Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Цитостатическое действие резидентных макрофагов и их растворимых продуктов на нормальные, трансформированные и опухолевые клетки

РГ6 од

{] I НОП ^РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НА/К ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи

БУРДЕЛЯ ЛЯДИИЛА ГЕРАСИНОйИА

ЦИТОСТАТИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ РЕЗИДЕНТНЫХ МАКРОФАГОВ И ИХ РАСТВОРИМЫХ ПРОДУКТОВ НА НОРМАЛЬНЫЕ, ТРАНСФОРМИРОВАННЫЕ И ОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТКИ

14.00.14 - Онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1993

/

- " •/' } / / Xх

Робота выполнена в лаборатории противоопухолевого иммунитета НИИ канцерогенеза Онкологического научного центра РАМН

Научный руководитель - доктор медицинских наук Дейчион Г.И. Официальные оппоненты: доктор медицинских наук Суслов А.П.

кандидат биологических наук Амфалова Т.В.

Ведущее учреждение - НИИ Иммунологии МЗ России

Защита диссертации состоится " 2. " ^^-СЬ^рЛ^ 1983 г. нв заседании специализированного Ученого Совета К.001.17.01. Онкологического научного центра РАИН (Москва, Каширское о. 24).

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке ОНЦ РАМН.

£ . иОл

Автореферат разослан ' 1993 г.

Ученый секретарь Совета, доктор медицинских наук

в. С. Туру ".Ой

ОЕЩЛП ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. К основным проблемам фундаментальна,! онкологии относятся механизмы трансформации клеток и прогрессии опухоли, а также реакции эффэкторных систем организма на

возникновение и рост опухоли.

При во жкновении трансформированных клеток ь организме, макрофаги (Мф) являются одними из первых клеток, реагирующих на их появление. Механизм распознавания опухолевых клеток Мф остается недостаточно выясненными (Суслов А.П, 1990, te Velde A., Figdor С. 199Z).

В последние годы накапливается все больше данных о - способности Мф при непосредственном контакта подавлять размножение, г.е. оказывать цитостатическое действие (ЦСД) на многие типы опухолевых клеток-мишеней (КМ) различного происхождения. Как правило, ЦСД Мф не затрагивает нормальные клетки или даже происходит стимуляция их роста. При этом активация Мф делает их способными не только останавливать пролиферацию, но также убивать (лизировать) некоторые типы трансформированный* и опухолевых клоток.

Существенно меньше исследовано ЦСД неактивированных резидентных "Мф; до настоящего времени имеются лишь единичные сообщения о ЦСД таких Мф, почти не исследована феноменология ЦСД неактиаированных Мф. Такиэ вопросы, как эффективность ЦСД, необходимость непосредственного контакта и КМ и/или продукция Мф растворимь!х цитостатических факторов (фактора) (ЦСФ), зависимость эффекта от дозы Мф, оптимальное бремя дпп проявления ЦСД, чувствительность различных типов опухолевых КМ к ЦСД Мф и ее возможная связь со злокачественными свойствами "КМ, свойства ЦСФ Мф и их идентификация о известными ЦСФ, сокретируемыми активированными Иф, - асе эти вопросы оставались недостаточно исследованными до настоящего времени. Между тем, интерес к ЦСД неактивированных Мф определяется тем, что ..ненно они являются (наряду о НК- „лотками, нейтроф 1ами и монацитами) посущаству первым элитным

барьером организма для роста трансформированных и .»пухопевых клеток , * *

ir» vivo. Нам представлялось, «то исследование ссох вышеперечисленных вопросов позволит получить то исходные характеристики цед

ноакiийирйванныл Мфкоюрий необходимы доя последующий идентификации факторов и механизмов этого эффекта.

Целью настоящего исследования явилось изучениа ЦСД неактивированных резидентных Мф и их растворимых продуктов на нормальные и опухолевые клетки разной степени злокачественности.

Задачи исследования. . '

1. Изучение способности неактивированных перитонаапьных макрофагов сирийского хомяка оказывать ЦСД на пролиферируимцие кпатки.

2. Нее» дование возможных ' механизм; ЦСД неактиеированных перитонеальных Нф сирийских хомяков, одним из которых является выделение в среду растворимого цитостатического фактора (факторов).

3. Изучение свойств ЦСФ и условий его продукции.

4. Сравнение по чувствительности к ЦСД иеактиеироваиных Мф и и*

, i •

ЦСФ нормальных и трансформированных In vitro (различными агентами! клеток, а также клеток разной степени злокачественности, полученных в результате их отбора 1' vivo.

Научная новизна. Впервые, в работе на большом материале показана способность иеактиеироваиных резидентных Мф сирийского хомяка оказывать цитостатическов противоопухолевое деиигвие и определены количественные параметры этого эффекта. Создана модель дли исследования возможных механизмов'ЦСД неактиеированмых Мф сирииских хряков, включающая использование высокочувствительных кпаток штамма ХЭТР. Обнаружено выделение иеактиаированными Мф растворимого ЦСФ. Охарактеризованы некоторое юйстеа ЦСФ и условия его секреции, которые в дальнейшем могут оказаться важными дня идентификации этих факторов. При сравнении чувствительности к ЦСД иеактиеироваиных Мф и их ЦСФ ниэкозлокачественных спонтанно трансформированных 1л vitro клеток штамма ХЭТР и полученных в результате их отбора In Vivo вариантов показано, что отбор 1п vivo высокотуморогенных и высокометастатических вариантов этого штамма, как правило, коррелирует со снижением чувствительности отобранных клаток к ЦСД Мф и их Су. Корреляция между злокачественностью опухолевых клет. ,. и резистентностью к ЦСД активированных Мф описана многими авторами, но

о этой работе она впервые продемонстрирована в отношении

i

ипактивировамнмх резидентных Мф.

ГТрсктичоская ценность. Получанные данные расширяют представпение о способности ноактивированных макрофагов и их растворимых продуктов оказывать ЦСД на пролиферирущие клетки, различающиеся по уровню злокачественных свойств и, возможно, пос- -жит исходными характеристик." -л ЦСД неактиаированных Мф, необходимыми для понимания механизмов этого эффекта.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано в работ. Апробпция диссертации. Основные попожения работы доложены на Всесоюзном совещании "Клеточныа и молекулярные механизмы канцерогенеза и амтиканцерогенеэа" в Ленинграде (1.988), на международной школа иммунологов им. Дж. Хамфри в Румынии (191.), паборпторнсй и меж лабораторной конференциях НИИ Канцерогене за ОИЦ РАИН в 1991-1993 г.

ОбЬем и структура работы. Материал диссертации изложен на 154 страницах машинописного текста, включая указатель литературы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной •тети исследований, изложенной о 5 главах, обсуждении результатов и выводов. Экспериментальный материал г едставлен в 21 таблицах и б рисунках. Указатель литературы содержит 147 работ отечественных и зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Набор •клеточных пиний

сирийского хомяка, исследованных в работе, включает:

ХЭ - нормальные эмбриональные клетки сирийского хомяка;

ХЭТР - спонтанно трансформированные 1r> vitro эмбриональные клетки

3

сирийского хомяка, низкотуморогенныа (прививочная доза >10 клеток) и низкометастатичьские;

хэтр-123 - низкозлокачветвенный отобранный iri vivo вариант хэтр; хэтр-млн-1, хэтр-мпн-4, хэтр-млн-в, хэтр-млн-а, хэтр-74/ib, ХЭТР-75/18 и хэтр-83/20 отобранные in vivo высокотуморогенные и

высокомотастатические варианты ХЭТР; ;

• *

X3T-SR - эмбриональные клетки сирийского хомяка,• трансформированные 1n vitro вирусом саркомы Рауса \итамм Шммдт-Руппин (BCP-UiP), высокие

i , liu^oíbiiiiuct L ii ¿ксперимвн i ajillldh mstttc'l а ги чйскан &к"гиб|юс i u киторыл

возникают в результате вирусной трансформации и не связаны с отбором In vivo;

ХЭТ-SR-l - 1брионапьные клетки сирийского хомяка, трансформированные in vitro ВСР-ШР, высокотуморогенные и обладающие, в отлична от клеток штамма ХЭТ-БЯ, спонтанной метастатической актионоотыо; L929 - трансформированные мышиные фибробласты, характеризующиеся высокой чувствительность» к TNF-a.

В качестве эффекторов испсльзоза>..\ естественную популяцию клаток леригонеального экссудата (КПЗ), полученную путем промывания Брюшной полости интактиых сирийских хомяков ростовой средой» или резидентные перитонеальные Мф, полученные из КПЗ после их адсорбции на пластике и последующего интенсивного отмывания^еприлипающих клеток. Большинство оставшихся на пластике клеток составляли Мф (более 93 % при окраске по методу Гимза). Для получения ЦСФ через разные с эки поел© отмывания неприпипаящи* клеток супернвтанты (Су) исследуемых Мф переносили в пробирки, центрифугировали при 1000 об/мин 10 мин или фильтровали (0.45 мкм)'и добавляли к предварительно noca* <мым КМ,

Определение цитостатической активности (ЦСА) Мф и их супернатантоо проводили с помощью двух модификаций цитостатического теста - по включению ЗН-тимидина в КМ и непосредственным подсчетом количества КМ ч лунках.

При определении ЦОД мф и их Су по вктечении» ЗН-тимидина за 4 ч до окончания совместного куль.ивирования Зф (или Су) и КМ в лунки вносили по 50 мкл раствора ЗН-тимидина 5 мкКи/мл ( 0.26 мкКи/ лунку, удельная активность 6 Ки/ммоль, "Изотоп", Россия).

По окончании времени инкубации сдоду из лунок удаляли, а КН обрабатывали раствором версена или трипсина. Метку, включившуюся в ДНК, считали, перенося опухолевые клетки на стекловолокнистые фильтры с помощью автоматического сборщика клеток ("Cell Harveater", "LKB", Швеция), и выделяя кислогонерастворимум фракцию с помадьд трихлоруксусной кислоты о последующей обработкой фильтров спиртом ^ тщательным высушиванием Перед помещением во флаконы сс сцинтилляционной жидкостью (КС-а). Для просчета включения ftef/o

лспопьзовапи /?-счетчик ('ХКВ, ИаПас 1219 РаскЬе1а", Ш»еция).

Результаты ЦСД выражены в процентах подавления включения метки в КМ -

«онтакте с Эф или их Су по сравнению с интактными КМ

(культивированные баз Эф) по формуле:

- 1 включение ЗН-тимидина а КМ в присутствии Эф или ЦСФ ^ включение ЗН-тимидина интактными М Как правило,включение меченого тимидина в КПЗ (или в Мф) было на

уровне фоновых значений или составляло не более 1 % •от включения

чэтки в КМ.

В ходе исследования нам пришлось также проверить возможность использования общепринятого метода определения уровня пролиферации КМ с помощью меченного тимидина и отметить наряду с преимуществами важные временные ограничения этого метода (см. раздел диссерт»ции "Материалы и методы").

Для определения ЦСА Мф и их супернатантов прямым подсчетом КМ их помещали в лунки и вносили Мф (или Су Мф) или свежую ростовую среду, как при обычной постановке цитостатического теста с использованием ЗН-тимидина. Через 43 ч культивирования КМ из лунок с ЦСФ (n0) или со средой (ЫЦ) снимали с пластика раствором Версена и подсчитывали количества КМ. Б е подсчеты клеток проводились с использованием трипанового синего дпя контроля цитотоксичности. -Процент подавления этого прироста при контакте с ЦСФ (ЦСД) по сравнению со свежей средой определяли по формуле:

n0 - N

ЦСД (*) = 1 - мк _ м ■« 100, где N - исходное количество КМ а лунке.

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили с использованием Ъ-критерия Стьюдента, критерия Вилкоксона дпя неравнозначных парных совокупностей и критерия Уайта с учетом пределов случайны колебаний в неравнозначных выборках. Статистически значимыми считали различия при р < 0.05.

Параллельно с цитостатическим тестом а некоторых этапах работы для подтверждения антипролиферативного, но не литического действия, эффекторов ставился цитот лческий тест по выделение зн-тимид- а из Меченых КМ (\Лэ1|эе Е.А. 1992). '

Высокочувствительные к ЦъД Мф клетки штамма ХЭТР, а также клетки

штамма ХЭТ-SR, никогда не пассированный In vivo, гюд&брг&пись контролю на зараженность микоплаэмой с помощью метода авторадиографии по включению ЗН-тимидина в ДНК исследуемых клеток.

Для проверки сохранения в процессе культивирования in vitro злокачественных свойств клетками высокотуморогенного и высокометастатичвского штамма ХЭТР-МЛН-8 и- низкозлокачестввнногс штамма ХЭТР параллельно с цитостатическим тестом ставился трансплантационный тест in vivo, в процессе которого одноклеточнук суспензию Ю-коатно различающихся д^о с-холевых клаток (1-10*3 вводили хомякам л/к и после 2 месяцев роста п/к опухолей учитывал* туморогенную активность.(log 50Х прививочной дозы) и способность к спонтанному мвтастазированию.

Для предотвращения распластывания Мф в некоторых опыта;

использовали пластины, обработанные раствором полиХЗМ/

-5 -4 -4

(poly(2-hydroxy-ethyl methacrylate), 2x10 , 10 , 5x10 И

"Aldrlch"). Состояние на обработанном попиХЭМА пластике указывал! на существенное подавление их распластывания (от слабоприкрепившихс! до полностью неприкрепившихся Мф).

При исследовании термочувствительности ЦСФ проводили прогревами

Су Мф и в качестве контроля ингактную ростовую среду при температур

о о

56 С в течение 1 ч или при 100 С 30 мин.

' В серии опытсв при исследовании возможного участи

простагландина Е типа в цитостатической реакции как супрессируюцег

активность Мф реагента, лделяемого КМ или Мф, проводил

-б -Б

предварительную обработку КМ и/мпи Мф индомотацином (10 -10 И

"Sigma" США) в течение 4 и 21 часа в монослое с последующи

отмыванием; в ряде опытов вносили индомегацин в тест-систему.

С помощью двух модификаций цитостатического теста (по включени

ЗН-тимидина и по непосредственному подсчету количества КМ -в лунка)!

был испытан человеческий рекомбинантный TNF-a, хоторый в концентрат ■ -4

5x10 hi /мл добавляли к клеткам штамма ХЭТР .и L929 аналогично Су f

для сопоставления ЦСА этих двух ЦС©. Кроме того, исследовали .лиян»

моноклональных антител к TNF-а на активность ЦСФ Мф. При этом, I

-4

культивировали в среда, содержащей TNF-a (5*10 мкг/мл), нативиый Ц<

к

еактивированных Мф, а также TNF-a или ЦС® после их контакта с оноклональными антителами к TNF-a (1 мкг/мл) при 37°С в течение 1 ч.

Для исследования возможности прохождения через фильтры бнаруженного нами ЦСФ, использовали фильтры "Amlcon" (США), одерживающие частицы молекулярной массой от JO.OCO до 300.000 Д, ереэ которые пропускали Су Мф (без сыворотки) и ростовую среду (для онтроля). Затем проверяли содержание ЦСА в фильтрате и в оставшемся сфильтрованным Су, сконцентрированным в результате этой процедуры в раза или разведенным до исходного объема. Перед добавлением к КМ субмонослой клеток ХЭТР) все полученные Су пропускали через фильтры .45 или 0.22 мкм.

Результаты исследования В коллекции штаммов, которыми располагает наша лаборатория, были Внаружены клетки, обладающие высокой чувствительностью к ЦСД КПЗ и ф. Это штамм спонтанно-трансформированных In vitro фибробпастов мбриойа хомяка (штамм ХЭТР). Используя в качестве контрольного талона высокой чувствительности к ЦСД Мф клетки этого штамма, мы ристулили к исследованию эффекторных клеток, т.е. КПЗ и Мф от юрмальных животных.

Опрвдвпвнив цигосгаги ческой активности перитонеапьных клеток, параметры реакции.

При изучении цитостатической активности (ЦСА) КПЗ относительно леток штамма ХЭТР была проведена серия опытов . с использованием 1еразделенной популяции КПЗ, взятых в их естественном соотношении, в юторой исследована динамика ЦСД КПЗ при различных соотношениях ЭФ и

4.

:м (Рис.1). При добавлении к 1*10 клеток ХЭТР максимального

5

юличества КПЗ (1п ) цитосгазис выявлялся уже через 3 ч контакта

26.3 Ж). Затем наблюдалось постепенное усиление цитостазиса, и поспе

10стимения максимума через 23-28 ч (77.3-73.1 S) происходило

юстепенное его снижение. ЦСД КПЗ, взятых ь количествах 104 и Ю3 Эф

ia лунку, выявлялось ло-же и Было менее выраженным, соответственно,

2

¡4.5 и 37.1 %, При использовании 10 КПЗ слабый цю~.стазис (< ^0 %) 1ЫЯВЛЯлея также'на 25 ч. *

Таким образом, существует зависимость ЦСД КПЗ от количества Эф

при постоянном количестве КМ: с увеличение дозы Эф усиливаете! цитостазис, а максимум ЦСА КПЗ приходится на 23-25 ч ' контакта Эф I КМ.

ПоскопЬКу в состава КПЗ нейтрофилы и тучные клетки часто вообще отсутствуют или имеются в очень небольшом количестве, I неприпилающие клетки перитонеального экссудата 'интактных хомяков, состоящие на 99 * из лимфоцитов различных типов, полностью удаляются при отмывании, то в случае сохранения наблюдаемого эффекта можж предположить, что он обусловлен гпааьым образом активность» резидентных Мф перитонэальной полости и/или синергичным действием М< и других КПЗ. '

Рисунок 1. Динамика цитостатического действия различных доз кпето! перитонеального экссудата относительно клеток штамма ХЭТР

ЦСД. %

100

00

во

40

го

О _I_I II I I

о а з в в ю 1Я

23 26 27

31 34

Дозы КПЗ -

— ю -4- Ю

-*- хо 10

3

2

По оси абсцисс —

время контакта Эф и клеток ХЭТР, (часы).

С этой целью были поставлены опыты с использованием неразделенных КПЗ и Мф, полученных в результате удале'ни неприлипакхцих КПЗ. ЦСД Мф практически не отличалось от ЦСД неразделенных КПЗ при одинаковых условиях постановки цитостатического теста, что свидетельствует в пользу участия преимущественно Мф а ЦСД неразделенных КПЗ.

Получив описанные результаты, мы решили проверитьдействительно

ли наблюдаемый цитостазис КМ является результатом активных процессов

в Мф или он может вызываться действием каких-либо токсических

веществ, появляющихся в следствие, гибели Мф. Для ответа на этот

вопрос мы поставили опыты с нативными КПЗ и с КПЗ термически

о

инактивированными при 5S С в течение 30 мин. Оба вида КПЗ тестировались на ЦСА по отношению к высокочувствительным клеткам ХЭТР. Результаты опытов показали, что прогревание Эф полностью отменяет цитостазис и для осуществления ЦСА необходимо присутствие живых КПЗ.

Увеличивая в 4 раза количество КМ а лунку и снижая тем самым соотношение Эф и КМ, мы ожидали увидеть снижение цитостаэиса по аналогии с вышеоп.данными опытами. Однако, в подавляющем большинстве опытов ЦСД КПЗ на опухолевые клетки, взятые в большем количестве, было значительно сильнее по сравнению с меньшим количеством КМ при тех же условиях инкубации.

Обнаруженная зависимость ЦСД КПЗ от количества км в лунке, при которой с увеличением количества КМ при постоянном количестве Эф цитостазис усиливается, возможно, гоаорит о том, что клетки ХЭТР в нашей системе являются активаторами цитостатичоской реакции Мф.. В литературе имеются данные о спосоЗиости саркомных клеток и их Бескпаточных асци.ных <имдкостей активировать in vitro мышиные Мф а тесте In vivo по подаагания развития опухолей (Robinson М-, VíhaDlock Е. 1982).

"роме того, опипна ингмбиция синтеза ДНК клеток ЕМТ-б (.-аргинин-зависимым мохтп,^мои пол действием конди1 'онировапно сроды от активированных. Мф, причем, цитостатический агент (реактивные азотные оксиды) выявляется самими опухолевыми клэтками (Arobar 3. et

а).190в). Однако, по предварительным данным в нашей системе совместное культивирование Мф и КМ (ХЭТР или ХЭТ-БЯ) не приводит к изменению ЦСА Су Мф в какую-либо сторону. По-видимому, используемые в работе коли зства Эф и КМ не выделяют в среду определимые количества потных оксидов (определяемых методом с использованием реагента Гриесса) и ЦОД неактивированных Мф, возможно,' не связано с и-аргинин-зависимым механизмом.

Другим объяснением зависимости ЦСД от количества КМ может быть то, что повышенная плотность КМ в лунке может способствовать распространению состояния цитостаэиса, индуцированного одним Эф в одной клетке, на другие КМ с помощью сигналов, передаваемых лс межклеточным контактам. Это предположение основывается на данных, показывающих обеспечение щелевыми мрдтиками путей для межклеточного прохождения регулирующих рост молекул о нормальных клетках и снижение количества (целевых мостиков у некоторых раковых клеток по сравнению с соответствующими им нормальными клетками, а также при сравнении дву» различающихся по спонтанной метастатической активности пини( (ШсоТеоп О. еЪ «1. 1988).

Тот факт, что КПЗ сирийских хомяков подавляют включение метк» клетками ХЭТР при столь низком относительном количестве - 1:400, позволяет предположить, что ЦСД КПЗ интактных сирийских хомяков мо*в1 ноЪить гуморг >ный характер, т.е. опосредуется факторами, выделяемым« КПЗ в окружающую среду.

Поэтому, обнаружив высокую чувствительность к ЦСД резидентных М< клеток штамма (ЗТР мы попытались обнаруиить ЦСФ в супорнатантах (Су этих Эф. Для этой цели КПЗ или Мф, полученные поел», адгезии Н1 пластике в 3-х 10-кратно . различающихся дозах и отбывали: неприлилакщих клеток, инкубировали в течение 16 ч. Наличие иш отсутствие ЦСА таких Су на клетки ХЭТР определяли с помощь» дву; нодифик"(ий цитостатического тесто - по включению ЗН-тимидииа I непосредственным подсчетом КМ в лунках.

При определении ЦСД Мф и их Су на клетки ХЭТР по еключенн ЗН-тимидина наблюдалось подавление включения метки на 26-60 % зависимости от количества МФ, используемого в цитостатичаском тест©

для получения Су. Уровень ЦСД Су приблизительно соответствовал таковому самих Мф или был несколько ниже (в большинстве опытов пр

5

использовании большей дозы Мф (2.5x10 ) для получения ЦСО). Результаты опыта с использованием клеток штамма ХЭТР представлены на рисунке 2. Удивительным является как сам факт продукции ЦС® неактивированчыми резидентными Мф, так. и продукция реакционнослособного количества ЦСФ столь малыми дозами Мф (до

3

2.5*10 /лунку).

Рисунок 2. Цитостатическое действие макрофагов и их супернатантов на

клетки штамма ХЭТР

цсд.»

ЕЭ г.5»Ю У-3 £.5*10 I I 2.5*10

Непосредственный подсчет клеток ХЭТР в лунках сразу после посадки и через 48 ч культивирования показал, что их количество в интактном контроле за это время приблизительно утраивается. При этом мы отмечаем Реальное подавление прироста количества КМ, находившихся

4

т контакте о ЦСФ Мф. Так, Су из лунок с Мф 2.5*10 /лунку подавляет прирост числа КМ на 40-70 X.

Результаты, полученные путем непосредственного подсчета числа КМ в лунках в опыте и в контроле, позволяют исключить возможность выделения Мф холодного тимидина и уменьшения, таким образом, включения меченного тимидина в КМ, не затрагивая при этом их пролиферативную активность.

Представлялось интересным исследовать в сравнительных опытах (с учетом динамики) продукцию ЦСФ резидентными Мф от интактных животных, а также Мф животных-носителей опухолей. О последних известно, что они могут быть активированы и обладать как цитолитическо., так и супрессорной активностью (Mashiba Н. et г1. 1981, Nakata Y. et о). 1986).

В качестве КМ использовали высокочувствительные к ЦС Мф клетки штамма ХЭТР. Перитонеальные резидентные Мф получали от интактных животных или живогных-опухоленосителей после л/к прививки им клеток штаммов ХЭТР или ХЭТ-SR (высокоэлокачестеенные эмбриональные клетки, трЪнсформирое- иные BCP-IUP). Через разные сроки инкубации Мф после прилипания к пластику Весклеточные Су исследуемых Мф забирали из лунок и добавляли к посаженной за 2 часа КМ. Обработанные таким образом КМ ин' 'бироеапи в присутствии Су Мф в течение 24 часов. В качестве контроля для обраСотки КМ использовали ростову! среду. ЦСА Су определяли по включению ЗН-тимидина в КМ за последние 4 часа.

В 6 опытах была, исследована динамика продукции Мф интактных животных растворимого ЦСФ в зависимости от дозы Мф и от времени мх инкубации на пластике. Результаты типичного блыта представлены на рис. 3 (график А). Хотя ЦСА Су в этих опытах варьировала, динамика накопления ЦСФ в Су и ее зависимость от дозы Мф проявлялась во всех

5

опытах. Так, при дозе З.бхЮ Мф значительное накопление ЦС© в Су обнаруживалось уже к 4 часам их инкубации; максимум ЦСА был отмечен в

Динамика продукции цитост-^мчвского фактора макрофагами интактных животных и

животных-опухоленосителей

Исследуемый супернатант взят от Мф интактных животных (А), от Мф животных-носителей опухолей после привив» подкожно клеток штаммов ХЭТР (Б) и ХЭТ-ЗН (В). По оси абсцисс - вр чя инкубации Мф, секретирующих ЦСФ (часы). По оси ординат - ЦСА,

в х, подавление включения ЗН-тимидина в клетки ХЭТР. ниже нуля - усиление пролиферации

5 4 3

КМ. 1 - Су от 3.5x10 Мф, 2 - Су от .3.5x10 Мф, 3 - Су от 3.5x10 Мф.

пробах Су, взятых через 7-10 часов и снижение этой активности, иногда

вплоть до усиления пролиферации КМ отмечено в пробах Су взятых в

пробах Су, взятых через 24 часа инкубации Мф. Мф в меньшей розе

(¿.6x10 ) секретирумт ЦСФ на более низком уровне весь период

3

наблюдения (4-24 часа). При инкубаи.-и Мф в дозе 3.5x10 накопление ЦС"1 может быть определено лишь к 7 часам и в течение всего периода наблюдения происходит постеленное усиление ЦСА этих Су, не достигающее, однако, уровня секреции ЦСФ высокими дозами Мф.

Отмеченное выше снижение к 24 часам ЦСА Су Мф, взятых в максимальной дозе, и их рост-стимулирующее действие позволяют предполагать выделение Мф в среду нескольких факторов как подавляющих, так и усиливающих пролиферацию КМ. Эти факторы, возможно, одновременно выделяются в среду и конкурируют за проявление своег активности с постепенным преобладанием активности фа. гора, усиливающего пролиферацию КМ. Возможно, однако, что накопление ЦСФ Мф до некоторого высокого уровня приводит к подавлению его выделения и началу секреции другого фа тора, усиливающего пролиферацию кле. ->к-мишеней. Не исключена также возможность бимодального действия на КМ одного и того же фактора, который при увеличении его концентрации в Су начинает оказывать вместо ЦСД действие, усиливающее пролиферацию.

[ я исследования вопроса о влиянии опухолвноситепьства на секре мю ЦСФ было поставлено 2 серии опытов по определению динамики . -жреции ЦСФ Мф животных-носителей двух различающихся по туморог 1Ности опухолей (ХЭТР и ХЭТ-БН, рисунок 3, графики Б и В). Как вид о из сопоставления трех графиков (А, Б и В),х никаких существенных различий в динамике накоплену.я ЦСФ Мф интактных животных и животных-носителей опухолей нэ обнаружено.

В цел-ч, представленные в ' этой части работы данные свидетел-ствуют о cnoco5^ 'оти Мф нормальных сирийских хомяков (как и живочных-носителей опухолей) секретировать фактор (или факторы), обладающий выраженным ЦСД. Возможно, что продукция ниактивированными Мф ЦСФ является одним з существенных механизмов контроля пролиферг ии трансформированных клеток в организме,

II. Условия продукции цитостатичвского фактора /»акрофагор н характеристика некоторых его с во, те

Была поставлена серия опытов по определению продукции 1|сф в бессывороточной среде по сравнению с его продукцией в среде a 10 * коровьей сыворотки. В этих опытах Мф инкубирован» в среде RPMI 1640 с 10 Я коровьей с чоротки или Воз нее в течение 18-24 ч. Показано, что ЦСА Су Мф инкубированных в бессывороточной среде ie отличается от таковой а среде с сывороткой, что можеч оказаться полезным дли последующей его идентификации.

Другим условием, потенциально влияющим на продукцию цсф Мф

является распластывание Мф на пластике, поскольку другими

исследователями показано, что прилипание к стеклу и некоторым видам

пластика может служить стимулом для синтеза РНК интерлейкина-1

(Kurt-Jonea Е. et а 1. 1980), а также, что от степени распластывания

Мф ,на ппастико может зависеть уровень выброса реактивных форм

кислорода а ответ на РИД- (Gerton G., Gordon S. 1963 ). Поэтому а

нгиаих опытах дпя срватиип ЦСА су МФ при разной степени их

распластывания мы инкубировали Мф на обычном полистериновом пластике

или на пластика, обработанным тремя концентрациями полиХЭМА (2x10 б, -4 -4

10 , 6x10 М). Состояние Мф на пластике, обработанным полиХЭМА, указывало на существенное подавление их распластывания (от сла0оприкролмв> <хся до полностью нелрикрепившихс. • Мф). При переносе Су ма КМ от Мф, находившихся на необработанной или обработанной полиХЭМА пластиковой поверхности, цитостазис КМ немного снижался, однако, оставался достаточно высоким даме при максимальной д>- и ппиХЭМА, что позволяет судить о независимости ЦСА Су Мф от их распластывания.

Далее, мы определяли активность ЦСФ при хранении в холодильнике пр.» 4°С в течение нескольких суток. Опыты по определению. ЦСА су Мф показали<стабильность этой »ктивности п,«и таком режиме хранения, i крайней мерь, до 21 дня.

При исследовании молекулярной массы обнаруженного нами ЦСФ С' МФ, его пропускали через фильтры "Амикон" для частиц до 100.000 Д и сравнивали по ЦСА с интактным Су относительно клеток хэтр. Tai па

1 5

фнпьтры в большинстве опытов задерживали ЦСФ, т.к. фильтрат ие содержал ЦСА. Кроме того, в результате этой процедуры возможна концентрация ЦСФ и усиление цитостазиса КМ. Таким образом, »-видимому, обнаруженный нами ЦСФ имеет молекулярный вес больше 100.000 Д.

При исследовании влияния температуры ,, на ЦСФ прогревание

18-часового Су Мф при 5б°С, 1 ч незначительно снижало его ЦСА. Во

всех опытах было небольшое уменьшение ЦСА Су после его прогревания.

о

После термической обработки ЦСФ при .100 С в течение 30 мин ЦСА Су Мф снижается приблизительно, е 2 раза, судя по подавлению включения метки. Такой же обработке подвергалась и ростовая . среда для контрольных лунок. Однако, некоторая часть активности все же сохраняется, что может говорить либо о действии нескольких факторов, либо одного, но обладающего высокой термостабильностью.

о

Факт сохранения ЦСА после прогревания при Б6 С может,

по-видимому, исключить причастность к ЦСА Су Мф протеаз, диапизуемого

супероксид-аниона и перекиси водорода. Высокая терморезистентиость

о

оставшейся после обработки при 100 ЦСА вызывает сомнения в Белковой природе ЦСФ. Однако, имеются данные в отношении IL^-1, которые показывают образование низкомолекулярных пептидов под действием сериновых протеаз с сохранением Биологической активности (Auron Р. et al. 1587). Поэтому можно предположить, что и термическая обработка при 10О°С (1ч) также приводит к образовании подобных пептидов, охраняющих ЦСА. Остается также предположение о причастности ганглис.. ,идов Мф к выявляемому цитостазису, которые являются тврмостобильными и могут тормозить пролиферацию КМ (Ritter К. 1986).

Поскольку Мф секротируют наряду с другими ЦСФ TttF-a, представлялось . интересным провести сравнительный анализ чувствительк гтм двух клеточных линий к TNF-a и ЦСФ Мф. Известно, что клетки г нии 1.929 характеризуются высокой ч.зствительностью к TNF, а клетки штамма ХЭТР к ЦСФ Су Мф. С помощью двух модификаций цитостатичвск<--о тестп (по включению ЗН-тимидина и по непосредственному подсчету количества КМ в лунках) еыявле.а достаточ! высокая ЦСА исследуемого ЦСФ относительно клоток L929.

Одновременно эти клетки проявляли цитостазис при инкубации с сублорогрвой для лизиса дозой рекомбинантного TNF д. Клетки we штамма ХЭТР, высокочувствительные к ЦСФ Мф, оказались практически резистентными к TNF. Добавление моноклональных антител к TNF-a не влияло на ЦСА Су относительно обеих клеточных линий при отмене ЦСД TNF на клетки 1329. Таким образом, мы можем полагать, что если даже TNF-<x и присутствует в Су Мф, то обнаруженн i нами ЦСФ не идентифицируется как TNF-a.

XIX. Чувствительность клеток разной степени злокачественности к

ЦСД Нф

Прежде всего мы проверили, как влияют Мф на пролифератияную активность клеток ХЭ и спонтанно трансформированных клеток ХЭТР при

4

контакте с КМ. Для этого к 2.6*10 Мф, полученным после отмывания

4

неприлипающих клеток, добавляли 2*10 KN и через 24 ч совместной инкубации учитывали ЦСД по включению ЗН-тимидина за последние 4 ч. Результаты этой серии опытов представлены в таблице 1. Опыты показали, что в результате спонтанной трансформации 1n vitro клетки ХЭТР приобрели наряду с туморогенностью повышенную по сравнению с нормальными клетками чувствительность к ЦСД неактивированных леритоиеапьных Мф.

Далее мы сравнили два трансформированных 1п vitro штамма: ХЭТР -спонтанно-трансформирован..we эмбриональные клетка сирийского хомяка и ХЭТ-8Я - эмбриональные клетки, трансформированные in vitro ВСР. Эти штаммы имеют одно происхождение (ХЭ), но существенно различаются по ТГ и, как видно из таблицы 3, по чувствительности к ЦСД КП_. Вы<-окогумсрогенные клетки штамма X3T-SR значительно более пезистентны к ЦСД КПЭ при данной дозе Эф, величина цитостазиса этих клеток была на уровне нориальных эмбриональных клеток ХЭ. Тогда как клетки штамма Х5ТР выли высокочувствительны к ЦСД КПЭ. Очевидно, что в результате трансформации in vitro ВС» клетки jOT-SR либо сохранили, ли( приобрели определенный уровень резистентности к ЦСД КПЭ (при данной дозе Эф) в отличие от клеток штамма ХЭТР.

В следующих опытах мы сравнили по чувствительности к ЦСД Мф клетки ХЭТР и два отобранных in vivo его варианта, различающихся по

Таблица 1. Цк.гостатическое действие какроф&гоо при кон акте с нормальными клетками ХЭ и трансформированными клетками штаммов ХЭТР и

ХЭТ-БГ?

NN опытов ЦСД Мф при контакт» с KW: (*}

Серия 1. ХЭТР ХЭ

1. ев 32

2. 96 65

3. 58 39

4. 63 36

Б. 86 49

среднее + м 74.2+7.2 44.2+5. 9

достоверность отличия р < 0.02

Серия 2. ХЭТР X3T-SR •

1 . 2. 81 96 39 48

3. Б8 -14

4. ее 21

5. 66 65

6. 71 65 •

?. 87 79

8. 62 43

9. 72 32

среднее + м 71.2+4.2 40.1 Ь9 0

достоверность отличия р < 0.01

г экачественным свойствам. Как показывают результаты, отбор 1n vivo обесгчил и низк зпокаченственным клеткам штамма ХЭТР-128 и ' высокозлокачественныи .ХЭТР-74/18 снижение в чувствительности к ЦСД Мф.

При сравнительном исследовании чувствительности к ЦСД КПЗ клеток tirar s и Более широкого набора полученных в результате отбора in

Hvo вариантов этого штамма можно видеть (таблица ¿i, чю родительские клетки ХЭТР высокочувствительны к ЦСД КПЗ, в то время как осе его варианты, отобранные 1n vivo, кроме ХЭТР-МПН-8, существенно менее чувствительны к ЦСД КПЗ. Максимальные различия в

чувствительности между сравниваемыми штаммами проявляются при дозе

-3 4

КПЗ 5*10 на лунку, тогда как при дозе б»10 на лунку различия менее

выражены, но остается статистически достоверными для всех вариантов,

крема ХЭТР-МПН-1.

Таблица 2. Сопоставление клеток разной степени злокачественности по чувствительности к цитостатичвскому действию КПЗ

Исследуемые ТГА ЗМА Число ЦСД при дозе КПЗ:

КМ опытов 6*10 5*10 5Н02

ХЭТР + + 18 80 +2.0 53 +2 в 28 +2.2

ХЭТР-МЛН-1 + " +■+ б 73 • +5.4 31 +9 Н.д.

ХЭТР-МЛН-4 ++ 10 57 +5.0 22 +0 в Н.д.

ХЭТР-МЛН-в ++ в 91 +4.7 22 +5 5 Н.д.

хзтр-млн-а +♦ ++ 13 7-1 » + 1.9 5в +2. * 1 27 +3.3*

ХЭТР-75/18 +4+ ++ 13 49 +2.8 30 +2 7 7 +2.6

т

• ) - отличив от у.ЭТР но достоверно (р > 0.05); »») - нет данных.

Принципиально аналогичные результаты были получены при

и<--ользовании Мф в качестве Эф, получанных в результате удаления неприлипаюцих к лльстику клеток. 8 этой постановке опыта КМ добавляли к . ,)едеарительно посаженным и отмытым от неприлипающих кле -ок Мф.

Поскольку одним из механизмов ЦСД не&ктивированных Мф сирийских хомяков является рнделение в среду растворимого ЦС®, обнаруженного нами благодаря высокой чувствительности к его ЦСА клеток штамма ХЭТР, представлялось интересным равнить чувствительность к ЦСА тог., фактора ряда нормальных, т- чнеформировамных и опухолевых клеток.

Прежде всего мы сравнили чувствительность нормальных клеток ХЭ, спонтанно трансформированных in vitro клеток штамма ХЭТР и

трансформирова ных in vitro ВСР клеток штамма ХЭТ-SR к ЦСД растворимого ЦСФ неактивированных Мф (Таблица 3). Обнаруживаются различия в сторону большей чувствительности к ЦСФ нормальных клеток ХЭ по сравнению с трансформированными и опухолевыми клетками (достоверность . различий подтверждается критерием Ви. .коксона).

Клетки штамма ХЭТ-SR, полученного при трансформации эмбриональных клеток in vitro ВСР, которые, как и клетки штамма ХЭТР, никогда не проходили отбор in vivo, но отличаются значительно более высоким уровнем ТГ и ЭМ, приобретенными в процессе трансформации, оказались высоко резистентными к ЦСФ, секретируемому использованными дозами Мф, по сравнение со спонтанно трансформированными клетками штамма ХЭТР. Наблюдается лишь слабый (около 20 %) цитостазис, тогда как пролиферация клеток ХЗ и ХЭТР подавляется более, чем на 50*.

В таблице 3 также представлены данные по чувствительности к ЦСФ Мф клеток ряда штаммов различающихся по степени злокачественности, в том числе еще одного высокозлокачественного независимо полученного штамма эмбриональных клеток, трансформированных ' in vitro ВСР (ХЭТ-SR-I). Этот штамм в отличие от ХЭТ-SR обладает способность» к спонтанному метастазированию. Как видно из таблицы, оба ВСР-трансформированнмх штамма оказались существенно менее чувстиительны к ЦСФ Мф по сравнению со спонтанно трансформированными клет, т штамма ХЭТР. Различия в чувствительности к ЦСФ между клетками штаммов ХЭТ-SR и ХЭТ-SR-I статистически не значимы. Поскольку два ВСР-трансформированных штамма, различающиеся по способности к спонтанному метастазированию, практически, одинаково слабо чуствительны к ЦСФ, можно предположить, что резистентность к нему не является, признаком, специфичным для метастазирования.

Посколь .у по нашим данным, отбор in vivo высокотуморогенных и высоком*, астатических вариантов штамма ХЭТР кок правило, коррелирует со снижением чувствительности отобранных кпвток к ЦСД Мф при контакте с КМ, была мс, педоваиа чувствительность клеток ХЭТР и его отобранных in vivo вариантов к ЦСФ. (телица 3). У пяти из шести исследован» х штаммов .ухолевых клеток, полученных из метастатических узпоа после

I ablitntd S. ЧуьС» аи leíluHGC I ii S fió ТОК ajilan üleilcimi Jil.iia ■j.joch,!«. III I

цитостатическому действию растворимого фактооа м^кмофш ов

Исследуемые ЦСД (*) Число ** Степень

КМ м + И опытов достоверности (р)

ХЭ 70.2 + 2.9 8 < 0.01

ХЭТР 67.9 + 3.0 16 -

ХЭТР-МЛН-8 45.9 1.6 tí > 0.05

хэтр-млн-а 23.3 + 4.4 0 < 0.001

ХЭТР-75/1Q 23.3 + 6.2 10 < 0.001

хэтр-аэ/20 18.0 + 4.8 в < 0.001

ХЭТ-SR 22.9 + 4.8 13 < 0.001

ХЭТ-SR-1 35.9 4.6 7 < 0.02

О

*) - Использовали 2*10 Мф/лунку 24-луночной пластины для получения ЦСФ; **) - значимость отличия цитостазиса исследуемых КМ от ХЭТР.

п/к прививки клеток ХЭГ-Р, наблюдался более высокий уровень

резистентности к ЦСД растврримого ЦСФ. Относительная чувствительность

этих опухолевых штам(*с^е к контакт'ому ЦСД и к растворимому цсф

совпадает.

Таким образом i нугв.сл.вительность используемых КМ может зависеть от их дро,исхг -двнир, поскольку трансформация 1n vitru хомячьих эмбриональных кдеток вирусом саркомы Рауса (в отличие от спонтанно трансформированных клеток ХЭТР) обеспечила высокую тумор генность клеток и одновременно резистентность к ЦСД Мф и мх ЦСФ i отбора 1n vivo.

Однако, проверив влияние неактивированных перитонеапьных Мф на дролиферативную активность нормальных эмбриональных клеток ХЭ, кс орое по уровню ЦСД практически соответствует таковому на клетки ХЭТ-SR и отобранным 1п vivo eapt 1там штамма ХЭТР, мот i интерпретир. ^ать порученные данные, как сохранение определенного уровня чувствительности к ЦСД - Мф эмбриональных клеток трансформированных $СР, и приобретение приблизительно этого же уровни чувствительности штаммов, полученных в результата отбора клеток m

V ?vo.

Как показано е нашей лаборатории, все изученньн высокотуморогенные штаммы опухо..авых клеток отличаются от клеток ХЭТ1 < чособностью к выбросу иммунодепрессанта пге2 при их непосредственно! контакте с НК-клетками, Мф и нейтргЛилами и способностью подавлять i помощью ПГЕг цитотоксическую активность естественных киллеро! (Ключарева Т.Е. и соавт. 1989). Имеются также данные других авторов < выбросе ПГЕ макрофагами, активированными ЛПС и о подавлении секрецж ЦСФ Мф эндогенным и экзогенным пге2 (Young М., Slmmermaker J. 1984).

Чтобы выяснить, связано ли низкое ЦСД Мф относительж злокачественных клеток со снижением чувствительности этих клеток к Ms или с подавлением активности этих Эф выбросом ПГЕг (макрофагальноп или опухолевого происхождения), мы ингибироеали возможную секрецм ПГЕг в клетках ХЭТ-SR и ХЭТР-76/1в и/или в Мф предварительн .i И! обработкой индометацином (5*10 5 М) в течение 4 и 21 ч в монослое i последующим тщательным отмыванием, а также вносили индометацин i тест-систему. В 6 из 7 опытов ни.один из использованных режимов и до: обрэотки индометацином не сопровождался повышением ЦСД КП: относительно резистентных клеток штаммов X3TP-76/18 и ХЭТ-SR. Пр| этом, в параллельных опытах (данные Т.Е. Ключаревой с соавт. - ж представлены) подтверждалось наличие ингибиции продукции опухолевым! кпетке-"и ПГЕг обработкой индометацином и одновременное усиление ЦТ/ НК-кл^ток.

Поскольку активность исследуемых КПЗ не подавляется ПГЕ секрети уемым опухолевыми КМ, резистентность к ЦСД КПЗ отобранных 1< vivo ее кантов клеток ХЭТР, а также ВСР-трансформированных клеток, по-видимому, обусловлено снижением их чувствительности к ЦСД КПЗ з( счет иного механизма.

Таким образом, выявляется четкая корреляция в чувствительное™ к.-следуемых КМ к ЦСД Мф . - контакте с Эф и при действии топьк! pocTLjpHMoro ЦСФ. Исключение составляют нормальные клетки ХЭ, которьк оказались наиболее чувствительными из всех исследованных штаммов » растворимому цс®, тогда как ■ »тостазис при контакте с Мф значитель-ниже, чем у самых чувствительных кпеток ХЭТР при тех же условиях

j»ho предположить, что либо нормальные фиороо/iacru пидььпжщ

экрецша ЦСФ Мф, либо Мф в контакте о ХЭ усиливаю их пролиферацию, вступая в роли подложки, и на позволяют выявить истинную увствительность к ЦСД Мф исследуемых КМ.

ВЫВОДЫ

1. Выявлен способность резидентных ноактивированных макрофагов оритонвальной полости сирийских хомяков оказывать при впосредсгвенном контакте цитостатическое действие на нормальные, расформированные и опухолевые клетки.

2. Создана модель для исследования цитостатического действия акрофагов, включающая клетки высокочувствительного штамма ХЭТР и ременные и количественные параметры цитостатического действия ормапьных неактивированных макрофагов. Показана зависимость эффекта рт дозы макрофагов и типа клеток-мишеней.

3. Показано выделение неактивированными макрофагами в среду lacTBopuMoro цитостатического фактора (или факторов), цитостатическое ^йствие которого на различные опухолевые клетки-мишени не отличимо >т цитостатического действия макрофагов при непосредственном контакте : этими клетками.

4. Цитостатический фактор секретирувтея макрофагами спонтанно, (езависимо от присутствия сыворотки в среде и степени распластывания

Он тармост: *5илен и з держивватся на фильтрах "Амикон" и размером юр для частиц с молекулярным весом менее 100.ООО Д. Цитостатический фактор секретируется как нормальными резидентными макрофагак i, так и 1.1крофагами животных-носителей опухолей. Исследована динамика . о -школления в среде в заьисимости от количества макрофагов.

5. Показаны существенные различия в чувствительности различных гилов клеток-мишеней к ЦСД резидентных макрофагов (и их растворимому Jit тору), зависимые от характера трансформации клеток In vitro (спонтанной или вызванной вирусом саркс ы Рауса) и от отбора In vi о их злокачес ленного варианта. Показана корреляция между приобретением клетками высокой туморогенности (в процессе трансформации in vitrn или при отборе in vivo) и снижением их. чувствительности к цитостатическому действию резидентных макрофагов.

й. в di mi" ч oí ипучолевых ипоток-мишаней и клеток штамма ХЭТР, 'Iiмоейтепьно резистентные к контактному цитостатичоскому дойстви» меактивироаанных макрофагов нормальные хомячьи эмбриональные клетки oí адают большей чувствительностью к их растворимому цитостатичаскому фактору.

Список публикаций по теме диссертации

1. Высокая чувствительность спонтанно-трансформированных In vitro клеток к цитостатичоскому действию эффекторов естественной резистентности и её снижение в результате отбора in vivo. Цитология, езиоы докладов и сообщений, представленных на Всесоюзное совещание "Клеточные и молекулярные механизмы канцерогенеза и антиканцерогенеза", 198£, т.XXX, N9, 1136, в соавторстве о H.A. Лавниковой.

л. Цитостатическое действие перитонеальных клеток сирийских хомяков на трансформированные клетки. БЭБиМ, 1989, 3, 333-335, в соавторстве с H.A. Лавниковой.

3. Чувствительность клеток р;.зной степени злокачественности к цитоигагическому действию резидентных перитонеальных макрофагов сирийских хомяков. БЭБиМ, 19S0, 7, 83т85, в соавторстве с H.A. Лавниковой.

4. Продукция противоопухолевых цитостетических факторов навкти! рованными резидентными макрофагами леритонеальной полости оирийс ix хомяков. БЭБиМ, 1991, 6, 647-649, в соавторстве с H.A. Л жиковой•

5. Динамика продукции цитостатического фактора неактивированными перитоне^.льными макрофагами сирийских хомяков. БЭБиМ, 1992, 8, 189-191.

6. Цитостатическая активность растворимых факторов, секретируемых чеактиеировйнными перитонеальными макрофагами сирийских хиняков, тноемтеп^чо нор .альных, трансформированных и опухолевых клеток. БЭБиМ, 1993, Б, 505-507.

__ИДСТОК »НШЧИТЕЯЬИОЙ ТЕ *КИ ВОИН АМН СССР

ппдп. КЛЕ р^п-- »AKA3 \Ц% тирА»|Ьоаа.