологии. — 2013. — Т. 59, № 3.— С. 137-138

17. Kainov, Y. CRABP1 is ubiquitously expressed in synovial sarcomas and promotes tumorigenicty and metastatic activity of transformed mesenchymal cells / Y. Kainov, I. Favorskaya, G. Chemeriz, N. Dyakova, A. Komelkov, E. Tchevkina // 5th EMBO meeting, 21-24 September 2013, Amsterdam, Netherlands//Abstracts-2013,- P. 139-140

Подписано в печать: 11.06.2014 Тираж: 150 шт. Заказ № 026 Отпечатано в типографии «Реглет» 125009, г. Москва, Страстной бульвар, д. 4 +7(495)979-98-99; www.reglet.ru