Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Поиск фармакологических веществ для терапии нейрофиброматоза II типа

На правах рукописи

СТЕПАНОВА ДИНА СЕРГЕЕВНА ПОИСК ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ ДЛЯ ТЕРАПИИ ПЕЙРОФИКРОМАТОЗА II ТИПА

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 7 ИАГ1201 з

005569507

МОСКВА-2015

005569507

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего

профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской

Федерации

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор Николай Львович Шнмановскми

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Николай Владимирович Образцов

ФГБОУ ДПО «Институт повышения квалификации»

ФМБА, профессор кафедры токсикологии и клинической фармакологии

Доктор медицинских наук, доцент Юрий Кузьмич Наполов

ГБОУ ВПО «Первый московский государственный

медицинский университет им. И.М. Сеченова»,

профессор кафедры фармакологии фармацевтического факультета

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологическим университет имени А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится « 1 » июня 2015 года в «_» часов на заседании Диссертационного

совета Д 208.072.01 при ГБОУ ВПО ((Российский национальный исследовательский медицинский университет им. H.H. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 117998, Москва, ул. Островитянова, д. 1.

Автореферат разослан «_» апреля 2015 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

A.C. Духанин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования и степень её разработанности.

Нейрофиброматоз второго типа (НФ II) - аутосомно-доминантное наследственное заболевание, характеризующееся образованием множественных доброкачественных опухолей, преимущественно шванном и менингиом, локализующихся в центральной нервной системе и по ходу периферических нервов (Evans, D.G., et al., 1992). Лечение сводится к многократным хирургическим вмешательствам, и пациенты редко доживают до тридцати лет.

Развитие заболевания связано с повреждением гена NF2 (Evans, D.G., et al., 1992, Bianchi, A.B., et al.,1994). До сих пор неизвестно, каким образом регулируется активность продукта гена NF2, белка мерлин, и не установлены посредники, отвечающие за его онкосупрессорную функцию.

Поскольку до сих пор не существует фармакотерапии нейрофиброматоза II, многократные хирургические вмешательства снижают качество и продолжительность жизни пациентов, а генной терапии данного заболевания не существует в связи с невозможностью равномерного распределения недостающего онкосупрессора мерлина в тканях пациента, поиск лекарственных веществ (ЛВ) для лечения НФ II является чрезвычайно актуальной задачей. Традиционный подход к решению этой задачи заключался в испытании зарегистрированных противоопухолевых препаратов на пациентах с НФ II и пока не привел к положительным результатам (Plotkin, S.R., et al., 2008 и 2009). Было опробовано качественно иное решение задачи, а именно, проведён скрининг панели биологически-активных соединений, относящихся к различным классам ЛВ, с использованием клеточной модели нейрофиброматоза II типа.

Цель исследования. Целью данной работы является поиск соединений для фармакотерапии нейрофиброматоза второго типа при помощи химического скрининга.

Задачи:

1) Модифицировать имеющуюся клеточную линию с высоким уровнем экспрессии гена Nf2, добиваясь нокаута Nf2.

2) Охарактеризовать полученную линию и сравнить ее с исходной -изогенной — линией, используя следующие критерии:

а морфологию b кривые роста

с устойчивость клеток к истощению среды d устойчивость клеток к действию цитотоксических агентов.

3) Сравнить действие некоторых известных биологически активных молекул на изогенные JV/2-отрицательные и NJ2-положительные линии с целью определения веществ, избирательно действующих на NfT'~ клетки с помощью химического скрининга.

а провести скрининг коллекции низкомолекулярных биоактивных соединений (оценить соотношение выживаемости А/2-отрицательных и jV/2-положительных клеток в присутствии исследуемых соединений) b валидировать результаты скрининга:

• изучить зависимость эффекта отобранных в скрининге соединений от концентрации

• протестировать выбранные соединения на различных Л/2-отрицательных линиях

• оценить влияние реэкспрессии белка мерлин в jV/2-отрицательных клетках на эффект исследуемых веществ.

• протестировать фармакологические аналоги веществ, отобранных по результатам скрининга.

4) Определить механизм действия веществ-кандидатов, найденных в результате скрининга.

5) Проверить эффективность отобранных соединений т vivo.

Научная новизна работы. Работа содержит новые данные о J1B, проявляющих избирательную токсичность в отношении jV/2-отрицательных клеток. Показана селективная токсичность ингибитора 3-гидроксиметилглутарил-коА редуктазы ловастатина и ингибитора синтазы жирных кислот церуленина в отношении JV/2-отрицательных клеток и описан

механизм селективности действия данных соединений. Работа содержит новые данные о роли активации цитоплазматической фракции малой ГТФазы Racl в запуске клеточной гибели. Ранее были подробно описаны функции мембранной фракции Racl, играющей важную роль в направленном движении клетки. Однако есть лишь одна статья (Liang, S.L., et al., 2006), демонстрирующая роль активированной Racl в цитоплазме. В данной работе показано, что гиполипидемические препараты группы статинов, вызывая истощение внутриклеточного пула геранил-гераниола, переводят Racl из мембранной фракции в цитоплазматическую, а также, селективно активируют Racl в Nf2-отрицательных клетках, вызывая их гибель. Впервые описан синергизм между статинами и ингибитором геранилтрансферазы I. Работа содержит данные о роли белка мерлин в регуляции метаболизма жирных кислот. В данной работе были обнаружены особенности метаболического сдвига в jV/2-отрицателыгых клетках и доказано, что благодаря этим особенностям ингибиторы синтазы жирных кислот, в частности, церуленин, обладают селективностью в отношении jV/2-отрицательных клеток.

На основании полученных результатов впервые предложены два возможных подхода к терапевтическому лечению НФ II: ингибирование 3-гидрокси-З-метилглутарил-коА редуктазы и геранилтрансферазы I и ингибирование синтазы жирных кислот.

Практическая значимость диссертации. При отсутствии терапевтических средств для лечения НФ II в настоящее время активно ведется поиск и изучение ферментных каскадов, которые могут быть нарушены в результате утраты мерлина. В данной работе были обнаружены существенные изменения метаболического профиля Лу2-отрицательных клеток, а также, доказана необходимость нормального геранилирования ГТФазы Racl для выживания /^-отрицательных клеток. Таким образом, результаты работы позволяют рассматривать ингибиторы геранилтрансферазы I, З-гидрокси-З-метилглутарил-коА редуктазы и синтазы жирных кислот в качестве новых потенциальных терапевтических агентов в лечении НФ II.

Основные положения, выносимые на защиту

1) Получена клеточная линия мышиных эмбриональных фибробластов, нокаутных по гену N/2, моделирэдощая нейрофиброматоз II типа.

2) Фармакологический скрининг, проведённый на полученной клеточной линии, выявил два соединения: ингибитор З-гидрокси-З-метилглутарил-коА редуктазы ловастатин и ингибитор синтазы жирных кислот церуленин, проявляющие избирательную цитотоксичность в отношении /У/2-отрицательных клеток. Дальнейшие исследования показали, что фармакологические аналоги обнаруженных соединений: гиполипидемические препараты группы статинов и ингибиторы синтазы жирных кислот, а также ингибитор геранилтрансфераз золедроновая кислота также обладают избирательной цитотоксичностью в отношении Д'/2-отрицательных клеток.

3) Механизм избирательной цитотоксичности ингибиторов З-гидрокси-З-метилглутарил-коА и геранилтрансфераз связан с истощением внутриклеточного пула геранилгераниола, что приводит к отсоединению от клеточной мембраны малой ГТФазы Кас1. Под действием статинов Г1ас1 транслоцируется в ядро, где в /у/2-отри цате л ы I ых клетках активируется и вызывает клеточную гибель.

4) Механизм избирательной цитотоксичности ингибиторов синтазы жирных кислот связан с более высоким уровнем метаболизма жирных кислот в Д/2-отрицательных клетках по сравнению с нормальными клетками.

5) Исследованные соединения (ловастатин, симвастатин, золедроновая кислота и церуленин) замедляли рост шванном у бестимусных мышей в ксенографтной модели нейрофиброматоза II типа.

Внедрение результатов исследования. Результаты исследований и ряд примененных в работе методов применяются в исследованиях в Фокс-Чейзовском Онкологическом Центре (Филадельфия, США) и внедрены в учебный процесс на кафедре радиобиологии и молекулярной биологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Пирогова Минздрава России.

Личный вклад автора. Автором проведён анализ литературы по теме работы, спланирован ход работы и разработаны схемы экспериментов по

получению клеточных линий, проведению скрининга и установлению механизма действия исследуемых соединений, самостоятельно выполнена экспериментальная часть исследования. Автор лично провёл статистическую обработку и анализ полученных результатов, сформулировал выводы и научно-практические рекомендации. Публикации по результатам работы подготовлены при активном участии автора.

Степень достоверности н апробация результатов диссертационной работы. Высокий уровень достоверности результатов работы подтверждается достаточным объемом экспериментальных данных, использованием высокотехнологического оборудования, адекватных современных методов и критериев статистической обработки данных. Результаты работы были представлены в виде устных и стендовых докладов на международных конференциях: "Cell Symposia: Systems Approach to Metabolic Diseases" (Чикаго, США, 2014), "The NF Conference 2013" (Монтеррей Бэй, США, 2013), "18th Annual Postdoctoral and Graduate Student Conference" (Филадельфия, США, 2013), "The NF Conference 2011" (Джексон Хол, США 2011), "16,h Annual Postdoctoral and Graduate Student Conference" (Филадельфия, США, 2011)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, из которых 3 - статьи в российских и зарубежных рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования России.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 139 источников, из которых 137 зарубежных. Работа содержит 49 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали мышиные эмбриональные фибробласты, несущие флокс-аллель в гене N/2 (MEF Nf2f,°xJJ1°x), иммортализованные клетки мышиной /^-отрицательной шванномы (SC4-9), иммортализованные мышиные шванновские клетки FC912 (дикого типа) и FH912 (Лу2-отрицателышс) -любезно предоставлены д-ром Марко Джованнини (dr Marco Giovannini, Centre d'Etude du Polymorphisme Humain (СЕРН) et Institut Universitaire d'Hematologie, Paris, France); и клетки линии крысиной iV/2-отрицательной шванномы (RT4) -получены из Американского банка клеток и тканей (АТСС, кат. № CRL-2768).

Все клетки, кроме FC912 и FH912, выращивали в модифицированной по Дульбекко среде Игла (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 2 мМ L-глютамина, 1мМ пирувата натрия и 0.1 м M смеси заменимых аминокислот (все Gibco Invitrogen Ltd, Paisley, UK) при 37°C, 5% C02. Клетки линий FC912 и FH912 выращивали в среде DMEM:F12 (1:1) с добавлением 2 мкМ форсколина, 10 нг/мл нейрегулина и добавки N2 в рекомендованной производителем концентрации на чашках, обработанных полилизином и ламинином.

Получение фибробластов, нокаутных по гену NJ2. Иммортализованные клетки MEF W/2/7"T':/7at трансфецировали плазмидным вектором pMSCV-Cre-GFP, несущим Сге-рекомбиназу и зеленый флуоресцентный белок (GFP). Контрольные клетки MEF М/2П0Х/^0Х трансфецировали плазмидным вектором pMSCV-GFP, несущим только GFP. Через 48 часов после трансфекции на проточном цитофлуориметре (Becton Dickinson FACS-VantageSE flow cytometer) отбирали флуоресцентные клетки. Делеция гена NJ2 была подтверждена геномным типированием и иммуноблоттингом.

Скрининг коллекции низкомолекулярных биоактивных веществ. В работе использована коллекция биологически активных веществ ICCB Known Bioactives (Enzo Life Sciences, США, № BML-2840-0100). Скрининг был осуществлён на двух клеточных линиях: экспериментальной MEF Nj2~'~ и

контрольной MEF црПох/11ох, в триплетах, и повторён дважды. В качестве отрицательного контроля использовали растворитель (ДМСО). В качестве положительного контроля использовали стауроспорин в конечной концентрации 20 мкМ. Действие веществ оценивали по уровню выживаемости клеток, измеренному с помощью модифицированного МТТ-теста. Веществами, показавшими положительный результат, считали такие, для которых соотношение жизнеспособных клеток MEF Nf2~'~ к MEF b!fl,}"*'ß"x было < 0,8, расценивая разницу в 20% как умеренные различия, а ожидаемая доля ложных отклонений гипотез (FDR, false discovery rate) по методу Бенджамини-Хохберга [Y. Benjamini и Y. Hochberg, 1995] < 20%. При валидации результатов скрининга клетки выращивали в 96-луночных планшетах. Среднюю ингибиторную концентрацию (IC50, концентрацию вещества, при которой доля жизнеспособных клеток составляла 50%) рассчитывали по формуле IC¡o=a+b*arctg(l-l/2c) после аппроксимации кривой Доза/Эффект логистической функцией y=c*(l-tg((x-a)/b)), где х - концентрация вещества, методом наименьших квадратов по коэффициентам a, bu с.

Активность малой ГТФазы Racl оценивалась методом резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) (L. Hodgson, F.Shen, К. Hahn, 2010).

Уровень синтеза жирных кислот оценивался с помощью иммуноблоттинга с антителами против ферментов, участвующих в липогенезе (синтаза жирных кислот (Fasn), ацетил-коА карбоксилаза (Асс), фосфо-ацетил-коА карбоксилаза (фАсс), фактор транскрипции липин 1 (Lipinl), АТФ-цитратлиаза (Acl), фосфо-АТФ-цитратлиаза (фАс1), ацетил-коА синтетаза (Acecsl), лигаза длинноцепочечных жирных ацил-коА (long fatty acid acyl-coA ligase Acsll), нормализуя результаты к уровню экспрессии ß-актина, и с помощью количественной ПЦР с праймерами генов Fasn, Асаса (ген Accl), Acacb (ген Асс2), Lpinl, Acíy, Acss2 (ген Acecsl), Acsll, Srbpl (ген стерольного регуляторного элемента 1, фактора транскрипции), Cptlc (ген карнитинпальмитоилтрансферазы 1у) и Cpl2 (ген карнитин-

пальмитоилтрансферазы II), нормализуя результаты к усреднённому уровню экспрессии генов «домашнего хозяйства» Actinb, Tbpl и Hrpt.

Накопление промежуточных продуктов синтеза жирных кислот (ацетил-коА и малонил-коА) оценивали с помощью ультравысокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (УВЭЖХ/МС) с предварительной твердофазной очисткой клеточных экстрактов.

Статистический анализ. Все эксперименты повторяли в триплетах по 4 раза. Для построения графиков и таблиц использовали средние значения и доверительный интервал для вероятности Р= 95%. Статистическую значимость результатов р оценивали с помощью двухвыборочного t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Получение фибробластов, нокаутпых по гену NJ2

В работе использовали мышиные эмбриональные фибробласты (MEF), так как в норме в этих клетках наблюдается выраженная экспрессия гена Nf2, и имеются литературные данные, подтверждающие, что потеря данного гена оказывает значительный эффект на фенотип этих клеток (Morrison, Н. Et al., 2001, Lallemand, D., et al., 2003).

Первичные культуры мышиных эмбриональных фибробластов (MEF fjj^Pox/jioxj 5Ь1ЛИ иммортализованы и обработаны Сге-рекомбиназой (описано в разделе «Материалы и методы»)

Для подтверждения нокаута гена Nf2 в клетках MEF Nf2"'~ было проведено генотипирование полученных линий и вестерн-блоттинг лизатов клеток. Данные исследования подтвердили нокаут гена NJ2.

Были исследованы изменения функциональных свойств, вызванные нокаутом гена NJ2. Полученная линия отличалась от контрольной морфологически - клетки выглядели более распластанными, склонными к образованию ламеллиподий, склонными к отделению от субстрата; более высокой скоростью роста; большей устойчивостью к истощению среды и к

воздействию цитотоксических агентов (стауроспорина). Также, в клетках полученной 7у/2-отрицательной линии были проанализированы изменения уровня экспрессии и фосфорилирования некоторых белков, в норме взаимодействующих с мерлином. Результаты иммуноблоттинга свидетельствуют об активации пролиферативных и антиапоптотических каскадов в клетках линии МЕР N/2'''.

В данной работе получены две линии клеток, отличающихся только по одному гену N/2, что может стать мощным инструментом для изучения взаимодействий мерлина, а также для поиска лекарственной терапии НФ II.

Скрининг коллекции низкомолекулярных биоактивных веществ

Скрининг провели на клетках полученных линий MEF Nf2'/' и MEF ^уpfiox/jiox^ 4TOgbI оценить избирательную токсичность соединений в отношении /V/2-отрицательных клеток. На рис. 1 представлены первичные результаты скрининга, и цветом выделены вещества, удовлетворяющие критериям отбора (соотношение жизнеспособных клеток MEF Nf2~'' к MEF N< о,8; FDR по методу Бенджамини-Хохберга < 20%).

Рисунок 1. «Первичные результаты скрининга коллекции низкомолекулярных биоактивных соединении»

4 ■

)1 = 2

FDR < 20%

« Мевинолин (ловастатан)

• Цфуленин ■ОобЭТб ®Нифедипин

Ресвератрол

* Цигскалазин D

«КапсаицинСЕ) ■ Нигерицин

» Микрфеноловая кислота

биоасгивные соединения

9 веществ, соответствовавших критериям отбора скрининга (соотношение жизнеспособных NJ2-отрицательных клеток к жизнеспособным контрольным < 0,8; FDR < 20%) были выбраны для следующего этапа исследований.

Первичная валидация результатов скрининга

Для соединений, идентифицированных с помощью скрининга, были исследованы зависимости цитотоксичности от концентрации для обеих клеточных линий. Соединения были протестированы на клетках других /неотрицательных линий (БС4-9 и ЯТ4). На следующем этапе был изучен эффект фармакологических аналогов исследуемых соединений, а также, чтобы подтвердить, что селективная токсичность выбранных веществ обусловлена отсутствием белка мерлин в клетках Л//2-отрицательных линий, в клетках линии ЭС4-9 реэкспрессировали белок мерлин и снова протестировали исследуемые соединения. По результатам валидации, из девяти соединений, удовлетворявших критериям отбора скрининга, для дальнейших исследований были выбраны два: ингибитор З-гидрокси-З-метилглутарил-коА редуктазы ловастатин и ингибитор синтазы жирных кислот церуленин.

Исследование механизма действия статинов в отношении 7у/2-отрицательных клеток

Ловастатин является ингибитором З-гидрокси-З-метилглутарил-коА редуктазы, фермента, который осуществляет синтез холестерола из мевалоната. Статины блокируют первую стадию синтеза - превращение ацетил-коА в мевалонат. Чтобы выяснить, какой из этапов синтеза является ключевым для жизнедеятельности Д/2-отрицательных клеток, в среду совместно с ловастатином добавляли холестерол или промежуточные продукты. Холестерол не влиял на токсичность статинов, однако фарнезилфосфат и геранилгераниолфосфат полностью подавляли действие статинов. Геранилгераниолфосфат и фарнезилфосфат необходимы для пренилирования и заякоривания на мембране некоторых белков. Поскольку геранилгераниолфосфат может быть синтезирован в клетке из фарнезилфосфата, были использованы различные ингибиторы фарнезилтрансфераз и геранилтрансфераз, чтобы выяснить, какой из процессов определяет избирательную токсичность статинов. Только ингибиторы

геранилтрансферазы обладали селективной токсичностью в отношении Nf2-отрицательных клеток.

Одной из основных групп геранилируемых белков являются малые ГТФазы семейства Rae. Химическое и генетическое повышение активности Rae привело к потенцированию эффекта статинов, в особенности, в Nf2-положительных клетках.

Поскольку известно, что мерлин является ингибитором Rae, и в Nf2-отрицательных клетках наблюдается их патологическая активация, можно предположить, что нарушение геранилирования и, следовательно, заякоривания активированной Rae на мембране вызывает клеточную гибель.

Выключение гена Racl, как и следовало ожидать, приводило к подавлению токсичности симвастатина. Выключение генов других ГТФаз семейства Rae не давало столь выраженного эффекта антагонизма.

С помощью флуоресцентной микроскопии было установлено, что под действием статинов происходит транслокация Racl в ядро. Клетки линий MEF Nf2~'~ и MEF Nflf!i трансфецировали плазмидным вектором, кодирующим фьюжн-белок Racl-GFP, и через 24 часа после трансфекции добавили в среду симвастатин. Через час инкубации с симвастатином в большинстве клеток линии MEF Nf2~'~ Racl визуализировалась преимущественно в ядре. Тем не менее, через 24 часа транслокация наблюдалась уже в обеих клеточных линиях (рис. 2)

Рисунок 2. «Транслокация Racl в ядро в отсутствие геранилирования» MEF NjW МКК

Активность Racl в ядре была измерена с помощью флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) (рис. 11). Для этого клетки линий MEF /V/2"'" и MEF Nf2r'f трансфецировали плазмидными векторами, кодирующими сенсоры активности Racl: белок-фьюжн Racl-CFP и белок-фьюжн Pid-YFP, являющийся субстратом Racl. Исследование показало, что в клетках линии MEF Nf2~'~ Racl под действием статинов активируется (рис. 3)

Таким образом, статины вызывают истощение внутриклеточного пула геранилгераниола, приводящее к нарушению геранилирования малых ГТФаз, в частности Racl. Под действием статинов Racl разъякоривается, отсоединяется от клеточной мембраны и транслоцируется в ядро. В iV/2-отрицательных клетках разъякоренная Rae 1 активируется и вызывает клеточную гибель.

Рисунок 3. «Измерение активности ядерной Racl с помощью

флуоресцентного резонансного переноса энергии»

_*

150-

еимвастапш снмвасуагнк

Цитоплазматические и ядерные функции Racl до сих пор не были описаны и подлежат дальнейшему изучению.

Исследование механизма противонейрофиброматозного действия

церуленина

Церуленин - второе по эффективности соединение, прошедшее валидацию — является ингибитором синтазы жирных кислот. Поскольку фармакологические аналоги церуленина обладают селективной токсичностью в отношении N/2-отрицательных клеток, можно предположить, что этот фермент имеет большое значение для клеток опухолей, развивающихся в результате

утраты гена N/2. Был проведён ряд экспериментов, чтобы установить причину, по которой нормальное функционирование Равп особенно важно именно для Л/2-отрицательных клеток.

Наряду с химическим ингибированием Разп были применены малые интерферирующие РНК против гена синтазы жирных кислот 1'ахп. Клетки линий МЕР N/2''' и МЕР уУ/Э/;°г77ог трансфсцировали шпилечной РНК против гена в плазмидном векторе рОРР-У-ЯЯ. Через 24 часа после трансфекции в чашках с клетками МЕР N/2"'", трансфецированными РНК против гена Л/ли, наблюдались округлившиеся всплывшие клетки, подвергшиеся апоптозу. В чашках с клетками МЕР N/2''', трансфецированными контрольной РНК, а также в чашках с клетками МЕР N/2^ клеточной гибели не наблюдалось.

Для количественной оценки апоптоза, вызванного выключением гена Ра$п, а также для сравнения действия церуленина с эффектом нокдауна Га.чп, был выполнен иммуноблоттинг с антителами против эффекторной каспазы 3, которая является надёжным индикатором апоптоза. Были исследованы 6 групп образцов: клетки линий МЕР N/2^' и МЕР трансфецированные

шпилечной РНК против гена Раьп, клетки, трансфецированные контрольной РНК, и клетки, трансфецированные контрольной РНК и инкубированные с ЮцМ церуленином в течение 12 часов. Значительное повышение уровня апоптоза наблюдалось только в лизатах клеток МЕИ N/2трансфецированных шпилечной РНК против гена Fa.^/?, и МЕБ N/2''', подвергнутых действию церуленина. Ещё одним отличием Д'/2-огрицательных клеток от контрольных оказалось снижение уровня экспрессии РаБп под действием церуленина, которое наблюдалось только в клетках линии МЕР N/2'''.

Эксперименты с химическим ингибированием и генетическим выключением синтазы жирных кислот доказали, что селективность церуленина связана с его прямым механизмом действия и обусловлена зависимостью Л//2-отрицательных клеток от нормального функционирования Разп. Поскольку для каждой из протестированных клеточных линий (МЕР N/2"", МЕР N0'^, ЭС4-9 и ЯТ4) 1С50 церуленина в бессывороточной и полной среде не

отличалась, а добавление 5 цМ пальмитата не уменьшало токсичности церуленина, мы сделали вывод, что апоптоз, вызываемый данным соединением, не обусловлен дефицитом жирных кислот. В то же время, известно, что церуленин блокирует раннюю стадию синтеза жирных кислот — конденсацию малонил-коА (Price A.C. et at., 2001), - что приводит к накоплению в клетках малоната. Малонил-коА, утилизируемый синтазой жирных кислот, синтезируется из ацетил-коА ферментом ацетил-коА карбоксилазой (Асс). Чтобы убедиться, что в данном случае механизм действия церуленина не отличается от уже описанного, мы проверили действие церуленина на клетках с выключенным геном ацетил-коА карбоксилазы (Асаса). Клетки линий MEF Nf2~ " и MEF Л//2^трансфецировали миРНК против гена Асаса и сравнили действие церуленина на клетки с выключенным геном Асаса и клетки, трансфецированные контрольной миРНК. Химическое ингибирование Асс 5-тетрадецилокси-2-фуроевой кислотой (ТОФК) также повышало IC50 церуленина. Активация Асс 5-йодотуберцидином, наоборот, делала клетки более чувствительными к церуленину. Примечательно, что эффект ТОФК был более заметен на клетках MEF NJ2~'', а действие 5-йодотуберцидина, наоборот, сильнее проявляется на MEF Nj2n"x^'".

Подавление конденсации малонила, опосредованное церуленином, приводит к повышению внутриклеточного уровня малоната, токсичного для клеток. Поскольку конденсация блокируется в любых типах клеток, разница в чувствительности к церуленину может объясняться различием в уровне синтеза жирных кислот. Для подтверждения гипотезы о различных уровнях метаболизма в опухолевых и нормальных клетках, мы измерили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (ВЭЖХ/МС) уровни ацетил-коА и малонил-коА в клетках линий MEF Nf2~'~ и MEF iV/2^, часть которых была обработана церуленином (рис. 4).

Результаты эксперимента подтверждают резкое повышение уровня метаболизма в /V/2-отрицательных клетках, а также свидетельствуют о различной реакции клеток MEF NJ2'' и MEF N0'* на воздействие церуленина.

Рисунок 4 «Измерение внутриклеточных уровней ацетил-коА и малонш-коА с помощью ВЭЖХ/МС»

Ацетил-коА

Малонил-коА

ME Г Asa0" МЮРЛГ/Э®' МЕРА/Т" МЕР ЛУГ'

Церу;а'|ши Церуленин

MEF.Vfi'-' МКГNfiff MEF ЛУ7" wmXJT'

Церуленмн Цсрулсшш

Было обнаружено двукратное повышение базового уровня ацетил-коА в клетках MEF NJ2~'~. Базовые уровни малонил-коА в клетках MEF N/2"'' и MEF Nf2^отличались незначительно, что, по-видимому, объясняется более высокой скоростью потребления малоната /V/2-отрицательными клетками в последующих реакциях. Под действием церуленина в клетках MEF NJ2~'~ содержание ацетил-коА и, особенно, малонил-коА резко повышалось (десятикратная разница для малонил-коА). В клетках MEF Nf2^уровни данных соединений под действием церуленина не менялись или даже понижались (ацетил-коА), что свидетельствует о существовании отрицательной обратной связи, нарушающейся с утратой гена Nf2.

Синтаза жирных кислот осуществляет синтез насыщенных жирных кислот cle novo, используя малонил-коА в качестве исходного материала. Малонил-коА синтезируется ацетил-коА карбоксилазой из ацетил-коА. Чтобы оценить различия в уровне синтеза жирных кислот в клетках MEF Nf2~" и MEF N/2fif, мы выполнили иммуноблоттинг с антителами против Fasn, Асс и вспомогательных ферментов липогенеза: Acl, Acecsl, Acsll и фосфо-Асс и фосфо-Ас1. Уровень Fasn и, что ещё важнее, Асс, оказались существенно повышены в клетках MEF Nf2'A. Иммуноблоттинг также показал, что уровень фосфорилирования Асс в этих клетках значительно ниже, чем в контрольных, что является признаком повышения активности этого фермента. Низкий

уровень фосфорилирования Асс в клетках MEF Nf2J~ объясняет их слабую чувствительность к 5-йодотуберцидину, механизм действия которого связан с дефосфорилированием Асс. И, соответственно, отсутствие эффекта ТОФК в клетках MEF N/2^ объясняется низким уровнем экспрессии Асс в этих клетках. Иммуноблоттинг также выявил значительное повышение уровня экспрессии остальных белков, участвующих в липогенезе, в клетках MEF Nf2"'\ Количественная ПЦР (кПЦР) для оценки уровня экспрессии генов белков, участвующих в липогенезе, показала значительное повышение уровня экспрессии всех исследуемых генов в клетках линии MEF Nf2J~, причём наиболее существенные различия наблюдались в группе генов, продукты которых связаны с реакциями бета-окисления жирных кислот.

Реэкспрессия белка мерлин в клетках линии SC4-9 сопровождалась снижением уровня продукции белков, вовлечённых в липогенез, повышением уровня фосфорилирования Асс и снижением экспрессии генов белков, участвующих в синтезе жирных кислот.

Обнаруженные различия в уровнях экспрессии генов и продукции и фосфорилирования белков, вовлечённых в синтез жирных кислот, доказывают, что липогенез значительно повышен в ^^-отрицательных клетках. В то же время, повышение экспрессии генов и продукции белков, связанных с бета-окислением жирных кислот, а также различия в реакции клеток MEF Nf2v' и MEF Nf2^на воздействие церуленина позволяют предположить, что утрата гена NJ2 вызывает нарушения бета-окисления жирных кислот, что может служить дополнительным механизмом цитотоксичности церуленина в отношении NJ2-отрицательных клеток.

Эксперименты по изучению противоопухолевой активности ловастатина, золедроновой кислоты и церуленина в ксенографтной модели НФЦ на

мышах

Исследования in vitro позволили нам понять механизм селективности ингибиторов З-гидрокси-З-метилглутарил-коА редуктазы и синтазы жирных кислот и позволили предположить, что данные классы соединений могут стать

перспективными средствами терапии НФ II. Следующим этапом доклинических испытаний этих веществ стали исследования на животных. Мы провели ряд ксенографтных экспериментов на бестимусных мышах (nu/nu), используя клетки линий RT4 и SC4-9 (рис. 5).

Рисунок 5 «Тестирование противоопухолевой активности ловастатина, заметы и церулеиина в ксенографтиои модели НФ II на мышах»

1500

1000

RT4

Контроль я-л, /' М"

Ловастатин

Зочста

12 14

Время, дни

RT4

А

«5

С

J6

Р * H.nfioi

Контроль Ловастатин Зомста

15-й лень иисдения «pi'inipiTi

8000л

Я

'ё

g бооо

2 4000

I

■я 2000-я

&

У

RT4

Контроль П'7. Р SÎ

Ш'ру.тснни

RT4

5 10 1S 20

Врсчи, Д!! и

s s

6000

a»

S

i, 4000

â о

Контроль Цсрулешш

21-й лень нведення препарата

| 4000'

ч

Ч

SC4-9

КОНТРОЛЬ « -Р 95Ча

Церулелин Ловастатин

10 20 Время, дни

S

S5 3000-

£ с

SC4-9

Контроль Церулснии Ловастатин

28 -Я доиц введения препарата

Введение всех трёх препаратов не приводило к уменьшению объёма уже сформированных опухолей. Однако все три соединения значительно замедляли рост опухолей при использовании их в качестве профилактических средств, то есть, если лечение начинали вскоре после введения опухолевых клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Была разработана клеточная система для исследования гена NJ2 in vitro и выполнен химический скрининг с использованием этой системы. Из девяти соединений-кандидатов, отобранных по результатам скрининга, два: ингибитор З-гидрокси-З-метилглутарил-коА редуктазы ловастатин и ингибитор синтазы жирных кислот церуленин - успешно прошли валидацию и были отобраны для последующих испытаний.

Было доказано, что ингибирование З-гидрокси-З-метилглутарил-коА редуктазы вызывает истощение внутриклеточного пула геранилгераниола, что приводит к разъякориванию малой ГТФазы Racl и отсоединению её от клеточной мембраны. Было установлено, что Racl активируется под действием статинов только в jV/2-отрицательных клетках. Было также показано, что активация Racl, не ассоциированной с клеточной мембраной, приводит к клеточной гибели. Ранее подобная роль Racl описана не была. В последующих исследованиях предстоит выяснить механизм Racl-опосредованной клеточной гибели.

Также было доказано, что утрата гена Nf2 приводит к метаболическому сдвигу, заключающемуся в резком повышении скорости синтеза жирных кислот. jV/2-отрицательные клетки зависимы от нормального функционирования синтазы жирных кислот. Данные исследования позволяют предположить, что утрата гена Nf2 приводит к нарушению бета-окисления жирных кислот, что негативно отражается на энергетическом метаболизме этих клеток. Снижение продукции энергии и повышенные энергетические потребности, обусловленные высокой скоростью роста, приводят к резкому повышению синтеза жирных кислот и зависимости от нормального функционирования участвующих в синтезе ферментов.

Полученные результаты позволяют предположить обусловленные утратой гена N/2 глубокие сдвиги во всех метаболических путях. Известно, что для раковых клеток характерна триада метаболических изменений: предпочтение гликолиза перед митохондриальным окислением (эффект Варбурга), повышение уровня липогенеза и повышение уровня глютаминолиза. В данной работе было подтверждено повышение уровня липогенеза в N/2-отрицательных клетках. Последующие исследования будут направлены на оценку остальных метаболических путей в этих клетках.

Несмотря на множество открытых вопросов, очевидно, что синтаза жирных кислот, геранилтрансфераза I и З-гидрокси-З-метилглутарил-коА редуктаза представляют собой перспективные мишени для фармакотерапии НФ II. Гиполипидемические препараты группы статинов, воздействующие на 3-гидрокси-З-метилглутарил-коА редуктазу и препарат золедроновой кислоты Зомета, применяющийся для лечения остеопороза и являющийся ингибитором геранилтрансферазы I, являются уже одобренными к применению лекарственными средствами, и, таким образом, для этих препаратов могут быть начаты клинические испытания II и III фазы на пациентах с НФ II. Хотя церуленин и его аналоги пока находятся на стадии доклинических испытаний, повышенный интерес к этой группе веществ позволяет надеяться, что вскоре появится эффективное лекарственное средство, блокирующее синтазу жирных кислот, которое можно будет применять для терапии НФ II.

ВЫВОДЫ

1. Получена линия мышиных эмбриональных фибробластов, нокаутных по гену Nf2, моделирующая нейрофиброматоз II типа.

2. Сравнение данной линии с исходной (контрольной) показало, что полученные Л/2-отрицательные клетки отличаются от контрольных по морфологии (имеются признаки дезорганизации актинового цитоскелета, отсутствуют плотные клеточные контакты), большей скоростью роста и устойчивостью к неблагоприятным воздействиям среды.

На полученных клеточных линиях проведён скрининг коллекции 486 низкомолекулярных биоактивных соединений, который выявил 9 веществ, обладающих селективностью в отношении антипролиферативного действия на Л/2-отрицагельные клетки.

• Из отобранных по результатам скрининга 9 соединений-кандидатов 2 - ингибитор З-гидрокси-З-метилглутарил-коА-редуктазы ловастатин и ингибитор синтазы жирных кислот церуленин -прошли первичную валидацию результатов скрининга, проявив стабильную селективность в отношении различных NJ2-отрицательных клеток. Селективность оказалась также характерна для фармакологических аналогов данных соединений: гиполипидемических препаратов группы статинов и ингибиторов синтазы жирных кислот лютеолина и С75, а реэкспрессия белка мерлин в Л'/З-отрицательпых клетках приводила к обращению токсичности исследуемых соединений.

Установлен механизм действия соединений, выбранных по результатам скрининга:

• Селективная цитотоксичность ловастатина в отношении NJ2-отрицательных клеток обусловлена раъякориванием малой ГТФазы Racl и отсоединением её от клеточной мембраны. Под действием ловастатина Racl транслоцируется в ядро и активируется в N/2-отрицательных клетках, вызывая клеточную гибель. В ходе исследований также обнаружена селективная токсичность ингибитора геранилтрансферазы I золедроновой кислоты в отношении jV/2-отрицательных клеток.

• Селективная цитотоксичность церуленина обусловлена различиями в уровнях метаболизма жирных кислот в 7V/2-отрицательных и нормальных клетках. Показано, что под влиянием церуленина накопление промежуточных продуктов синтеза насыщенных жирных кислот в Л'/2-отрицательных клетках происходит

интенсивнее в 1,5 - 2,5 раза по сравнению с контрольными клетками. Также, уровень экспрессии ферментов, участвующих в липогенезе, в ./^-отрицательных клетках повышен на 30 - 50% по сравнению с контрольными клетками. 5. Ингибитор З-гидрокси-З-метилглутарил-коА-редуктазы ловастатин, ингибитор геранилтрансферазы I золедроновая кислота и ингибитор синтазы жирных кислот церуленин обладают выраженной противоопухолевой активностью в испытаниях in vivo на мышах с ксенографтной трансплантацией мышиных и крысиных шванном. Все три соединения снижали скорость роста шванном на 80% по сравнению с контрольной группой.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Материалы диссертационной работы по изучению метаболического профиля Ду2-отрицательных опухолевых клеток могут быть использованы в разработке методов фармакотерапии для лечения НФ II. Описанные в данной работе изменения уровней синтеза жирных кислот, характерные для опухолей, ассоциированных с НФ II, позволяют применить новый подход — воздействие на участвующие в данных метаболических путях ферменты - к терапии данного заболевания и могут способствовать дальнейшему изучению приложения ингибиторов синтазы жирных кислот в терапии доброкачественных опухолей нервной системы. Препараты золедроновой кислоты могут быть рекомендованы для дальнейших исследований возможности их использования в качестве противоопухолевых средств для лечения Rac-зависимых форм рака (метастазирующий рак молочной железы, немелкоклеточный рак лёгкого и др.)

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Степанова Д.С., Чернов Дж., Шимановский Н.Л. Поиск химических веществ для фармакотерапии нейрофиброматоза второго типа // Химико-фармацевтический журнал. 2014. Т. 48. № 12. С. 9-14

2. Chow HY, Jubb AM, Koch JN, Jaffer ZM, Stepanova D, Campbell DA, Duron SG, O'Farrell M, Cai KQ, Klein-Szanto AJ, Gutkind JS, Hoeflich KP, Chemoff J. p21-Activated kinase 1 is required for efficient tumor formation and progression in a Ras-mediated skin cancer model. (p21-активируемая киназа 1 необходима для формирования и прогрессии опухолей в модели Ras-опосредованного рака кожи). // Cancer Research. 2012. Т.72. №22 C.S966-7S

3. Chow HY, Stepanova D, Koch J, Chemoff J. p21-Activated kinases are required for transformation in a cell-based model of neurofibromatosis type 2. (p21-активируемые киназы необходимы для злокачественной трансформации в клеточной модели нейрофиброматоза II типа). // PLoS One: электронный журнал. 2010. Т. 5 № 11: е13791. URL:

http://joumals.plos.org/plosone/article?id= 10.1371/joumal.pone.0013791

4. Dina Stepanova; Galina Semenova; Jonathan Chemoff. Fatty acid synthase inhibitors: potential therapy for NF2. (Ингибиторы синтазы жирных кислот как потенциальные соединения для терапии нейрофиброматоза II) «Abstract Book of the NF Conference 2013» Монтеррей Бэй, США, 2013

5. Dina Stepanova; Galina Semenova; Jonathan Chemoff. Fatty acid synthase inhibitors: potential therapy for NF2. (Ингибиторы синтазы жирных кислот как потенциальные соединения для терапии нейрофиброматоза II) «Abstract Book of Fox Chase Cancer Center 18th Annual Postdoctoral and Graduate Student Research Conference»; Филадельфия, США, 2013

6. Dina Stepanova; Jonathan Chemoff. Modulators of geranylation show selective toxicity on AJC-nuIl cells. (Модуляторы геранилирования обладают избирательной цитотоксичностью в отношении ¿V/2-отрицательных клеток) «Abstract Book of the NF Conference 2011» Джексон Хол, США 2011.

7. Dina Stepanova; Jonathan Chemoff. Modulators of geranylation show selective toxicity on Nf2-nuII cells. (Модуляторы геранилирования обладают избирательной цитотоксичностью в отношении iV/2-отрицательных клеток) «Abstract Book of the 16lh Annual Postdoctoral and Graduate Student Conference» Филадельфия, США, 2011.

Отпечатано в ООО «ВНИГТР» (www.vnipr.ru) 127644, Москва, Клязьминская ул., дом 15, (495) 486-8076 Заказ № 4964 Подписано в печать 01.04.15. Тираж 100 экз. Усл.п.л. 1,25