Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммунорегуляторная и противоопухолевая активность клеток эритроидного ряда

Задачи исследования:.7

Научная новизна.7

Научная и практическая значимость.8

Основные положения, выносимые на защиту:.8

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ. 10

1.1. Эритроидные клетки в регуляции пролиферативной и функциональной активности лимфоидных клеток.10

1.2. Цитостатическая активность клеток костного мозга и её регуляция. 14

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.27

III. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.37

3.1 Характеристика иммуносупрессорной активности ЭК.37

3.2.Влияние растворимых эритроидных продуктов на гемопоэз.48

3.3. Характеристика цитостатической активности ЭК.51

IV. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.60

ВЫВОДЫ.73

СПИСОК ЦИТИРУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ.75

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АЗП - агглютинин зародыша пшеницы АЗП-Р - рецептор к АЗП AT - антитело

БОЕ-Э - бурстобразующие единицы - эритроидные ГКГ - главный комплекс гистосовместимости Д-ФБ- Дульбекковский фосфатный буфер ЕКК - естественная киллерная клетка ECK - естественная супрессорная клетки ЕЦК - естественная цитотоксическая клетка ИЛ - интерлекин ИФ-интерферон

ККС - костномозговой клеточный супернатант

КОЕ-ГМ - колониеобразующие еденицы - гранулоцито-макрофагальные

КОЕ-М - колониеобразующие еденицы - макрофагальные

КОЕ-М - колониеобразующие еденицы - эритроидные

КСФ - колоние-стимулирующий фактор

Кон А - конканавалин А

КЦЭ - костномозговой цитостатический эффектор

ЛМЭ -L-лейцил-метиловый эфир

ЛПС - липополисахарид мАТ - моноклональное антитело

ПГ - простагландин

СКЛ - смешанная культура лимфоцитов ТРФ - трансформирующий ростовой фактор ФИО - фактор некроза опухоли ЦТЛ - цитолитический Т-лимфоцит

ЭК - эритроидная клетка

ЭКС - эритроидный клеточный супернатант

ЭПО - эритропоэтин

ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка

ВВЕДЕНИЕ

Адекватное запросам организма функционирование системы эритропоэза играет важную роль в механизме поддержания постоянства внутренней среды организма. Дисфункции эритропоэза, характеризующиеся изменением количественного и (или) качественного состава эритроцитов в периферической крови вынесены в отдельную неоднородную группу анемических состояний, утяжеляющих течение многих заболеваний. Хотя имеющиеся данные пока не позволяют создать целостной картины интеграции эритропоэза в системе кроветворения, сложность регуляторных процессов, определяющих течение эритропоэза, очевидна. Wang с соавт. показали что усиление моноцитопоэза у мышей ассоциируется с подавлением эритропоэза [112]. Подавление эритропоэза, коррелирующее с увеличением количества активированных CD4+ и CD8+ Т - лимфоцитов в костном мозге, было обнаружено у пациентов страдающих хроническими воспалительными заболеваниями, осложненными анемией не ясной этиологии [94]. Способность поддерживать рост и дифференцировку эритроидных предшественников была продемонстрирована для ЕРО [64], ИЛ-3 [80], ИЛ-6 [104], ИЛ-10 [ИЗ], ИЛ-12 [47], ФРГ [105], SCF [37]. Эритропоэзингибирующая активность описанна для ФНО-а [59; 57], ИФ-у [114], ТРФ-Р [40]. Важную роль в прцессе дифференцировки эритробластов играют интегринопосредованные взаимодействия эритроидных клеток (ЭК) с элементами межклеточного матрикса [49]. Эти же интегрины (VLA-4, VLA-5) участвуют в формировании эритроидного островка, обеспечивая межклеточные контактные взаимодействия как между центральным макрофагом и окружающими его эритробластами, так и между самими эритробластами [51]. Центральный макрофаг в эритроидном островке обладает способностью продуцировать ЭПО [81], более того, как было показанно Prchal at al., сами эритробласты способны продуцировать этот цитокин [87]. Примером негативной ауторегуляции эритропоэза могут служить данные, представленные в работах групп Krantz и Peschle, продемонстрировавшие наличие в эритроидном островке системы Fas/FasL [65; 85].

Если исследования по изучению регуляции эритропоэза активно проводились раньше и проводятся в настоящее время, то, к сожалению, приходится отметить отсутствие интереса к исследованию гемоиммунорегуляторных свойств эритроидных клеток, хотя предпосылки к развитию этого направления возникли достаточно давно. Журавкин и соавт. [7] и Macario et al.[69] примерно в одно и тоже время описали способность ЭК подавлять гуморальные иммунные реакции. Дальнейшие исследования показали, что супрессорная активность ЭК в отношении В-клеточных реакций реализуется через продукцию растворимого фактора(ов) [7; 8; 9; 11; 12; 14; 18; 19; 20; 74]. В последующих работах была продемонстрирована способность ЭК продуцировать ИФ-у и ТРФ-(3 [15; 23]. Помимо этих двух цитокинов в ЭК была обнаружена экспрессия генов ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-6, ГМ-КСФ [6; 95; 96]. Супрессорная активность так же была присуща низкомолекулярным продуктам ЭК, обозначенным как эритроидный супрессорный фактор (ЭСФ) [14; 25; 15]. ЭСФ был охарактеризован как термостабильный небелковый фактор с молекулярным весом ниже <10 kDa, способный подавлять В-клеточные реакции [ 15; 23].

Обладая таким мощным иммуномодулирующим потенциалом ЭК, на наш взгляд, способны оказывать регуляторное влияние на более широкий спектр иммунологических реакций. Факт продукции ЭК цитокинов, обладающих геморегуляторной активностью, позволяет предположить возможность участия ЭК в регуляции, как других ростков кроветворения, так и роста опухолевых клеток гематологической природы.

Цель работы - исследовать механизмы, лежащие в основе иммунорегуляторной активности ЭК и определить роль этих клеток в механизмах цитостатической регуляции роста лейкозных клеток.

Задачи исследования:

Изучить влияние ЭК и их растворимых продуктов на пролиферативную и функциональную активность В- и Т-лимфоцитов. Изучить влияние ЭК и их растворимых продуктов на рост клеток -кроветворных предшественников. Исследовать влияние ЭК на рост лейкозных клеток. Охарактеризовать продуцируемые ЭК растворимые супрессорные продукты.

Научная новизна.

Получены новые данные, расширяющие спектр иммунологических реакций, в регуляции которых могут принимать участие эритроидные клетки. В частности, показано, что ЭК способны подавлять не только В-клеточные, но и Т-клеточные реакции. В работе продемонстрирован супрессорный эффект продуктов секреции ЭК на пролиферативную активность полипотентных кроветворных клеток, способных формировать 8-суточные колонии в селезёнке летально облученных животных, а также на рост БОЕ-Э в агаровой культуре. Вместе с тем показано, что эти же продукты способны поддерживать рост макрофагальных, гранулоцит-макрофагальных и более зрелых эритроидных колоний, генерируемых in vitro. Очерчена новая грань функциональной активности ЭК, связанная со

1. 2.

3.

4. способностью их низкомолекулярных продуктов подавлять рост лейкозных клеток как прямо, так и опосредованно - через стимуляцию активности костномозговых цитостатических эффекторов. В работе представлены основные характеристики ЭСФ. По своим физико-химическим и функциональным свойствам ЭСФ отличается от всех ранее описанных супрессорных факторов. Он термостабилен, имеет молекулярный вес <0.5 Ша, резистентен к ферментному протеолизу, а также к действию липазы и фосфолипазы С, но, чувствителен к обработке нейраминидазой.

Научная и практическая значимость.

Полученные данные расширяют представления о роле эритроидных клеток в регуляции гемо- и иммунопоэза. Представленные в работе экспериментальные данные предполагают участие эритроидных клеток в поддержании кроветворного баланса, что, в свою очередь, позволяет предположить возможность использования эритропоэз-модулирующей терапии при лечении гемобластозов. Физико-химические и функциональные характеристики ЭСФ дают основания надеяться на то, что после определения молекулярной структуры этого фактора появится возможность получить новый фармакологический препарат, обладающий иммуномодулирующим действием.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Иммуносупрессорная активность ЭК проявляется в подавлении как В-, так и Т-клеточных реакций. В реализации иммунорегуляторной активности ЭК важную роль играет продукция ЭСФ.

2. ЭК, являясь структурным элементом кроветворной ткани, участвуют в регуляции гемопоэза, оказывая супрессорный эффект на уровне стволовой клетки и, в то же время, поддерживая рост более зрелых клеток - кроветворных предшественников.

3. Активация эритропоэза в экспериментальных моделях in vivo и in vitro характеризуется приобретением ЭК противоопухолевой цитостатической активности, которая проявляется как в непосредственном подавлении роста клеток лейкозных линий, так и опосредованно, через усиление цитостатической активности костномозговых эффекторных клеток.

4. По своим физико-химическим и функциональным свойствам ЭСФ отличается от всех ранее описанных супрессорных факторов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на: отчетных научных сессиях Института клинической иммунологии СО РАМН (Новосибирск, 1997-2000 гг.); втором съезде иммунологов России (Сочи, 1999 г.);

Апробация диссертации состоялась на расширенном заседании семинара Института клинической иммунологии СО РАМН и общества иммунологов (Новосибирск). Результаты исследования по теме диссертации отражены в 5 научных публикациях.

Диссертация изложена на 90 страницах машинописного текста, содержит 23 рисунка и 2 таблицы, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения и выводов. Список цитируемой литературы включает 115 источников.