Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Регуляция RAL-зависимых сигнальных путей в канцерогенезе

На правах рукописи

АУШЕВ Василий Николаевич

РЕГУЛЯЦИЯ RAL-ЗАВИСИМЫХ СИГНАЛЬНЫХ ПУТЕЙ В КАНЦЕРОГЕНЕЗЕ: УБИКВИТИНИРОВАНИЕ RALA И RALB.

Специальность 14.00.14-онкология

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

о г; " ; о ■^'■п

i_ . ._____. <

Москва 2009

003465590

Работа выполнена в Лаборатории регуляции клеточных и вирусных онкогенов НИИ Канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН и Группе ART Института Кюри (Institut Curie / Université Paris XI)

Научные руководители:

Кандидат биологических наук Зборовская Ирина Борисовна

Профессор, M.D., PhD Камонис Жак Хенрик (Jacques H. Camonis)

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук Красильников Михаил Александрович

Доктор химических наук Шахпаронов Михаил Иванович

Ведущая организация: Институт Молекулярной Генетики РАН

Защита диссертации состоится 17 апреля 2009 года в 10 часов на

заседании диссертационного совета (К.001.017.02) ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН

по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24.

С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН

Автореферат разослан «6 »'*-<<y>vg. 2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Барсуков Юрий Андреевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Онкологические заболевания сегодня являются одной из актуальнейших медицинских проблем, и изучение всех аспектов возникновения и развития опухолей имеет большое значение для современной медицинской науки. Процессы канцерогенеза представляют огромный интерес и для молекулярной биологии, поскольку причиной возникновения всех опухолевых заболеваний являются нарушения в сложных механизмах регуляции клеточной жизнедеятельности, а многие из этих механизмов до сих пор не до конца изучены даже в норме.

Поскольку трансформация и опухолевая прогрессия представляют собой нарушения регуляции клеточных сигнальных путей, становится очевидной необходимость изучения участников и деталей функционирования этих путей в нормальной и трансформированной клетке. При этом следует учитывать, что каждый случай опухолевой трансформации может быть уникален и затрагивать различные участки сигнальных каскадов, поэтому тем более актуальным является выделение конкретных механизмов - как общих, так и специфических для отдельных типов трансформации.

Белки из группы малых ГТФаз являются одними из важнейших участников клеточных сигнальных путей. В частности, не подвергается сомнению критическая роль в сигналинге белков суперсемейства Ras. Представители этой группы передают мито-генные стимулы, активируясь в ответ на различные сигналы - начиная с действия ре-цепторных тирозинкиназ и заканчивая ответом на повышение внутриклеточной концентрации кальция. Неудивительно, что эти белки принимают участие во многих случаях клеточной трансформации. Так, активирующие мутации Ras обнаружены в более 30% случаев человеческих опухолей (более 90% случаев для отдельных видов рака).

Хотя активация Ras является несомненной особенностью многих опухолевых клеток, детали этого процесса требуют дальнейшего изучения. В частности, активированный Ras может передавать сигнал на несколько сигнальных путей, участие каждого из которых в процессе трансформации и опухолевой прогрессии может быть различным. Среди таких путей наиболее известны Ras-Raf-ERK, Ras-PI3K-PDK1 и Ras-RalGEFs-Ral. До недавнего времени важнейшая роль в онкогенезе приписывалась Raf-ERK пути, однако позднейшие исследования показали, что он критичен в первую очередь в моделях мышиных клеток, в то время как для трансформации человеческих

клеток более важным может являться путь активации малых ГТФаз Ral. Таким образом, изучение белков Ral является крайне актуальным для понимания механизмов человеческого онкогенеза.

Регуляция активности белковых молекул может осуществляться множеством различных способов, включая разнообразные постгрансляционные модификации. Широко известным примером является система фосфорилирова-ния/дефосфорилирования, которому подвергается большое количество белков, включая упомянутые выше малые ГТФазы. В последнее время, однако, выявляется всё большая роль других типов модификаций, одним из которых является убиквитиниро-вание. Присоединение одного или нескольких убиквитиновых остатков к белку-субстрату может значительно изменять его свойства, влиять на взаимодействие с партнёрами, стимулировать деградацию, и т.п. Среди субстратов убиквитинирования обнаружено большое количество разнообразных белков, включая многие онкобелки и онкосуппрессоры. Соответственно, активно изучаются и возможности влияния на систему убиквитинирования с терапевтическими целями. Ряд соединений проходит испытания на противоопухолевую активность, а отдельные препараты (например, протеасомный ингибитор бортезомиб) уже применяются в клинической практике.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы является выявление деталей регуляции Ral-индуцированных сигнальных путей, и в частности, роль убиквитинирования RalA и RalB.

В соответствии с указанной целью предполагалось решить следующие экспериментальные задачи:

1. Определить статус убиквитинирования белков Ral

2. Оценить уровень убиквитинирования Ral в различных линиях трансформированных клеток

3. Найти позиции, по которым происходит убиквитинирование

4. Создать неубиквитинируемые варианты Ral путём точечного мутагенеза найденных позиций

5. Определить свойства полученных мутантов Ral по сравнению с исходными белками

6. Выявить роль ранее обнаруженных партнёров в убиквитинировании Ral.

Научная новизна и практическая значимость исследования

В данной работе был впервые продемонстрирован факт убиквитинировання белков RalA и RalB; показано, что данная модификация не является сигналом протеа-сомной деградации. Убиквитинирование RalA найдено во всех исследованных линиях клеток человека и грызунов и является, таким образом, универсальным для различных типов клеток. В ходе работы создано более 60 новых генных конструктов, которые могут быть использованы при изучении свойств белков RalA и RalB. В том числе, получена панель мутантных форм RalA с разной степенью убиквитинировання; определены участки RalA, наиболее важные для убиквитинировання; показано критическое значение локализации RalA для его убиквитинировання. Оптимизирована методика определения убиквитинировання белков in vivo, которая позволяет уменьшить количество требуемого для исследования материала и сократить время исследования.

Работа носит в первую очередь теоретический характер, однако полученные данные могут быть использованы при дальнейшем изучении участия белков Ral в процессах опухолевой трансформации и прогрессии, а также разработке противоопухолевых агентов, влияющих на убиквитинирование данных белков.

Апробация работы

Диссертация апробирована и рекомендована к защите 27 сентября 2007 года на совместной научной конференции лабораторий регуляции клеточных и вирусных онкогенов, вирусного канцерогенеза, иммунологии онкогенных вирусов, молекулярной биологии вирусов, биохимии опухолей, методов скрининга канцерогенов НИИ Канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Материалы работы докладывались на конференциях «Journées scientifiques de l'Ecole doctorale de cancérologie» в 2006 и 2007 гг. (Роскофф, Франция), «Vlème Colloque Petites Protéines G». (Муан-Сарту, Франция).

По материалам диссертации опубликовано 2 научные статьи и 6 тезисов докладов.

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 92 страницах машинописного текста, содержит 39 рисунков, 2 таблицы. Состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов», «Выводы», «Список использованной литературы». Список литературы содержит 105 источников, в том числе 3 в отечественных рецензируемых изданиях.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

В работе были использованы следующие методы исследования: культивирование и анализ культур трансформированных клеток млекопитающих, трансфекция клеток млекопитающих плазмидами и siRNA, выделение ДНК и РНК из клеток млекопитающих, получение радиоактивно меченых зондов, электрофорез нуклеиновых кислот, блот-гибридизация нуклеиновых кислот, трансформация бактериальных клеток, выделение плазмидной ДНК, молекулярное клонирование в плазмидных векторах, выделение и анализ белковой фракции клеток (иммунопреципитация и иммуноб-лотинг), экспрессия и выделение His-меченых убиквитинированных белков.

Результаты исследования

1. Модельная система для детекции убиквитинированных in vivo белков

Для изучения убиквитинирования интересующих белков использовалась система, основанная на экзогенной экспрессии меченого убиквитина (Рис. 1). В качестве метки выступала последовательность из шести гистидиновых остатков («6His-tag»), Экспрессируемый продукт включается в нормальный цикл убиквитинирования в клетке; таким образом, убиквитинированные белки оказываются несущими метку. Такие белки выделяются из тотального лизата с помощью металлоафинной сорбции: двухвалентные катионы Со2+ и Ni2+ обладают сродством к структуре имидазольного кольца, входящего в состав гистидинового остатка.

Полученная в результате описанной очистки смесь помеченных (т.е. убиквитинированных) белков разделяется с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях, после чего производится детекция с помощью специфических антител к интересующим белкам. В случае, если белок в клетке убиквитини-руется, он будет выявлен в виде специфической полосы (при моноубиквитинирова-нии) или нескольких полос (при мульти- и полиубиквитинировании).

0) (S)

^CDSl^

+

Рис. 1.

Принцип выделения убиквитинироваиных белков. «Ub» - убиквитин с гистидииовой меткой, «CDS» -убиквитинированные белки .

В ходе работы были протестированы и оптимизированы различные варианты и модификации данного метода; наиболее эффективным и удобным в использовании оказался метод лизиса в гуанидиновом буфере с последующей сорбцией комплексами кобальта. Оптимизированный протокол позволяет использовать малое количество материала (эквивалент 6 см чашки Петри в случае сверх-экспрессированного 11а1А) и сокращает время очистки.

Важным аспектом при постановке экспериментов с меченым убиквитином является контроль равномерной его экспрессии среди исследуемых образцов. При этом классический вестерн-блотинг в данном случае неприменим, поскольку убиквитин не существует в виде единственной белковой формы, а включается в белковый оборот с различными мишенями. В связи с этим, был введён в использование метод оценки

экспрессии меченого убиквитина с помощью дот-

©

Рис.2. Дот-блот-гибридюацияубик- блот-гибридизации (Рис. 2). Показано, что данный

витинированной фракции после очистКИ (анти-Н,5 антитела). 1 - контроль- мет°Д может использоваться как для убиквитина с

ный образец, 2,3,4 - образцы с экспрессией меченого убиквитина. тус-эпитопом, так и для убиквитина, имеющего

только Н1з-метку.

2. Убиквитинирование эндогенного и сверх-экспрессированного 11а1А

Для определения возможного убиквитинирования 1ЫА, этот белок был экспрес-сирован с плазмиды р!1К5 под контролем СМУ-промотора вместе с плазмидой, кодирующей Ив-меченый убиквитин. После выделения Иэ-меченых белков, производилось их разделение электрофорезом и детекция с помощью моноклональных антител против Яа!А. В результате была выявлена характерная картина убиквитинирования -специфические (то есть появляющиеся только при наличии меченого убиквитина)

сигналы, различающиеся примерно на 9 кДа, что соответствует молекулярному весу убиквитиновой метки (Рис. 3, А).

иЬ: + -

Рис.3.

Убиквитинирование сверх-экспрессированного (А) и эндогенного (Б) Ка!А. Немодифицированная форма Ка1А имеет молекулярный вес 24 кДа.

Чтобы показать, что убиквитинирование 11а1А является физиологическим процессом, присущим не только сверх-экспрессированной форме, был проведён аналогичный опыт с эндогенным белком, т.е. при трансфекции одним только меченым уби-квитином. В этом случае сигнал был значительно слабее, тем не менее факт убикви-тинирования удалось подтвердить и для эндогенного белка (Рис. 3, Б): были обнаружены по меньшей мере две убиквитинированных формы ~Ъ1 кДа и =46 кДа.

3. Убиквитинирование Яа1А в различных клеточных линиях

Помимо клеток НеЬа, служивших основной модельной системой для изучения различных аспектов уби-квитинирования 11а1А, наличие данной модификации показано и в других клетках, в том числе в клеточных линиях СНО, НЕК-293 и НЕТ-БЛ (Рис. 4). Профиль убик-витинирования оказался сходным во всех исследованных линиях, а уровень убиквитинированного Г1а1А в каждом случае определялся главным образом уровнем экспрессии белка, т.е. эффективностью трансфекции.

Не1.а СНО НЕК-293 НЕТ^

иь + - +- + - +-

в

и

Рис. 4. Убиквитинирование сверх экспрессированного Яа1А в различных клеточных линиях.

4. Влияние ингибиторов протеасомных и лизосомных протеаз на стабильность и убиквитинированис Ral

Поскольку наиболее известной функцией убиквитинирования является направление белка на деградацию, данный тип регуляции был исследован и для изучаемого белка. Изучено влияние веществ MG132 (ингибитор функции протеосомы) и леупеп-тина (ингибитор лизосомных протеаз) на стабильность RalA. Оказалось, что ни один из указанных ингибиторов не повышает стабильность RalA и не ведёт к накоплению убиквитинированных форм белка, как это можно было бы ожидать в случае протеа-сомной или лизосомной деградации. В случае MG132 наблюдался даже эффект некоторого снижения уровня RalA, который был подтверждён последующими экспериментами.

Эффект снижения экспрессии под воздействием протеасомного ингибитора MG132 был показан для различных мутантных форм RalA и RalB, включая конститутивно

активные (G23V) и доминантно-негативные (S28N) формы. Наиболее заметное снижение наблюдалось в случае RalB, в особенности его доминантно-негативного мутанта. Следует отметить, однако, что данный эффект

Я.а!А G2SA RaíAw/t Ra

+ - + — + —

XG23V +

. _

_ Ra(B G23V + - + Ra IBS2SN — + RalB vy/t — +

„ . _ , ' . был замечен только для сверх-

Рис. 3. Влияние ингибитора протеасомнои деградации г

mgl32 на уровень экспрессии различных форм RalA и RalB. экспрессированных белков, НО Не ДЛЯ

эндогенного RalA или RalB.

5. Определение возможного типа полиубиквитинирования RalA

Для того чтобы определить, подвергается ли RalA поли- или мультиубиквитини-рованию, были использованы функцио-нально-мутантные формы убиквитина K48R, K63R и КО (мутантный по всем 7 остаткам лизина).

При использовании мутанта K48R наблюдалось увеличение количества убикви-. . ... , „ ,. тинированного RalA по сравнению с убик-

Рис. 5. профиль убиквитинирования RalA при ис- 1 1

пользовании различных мутантов убиквитина.

Ub: - ptly «Л K4SR K6JF KAZPJ ... KS.5B К0 .

ия

йа

< ц вВ —- 55

"Я И -40

'Л

я я тшт -34

« £ -2 А

витином дикого типа (Рис. 5). Убиквитинирование Иа1А с участием мутанта КбЗЯ, напротив, было значительно снижено. При экспрессии двойного мутанта убиквитина К48К-К63Я убиквитинирование Яа1А также снижалось по сравнению с контрольным вариантом, хотя и оставалось выше чем в случае двойного мутанта.

6. Стабильность Ка1А при подавлении клеточной трансляции

Для оценки скорости «оборота» 11а1А, то есть замены деградирующего белка но-восинтезированным, был использован метод подавления клеточной трансляции. При обработке клеток ингибиторами трансляции (эметин, циклогексимид, и т.п.) синтез новых белков прекращается, что даёт возможность оценить стабильность интересующего продукта.

Воемя инкубации с ингибиторов трансляции Время, ч О 0.5 2 7 9 10 14 15 20 22 23 25

Рис. 6. Стабильность эндогенного Ка!А в отсутствие клеточной трансляции.

После обработки клеток НеЬа эметином, сигнал короткоживущего белка р53 исчезал уже после 1 часа инкубации, в то время как сигнал Яа1А оставался на примерно одинаковом уровне даже после 24 часов инкубации (Рис.6).

7. Роль деубиквитинирующей протеазы и8Р25 в убиквитинировании Ка1А

Ранее показано, что протеаза иБР25 является вероятным партнёром взаимодействия с комплексом экзоциста. Для оценки возможной роли данного фермента в убиквитинировании Ка1А использовались два подхода: суперэкспрессия ШР25 и её подавление с помощью специфической 8111КА.

При суперэкспрессии ШР25 не обнаружено никаких изменений в уровне убик-витинирования Яа1А. Подавление ШР25 с помощью эхИМА вызвало снижение уровня убиквитинированного Яа1А, однако данное изменение сопровождалось снижением уровня экспрессии экзогенного 11а1А. Для оценки специфичности данного эффекта был поставлен эксперимент с использованием другого, неродственного белка Мус-

11ар2А. Оказалось, что и в этом случае подавление ШР25 вызывало резкое снижение экспрессии экзогенного продукта. Механизм данного явления остаётся невыясненным.

8. НВХ 41,108 - ингибитор деубиквитинирующсй протеазы USP7/HAUSP

Известно, что активация Ras-Ral пути ослабляет ответ на повреждение ДНК в клетках, дефицитных по р53. В то же время одним из регуляторов уровня р53 является деубиквитинирующий фермент USP7/HAUSP. В этом контексте были протестированы свойства нового ингибитора USP7 компании Hybrigenics. Показано, что данный ингибитор (НВХ 41,108) вызывает р53-зависимую активацию апоптоза в раковых клетках НСТ116 (Рис. 7). В то же время, не было обнаружено значительного изменения убиквитинирования Ral при воздействии НВХ 41,108.

НСТ116 НСТ116 НСТ116 НСТ11В (pS3 J j__foS3 "i {pS3 J j__(pS3 ")

ltM4t.ie- 0 2 o 18 0 2 6 18 0 100 ¿00 O 100 4C0 - »Si SFC

Рис. 7. Эффект ингибитора деубиквитинирующей протеазы и5Р7. Слева - ингибитор (НВХ 41,108), справа -контрольное вещество (5-фтороурацил).

9. HET-SR и НЕТ-8К1 - трансформированные линии с различиями в системе контроля фолдинга и деградации белков

В работе протестированы линии эмбриональных фибробластов сирийского хомячка, трансформированные вирусом саркомы Рауса - низкометастазирующая НЕТ-SR и высокометастазирующая HET-SR1. Показано, что данные линии отличаются по уровню экспрессии молекулярного кошаперона из семейства Н8Р40. Белки данной группы являются партнёрами шаперонов ШР70, участвуя в контроле сворачивания, транспорта и деградации белков. В то же время, не было обнаружено различий в уровне убиквитинирования RalA между линиями HET-SR и HET-SR1.

10. Роль сигналов внутриклеточной локализации в убиквитинировании 11а1А

Как известно, правильная локализация малых ГТФаз в клетке является важным условием их функционирования. Для установления возможной связи между локализацией Яа1А и его убиквитинированием, были сконструированы мутантные формы Ка1А, с различными изменениями в С-концевой последовательности (Рис. 8, А).

Н-ИЗБ : ...КЕГКОНКЬККЬЫРРПЕЗОРС^МЗ^КрУЬв

АЯ: ...КЕ11ШЖМЕВЗКЕКК0КККНКЗЬА1Ж1КЕН|§&1Ь

АЯДСААХ: ...КЕХНАКШЕПЗКЕКЫСКККККЗЬАКМБШЖ

АЯ-НИазСААХ: ...КЕ1КАКШЕОЗКЕКЫСКККККЗЬАКК1КЕГ!|С]С1

AWЛCAAX-HRasCAAX: ...КЕ1КАККМЕВЗКЕККСКККНКЗЬАКа1аЕКдв@/Ь& Д АНйСЬег-НПаэСААХ: ...КЕНШЖМЕО

^ л? < «ЗГ

и V- О с, ^

у <У # О" л?

Рис. 8. Убиквитинирование Яа!А с изменённой С-концевой частью. А, последовательность С-конца сконструированных мутантов. Светлым фоном обозначены сайты пальмитшшрования, тёмным - сайты изопре-нилирования; отщепляемые аминокислоты зачёркнуты. Б, профиль убиквитинирования указанных конструк-

Показано (Рис. 8, Б), что удаление СААХ-сигнала значительно снижает убиквитинирование Яа1А, а делеция всей С-концевой последовательности вместе с полили-зиновым трактом почти полностью отменяет убиквитинирование. При этом замена собственного СААХ-сигнала Ла1А на таковой белка НИав восстанавливала исходный

уровень убиквитинирования, но только при наличии полилизинового тракта RalA: уровень убиквитинирования мутанта RalA ACter-HRasCAAX оставался таким же низким, как у RalA ACter. Таким образом, мембранная локализация RalA является необходимым условием для его убиквитинирования.

Для многих малых ГТФаз характерна локализация в специфических участках мембраны - липидных рафтах. Для проверки роли этого явления в убиквитинирова-нии RalA был использован метил-бета-циклодекстрин (MBCD) - химический агент, разрушающий липидные рафты. Показано, что при обработке клеток MBCD уровень убиквитинирования RalA существенно снижался.

11. Убиквитинирование RalA, мутантного по позициям 134,143,191

Первоначальные результаты об убиквитинировании Ral давали основание полагать, что этой модификации подвергается только RalA, но не RalB. Исходя из этих данных, было проведено сравнение последовательностей RalA и RalB, которое показало, что среди 21 остатка лизина, присутствующего в RalA, только 3 отсутствуют в RalB (Рис. 9). Эти позиции были заменены точечным мутагенезом на аргининовые

|QM]ORa!A (PMjORaE?

Svwtcft i G- 2

¡HSj НЙА (MM/RM) RalA

Ifi ...........„..........ш....................n ■ 3B...............................M..................... ......Ш : .................gQ..............................?Q

. V^KiSA^T LOFM Yr KFVeríVEP KA D» YPJKKV VI,»« KS VOÏ DÏI.CT A

-H^^b^A^g Ь<аРМУ XB P УЕРУ8г^>.&ЗУи|^УУХ.&<?ЕВ VQX PX XSYA

i О» ЗЪАЫЩУХП V<S a<*»У оИзАТ> Y Ь"ОГКУ t К У УКУ/ЕРTÏIAt>¿! УКРЛ'.У VLO'Э ЕЕ VÇ-X DI Î.DÎA

[HSj RaiB Ш

(RNJ Ra® Ш

ЗММ1 RalB <'i> МААкИзк&ОФвСЬУЬНкУХМУ«»«« V«^SA2/TLOPXyCEPVEPy«»5Sd&»SyRjjqiWyb&<SBEVC!XOXL&YA

4 t? W '-tí 'i? W t*&

7 i

[ОМ j DRaiA f' > <• ОЕГ l'A A rRPfn'í «U JSCÏFI. V FiflTt-r-S 3 ГОАТОЯ F P.EOI I.K '/К;- Í-Í&K Л X£? F X. X, V<SK:ivO Vb мЫг. HKVBb

íDMt DRal? t^S) «QgDVAAI ftOîf/FftSOS^FbCVFSXTaiigS^^

jHSi RaiA ) ®OfiOVAAîRDKSfPREBKRC'VSV flvSNb'RWÎP*ÍA 1-IHS Se

IRMÎRsîB &0 <*OE&YAAXRDm*FRS«B<3rXbVFaXTÈHBaP?ATASFftB£^

"s W W Ф

ÍDMJ DRalA jPMj DFalS

! SKvlafcRAQaWAV*УУВТЗАЬФKBKvoüvr г¡&ЬКК8IRSRKïEОЙКА?Г йI

CjK3-:RR.Ï/KCYbb

{HSj RalA <1*3) EEÂÏKfcRA BOWWVSV VEYSAiJCjY RAKVÜ^VPFDbHRE X RAR^Sti A^IX RE ROC

?Mfv№NjR3lA <14Ù) ЕйфЬ^АС О» KVttY VETS AlKjT RAM У &УУ Г FPХМREXRA RÍKH S E> gÍKjgkft К XAÍK». X RS R-~ С

¡MSjRaie çnr» ёв s ём^огШт^Щт кв&сс

[Rn| Ra® {Mi) В8*|кЬкЛ£B*»<SVQYVBT 3 A&j*RАНVüNvrFOIiHRSIR АккЙ8В

RalB Çt*t) »8AkfcKА ВBW«W3Y VBYS A!*!?R AK VfclífVPF »bMRKX RAKÏKM8К«ïqKiaFKKRCC

* iir <йг *r -Sr ^ &

Рис. 9. Выравнивание белковых последовательностей нескольких представителей группы Ral. Звёздочками обозначены лизиновые остатки - потенциальные сайты убиквитинирования; тёмными звёздочками -сайты, присутствующие у RalA, но не RalB. DM - Drosophila melanogaster, HS - Homo sapiens, MM - Mus musculus, RN — Raîtus norvegicus.

Опыты с полученными точечными мутантами показали (Рис. 10), что ни у одного из них, включая тройной мутант K134R-K143R-K191R, не наблюдается значительного снижения убиквитиниро-вания. Таким образом, данные позиции не являются основными сайтами убиквити-нирования RalA.

Рис. 10. Убиквитинирование форм RalA, му-тантных по позициям 134, 143, 191. Вверху - убикви-тинированная фракция, внизу - экспрессия RalA.

12. Убиквитинирование химерных белков RalA/RalB

С целью картирования участков, участвующих в убиквитинировании, были созданы химерные конструкции RalA/RalB, несущие различные участки этих белков. В работе использовалось б конструкций, в которых замена последовательностей была осу-¡IÉ1I »«в ществлена на границах 10, 115 и 185

Рис.11. Химерные конструкции RalA/RalB. Тем- амИНОКИСЛОТ (Рис. 11). Из НИХ, два

Е-дюв ;

|:-Е10Л !

«■А115В; «-BÏ'lSÂj

i^fUSSAi

белка (BIOA и B115A) детектирова-

ным обозначены участки, относящиеся к RalA, светлым - к RalB. Внизу указано расположение эпитопов используемых антител лись только антителом anti-RalA, два

(А10В и Al 15В) - только антителом anti-RalB, один (А185В) - обоими антителами и

один (В 185А) не детектировался ни одним из антител. Все конструкты несли шус-

эпитоп на N-конце, однако убиквитинированные формы Ral не детектировались anti-

myc антителами.

При использовании химерных белков оказалось, что все детектируемые формы RalA/RalB в той или иной степени убиквитинируются (Рис. 12). Наиболее сильное

убиквитинирование проявлялось у химеры А115В - значительно сильнее, чем у исходных RalA и RalB.

(У

<3- ^ ¿р

<§= «j- S & S

** V V V "V <*> *Г **>

* «

||

I-'

*

Рис. 12. Убиквитинирование химерных конструкций Яа1А/Яа1В.

Вверху - убиквитинированная фракция, внизу - уровень экспрессии.

13. Убиквитинирование точечных мутантов 11а1А с различными заменами лизиновых остатков

В ходе дальнейшего поиска возможных дополнительных сайтов убиквитиниро-вания 11а1А, была создана серия мутантных конструкций с заменами лизиновых остатков в различных позициях. Эксперименты с этими конструкциями показали, что только замена лизина в позиции 115 ведёт к значительному подавлению убиквитини-рования, в то время как ряд мутантов (К27Г1, К17911, К159К/К166И) не только не теряют убиквитинирования, но напротив, убиквитинируются значительно сильнее чем 1?а1А дикого типа (Рис. 13).

Дальнейший мутагенез потенциальных сайтов убиквитинирования показал, что даже при наличии единственного лизинового остатка (Ьув115) Иа1А эффективно уби-квитинируется, и только полная замена всех лизиновых остатков на аргининовые способна отменить убиквитинирование Яа1А (Рис. 14).

4033.

тр

ШШ Яш

шпцсг- Ш^т -щру ттш- ШшШШ'

Рис. 13. Убиквитинирование точечных мутантов Яа1А с заменами аминокислот К5-К7, К16, К27, К50-К56-К57, К115, К128, К179, К159-К166. Вверху - убиквитинированная фракция, внизу - экспрессия Яа1А.

// / // * ва

/ ///

70 55 40 33

24 i RatA

я т • м1 Щ \

* и штщй. i Щ

70

55

40

33

24

Рис.14. Убиквитинирование точечных мутантов RalA с множественными заменами лизин - > аргинин, «control» - без гиперэкспрессии RalA; «wild-type» - RalA дикого типа; «polyKl» - замены К179, К184, К186; «ро1уК2» - замены К189, К190, К191, К193, К197; «polyK-all» - замены К179, К184, К186, К189, К190, К191, К193, К197; «-18R» - замены всех лизинов кроме К115, К134, К143; . «-19R» - замены всех лизинов кроме КИ5, К134; «-20R» - замены всех лизинов кроме К115; «-21R» - замены всех лизинов.

14. Убиквитинирование 1{а1А и 1*а1В с изменённой активностью

Одной из возможных функций убик-^ * а витинирования может являться регуляция

активности соответствующего белка-субстрата. В связи с этим было изучено убиквитинирование доминантно-

негативных и конститутивно активных мутантов Ра1А и Яа1В. Оказалось, что в случае Яа1А, активирующая мутация С23У повышает убиквитинирование белка, в то время как доминантно-негативная „ , форма с мутацией Б28К убиквитинирует-

)'ис. о Убиквитинирование мутантных форм ка1А (А) и ЯаШ

(Б). Вверху - убиквитинированная фрак- ся г0ра3д0 слабее. В ТО же время другой ция, внизу-уровень экспрессии.

доминантно-негативный мутант ГЫА, С26А, проявил крайне высокий уровень убиквитинирования (Рис. 15).

55

т.»* штщ

40 Ш1 ЧВЦ;

мтфц- 33 тт ¡вт*

24

• шж.

15. Убиквитинирование эффекторных мутантов ка1А и Яа1В

С целью определения возможной связи убиквитинирования 11а1А и 11а1В с передачей сигнала соответствующим эффекторам, изучены эффекторные мутанты активированных форм Ла1А и Яа1В. Показано (Рис. 16), что в случае 11а1А наиболее высокий уровень убиквитинирования характерен для мутантов 049Е и 049И, неспособных взаимодействовать с 8ес5 и 11а1ВР1, соответственно. В случае ИаШ также отмечено повышенное убиквитинирование мутантов Б49Е и В491Ч, а также мутанта ЛЖ1, неспособного взаимодействовать с фосфолипазой Б. Необходимо отметить, что активированный мутант Яа1В А48Е, неспособный взаимодействовать ни с Бесб ни с ЯаГОР!, сохраняет низкий уровень убиквитинирования.

12 3 4 5 6 7 AW AV AA AN АV AV AV

É38R A48W D49£ 049Ы

70 J|í; :f'i!--Щщ 1Ш. é ш

55 < al шш ■р т ft"-

40 ® щт

33 24 9 BW 10 в C21V и в OÍ3V А4Ш 12 В c»v 13 ь 02SV ШШ ¡4 и G8V ЖП

1 IB: RalA щшшти «и —

I IB: actln PwZ™ 111 -

Б :..................

IB:

RalB

16:

actin

Рис. 16. Убиквитинирование мутантных форм Ral А и RalB. 1 - RalA дикого типа, 2 - RalA G23V, 3 -RalA G26A, 4 - RalA S28N, 5 - RalA G23V E38R, 6 - RalA G23V A48W, 7 - RalA G23V D49E, S - RalA G23V D49N, 9 - RalB дикого типа, 10 - RalB G23V, 11 - RalB G23V A48E, 12 - RalB G23V D49E, 13 - RalB G23V D49N, 14 - RalB G23V AN11.

Обсуждение результатов

Понимание механизмов осуществления и регуляции клеточных сигнальных путей является одной из важнейших тем в современной биологии. Сигнальный путь Ras-RalGEFs-Ral представляет особенный интерес в изучении онкологических заболеваний, поскольку активирующие мутации Ras были обнаружены в 30% случаев человеческих опухолей, a Ral считается ключевым эффектором Ras-пути в случае канцерогенеза человеческих клеток. При этом, о деталях действия ГТФаз Ral и вероятных механизмах их регуляции известно не так много.

При изучении белковых партнёров, взаимодействующих с участниками Ras-Ral пути выявлен ряд компонентов системы убиквитинирования - как убиквитин-лигаз, так и деубиквитинирующих ферментов (Рис. 17). Это подтолкнуло к выдвижению гипотезы о вероятном убиквитинировании самих участников этого пути. Обнаруженный в работе факт убиквитинирования RalA и RalB подтвердил эту гипотезу и открыл новое направление в поисках механизмов регуляции Ras-Ral-пути. Данное явление представляется особенно ценным с учётом недавно обнаруженного убиквитинирования ГТФаз Ras, влияющего на их локализацию и активность.

Ras

?

RalSEFs

НЕСГО1

IS5P3X=FAF

USP25 USP2S '

la!

1

USP20

HYD=D05=F!DDX

(€3 S!t/S<Sal*}

зювцмсг

Д-IHIIMU MVMJIII ■ (M.While. I ITV.V)

n*V«l(4i'UIHi (|1|<U?KT [ll US

Рис. 17. Связи сигнального пути Ral с компонентами системы убиквитинирования.

Основные эксперименты в работе проводились с использованием сверхэкспрес-сированных продуктов на клетках линии HeLa, однако по меньшей мере сам факт убиквитинирования RalA был подтверждён и для эндогенного белка, а также на других, достаточно отличающихся друг от друга линиях трансформированных клеток.

Наличие нескольких сигналов, соответствующих убиквитинированным формам, говорит о том, что модификация RalA и RalB не относится к моноубиквитинирова-нию, но является мульти- и/или поли- убиквитинированием.

Полиубиквитинирование, исторически известное, в первую очередь, как сигнал протеасомной деградации белка, может иметь и другие последствия. В работе показано, что при использовании ингибитора протеасомной деградации накопления RalA и RalB не происходит. Это свидетельствует о том, что данные белки не подвергаются протеасомной деградации. Неожиданным фактом является снижение уровня экзогенных RalA и RalB при использовании такого ингибитора. Такой эффект позволяет предположить наличие пока невыясненных негативных регуляторов Ral, подверженных протеасомной деградации.

Использование функциональных мутантов убиквитина продемонстрировало значительное снижение уровня убиквитинирования RalA в случае КбЗ-мутанта. Таким образом, наиболее вероятной модификацией RalA является К63-полиубиквитинирование.

Важность правильной мембранной локализации для функционирования малых ГТФаз является известным фактом. В связи с этим, было интересным рассмотреть вероятную связь между убиквитинированием и локализацией Ral. Действительно, оказалось, что удаление одного только СААХ-мотива значительно снижает убиквитини-

роваиие RalA, в то время как удаление всей С-концевой части включая полиосновный тракт, практически полностью отменяет его убиквитинирование. Кроме того, уровень убиквитинирования RalA зависит от наличия в клетке липидных рафтов. Конкретный механизм, обусловливающий данную связь, ещё предстоит выявить.

Последовательный точечный мутагенез вероятных позиций убиквитинирования позволил в конечном счёте найти основной сайт - Lysll5. Одного этого остатка достаточно для сохранения убиквитинирования RalA, в то время как его одиночная мутация снижает убиквитинирование. Следует отметить, однако, что даже в этом случае убиквитинирование не исчезает полностью. Таким образом, другие позиции могут играть роль минорных сайтов убиквитинирования, что согласуется с последними данными об убиквитинировании ГТФаз Ras.

Ведущееся параллельно изучение вероятной роли партнёров сигнального пути Ras-Ral (см. Рис. 18) включает в себя тестирование обнаруженных партнёров в свете убиквитинирования Ral. В рамках данной работы был исследован один такой белок -деубиквитинирующая протеаза USP25. Предварительные результаты показывают, что данный фермент не влияет на убиквитинирование RalA.

Отдельный интерес представляют опыты по определению возможной роли убиквитинирования Ral в передаче сигнала соответствующим эффекторам. Эффекторные мутанты, использованные в работе, позволяют избирательно отменять активацию отдельных эффекторов, включая PLD, Sec5, и др. Полученные результаты показывают, что отмена взаимодействия с отдельными эффекторами ведёт к изменению уровня убиквитинирования как RalA, так и RalB.

Выводы

1. Впервые показано, что малые ГТФазы RalA и RalB, ключевые участники сигнальных путей, ассоциированных с канцерогенезом, подвергаются убик-витинированию во всех исследованных клеточных линиях и во всех вариантах активности Ral.

2. При анализе возможных сайтов убиквитинирования с помощью направленного мутагенеза обнаружено, что основным сайтом убиквитинирования RalA предположительно является Lysll5. Замены лизинов на аргинин в позициях 27, 179,159, 166 ведут к значительному усилению убиквитинирования RalA.

3. Использование делеционных мутантов показало, что критическим для убиквитинирования RalA является наличие сигналов внутриклеточной локализации в виде СААХ-мотива и полшшзинового тракта, а также функционирование липидных рафтов в клетке.

4. Убиквитинирование RalA и RalB не ведёт к их протеасомной деградации. При этом наиболее вероятным типом убиквитинирования RalA является К63-полиубиквитинирование.

5. Деубиквитинирующий фермент USP25, ранее выявленный как партнёр одного из компонентов Ral-пути, не осуществляет модификацию RalA.

6. Конститутивно активный RalA убиквитинируется значительно сильнее, чем RalA дикого типа. Активирующая мутация RalB, напротив, снижает уровень его убиквитинирования.

7. Доминантно-негативная мутация RalA G26A усиливает, a S28N - подавляет уровень убиквитинирования RalA.

8. Убиквитинирование активированных форма как RalA, так и RalB зависит от их способности взаимодействовать с эффекторами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Isachenko N, Dyakova N, Aushev V, Chepurnych T, Gurova K, Tatosyan A. High expression of shMDGl gene is associated with low metastatic potential of tumor cells. Oncogene 25 (2006).

2. Тепкеева И., Аушев B.H., Зборовская И.Б., Дёмушкин В.П. Цитостатическая активность пептидных экстрактов лекарственных растений на трансформированных клеточных линиях А549, Н1299 и HeLa. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, №1 2009г.

3. Aushev V., Neyraud V., Hatzoglou A., Camonis J. Ubiquitination of Ral: biochemical approach. // Тезисы конференции «Journées scientifiques de l'Ecole doctorale de cancérologie» (IV.2007, Poc-кофф, Франция), стр.10.

4. Aushev V., Hatzoglou A., Camonis J. Ubiquitination of Ral GTPases and its role in tumorigenesis, migration and metastasis formation. // Конференция «Journées scientifiques de l'Ecole doctorale de cancérologie» (15-17.05.2006, Роскофф, Франция), стр. 6.

5. Neyraud V., Aushev V., Hatzoglou A., Camonis J. Modification of Ral by ubiquitination. // Конференция Vlème Colloque Petites Protéines G (7-9.10.2008, Муан-Сарту, Франция).

6. Isachenko N.. Aushev V., Tatosyan A. High expression of chaperone shMDGl is associated with low metastatic potential of tumor cells. // Тезисы конференции EMBO-FEBS Workshop on Biology of Molecular Chaperones (28.05-02.06 2005, Закопане, Польша), стр. 92.

7. Isachenko N.. Aushev V., Tatosyan A. Chaperone shMDGl is associated with decrease in metastatic activity of highly metastatic RSV-transformed cell line. // Тезисы конференции FEBS Lecture Course on Cellular Signaling & 4th Dubrovnik Signaling Conference (21-27 мая 2004, Дубровник, Хорватия), стр. Р-102.

8. Isachenko N., Aushev V. Isoform of v-src oncoprotein isolated from low metastatic cell line is unable to activate N-acetylglucosaminyltransferase V. // Тезисы конференции BioScience2004 - from molecules to organisms (18-22 июля 2004, SECC, Глазго).

Подписано в печать:

25.02.2009

Заказ № 1658 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www. autoreferat. ru

Онкологические заболевания сегодня являются одной из актуальнейших медицинских проблем, а изучение всех аспектов возникновения и развития опухолей имеет большое значение для современной медицинской науки. Процессы канцерогенеза представляют также огромный интерес для молекулярной биологии, поскольку причиной возникновения всех опухолевых заболеваний являются нарушения в сложных механизмах регуляции клеточной жизнедеятельности, а многие из этих механизмов до сих пор не до конца изучены даже в норме.

В опухолевой прогрессии принимают участие не только широко изучаемые онкогены и гены-супрессоры опухолевого роста, но и гены-модуляторы. Белковые продукты последних не влияют на злокачественную трансформацию клеток, но способствуют росту и распространению опухоли в организме: участвуют в процессах неоангиогенеза, инвазии и метастазирова-ния. К ним можно отнести ряд цитокинов, хемокинов, ростовые факторы и их рецепторы, некоторые гены иммунного ответа, гены контроля активности протеолитических ферментов, везикулярного транспорта, системы белковой деградации и т.п.

Целью данной работы является выявление деталей регуляции Ral-индуцированных сигнальных путей, и в частности, роль убиквити-нирования в этом процессе.

В соответствии с указанной целью предполагалось решить следующие экспериментальные задачи:

1. Определить статус убиквитинирования белков Ral

2. Оценить уровень убиквитинирования Ral в различных линиях трансформированных клеток

3. Найти позиции, по которым происходит убиквитинирование

4. Создать неубиквитинируемые варианты Ral путём точечного мутагенеза найденных позиций

5. Определить свойства полученных мутантов Ral по сравнению с исходными белками

6. Выявить роль ранее обнаруженных партнёров в убиквитинировании Ral.

Научная новизна и практическая значимость исследования

В данной работе был впервые продемонстрирован факт убиквитинирования белков RalA и RalB; показано, что данная модификация не является сигналом протеасомной деградации. Убиквитинирование RalA найдено во всех исследованных линиях клеток человека и грызунов и является, таким образом, универсальным для различных типов клеток. В ходе работы создано более 60 новых генных конструктов, которые могут быть использованы при изучении свойств белков RalA и RalB. В том числе, получена панель мутантных форм RalA с разной степенью убиквитинирования; определены участки RalA, наиболее важные для убиквитинирования; показано критическое значение локализации RalA для его убиквитинирования. Оптимизирована методика определения убиквитинирования белков in vivo, которая позволяет уменьшить количество требуемого для исследования материала и сократить время исследования.

Работа носит в первую очередь теоретический характер, однако полученные данные могут быть использованы при дальнейшем изучении участия белков Ral в процессах опухолевой трансформации и прогрессии, а также разработке противоопухолевых агентов, влияющих на убиквитинирование данных белков.

Апробация работы

- Диссертация апробирована и рекомендована к защите 27 сентября 2007 года на совместной научной конференции лабораторий регуляции клеточных и вирусных онкогенов, вирусного канцерогенеза, иммунологии онкогенных вирусов, молекулярной биологии вирусов, биохимии опухолей, методов скрининга канцерогенов НИИ Канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина

РАМН. Материалы работы докладывались на конференциях «Journées scientifiques de l'Ecole doctorale de cancérologie» в 2006 и 2007 гг. (Роскофф,

Франция), «Vlème Colloque Petites Protéines G». (Муан-Сарту, Франция).

По материалам диссертации опубликовано 2 научные статьи и 5 тезисов докладов.

2. Обзор литературы

Процессы канцерогенеза носят комплексный характер и затрагивают многие аспекты жизнедеятельности клетки и организма. В основе этого процесса лежит накопление клетками различных генетических изменений, искажающих нормальные пути проведения сигнала и приводящие к неопластической трансформации. Малигнизация клеток происходит в результате накопления в их геноме нарушений, приводящих к неконтролируемой пролиферации клеток, их иммортализации и приобретению способности к инвазии и метастазированию. Несмотря на то, что получено множество данных о молекулярных изменениях, происходящих при трансформации клеток, картина остается неполной и многие аспекты требуют дальнейшего изучения.

6. Выводы

1. Впервые показано, что малые ГТФазы RalA и RalB, ключевые участники сигнальных путей, ассоциированных с канцерогенезом, подвергаются убиквитинированию во всех исследованных клеточных линиях и во всех вариантах активности Ral.

2. При анализе возможных сайтов убиквитинирования с помощью направленного мутагенеза обнаружено, что основным сайтом убиквитинирования RalA предположительно является Lysll5. Замены лизинов на аргинин в позициях 27, 179, 159, 166 ведут к значительному усилению убиквитинирования RalA.

3. Использование делеционных мутантов показало, что критическим для убиквитинирования RalA является наличие сигналов внутриклеточной локализации в виде СААХ-мотива и полилизинового тракта, а также функционирование липидных рафтов в клетке.

4. Показано, что убиквитинирование RalA и RalB не ведёт к их протеа-сомной деградации. При этом наиболее вероятным типом убиквитинирования RalA является КбЗ-полиубиквитинирование.

5. Деубиквитинирующий фермент USP25, ранее выявленный как партнёр одного из компонентов Ral-пути, не осуществляет модификацию RalA.

6. Конститутивно активный RalB убиквитинируется значительно слабее чем RalB дикого типа. Активирующая мутация RalB, напротив, снижает уровень его убиквитинирования.

7. Доминантно-негативная мутация RalA G26A усиливает, a S28N -подавляет уровень убиквитинирования RalA.

8. Убиквитинирование активированных форма как RalA, так и RalB зависит от их способности взаимодействовать с эффекторами.