Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Цитотоксические реакции лимфоцитов крови у детей при инфекционном мононуклеозе

003492454

На правах рукописи

Слепнчева Нелли Рафаиловиа

ЦИТОТОКСИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ У ДЕТЕЙ ПРИ ИНФЕКЦИОННОМ МОНОНУКЛЕОЗЕ

14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск-2010

2 5 ФЕВ 2010

003492454

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор

Уразова

Ольга Ивановна

Помогаева Альбина Петровна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук

доктор медицинских наук

Чурин

Алексей Александрович Шевцова

Наталья Михайловна

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Северный государственный медицинский университет (г. Архангельск) Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится «_» _ 2010 г. в _ часов на заседании

диссертационного совета Д 001.031.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН

Автореферат разослан «_» февраля 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, /2 .

доктор биологических наук — Амосова E.H.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования: По мнению экспертов Всемирной организации здравоохранения, XXI век станет веком оппортунистических инфекций. Ежегодно в России регистрируется около 30-40 млн. инфекционных больных, до 80% населения Земли инфицировано вирусами семейства герпеса. Детский организм имеет большую восприимчивость к инфекционным факторам, поэтому смертность от инфекционных болезней у детей составляет около 63%. К одной из наиболее актуальных детских инфекций относится инфекционный мононуклеоз. Этиологическим фактором инфекционного мононугслеоза в подавляющем большинстве случаев является вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ). Реже мононуклеоз вызывают другие вирусы (вирусы простого герпеса, цитомегалии, кори, краснухи) и Toxoplasma gondii [Помогаева А.П. и соавт., 2003; Иванова В.В., 2005; Потарская Е.В. и соавт., 2006; Краснов В.В., 2007].

ВЭБ обладает тропностью к эпителиальным клеткам носоглотки и к иммунокомпетентным клеткам крови - лимфоцитам, моноцитам/макрофагам, нейтрофилам. В-лимфоциты после внедрения вируса в геном трансформируются в ВЭБ-презентирующие клетки и приобретают способность к неограниченной пролиферации, в результате чего вирус может длительно персистировать в организме, приводя тем самым к структурно-функциональной дезорганизации и истощению иммунной системы [Харламова Ф.С. и соавт., 2006; Mendes T. et al., 2008].

Эффективный иммунный ответ на внедрение ВЭБ включает гуморальный и клеточный компоненты. Формируются нейтрализующие ВЭБ антитела (IgM и JgG) к капсидному, раннему, мембранному, нуклеарному антигенам. Элиминация вируса и инфицированных клеток осуществляется за счет естественных клеток-киллеров, CD8+ и CD4+ Т-лимфоцитов. Т-клетки вырабатывают цитотоксические медиаторы и вызывают Fas/Fas-L-опосредованный апоптоз зараженных В-лимфоцитов. Однако ВЭБ может противодействовать иммунитету макроорганизма, создавая «дружественное» микроокружение, и выживать в организме хозяина в течение всей его жизни. Вирус вызывает усиление экспрессии Fas (CD95) на CD4+ и CD8+ лимфоцитах и Fas-L на В-лимфоцитах, что ведет к гибели Т-клеток, в основном Т-клеток памяти. Данный процесс может лежать в основе клеточно-оиосредованной транзиторной иммуносупрессии [Рыжов C.B., Новиков В.В., 2002; Жукова О.Б. и соавт., 2002, 2006; Андреева А.А., 2006; Scherrenburg J. et al., 2008; Ito Y., 2009].

В связи с этим, изучение роли лимфоцитов-киллеров при инфекционном мононуклеозе представляется важным как для понимания иммунопатогенеза заболевания, так и для создания средств специфической профилактики

вызываемой вирусом дизрегуляции системы специализированных клеток-киллеров и хронизации инфекционного процесса.

Цель исследования: выявить особенности и патогенетические факторы функционального дисбаланса цитотоксических Т-лимфоцитов и NK-клеток крови у детей при инфекционном мононуклеозе.

Задачи исследования:

1. Оценить экспрессию CD4, CD8, CD16, CD119, CD120a лимфоцитами периферической крови и продукцию интерферона (IFN) у, фактора некроза опухоли (TNF) a, трансформирующего фактора роста (TGF) ß in vitro у детей 1-6 и 7-14 лет, больных инфекционным мононуклеозом Эпштейна-Барр-вирусной и другой этиологии, в период разгара и фазу ранней реконвалесценции.

2. Охарактеризовать апоптоз-индуцирующую и цитолитическую активность Т-лимфоцитов и NK-клеток (натуральных киллеров) периферической крови у детей в возрасте 1-6 и 7-14 лет при инфекционном мононуклеозе, вызванном вирусом Эпштейна-Барр и другими возбудителями, в период клинико-гематологической манифестации и на этапе выздоровления.

3. Установить общие закономерности, особенности и патогенетические факторы нарушений лимфоцит-опосредованной цитотоксичности у детей, больных инфекционным мононуклеозом, в зависимости от возрастных особенностей организма, этиологии и фазы заболевания.

Научная новизна. Оценены реакции цитотоксических Т-лимфоцитов и NK-клеток периферической крови у детей при инфекционном мононуклеозе Эпштейна-Барр-вирусной и другой этиологии в динамике заболевания. Получены данные о том, что у детей 1-6 и 7-14 лет, больных инфекционным мононуклеозом, наряду с повышением абсолютного содержания CD4+, CD8+ и CD16+ лимфоцитов в крови в фазу клинико-гематологической манифестации (с тенденцией к его нормализации в фазу реконвалесценции), отмечается усиление антителозависимой клеточной цитотоксичности и повышенное содержание в крови лимфоцитов, экспрессирующих CD95, CD95L, TNF-RI и annexin V. Данные изменения свидетельствует об активации цитолитических свойств С016+-киллеров и апоптогенной (Fas- и TNF-RI-зависимой) функции Т- и NK-клеток. При этом дефицит сывороточной концентрации гранзима В и стимулированной продукции IFNy и TNFa in vitro на фоне компенсаторной гиперэкспрессии рецепторов цитокинов CD 119, CD 120a характеризуют снижение функционального резерва цитотоксических (по данным корреляционного анализа, преимущественно CD8 ) лимфоцитов, что в условиях гиперпродукции TGFß может быть определено как проявление иммуносупрессорного эффекта. Обосновано, что дисбаланс реакций лимфоцит-опосредованной цитотоксичности при инфекционном мононуклеозе у детей сопряжен с этиологией и фазой заболевания и является

более выраженным у детей в возрасте 1-6 лет. При этом изменения субпопуляционного состава лимфоцитов с цитотоксической активностью наиболее значимы при инфекционном мононуклеозе, вызванном вирусом Эпштейна-Барр, а уровень апоптогенного действия Т- и NK-клеток - при инфекционном мононуклеозе другой этиологии.

Практическое и теоретическое значение работы. Новые знания о механизмах дисфункции цитотоксических лимфоцитов и естественных клеток-киллеров у детей 1-6 и 7-14 лет при инфекционном мононуклеозе Эпштейна-Барр-вирусной и другой этиологии в острый период и фазу ранней реконвапесценции могут быть использованы для разработки дифференциальных патогенетических подходов к иммунокорригирующей терапии, для профилактики индуцированных вирусом нарушений цитоповреждагощего действия специализированных «клеток-убийц» и хронизации инфекционного процесса.

Положения, выносимые на защиту:

1. Развитие инфекционного мононуклеоза у детей сопровождается увеличением числа CD4+, CD8+, CD16+лимфоцитов в крови, активацией их апоптогенной и антителозависимой цитолитической функций в сочетании с истощением резерва продукции цитотоксических медиаторов. Структурно-функциональный дисбаланс клеток сохраняется в фазу ранней реконвапесценции, а его выраженность зависит от этиологии заболевания и возрастных особенностей организма.

2. Наиболее существенные изменения субпопуляционного состава лимфоцитов (CD4+, CD8+, CD16+) формируются у детей 1-6 лет при инфекционном мононуклеозе, вызванном вирусом Эпштейна-Барр. При этом уровень экспрессии лимфоцитами CD95, CD95L и TNF-RI, характеризующий наряду с увеличением количества annexin V+ клеток способность цитотоксических Т- и NK-лимфоцитов к индукции апоптоза, выше при инфекционном мононуклеозе другой этиологии.

3. Супрессия Т- и NK-клеточной цитотоксичности в условиях гиперсекреции TGFß при инфекционном мононуклеозе у детей проявляется дефицитом гранзима В в сыворотке крови и стимулированной продукции IFNy, TNFa in vitro на фоне компенсаторной активации экспрессии CD119-, CD120a-рецепторов цитокинов.

Реализация и апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на 66-й, 67-й научных студенческих конференциях им. Н.И. Пирогова (Томск, 2007, 2008), VIII Конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2008), VIII международной российско-германской конференции «Инновации в медицине. Социально значимые инфекционные заболевания» (Новосибирск, 2009), Российской научно-практической конференции «Актуальные

проблемы инфекционной патологии», посвященной 85-летию кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (Томск, 2009) и научно-образовательных семинарах при Центре компетенции по проблеме инфекционных болезней им. И.И. Мечникова и Р. Коха ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (Томск, 2008, 2009). Основные положения и выводы диссертации используются в учебном процессе в ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава на кафедре патофизиологии в разделах «Патофизиология клетки», «Патофизиология иммунитета», «Патофизиология системы крови» и на кафедре детских инфекционных болезней в лекционных и практических курсах по теме инфекционного мононуклеоза.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, 3 из которых в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4-х глав, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 1 рисунком и 7 таблицами. Библиографический указатель включает 188 источников, из них 115 отечественных и 73 зарубежных авторов.

ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В основу исследования положены результаты обследования 59 дете больных инфекционным мононуклеозом (ИМ) средней степени тяжести, период развернутой клинико-гематологической картины заболевания и период ранней реконвалесценции (в среднем через 7 дней от начала болезнг Все дети, больные ИМ, находились на лечении в инфекционном отделеш больницы им. Г.Е. Сибирцева. г. Томска.

Дети были разделены на группы в зависимости от возраста (1-6 и 7-14 ле и этиологии болезни (ИМ, вызванный вирусом Эпштейна-Барр (ИМ-ВЭБ), и] другими возбудителями). Группу детей с ИМ-ВЭБ дошкольного возрас составили 25 детей (18 мальчиков и 7 девочек). В группу детей школьно возраста, больных ИМ-ВЭБ, вошли 6 детей (4 мальчика и 2 девочки). Груш детей дошкольного возраста с ИМ другой этиологии составили 20 детей ( мальчиков и 4 девочек). В группу детей школьного возраста, больных И другой этиологии, вошли 8 детей (5 мальчиков и 3 девочки).

Диагноз заболевания устанавливался по характерной клиник гематологической картине и лабораторным данным. Диагноз ИМ-В^ верифицировали выявлением в сыворотке крови больных ДНК виру Эпштейна-Барр (ВЭБ) методом ПЦР и антител к антигенам ВЭБ (определя. IgM к капсидному антигену (VCA-IgM), IgG к раннему антигену (ЕА IgG) IgG к ядерному антигену (NA-IgG) вируса Эпштейна-Бар

иммуноферментным методом с использованием стандартных тест-систем производства ЗАО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск).

В контрольную группу вошли 14 здоровых детей (8 мальчиков и 6 девочек), сопоставимого возраста.

Материалом исследования служили лимфоциты гепаринизированной (25 Ед/мл) периферической крови, взятой утром натощак из локтевой вены. Выделение лимфоцитов проводили на градиенте плотности фиколл-урографина (1,077 г/см3) [Новиков А.К., Новикова В.И., 1979]. Концентрацию жизнеспособных клеток определяли в счетной камере Горяева с использованием 0,5% раствора трипанового синего [Гольдберг Е.Д. и соавт., 1992]. Идентификацию CD4+, CD81, CD16+, CD95+ лимфоцитов периферической крови осуществляли с помощью лимфоцитотоксического теста с использованием соответствующих моноклональных антител (МАТ) (ООО «Сорбент», г. Москва). Оценку экспрессии CD95L, CD119, CD120a проводили на лимфоцитах периферической крови методом поверхностной иммунофлуоресценции (использовали MAT Caltag Laboratories, Франция - для CD95L, CD119; R&D Systems Inc., США - для CD120a). Подсчет клеток проводили с помощью люминесцентного микроскопа Axiostar plus (Carl Zeiss, Германия), предварительно добавляя на стекла иммерсионное масло со сниженной собственной флуоресценцией. Продукцию цитокинов в культуре лимфоцитов определяли с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Для разделения лимфоцитов и моноцитов перед культивированием суспензию выделенных мононуклеарньгх лейкоцитов дополнительно инкубировали 1 ч при 37°С в чашках Петри с предварительно помещенными в них покровными стеклами, которые после инкубации извлекали. Для определения уровней IFNy, TNFct, TGFß в супернатантах культуральных суспензий и гранзима В в сыворотке крови использовали твердофазный иммуноферментный «сэндвичевый» метод (ELISA). Апоптотичеекие лимфоциты идентифицировали по экспрессии на наружном монослое плазматической мембраны молекул фосфатидилсерина методом флуоресцентной микроскопии с использованием FITC-меченного annexin V [Beckman Coulter, Франция]. Для оценки антителозависимой клеточной цитотоксичности использовали спектрофотометрический метод.

Полученные в ходе исследования данные обрабатывали с использованием стандартного пакета программ Statistica for Windows (2000, версия 6.0) фирмы «Statsofl Inc.». Проверку гипотезы нормальности распределения проводили по критерию Колмогорова-Смирнова. Для оценки достоверности различий выборочных данных, не подчиняющихся закону нормального распределения, использовали U-критерий Манна-Уитни (для независимых выборок) и Т-критерий Уилкоксона (для зависимых выборок). [Гмурман В.Е., 2002]. Различия считали достоверными при р-уровне менее

0,05. Зависимость параметров в группах оценивали с помощью ранговой корреляции Спирмена. Корреляцию считали значимой при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Инфекционный мононуклеоз (ИМ) - острое инфекционное лимфопролиферативное заболевание, возбудителем которого в подавляющем большинстве случаев является вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ), относящийся к семейству у-герпесвирусов [Учайкин В.Ф., 1998].

Важной особенностью ВЭБ является избирательная его адсорбция на В-лимфоцитах, имеющих специфические рецепторы, встраивание ДНК-йируса в геном лимфоцитов и трансформация клеток в атипичные мононуклеары. Также ВЭБ обладает тропностью к эпителиальным клеткам носоглотки, моноцитам/макрофагам, нейтрофилам [Харламова Ф.С. и соавт., 2006].

Уникальность ВЭБ заключается в его способности не разрушать, а стимулировать пролиферацию зараженных им лимфоцитов путем изменения соотношения между ростовыми и апоптозными потенциями клеток. В-лимфоциты после внедрения вируса в геном трансформируются в ВЭБ-презентирующие клетки и приобретают способность к неограниченной пролиферации, в результате чего вирус может длительно персистировать в организме, приводя тем самым к структурно-функциональной дезорганизации и истощению иммунной системы [Ройт А., 2000; Железникова Г.Ф., 2006; ЬогепгеШ М.А., 2009].

Общеизвестно, что в ответ на попадание во внутреннюю среду организма вирусных антигенов активируются механизмы врожденного н адаптивного иммунного ответа, направленные на ограничение инфекции и элиминацию инфектогена. В случае внутриклеточного проникновения вирусов ведущую роль отводят реакциям клеточного типа. Функционально в основе этого процесса лежит сложная межклеточная кооперация Т- и В-лимфоцитов [1шгеЬ М.Р., 1995; Ройт А., 2000]. Элиминация вирусов, как известно, осуществляется за счет естественных клеток-киллеров и СБ4+, СБ8+ Т-лимфоцитов, способных продуцировать иммунорегуляторные цитокины, индуцировать лизис и апоптоз зараженных и трансформированных вирусом лимфоцитов. Между тем, ВЭБ способен индуцировать дизрегуляцию иммунного ответа, выживать и длительно персистировать в организме хозяина [Голованова А.Е., 2006 ].

Результаты проведенного в настоящей работе изучения субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови у детей, больных ИМ (табл. 1), подтверждают данные литературы [Ройт А., 2000; Йо У., 2009]. Так, в период развернутых клинико-гематологических проявлений ИМ отмечалось достоверное повышение (по сравнению с нормой)

относительного и абсолютного содержания CD4+, CD8+, CD16+ лимфоцитов в крови. При этом у детей младшего возраста данные изменения были более выраженными, чем у детей 7-Í4 лет, что, вероятно, объясняется функциональной незрелостью их иммунной системы и повышенной реактивностью на воздействие болезнетворного фактора. Наряду с этим, необходимо заметить, что повышение относительного числа CD16+ лимфоцитов обнаруживалось исключительно при ИМ-ВЭБ (до 19,60±2,86% у детей 1-6 лет и 20,20±3,90% у детей 7-14 лет при норме 13,40±2,26% у детей 1-6 лет и 13,70±3,03% у детей 7-14 лет), возможно, в виду того, что ВЭБ обладает более выраженными лимфотропными свойствами по сравнению с другими возбудителями ИМ, наиболее распространенными из которых являются цитомегаловирус (выявляется в 5,3% случаев ИМ) и вирус простого герпеса (у 7,95% больных ИМ) [Уразова О.И. и соавт., 2003]. В период реконвалесценции у пациентов в возрасте 1-6 лет с ИМ-ВЭБ относительное количество CD8+, CD16* лимфоцитов нормализовалось. При этом абсолютное число CD4+ (у детей обеих возрастных групп с ИМ-ВЭБ и ИМ другой этиологии - ИМД), CD8+ и CD16+ лимфоцитов (у детей 1-6 лет с ИМ-ВЭБ и ИМД) в период реконвалесценции оставалось выше контрольных значений, несмотря на тенденцию к его нормализации.

Известно, что CD4+ лимфоциты мобилизуют макрофаги, секретируют цитокины, усиливающие воспалительный процесс (IL-2, IFNy, TNFP) и образование противовирусных антител (IL-4, IL-5 и др.). При вирусных инфекциях увеличение численности CD4+ лимфоцитов рассматривается как функциональное дублирование работы иммунной системы: при дисфункции CD8+ лимфоцитов CD4+ клетки «помогают» в устранении инфекции [Ройт А., 2000; Scherrenburg, J., 2008].

Увеличение числа Т-лимфоцитов с фенотипом CD8+ в крови у детей, страдающих ИМ, служит свидетельством доброкачественного течения заболевания, поскольку CD8+ клетки являются специализированными «клетками-убийцами», ответственными за распознавание

вирусопределяющих эпитопов на поверхности инфицированных В-лимфоцитов и апоптоз ВЭБ-трансформированных клеток.

Повышенное содержание в крови у больных ИМ лимфоцитов, экспрессирующих С016-антиген, также является благоприятным прогностическим признаком заболевания, поскольку известно, что NK-клетки осуществляют неспецифическую защиту организма-хозяина от внутриклеточных паразитов и, также как и CD8+ лимфоциты, обеспечивают поддержание тканевого гомеостаза [Малышева О.И. и соавт., 2001; Sauce D., 2009].

Таблица 1

Содержание СВ4+, С08+ и СБ16+, СБ95+, СЭ95Ь+ и аппехт У+ лимфоцитов в периферической крови (х 109/л)

у здоровых детей и у детей, больных инфекционным мононуклеозом, X ±гп

Показатели Здоровые дети Дети, больные инфекционным мононуклеозом (п=36)

Дети в возрасте 1-6 лет Дети в возрасте 7-14 лет

1-6 лет (п=6) 7-14 лет (п=8) Дети, больные ИМ-ВЭБ Дети, больные ИМ другой этиологии Дети, больные ИМ-ВЭБ Дети, больные ИМ другой этиологии

Острый период заболевания (п=12) Период реконвалес-ценции (п=11) Острый период заболевания (п=10) Период реконвалес-ценции (п=8) Острый период заболевания (п=б) Период реконвалес-ценции (п=6) Острый период заболевания (п=8) Период реконвалес-ценции (п=7)

СО 4+ 0,43*0,10 0,46*0,05 1,52±0,60 Р!<0,001 0,77*0,32 р,<0,01 р2<0,01 1,62*0,89 Р1<0,001 0,77±0,24 р,<0,01 р2<0,01 0,58*0,13 р4<0,05 1,09*0,41 р,<0,001 Р2<0,01 р»<0,05 1,54*0,76 р,<0,001 р3<0,001 1,10*0,39 Р1<0,001 Рг<0,01 р4<0,05

С08+ 0,41±0,09 0,40*0,07 1,06*0,50 р,<0,01 0,78*0,26 Р1<0,05 Рг<0,05 1,11 ±0,49 р,<0,01 0,98*0,32 р,<0,01 р3<0,05 0,8 5±0,22 Р1<0,05 Р4<0,05 0,47*0,10 р2<0,01 р4<0,01 0,76*0,24 Р1<0,05 р4<0,01 0,60*0,51 р4<0,01

С016+ 0,39±0,06 0,40±0,18 1,12*0,24 р,<0,001 0,90±0,19 р,<0,01 0,98*0,51 р!<0,01 0,79*0,17 р,<0,01 1,20*0,32 Р1<0,001 0,41*0,11 р2<0,01 Р<<0,01 0,78*0,14 Р1<0,01 Рз<0,01 0,50*0,09 р4<0,05

СИ95* 0,10*0,05 0,12*0,09 0,40*0,12 р,<0,05 0,19*0,08 0,44*0,07 Р1<0,05 0,32*0,02 Р1<0,05 р3<0,05 0,46*0,10 р,<0,05 0,16*0,05 Р2<0,05 0,50*0,18 р,<0,01 0,28*0,04 Р1<0,05 рг<0,05 р,<0,05

СЭ95Ь+ 0,03±0,01 0,06*0,02 0,45*0,05 р,<0,01 0,47*0,07 р,0,01 0,52*0,02 Р1<0,01 0,50±0,08 р,<0,01 0,48*0,04 р,<0,01 0,50*0,09 Р.<0,01 0,49*0,07 р,<0,01 0,51*0,08 р,<0,01

Аппехт V* 0,07*0,01 0,05*0,01 0,30*0,05 Р1<0,01 0,34*0,02 р,<0,01 0,37±0,04 р,<0,01 0,41 ±0,05 р,<0,01 0,39*0,03 р,<0,01 0,40±0,06 р,<0,01 0,40*0,07 р,<0,01 0,33*0,04 р,<0,01

Примечание: Р1 — уровень статистической значимости различий по сравнению с аналогичными показателя™ у здоровых детей соответствующего возраста, Рг - У детей соответствующего возраста, больных инфекционным мононуклеозом той же этиологии, в острый период болезни, Рз — у группы детей соответствующего возраста, больных инфекционным мононуклеозом, вызванным вирусом

Одной из антиапоптотических стратегий вирусов является блокирование пускового сигнала при взаимодействии «смертельных» рецепторов и лигандов на клетках. Лиганд Fas(CD95)-3aBncnMoro апоптоза - Fas-L -преимущественно экспрессируется цитотоксическими Т-лнмфоцитами и натуральными киллерами. Через механизм Fas-зависимого апоптоза цитотоксические Т-лимфоциты и NK-клетки «расправляются» с клетками, инфицированными вирусами [Железнякова Г.Ф., 2001].

При оценке показателей Fas-опосредованного апоптоза нами было отмечено повышение уровня экспрессии CD95L на поверхности лимфоцитов у детей 1-6 и 7-14 лет при ИМ-ВЭБ и ИМД в острый период. Известно, что, связываясь с комплементарным СБ95-рецептором, CD95L включает цепь передачи сигнала, приводящего к апоптозу. Следовательно, повышенная его экспрессия - показатель активации апоптогенной функции лимфоцитов-киллеров (Т-клеток и NK) [Uehara Т., 1992]. При этом нужно заметить, что в период раннего выздоровления у детей с ИМ отмечалось снижение относительного числа CD95L+ лимфоцитов в крови по сравнению с предыдущим этапом исследования, однако относительное и абсолютное число клеток, презентирующих Fas-лиганд, все еще превышало таковое у здоровых детей.

Другой участник рецептор-опосредованного апоптоза - CD95 (Fas) -является специализированным рецептором сигнала к индукции гибели инфицированной клетки. Повышение числа лимфоцитов, экспрессирующих CD95, является закономерным проявлением не только активации апоптоза, но и в целом иммунной системы. Следовательно, увеличение уровня экспрессии CD95 на лимфоцитах при ИМ у детей может быть следствием не только инфекционного повреждения, но и активации (в том числе вирус-стимулированной пролиферации) лимфоцитарных клеток.

В период ранней реконвалесценции относительное содержание CD95+ клеток в крови у детей с ИМ-ВЭБ и ИМД нормализовалось, что можно рассматривать как фактор саногенеза, обусловливающий элиминацию инфицированных лимфоцитов и снижение активности индуцированных инфекцией иммунных реакций. Абсолютное количество CD95+ лимфоцитов у реконвалесцентов с ИМ-ВЭБ также восстанавливалось до уровня нормы, в то время как у детей, больных ИМД, в период выздоровления оно по-прежнему превышало значение родственного показателя у здоровых детей (табл. 1), хотя и понижалось относительно предыдущего этапа исследования.

В ходе установления зависимости между исследуемыми параметрами было показано, что у здоровых доноров 1-6 и 7-14 лет и у детей школьного возраста, больных ИМ-ВЭБ, в острый период относительное число CD95+ клеток положительно коррелировало только с относительным содержанием CD4+ лимфоцитов (г=0,67; р=0,05 и г=0,58; р=0,05 соответственно), что

согласуется с общепринятыми представлениями [Железнякова Г.Ф., 2000] о преимущественном использовании системы FasL/Fas CD4+ лимфоцитами для индукции апоптоза других клеток в той же степени, что и в отношении запуска их собственной тонатогенной программы.

Реализацию апоптоза (по количеству апоптотических клеток) в популяции лимфоцитов периферической крови оценивали путем установления экспрессии на наружном монослое плазматической мембраны молекул фосфатидилсерина методом флуоресцентной микроскопии с использованием FITC-меченного аннексина (annexin) V. При изучении показателей, характеризующих степень выраженности программированной гибели лимфоцитов, при ИМ было зарегистрировано обогащение фракции лимфоцитов annexin V-позитивными (подвергшимися апоптозу) клетками как в острый период заболевания, так и в фазу раннего выздоровления у детей 1-6 и 7-14 лет независимо от этиологии заболевания (табл. 1). Вероятно, это следует рассматривать как защитную реакцию организма, направленную на ограничение дальнейшего распространения вируса, т.к. генетической программой любой клетки предусмотрена ее самоликвидация при инфекции и трансформации.

Важная роль в регуляции апоптоза клеток иммунной системы принадлежит цитокинам. В ходе проведенного исследования нами было отмечено, что у детей в возрасте 1-6 лет базальная продукция TNFa in vitro в оба периода ИМ (острый и реконвалесценции) не отличалась от показателя у здоровых детей, в то время как стимулированная фитогемагглютинином (ФГА) секреция цитокина была ниже контрольного значения в острый период и фазу клинического выздоровления. Напротив, у детей школьного возраста в острый период и на этапе реконвалесценции отмечалось увеличение (по сравнению с нормой) базальной продукции TNFa, в то время как ФГА-стимулированная его секреция не претерпевала выраженных отклонений от референтных ее значений и была ниже, чем в отсутствие стимуляции клеток ФГА.

Ограничение продукции TNFa в условиях ВЭБ-йнфекции можно расценивать как реакцию системы иммунитета, направленную на предотвращение реализации проапоптотического потенциала вируса и развития необратимого повреждения органов и тканей, обусловленного действием цитокина [Бокова А.Г., 2006]. Напротив, повышение уровня TNFa в сыворотке крови характеризует процессы воспаления и элиминации клеток путем прямой цитотоксичности или апоптоза [Потапнев М.П., 2003]. По результатам проведенного корреляционного анализа у детей с ИМ 7-14 лет в острый период уровень спонтанной секреции TNF-a оказался в обратной зависимости от относительного содержания CD4+ лимфоцитов (г=-0,95;

Таблица 2

Уровень секреции цитокинов in vitro, гранзима В в сыворотке крови и антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ)

у здоровых детей и у детей, больных инфекционным мононуклеозом, X ±т

Показатели Здоровые дети Дети, больные инфекционным мононуклеозом (п=16)

Дети в возрасте 1 -6 лет Дети в возрасте 7-14 лет

1-6 лет (п=6) 7-14 лет (п=8) Острый период заболевания (п=9) Период реконвалесценции (п=7) Острый период заболевания (п=7) Период реконвалесценции (п=7)

Секреция IFNy, пг/мл Спонтанная 3,54±0,68 3,82±0,62 2,25*0,29 Р|<0,05 4,88*0,52 р2<0,01 5,01*0,48 р3<0,01 4,96*0,43

Стимулированная ФГА 10,42±0,70 10,36*0,65 1,73*0,69 р,<0,01 1,55*0,26 р,<0,01 3,17*0,89 р,<0,01 2,65*0,62 р,<0,01

Секреция TNFa, пг/мл Спонтанная 3,83±0,33 3,80*0,49 5,27*1,20 3,97±0,71 7,19*1,06 р,<0,05 6,34*0,82 Pi<0,05

Стимулированная ФГА 4,58±0,67 4,54*0,45 2,63*0,40 Р1<0,05 2,51±0,82 Pi<0,05 5,23*0,76 5,60*0,79 р3<0,05

Секреция TGFP, пг/мл Спонтанная 292,30±21,60 243,30*26,80 1294,75*69,55 р,<0,01 994,02*39,15 р,<0,01 р2<0,05 976,21±43,19 р,<0,01 791,85*32,70 р,<0,01 Рз<0,05

Стимулированная ФГА 268,60*34,20 328,60*26,70 965,12±52,97 р,<0,01 949,55*46,22 р,<0,01 896,67±47,83 р,<0,01 759,3 8±40,26 Р.<0,01

Концентрация гранзима В, пг/мл 1168,14*77,30 1341,54±84,60 634,56*27,51 Р1<0,05 972,58±53,57 р2<0,01 888,46*32,15 Рз<0,01 819,23±119,79

АЗКЦ 23,40*1,20 24,00*1,60 38,43*1,50 р,<0,01 30,86*1,10 Pi<0,05 р2<0,05 39,57±1,90 р,<0,01 24,43±1,02 р3<0,05 р2<0,05

Примечание. Р] - уровень статистической значимости различий по сравнению с аналогичными показателями у здоровых детей соответствующего возраста, Рг — у детей соответствующего возраста, в острый период болезни, Рз — у группы детей, больных инфекционным мононуклеозом 1-6 лет, Р4 — по сравнению со спонтанной продукцией цитокина у детей, больных инфекционным мононуклеозом соответствующего возраста.

р=0,03) и положительно коррелировал с относительным количеством CD8+ лимфоцитов (г=0,63; р=0,05) в крови. Такого рода зависимость указывает на TNFa-опосредованный цитотоксический эффект CD8+ Т-клеток, активно секретирующих данный фактор (наряду с TNF0) при вирусных инфекциях. Кроме того, CD4+- и СБ8+-цитоз при ИМ может рассматриваться как проявление компенсаторной активации антивирусного потенциала системы цитотоксических лимфоцитов в условиях дефицита их TNFa-секреторного ответа (по результатам оценки секреции TNFa при стимуляции ФГА, которая была ниже базальной) (табл. 2).

TNFa проявляет свою биологическую активность при связывании со специфическим высокоаффинным мембранным рецептором. TNF-RI, известный также как CD120a, экспрессируется клетками большинства типов тканей. Результаты проведенного исследования свидетельствуют, что количество TNF-RI-презентирующих лимфоцитарных клеток у детей, больных ИМ, возрастало и сохранялось таковым (при еще более выраженном его повышении) в фазу клинического выздоровления. Таким образом, можно думать, что увеличение числа TNF-RI-несущих клеток в крови сопряжено с активацией апоптоза лимфоцитов и цитотоксическим эффектом Т-клеток при ИМ.

Между тем, индукция выброса TNFa при инфицировании вирусами происходит не только напрямую, но и опосредованно через IFNy. IFNy -основной интерферон, продуцирующийся активированными лимфоцитами. Преимущественно его секретируют натуральные киллеры и (в меньшей степени) Т-клетки и под действием IL-12.

Низкая базальная продукция IFNy in vitro у детей 1-6 лет в острый период ИМ, по всей видимости, связана с недостаточностью его синтеза прежде всего NK-клетками - основными продуцентами IFNy. Кроме того, первые годы жизни у детей характеризуются более низким уровнем фоновой и стимулированной продукции IFNy (основного медиатора клеточного иммунитета), чем у взрослых людей, а клеточные рецепторы к нему функционально малоактивны [Иванова В.В., 2005]. Отмеченное нами повышение уровня продукции IFNy у детей дошкольного возраста на этапе раннего выздоровления по сравнению с фазой манифестации инфекции в сочетании с положительной корреляционной связью между показателями спонтанного синтеза IFNy и абсолютного числа CD8+ лимфоцитов в крови у детей 1-6 лет с ИМ (г=0,79, р=0,03) в этот период может свидетельствовать об активации EFNy-секретирующей функции Т-клеток.

Наряду с продукцией IFNy у детей с ИМ была оценена экспрессия на лимфоцитах специфического рецептора к данному цитокину. При этом обнаружено, что у детей в острый период ИМ независимо от их возраста абсолютное и относительное содержание CD119+ лимфоцитов в крови

повышалось. В период рекоивалесцеиции оно снижалось (сравнительно с предыдущим этапом), но не достигало контрольных значений.

Трансформирующий фактор роста (TGF) Р - одна из наиболее важных известных иммуносупрессорных молекул, представляющая собой гомодимерный белок. Фактор подавляет гемопоэз, формирование цитотоксических NK- и Т-клеток, ответ лимфоцитов на 1L-2, IL-4 и IL-7, синтез провоспалительных цитокинов. Этим, возможно, и объясняется подавление TNFa- и INF-у-секретирующей активности лимфоцитов крови на фоне гиперпродукции TGF-P при ИМ.

Так, в острый период ИМ у детей обеих возрастных групп базальная и стимулированная секреция TGF-P in vitro была в несколько раз выше нормы (табл. 2). В фазу клинического выздоровления базальный уровень продукции TGF-P становился ниже, чем в острый период болезни как у детей 1-6 лет, так и у детей школьного возраста, но оставался выше контрольных значений. Стимулированная ФГА продукция TGF-P в период реконвалесценции не отличалась от значений в острый период и по-прежнему превышала норму (табл. 2).

В то же время показано, что противовоспалительный цитокин TGF-P способен снижать репликацию ВЭБ за счет регуляции продукции провоспалительных цитокинов IL-ip, IL-6 и TNFa, что позволяет судить о повышении его секреции при ИМ у детей также как о защитно-приспособительном механизме [Ohno Т., 2009].

Как известно, гранулы натуральных киллеров и цитотоксических Т-клеток содержат летальный агент — мембранолитический белок «перфорин» и сериновые протеазы, образующие семейство гранзимов. Порообразующие перфорины могут при определенных условиях индуцировать лизис клеток-мишеней, но не межнуклеосомную фрагментацию ДНК, характерную для апоптоза. Для этого необходим гранзим В, являющийся компонентом цитоплазматических гранул, секретируемых цитотоксическими Т-лимфоцитами или NK-клетками [Metkar S., 2008].

У детей в возрасте 1-6 лет, больных ИМ, в фазу выраженных клинико-гематологических проявлений заболевания было отмечено снижение (по сравнению с нормой) сывороточной концентрации гранзима В. В фазу клинического выздоровления у детей 1-6 лет уровень гранзима В в сыворотке крови нормализовался (табл. 2).

Цитотоксические эффекты перфорина и гранзима характеризуют, главным образом, активность CD8+ и CD16+ лимфоцитов. При этом, по результатам проведенного корреляционного анализа, у детей 1-6 лет с ИМ уровень продукции гранзима В оказался в обратной зависимости от относительного содержания CD8+ лимфоцитов (г=-0,51; р=0,05) в крови, что свидетельствует о недостатке функциональной активности преимущественно

цитотоксических CD8+ Т-клеток. Возможно, дефицит гранзима В -компонент стратегии вируса, направленный на блокирование перфоринового механизма уничтожения зараженных клеток [Alliston, Т., 2001].

Еще одним механизмом NK-опосредованной цитотоксичности, сходным по своей сути с перфорин-гранзимовым киллингом, является антителозависимая клеточная цитотоксичность (АЗКП). Она служит своеобразным отражением связи между гуморальным и клеточным звеньями иммунной системы, в которой гуморальные антитела выступают в роли «наводчиков» клеток-эффекторов на клетки-мишени, несущие чужеродные антигены [Зимин Ю.И. и соавт., 1983; Оловникова Н.И., 2006].

В острый период ИМ значения АЗКЦ у детей 1-6 лет и 7-14 лет превышали показатели у здоровых детей аналогичного возраста. В фазу клинического выздоровления у детей, больных ИМ, отмечалось достоверное снижение активности АЗКЦ по сравнению с острым периодом болезни, но у детей 1 -6 лет она все же оставалась выше нормы (табл. 2).

Данный факт свидетельствует об активации антителозависимых цитотоксических свойств натуральных киллеров при ИМ, что имеет место и при других вирусных инфекциях.

Таким образом, вирусы способны модулировать иммунный ответ хозяина, что приводит к развитию вторичного иммунодефицита, проявляющегося дисбалансом иммунологических функций (рис. 1). Результаты исследования свидетельствуют об активации цитолитических свойств CD16+ киллеров и апоптогенной функции Т- и NK-лимфоцитов при ИМ. Снижение же концентрации гранзима В в сыворотке крови и дефицит стимулированной продукции IFNy и TNFa в условиях гиперсекреции TGFP характеризует супрессию или, что также вероятно, истощение функционального резерва лимфоцитарных клеток с киллерной активностью.

ВЫВОДЫ

1. Клинико-гематологическая манифестация инфекционного мононуклеоза у детей 1-6 и 7-14 лет характеризуется повышением абсолютного содержания CD4+, CD8+ и CD161 лимфоцитов в крови с тенденцией к его нормализации в фазу реконвалесценции. При этом увеличение относительного числа CD16 клеток в крови у детей обеих возрастных групп сопровождает течение инфекционного мононуклеоза, вызванного вирусом Эпштейна-Барр, в то время как повышение процентного содержания CD4+, CD8+ лимфоцитов обнаруживается только у детей 1-6 лет вне связи с этиологией заболевания.

2. Об активации цитолитических свойств СВ16+-киллеров и апоптогенной функций Т- и NK-клеток в острый период инфекционного мононуклеоза у

Эпштейна-Барр-вирусиая инфекция

I

Пролиферация и активация СБ16+ ЫК-клеток

Активация АЗКД

Пролиферация и активация СБ4+, СБ8+Т-лимфоцитов

Вирус-индуцированная трансформация лимфоцитов

«Атипичные мононуклеары»

А

Гиперэкспрессия СБ95Ь

Активация секреции и рецепции

I

Гиперэкспрессия С095 на лимфоцитах

Активация Баз-, ЮТ-Щ-зависимого апоптоза лимфоцитов

Уничтожение инфицированных клеток —> элиминация вируса

Истощение функционального резерва лимфоцитов-киллеров

Гипопродукция гранзима В

Гиперсекреция ТОБР СВ4+, С138+Т-лимфоцитами

Гипопродукция Ш^у, Т№а

Нарушение секреторного (перфорин-гранзимового) лизиса инфицированных клеток

Вирус-индуцированная иммуносупрессия

Рис. 1. Схема иммунопатогенеза инфекционного мононуклеоза (по результатам проведенного исследования)

детей свидетельствуют усиление антителозависимой клеточной цитотоксичности и повышенное содержание в крови лимфоцитов, экспрессирующих annexin V, TNF-RI (в условиях базальной гипериродукции TNFa у детей 7-14 лет) и маркеры Fas-зависимого апоптоза (CD95L+, CD95+).

3. Снижение реактивности цитотоксических Т-лимфоцитов и NK-клеток в условиях гиперсекреции TGFP при инфекционном мононуклеозе у детей проявляется дефицитом гранзима В в сыворотке крови (у детей 1-6 лет), стимулированной продукции in vitro IFNy (у детей обеих возрастных групп в сочетании с низкой базальной секрецией цитокина у детей 1-6 лет) и TNFa (у детей 1-6 лет) на фоне компенсаторного повышения экспрессии на клетках цитокиновых рецепторов CD119, CD120a.

4. Дисбаланс реакций лимфоцит-опосредованной цитотоксичности при инфекционном мононуклеозе у детей сопряжен с этиологией и фазой заболевания, возрастными особенностями организма. Он наиболее выражен в острый период, чем в фазу реконвалесценции, а также у детей 1-6 лет, чем у детей 7-14 лет. При этом изменения субпопуляционного состава лимфоцитов (CD4+, CD8+, CD164) наиболее существенны при Эпштейна-Барр-вирусном мононуклеозе, а уровень экспрессии лимфоцитарными клетками апоптозного (CD95) и цитокиновых (CD119, CD 120а) рецепторов выше при инфекционном мононуклеозе другой этиологии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Изменения продукции противовоспалительных цитокинов при хронической герпесвирусной инфекции / И.О. Наследникова, В.И. Решетников, О.И. Уразова, Н.Р. Залялиева и др. // Материалы VI Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней - 2007» (Москва, 28-30 ноября 2007 г.). - Москва, 2007. - Т. 3.-С. 333-334.

2. Цитотоксические реакции лимфоцитов крови у детей, больных инфекционным мононуклеозом / Н.Р. Залялиева, 'О.И. Уразова, А.П. Помогаева и др. // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2008. - №2. -С. 35-38.

3. Залялиева Н.Р., Уразова О.И., Скареднева М.Н. Цитокинпродуцирующая активность лимфоцитов периферической крови у детей с инфекционным мононуклеозом // Материалы IX конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 22-23 мая 2008 г.). -Томск: СибГМУ, 2008.-С. 122-123.

4. Цитотоксическая активность лимфоцитов периферической крови при инфекционном мононуклеозе у детей / Н.Р. Слепичева, О.И. Уразова, В.В. Новицкий, А.П. Помогаева // Бюллетень сибирской медицины. - 2009. - №4. -С. 64-69.

5. Особенности иммуносупрессии при вирусных инфекциях / Е.Г. Чурина, О.И. Уразова, В.В. Новицкий, Н.Р. Слепичева и др. // Бюллетень сибирской медицины. - 2009. - №4. - С. 112-117.

6. Слепичева Н.Р., Уразова О.И., Помогаева А.П. Реакция клеточной цитотоксичности у детей при инфекционном мононуклеозе / Материалы VIII российско-германской научно-практической конференции «Инновации в медицине. Социально значимые инфекции» (Новосибирск, 12-13 ноября 2009 г.). - Новосибирск, 2009. - С. 169-170.

7. Апоптогенная активность лимфоцитов периферической крови при инфекционном мононуклеозе / Н.Р. Слепичева, О.И. Уразова, В.В. Новицкий, А.П. Помогаева // Актуальные проблемы инфекционной патологии: Материалы Российской научно-практической конференции, посвященной 85-летию кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии Сибирского государственного медицинского университета (Томск, 18-19 ноября 2009 г.). -Томск, 2009.-С. 155-157.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АЗКЦ - антителозависимая клеточная цитотоксичность ВЭБ - вирус Эпштейна-Барр ИМ - инфекционный мононуклеоз

ИМ-ВЭБ - инфекционный мононуклеоз, вызванный вирусом Эпштейна-Барр

ИМД - инфекционный мононуклеоз другой (неВЭБ) этиологии

ФГА - фитогемагглютинин

ЦТЛ - цитотоксические лимфоциты

CD - cluster of differentiation (кластер дифференцировки клетки)

Fas-R - Fas-receptor (Fas-рецептор)

Fas-L - Fas-Iigand (Fas-лиганд)

IFNy - interferon у (интерферон гамма)

IL - interleukin (интерлейкин)

NK - natural killers (натуральные или естественные киллеры) TNFa - tumor necrosis factor а (фактор некроза опухолей альфа) TNF-R - TNF-receptor (TNF-рецептор)

TGFp - transforming growth factor p (трансформирующий фактор роста бета)

Отпечатано в ООО «НИП» . Томск, ул. Советская, 47, «Штемпельная мастерская» . тел.: (3822) 53-14-70; 52-83-10 Заказ 824-11, Тираж 100 экз.

Актуальность исследования. По мнению экспертов Всемирной организации здравоохранения, XXI век станет веком оппортунистических инфекций. Ежегодно в России регистрируется около 30-40 млн. инфекционных больных, до 80% населения Земли инфицировано вирусами семейства герпеса. Детский организм имеет большую восприимчивость к инфекционным факторам, поэтому смертность от инфекционных болезней у детей составляет около 63%. К одной из наиболее актуальных детских инфекций относится инфекционный мононуклеоз. Этиологическим фактором инфекционного мононуклеоза в подавляющем большинстве случаев является вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ). Реже мононуклеоз вызывают другие вирусы (вирусы простого герпеса, цитомегалии, кори, краснухи) и Toxoplasma gondii [Помогаева А.П. и соавт., 2003; Иванова В.В., 2005; Потарская Е.В. и соавт., 2006; Краснов В.В., 2007].

ВЭБ обладает тропностью к эпителиальным клеткам носоглотки и к иммунокомпетентным клеткам крови - лимфоцитам, моноцитам/макрофагам, нейтрофилам. В-лимфоциты после внедрения вируса в геном трансформируются в ВЭБ-презентирующие клетки и приобретают способность к неограниченной пролиферации, в результате чего вирус может длительно персистировать в организме, приводя тем самым к структурно-функциональной дезорганизации и истощению иммунной системы [Харламова Ф.С. и соавт., 2006; Mendes Т. et al., 2008].

Эффективный иммунный ответ на внедрение ВЭБ включает гуморальный и клеточный компоненты. Формируются нейтрализующие ВЭБ антитела (IgM и IgG) к капсидному, раннему, мембранному, нуклеарному антигенам. Элиминация вируса и инфицированных клеток осуществляется за счет естественных клеток-киллеров, CD8+ и CD4+ Т-лимфоцитов. Т-клетки вырабатывают цитотоксические медиаторы и вызывают Fas/Fas-L-опосредованный апоптоз зараженных В-лимфоцитов. Однако ВЭБ может противодействовать иммунитету макроорганизма, создавая «дружественное» микроокружение, и выживать в организме хозяина в течение всей его жизни. Вирус вызывает усиление экспрессии Fas (CD95) на CD4+ и CD8+ лимфоцитах и Fas-L на B-лимфоцитах, что ведет к гибели Т-клеток, в основном Т-клеток памяти. Данный процесс может лежать в основе клеточно-опосредованной транзиторной иммуносупрессии [Рыжов C.B., Новиков В.В., 2002; Жукова О.Б. и соавт., 2002, 2006; Андреева A.A., 2006; Scherrenburg J. et al., 2008; Ito Y., 2009].

В связи с этим, изучение роли лимфоцитов-киллеров при инфекционном мононуклеозе представляется важным как для понимания иммунопатогенеза заболевания, так и для создания средств специфической профилактики вызываемой вирусом дизрегуляции системы специализированных клеток-киллеров и хронизации инфекционного процесса.

Цель исследования: выявить особенности и патогенетические факторы функционального дисбаланса цитотоксических Т-лимфоцитов и NK-клеток крови у детей при инфекционном мононуклеозе.

Задачи исследования:

1. Оценить экспрессию CD4, CD8, CD16, CD119, CD120a лимфоцитами периферической крови и продукцию интерферона (IFN) у, фактора некроза опухоли (TNF) а, трансформирующего фактора роста (TGF) ß in vitro у детей 1-6 и 7-14 лет, больных инфекционным мононукггеозом Эпштейна-Барр-вирусной и другой этиологии, в период разгара и фазу ранней реконвалесценции.

2. Охарактеризовать апоптоз-индуцируюгцую и цитолитическую активность Т-лимфоцитов и NK-клеток (натуральных киллеров) периферической крови у детей в возрасте 1-6 и 7-14 лет при инфекционном мононуклеозе, вызванном вирусом Эпштейна-Барр и другими возбудителями, в период клинико-гематологической манифестации и на этапе выздоровления.

3. Установить общие закономерности, особенности и патогенетические факторы нарушений лимфоцит-опосредованной цитотоксичности у детей, больных инфекционным мононуклеозом, в зависимости от возрастных особенностей организма, этиологии и фазы заболевания.

Научная новизна. Оценены реакции цитотоксических Т-лимфоцитов и NK-клеток периферической крови у детей при инфекционном мононуклеозе Эпштейна-Барр-вирусной и другой этиологии в динамике заболевания. Получены данные о том, что у детей 1-6 и 7-14 лет, больных инфекционным мононуклеозом, наряду с повышением абсолютного содержания CD4+, CD8+ и CD16+ лимфоцитов в крови в фазу клинико-гематологической манифестации (с тенденцией к его нормализации в фазу реконвалесценции), отмечается усиление антителозависимой клеточной цитотоксичности и повышенное содержание в крови лимфоцитов, экспрессирующих CD95, CD95L, TNF-RI и annexin V. Данные изменения свидетельствует об активации цитолитических свойств CD 16+-киллеров и апоптогенной (Fas- и TNF-RI-зависимой) функции Т- и NK-клеток. При этом дефицит сывороточной концентрации гранзима В и стимулированной продукции IFNy и TNFa in vitro на фоне компенсаторной гиперэкспрессии рецепторов цитокинов CD 119, CD 120a характеризуют снижение функционального резерва цитотоксических (по данным корреляционного анализа, преимущественно CD8+) лимфоцитов, что в условиях гиперпродукции TGFp может быть определено как проявление иммуносупрессорного эффекта. Обосновано, что дисбаланс реакций лимфоцит-опосредованной цитотоксичности при инфекционном мононуклеозе у детей сопряжен с этиологией и фазой заболевания и является более выраженным у детей в возрасте 1-6 лет. При этом изменения субпопуляционного состава лимфоцитов с цитотоксической активностью наиболее значимы при инфекционном мононуклеозе, вызванном вирусом Эпштейна-Барр, а уровень апоптогенного действия Т- и NK-клеток - при инфекционном мононуклеозе другой этиологии.

Практическое и теоретическое значение работы. Новые знания о механизмах дисфункции цитотоксических лимфоцитов и естественных клеток-киллеров у детей 1-6 и 7-14 лет при инфекционном мононуклеозе

Эпштейна-Барр-вирусной и другой этиологии в острый период и фазу ранней реконвалесценции могут быть использованы для разработки дифференциальных патогенетических подходов к иммунокорригирующей терапии, для профилактики индуцированных вирусом нарушений цитоповреждающего действия специализированных «клеток-убийц» и хронизации инфекционного процесса.

Положения, выносимые на защиту:

1. Развитие инфекционного мононуклеоза у детей сопровождается увеличением числа CD4+, CD8+, CD 16+лимфоцитов в крови, активацией их апоптогенной и антителозависимой цитолитической функций в сочетании с истощением резерва продукции цитотоксических медиаторов. Структурно-функциональный дисбаланс клеток сохраняется в фазу ранней реконвалесценции, а его выраженность зависит от этиологии заболевания и возрастных особенностей организма.

2. Наиболее существенные изменения субпопуляционного состава лимфоцитов (CD4+, CD8+, CD16+) формируются у детей 1-6 лет при инфекционном мононуклеозе, вызванном вирусом Эпштейна-Барр. При этом уровень экспрессии лимфоцитами CD95, CD95L и TNF-RI, характеризующий наряду с увеличением количества annexin V4" клеток способность цитотоксических Т- и NK-лимфоцитов к индукции апоптоза, выше при инфекционном мононуклеозе другой этиологии.

3. Супрессия Т- и NK-клеточной цитотоксичности в условиях гиперсекреции TGFp при инфекционном мононуклеозе у детей проявляется дефицитом гранзима В в сыворотке крови и стимулированной продукции IFNy, TNFa in vitro на фоне компенсаторной активации экспрессии CD 119-, CD 120a-рецепторов цитокинов.

Реализация и апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на 66-й, 67-й научных студенческих конференциях им. Н.И. Пирогова (Томск, 2007, 2008), VIII Конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2008), VIII международной российско-германской конференции «Инновации в медицине. Социально значимые инфекционные заболевания» (Новосибирск, 2009), Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии», посвященной 85-летию кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (Томск, 2009) и научно-образовательных семинарах при Центре компетенции по проблеме инфекционных болезней им. И.И. Мечникова и Р. Коха ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (Томск, 2008, 2009). Основные положения и выводы диссертации используются в учебном процессе в ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава на кафедре патофизиологии в разделах «Патофизиология клетки», «Патофизиология иммунитета», «Патофизиология системы крови» и на кафедре детских инфекционных болезней в лекционных и практических курсах по теме инфекционного мононуклеоза.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, 3 из которых в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4-х глав, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 1 рисунком и 7 таблицами. Библиографический указатель включает 188 источников, из них 115 отечественных и 73 зарубежных авторов.

ВЫВОДЫ

1. Клинико-гематологическая манифестация инфекционного мононуклеоза у детей 1-6 и 7-14 лет характеризуется повышением абсолютного содержания CD4+, CD8+ и CD16+ лимфоцитов в крови с тенденцией к его нормализации в фазу реконвалесценции. При этом увеличение относительного числа CD16+ клеток в крови у детей обеих возрастных групп сопровождает течение инфекционного мононуклеоза, вызванного вирусом Эпштейна-Барр, в то время как повышение процентного содержания CD4+, CD8+ лимфоцитов обнаруживается только у детей 1-6 лет вне связи с этиологией заболевания.

2. Об активации цитолитических свойств CD 16+-киллеров и апоптогенной функций Т- и NK-клеток в острый период инфекционного мононуклеоза у детей свидетельствуют усиление антителозависимой клеточной цитотоксичности и повышенное содержание в крови лимфоцитов, экспрессирующих annexin V, TNF-RI (в условиях базальной гиперпродукции TNFa у детей 7-14 лет) и маркеры Fas-зависимого апоптоза (CD 95L+, CD95L).

3. Снижение реактивности цитотоксических Т-лимфоцитов и NK-клеток в условиях гиперсекреции TGF0 при инфекционном мононуклеозе у детей проявляется дефицитом гранзима В в сыворотке крови (у детей 1-6 лет), стимулированной продукции in vitro IFNy (у детей обеих возрастных групп в сочетании с низкой базальной секрецией цитокина у детей 1-6 лет) и TNFa (у детей 1-6 лет) на фоне компенсаторного повышения экспрессии на клетках цитокиновых рецепторов CD119, CD120a.

4. Дисбаланс реакций лимфоцит-опосредованной цитотоксичности при инфекционном мононуклеозе у детей сопряжен с этиологией и фазой заболевания, возрастными особенностями организма. Он наиболее выражен в острый период, чем в фазу реконвалесценции, а также у детей 1-6 лет, чем у детей 7-14 лет. При этом изменения субпопуляционного состава лимфоцитов (CD4+, CD8+, CD16+) наиболее существенны при Эпштейна-Барр-вирусном мононуклеозе, а уровень экспрессии лимфоцитарными клетками апоптозного (CD95) и цитокиновых (CD 119, CD 120a) рецепторов выше при инфекционном мононуклеозе другой этиологии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Инфекционный мононуклеоз относится к числу наиболее распространенных инфекционных заболеваний человека, что определяет актуальность изучения его клинических особенностей и патогенеза. Инфекционный мононуклеоз (ИМ) - антропонозная инфекция, возбудителем которой в большинстве случаев заболевания является вирус герпеса 4-го типа - вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ). В настоящее время во всем мире отмечается увеличение количества больных ИМ.

ВЭБ обладает широким спектром уникальных биологических свойств -способностью к долговременной (нередко пожизненной) персистенции, супрессии иммунного ответа, трансформации и угнетению апоптоза клеток-мишеней, что является частью стратегии возбудителя, определяющей его длительное, незаметное присутствие в организме и способность к активной вирусной репродукции даже в условиях полноценно функционирующей системы иммунитета.

Ведущая роль в иммунопатогенезе персистентных вирусных инфекций в целом и ИМ в частности принадлежит лимфоцитам. При этом центральная роль в элиминации вируса и инфицированных клеток при ИМ отводится Т-клеточному ответу, в том числе цитотоксическим и естественным клеткам-киллерам, основными формами цитотоксичности которых являются секреция цитокинов, перфорингранзимовый механизм и опосредованный антителами киллинг. Кроме того, показана способность цитотоксических CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов к индукции апоптоза.

Таким образом, очевидно, что изучение роли цитотоксических лимфоцитов в патогенезе ИМ имеет большую значимость не только с фундаментальной точки зрения, но и с практической, поскольку полученные знания могут быть использованы для создания эффективных методов иммунокоррегирующей терапии, а также для предупреждения индуцированных вирусом нарушений цитоповреждающего действия специализированных «клеток-убийц» и дальнейшей хронизации инфекционного процесса.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Характеристика групп обследованных

Обследовано 59 детей в возрасте от 1 года до 14 лет, больных инфекционным мононуклеозом (ИМ) средней степени тяжести, в период развернутой клинико-гематологической картины заболевания и в период ранней реконвалесценции (в среднем через 7 дней от начала болезни). Все дети, больные ИМ, находились на лечении в инфекционном отделении больницы им. Г.Е. Сибирцева г. Томска. Возрастно-половая характеристика детей, больных ИМ, представлена в табл. 1. Диагноз заболевания устанавливался по характерной клинико-гематологической картине и лабораторным данным. Возбудителя ИМ идентифицировали выявлением в сыворотке крови больных ДНК вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ) методом ПЦР и антител к антигенам ВЭБ. Определяли IgM к капсидному антигену (УСА-1^М), ^О к раннему антигену (ЕА ^С) и к ядерному антигену (ЕВЫА ^в) иммуноферментным методом с использованием стандартных тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск), обнаружение которых свидетельствует о первичной ВЭБ-инфекции.

Большая часть больных ИМ (54,2%) была госпитализирована в марте-мае, 42,4% — в сентябре-ноябре, 3,4% - в другие месяцы года. Подавляющее большинство обследованных больных ИМ - дети дошкольного возраста (76,3%), преимущественно мальчики (72,9%). В г. Томске проживало 98,3% детей, больных ИМ, 1,7% - в сельской местности.

У обследованных больных ИМ определялась среднетяжелая форма заболевания (100%). Гладкое течение ИМ было зарегистрировано у 62,7%, негладкое — у 37,3% больных. Клиническая картина ИМ характеризовалась наличием симптомов интоксикации, лимфаденопатии, воспалительными изменениями в ротоглотке, поражением носоглоточной миндалины, гепато- и спленомегалией.

Дети, больные ИМ, в крови которых были обнаружены маркеры ВЭБ